CN101614696B - 高密度脂蛋白芯片电泳方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高密度脂蛋白芯片电泳方法，包括选择缓冲体系、选择电泳芯片、血清标本及标记、电泳等步骤。本发明基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，在4分钟内分离了血清HDL的两种亚类，弥补了血液生化常规分析方法无法对HDL亚类进行分析的不足。芯片电泳对脂蛋白所表现出来的高分辨、快速的分离分析能力，使它有希望成为快速、简便、高效分离检测HDL亚类的分析手段之一。

Description

高密度脂蛋白芯片电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种高密度脂蛋白芯片电泳方法。
背景技术：
脂蛋白是纳米大小的颗粒，根据超速离心法可将其主要分为三类：高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(lowdense lipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(Very Low DensityLipoprotein，VLDL)。HDL是一种由脂质和蛋白构成的，在形状、密度、颗粒大小、电荷和理化特性等方面都具有较大的异质性的脂蛋白，主要分为HDL2和HDL3两种亚类。
目前国内外报道已从多个侧面对HDL亚类进行了分析，方法主要有：密度梯度超速离心(Density Gradient Ultracentrifugation，DGUC)法、梯度凝胶电泳法(Gradient Gel Electrophoresis，GGE)、质子核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)光谱法、免疫亲和层析法(Immunoaffinity Chromatography)、双向电泳-免疫印迹法(TwoDimensional Electrophoresis-Immunoblotting)等，但这些方法多半费时耗力，技术要求高。毛细管电泳是继高效液相色谱之后分析科学的一大进展，使单细胞，甚至单分子分析成为可能。有关研究使用区带毛细管电泳(Capillary Zone Electrophoresis，CZE)、毛细管等速电泳(Capillary Isotachophophoresis，CITP)分析HDL，并结合临床进行了初步探讨，显示了此技术分析HDL亚类的强大优势。但该方法分离HDL亚类需要不同的缓冲体系、不同的分离模式才能实现。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，针对血清脂蛋白进行快速分离和分析的高密度脂蛋白芯片电泳方法。
本发明的技术解决方案是：
一种高密度脂蛋白芯片电泳方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)选择缓冲体系：缓冲液为：由40mmol/LTricine、50mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸钠组成，pH8.5；
(2)选择电泳芯片：芯片包括十字管道，十字管道的横臂左右两端分别向垂直方向延伸，并分别与缓冲液废液池及缓冲液池相通，十字管道的纵臂上端与样品池相通，十字管道的纵臂下端与通过横向延伸段后与样品废液池相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点；
(3)血清标本及标记：受试者清晨空腹采血3mL，以3000r/min离心10min分离血清，所取血清标本加入同体积由0.05mol/L氯化镁和1.52mmol/L磷钨酸组成的PH为6.1的沉淀剂，混匀，置室温15min后3000r/min离心15min，离心后的上清液供测定；取离心后的6μL上清液加入2μL去离子水，再加入经乙二醇∶甲醇＝9∶1(体积比)混合液预先溶解的4μL0.2g/LNBD C6-ceramide进行避光预染，1min后加入20μL样品缓冲液，作为电泳待测样品；
(4)电泳：用1mol/LNaOH浸洗各池和通道1分钟，然后用去离子水浸洗2分钟；样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池加入缓冲液后，样品池中注入待测样本；进样阶段，样品池+670V，样品废液池接地，缓冲液池+300V，缓冲液废液池+450V，进样45秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池0V，缓冲液池+3500V，样品池和样品废液池均施加+300V，运行温度为25℃；得到高密度脂蛋白亚类HDL2、HDL3的出峰时间、相对含量数据。
芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片管道宽100μm，深30μm，芯片样品池到十字交叉点长28mm，有效分离长度为45mm，样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池的直径均为2mm。
本发明基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，在4分钟内分离了血清HDL的两种亚类，弥补了血液生化常规分析方法无法对HDL亚类进行分析的不足。芯片电泳对脂蛋白所表现出来的高分辨、快速的分离分析能力，使它有希望成为快速、简便、高效分离检测HDL亚类的分析手段之一。
附图说明：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是电泳芯片的结构示图。
图2是HDL标准品的电泳图谱
图3是实施例1的受试品电泳图谱。
具体实施方式：
1)电泳缓冲体系的选择：
缓冲液(Background electrolyte)pH8.5，由40mmol/LTricine、50mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸钠组成。
2)血清标本的准备和标记
受试者素食三天后，清晨空腹采血3mL，以3000r/min离心10min分离血清，所取血清标本加入同体积由0.05mol/L氯化镁和1.52mmol/L磷钨酸组成的PH为6.1的沉淀剂，混匀，置室温15min后3000r/min离心15min，离心后的上清液中只剩下HDL一种脂蛋白，供测定。要求4h之内完成分离检测，或-70℃保存。6μL血清加入2μL去离子水，再加入4μL0.2g/LNBD C6-ceramide(以V(乙二醇)∶V(甲醇)＝9∶1混合液预先溶解)进行避光预染，1min后加入20μL样品缓冲液，作为电泳待测样品。
3)芯片电泳
芯片结构如图1所示。芯片包括十字管道，十字管道的横臂左右两端分别向垂直方向延伸，并分别与缓冲液废液池4及缓冲液池3相通，十字管道的纵臂上端与样品池1相通，十字管道的纵臂下端与通过横向延伸段后与样品废液池2相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点5；芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，整个芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片微管道宽100μm，深约30μm，芯片样品池到十字交叉点长28mm，有效分离长度为45mm，各储液池的直径为2mm。样品池1和样品废液池2为进样通道，缓冲液池3和缓冲液废液池4为分离通道。
分析前，用1mol/LNaOH浸洗各池和通道1分钟，然后用去离子水浸洗2分钟。样品废液池(2)、缓冲液池(3)和缓冲液废液池(4)加入分离缓冲液后，样品池(1)中注入待测样本。进样阶段，试样池(1)+670V，样品废液池(2)接地，缓冲液池(3)+300V，缓冲液废液池(4)+450V，进样45秒后切换电压进入分离阶段。分离时，缓冲液废液池(4)0V，缓冲液池(3)+3500V，样品池(1)和试样废液池(2)均施加+300V。运行温度为25℃。
4)结果判读
图谱和数据采用Microsoft excel，Origin7.5和SPASS11.5软件包处理。先由HDL标准品做出标准电泳图谱，再选择受试标本进行比对分析，得到HDL亚类：HDL2和HDL3的出峰时间、相对含量等参数。
其中标准品脂蛋白电泳分离分析
缓冲体系：缓冲液pH8.5，由40mmol/LTricine、50mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸钠组成。
样本及标记：HDL为80μmol/L，1μL标准品溶于10μL去离子水，然后用4μL0.2g/L脂蛋白特异性荧光染料NBD C6-ceramide进行避光预染，1分钟后加入60μL缓冲液，作为电泳待测标本。
芯片电泳：同步骤3)。
结果判读：图2为HDL标准品的电泳图谱(出峰顺序依次为：HDL3、HDL2)。HDL3和HDL2主要为密度和质量的差别，芯片电泳主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力，电泳时具有不同荷质比的脂蛋白颗粒在的电渗流的作用下实现分离。

Claims (2)

1.一种高密度脂蛋白芯片电泳方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)选择缓冲体系：缓冲液为：由40mmol/LTricine、50mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸钠组成，pH8.5；
(2)选择电泳芯片：芯片包括十字管道，十字管道的横臂左右两端分别向垂直方向延伸，并分别与缓冲液废液池及缓冲液池相通，十字管道的纵臂上端与样品池相通，十字管道的纵臂下端通过横向延伸段后与样品废液池相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点；
(3)血清标本及标记：取血3mL，以3000r/min离心10min分离血清，所取血清标本加入同体积由0.05mol/L氯化镁和1.52mmol/L磷钨酸组成的PH为6.1的沉淀剂，混匀，置室温15min后3000r/min离心15min，离心后的上清液供测定；取离心后的6μL上清液加入2μL去离子水，再加入经乙二醇∶甲醇＝9∶1混合液预先溶解的4μL0.2g/LNBDC6-ceramide进行避光预染，1min后加入20μL样品缓冲液，作为电泳待测样品；
(4)电泳：用1mol/LNaOH浸洗各池和通道1分钟，然后用去离子水浸洗2分钟；样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池加入缓冲液后，样品池中注入待测样本；进样阶段，样品池+670V，样品废液池接地，缓冲液池+300V，缓冲液废液池+450V，进样45秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池0V，缓冲液池+3500V，样品池和样品废液池均施加+300V，运行温度为25℃；得到高密度脂蛋白亚类HDL2、HDL3的出峰时间、相对含量数据。
2.根据权利要求1所述的高密度脂蛋白芯片电泳方法，其特征是：芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片管道宽100μm，深30μm，芯片样品池到十字交叉点长28mm，有效分离长度为45mm，样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池的直径均为2mm。
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