CN101038255B - 吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光仪器及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光检测仪器及方法，本发明仪器包括毛细管电泳缓冲液储液池、高压泵、高压电源、分离毛细管进样器接入口、接口装置、光电倍增管、微弱光检测器和计算机，其中接口装置包括酸化毛细管、酸化反应液注入泵、化学发光检测池、发光底液注入泵；本发明的检测方法为：待测物的标记；毛细管电泳分离待测样品；分离毛细管流出液的酸化；检测化学发光；定性与定量分析。本发明的方法简单易行，仪器结构简单，操作方便，成本较低，适用于pH≤11的电泳缓冲体系，可满足绝大部分分析对象的要求，可用于氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰标记物的分离与检测。

Description

吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光仪器及检测方法
技术领域
本发明涉及生命科学及医学检测领域，更具体涉及一种吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光仪器及检测方法。
背景技术
吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物的化学发光反应不需要催化剂，在有H2O2和NaOH存在下即能发光，具有许多优越性，特别是无须一个催化过程，也不需要增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少，且有很高的发光效率，如吖啶芳香酯的量子产率可高达0.05[MayerA，etc.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1994，33(10)：1044]。该类化合物作为化学发光免疫分析(CLIA)的发光标记物，还具有其它方面的优点，如光释放快速集中、发光效率高、发光强度大，易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少、标记物稳定，在2～8℃下可保存数月之久，因此吖啶酯或吖啶磺酰胺在化学发光免疫分析中得到了广泛的应用，是一个非常有效的化学发光标记物。国外有多种商业化的CLIA系统使用吖啶酯或吖啶磺酰胺作为其化学发光标记试剂，如Ciba Coring公司的Magic Lite System和Behring公司的Berilux System，前者用吖啶酯，后者用吖啶磺酰胺作发光物质标记抗体或抗原，用HNO3与H2O2的混合溶液和NaOH作发光启动试剂。
与CLIA相比，毛细管泳电泳化学发光分析方法有以下几个方面的优点：
1)只需用发光标记试剂直接对被分析对象进行衍生，通过分析对象的标记产物间的毛细管电泳性质上的差异实现分离并依次检测，而无需涉及抗原抗体反应，因而也不用担心抗原抗体的失活问题。
2)CLIA使用的一种抗原或抗体只能检测一个分析对象，当体系中有多个目标物需要检测时，就必须分别进行标记和检测，操作繁琐且分析速度慢。而毛细管电泳化学发光检测只需用同一个发光标记物对多个分析对象进行标记即可实现分析对象的依次检出。方法简单且分析速度快。
3)毛细管电泳化学发光分析方法样品用量少，无需用到昂贵的免疫分析试剂，且一次电泳可以同时检测多个目标物，分析成本要比CLIA低得多。
从以上的比较可以看出，毛细管电泳化学发光分析与化学发光免疫分析相比有明显的优势，也正是基于此，Michael A.等人偿试使用毛细管电泳化学发光检测吖啶酯及其标记物并取得了成功(Michael A.，etc..Anal.Chem，1992，84，2758；Michael A.etc.，Journalof Microcolumn Separations，6，(6)545)。但他们设计的检测体系只能在电泳缓冲液pH＜3时实现对分析对象的检测，而在可用毛细管电泳分离与检测的实际样品中，绝大部份被分析物都要求在pH＞3的情况下才能实现较好的分离，因而Michael A.等人的上述仪器并没有得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光仪器及检测方法，该方法结合毛细管电泳的高分离能力和化学发光的高灵敏度，方法简单易行，仪器结构简单，操作方便，成本较低，适用于pH≤11的电泳缓冲体系，可满足绝大部分分析对象的要求，可用于氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰标记物的分离与检测。
本发明的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光仪器，包括毛细管电泳缓冲液储液池，用以传送缓冲液的高压泵，高压电源，其特征在于：所述高压泵输出的缓冲液经分离毛细管进入接口装置，所述分离毛细管进样端设有进样器接入口，所述接口装置包括酸化毛细管，所述酸化毛细管的进液端设有酸化反应液注入泵，酸化毛细管的出样端接入化学发光检测池，所述化学发光检测池上分别设有发光底液注入泵和废液出口，所述化学发光检测池正下方放置有用于采集待测物光信号的光电倍增管，所述光电倍增管的输出端经微弱光检测器与计算机连接；所述高压电源两端分别施加于毛细管电泳缓冲液储液池和酸化毛细管出样端。
本发明的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光检测方法步骤为：
1)待测物的标记：将待测样品与吖啶酯或吖啶磺酰胺在0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液中室温避光反应10～20分钟，所述待测样品与吖啶酯或吖啶磺酰胺的摩尔比为1∶1；所述吖啶酯或吖啶磺酰胺与磷酸缓冲溶液的摩尔比为≤1∶5；
2)毛细管电泳分离待测样品：根据待测样品的性质选取相应的分离缓冲体系及分离电压进行毛细管电泳分离；
3)分离毛细管流出液的酸化：由分离毛细管出样端的酸化反应液注入泵注入酸化反应液将毛细管流出液酸化至pH＜2，使吖啶酯或吖啶磺酰胺转化成能够产生化学发光的酸式结构；所述酸化反应液为：0.04mol/L的硝酸和0.2％的H2O2水溶液按体积比1∶2～2∶1的混合溶液；
4)检测化学发光：酸化后的溶液流入化学检测池中，由连接检测池的发光底液注入泵注入1mol/L的NaOH溶液保持检测池中溶液pH＞13，由检测池正下方的光电倍增管记录化学发光信号；
5)定性与定量：通过电泳的保留时间进行待测样品的定性分析，通过标准加入法或绘制工作曲线的方法进行待测样品的定量分析。
本发明的显著优点是：通过自组装的检测系统解决了前人报导的毛细管电泳化学发光检测系统只能在电泳缓冲液pH值小于3情况下检测吖啶酯及其标记物的缺点，实现了在各种pH值条件下用毛细管电泳化学发光检测吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的目的，从而极大的扩展了其应用范围。该方法仪器装置简单，检测灵敏度高，可用于氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰标记物的分离与检测，有望在生命科学及医学检测领域发挥较大的作用。
附图说明
图1为本发明吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光检测仪器构造示意图，其中：1高压电源；2毛细管电泳缓冲液储液池；3分离毛细管；4酸化毛细管；5酸化反应液注入泵；6发光底液注入泵；7化学发光检测池；8光电倍增管；9微弱光检测器；10计算机；11废液池；12接口；13进样器接入口。
图2为本发明吖啶酯、吖啶磺酰胺及其标记物的毛细管电泳化学发光检测接口装置设计图，其中：17酸化反应液注入口；14发光底液注入口；15高压电源接入端；16废液出口。
图3为应用本发明装置检测吖啶酯[4-(2-羟琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐]的化学发光图。
图4为应用本发明装置检测吖啶酯[4-(2-羟琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐]的工作曲线。
图5为应用本发明装置检测丙氨酸与赖氨酸的化学发光图，其中a为溶液中过量的AE-NHS的化学发光信号峰，b为赖氨酸的化学发光信号峰，c丙氨酸的化学发光信号峰。
图6，a为应用本发明装置检测丙氨酸的工作曲线，图6，b为应用本发明装置检测赖氨酸的工作曲线。
具体实施方式
具体步骤如以上所述，在步骤4)注入NaOH溶液时同时还可以加入表面活性剂TritonX-100以增强发光，所述表面活性剂的加入量为发光底液体积的2％。
该仪器的具体工作原理及流程如下：首先是用毛细管电泳系统分离待测样品，然后在分离毛细管出样端的酸化反应液注入泵将分离毛细管流出液酸化至指定酸度，毛细管高压电极一端设在酸化毛细管的出样端，这样可以保证被分离样品在酸化阶段不会产生谱带的展宽。经酸化毛细管酸化后的待测样品流入化学发光反应池中，与发光底液注入泵注入的发光底液反应产生发光，由放置于发光池底部的光电倍增管检测发光信号并由微弱光检测系统处理后传至计算机。
仪器的操作步骤：开启仪器电源，用0.1mol/L NaOH和分离缓冲液分别冲洗分离毛细管10min，同时将酸化反应液注入泵和发光底液注入泵的流速调至适当位置，进样，计算机自动记录发光信号，计算待测样品含量。
实施例1
1、4-(2-羟琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐(AE-NHS)的检测：
1)电泳条件：分离毛细管总长度为550mm，内径为75μm；运行缓冲液为5mmol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液；新毛细管用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH和水依次冲洗20min活化柱表面，每天开始工作前用0.1mol/L的NaOH和水分别冲洗10min，再用运行缓冲液冲洗5min。运行电压：15kV。分离温度：20℃。进样：电动进样20s。
2)样品检测：用1)所述电泳缓冲液配制浓度分别为1.0×10-11mol/L，1.0×10-10mol/L，1.0×10-9mol/L，1.0×10-8mol/L，1.0×10-7mol/L，1.0×10-6mol/L，的AE-NHS标准溶液各1ml，按1)步所述电泳条件进行毛细管电泳分离，控制酸化泵与发光底液泵的流速为0.5μl/s，微弱光检测器光电倍增管电压为950V，记录发光信号，以AE-NHS的摩尔浓度值的对数为横坐标，以相对发光强度值的对数为纵坐标，绘制检测AE-NHS的工作曲线(如图4所示)，由图可求得检测AE-NHS的线性方程为y＝0.4342x+6.9366(R2＝0.9963)，线性范围可达五个数量级，检测限低至1.05×10-13mol/L。
实施例2
丙氨酸与赖氨酸的定性与定量测定：
1)电泳条件：分离毛细管总长度为550mm，内径为75μm；运行缓冲液为20mmol/L，pH＝5.8的醋酸缓冲液(其中加入体积分数为28％的乙腈作为添加剂)；新毛细管用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH和水依次冲洗20mi n活化柱表面，每天开始工作前用0.1mol/L的NaOH和水分别冲洗10min，再用运行缓冲液冲洗5min。运行电压：15kV。分离温度：20℃。进样：电动进样15s。
2)丙氨酸与赖氨酸标准品的发光标记：
分别称取4.0nmol丙氨酸与赖氨酸与2.0mmol/L的AE-NHS 2μl在98μl浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝8.0)中室温避光反应10-20分钟。
3)样品定性检测：
a.标准物质的保留时间：用1)所述电泳缓冲液将2)步标记好的氨基酸稀释至浓度为1.0×10-8mol/L，按1)步所述电泳条件进行毛细管电泳分离，控制酸化泵与发光底液泵的流速为0.5μl/s，微弱光检测器光电倍增管电压为950V，记录发光信号(如图5所示)图示两个发光信号峰值对应的出峰时间即为两个标准物质的保留时间。
b.样品测定：按步骤2)所述方法标记待测样品，按3)a.所述方法检测待测样品的保留时间，所测得的保留时间与上述标准物质的保留时间相比，保留时间相同者即判为同一物质。
4)样品定量检测：
a.标准加入法定量：
用3)所述方法分别标记标准物质与待测样品，取两份等体积(V)标记好的待测样品，往其中一份中加入体积为V标(其中V标＜＜V)浓度为C标的标准物质，分别测定其发光信号，按以下公式计算未知样品的浓度CX：
Cx＝Hx·C标/(Hx+标-Hx)
CX-未知样品的浓度
C标-标准物质的浓度
Hx-待测样品发光信号的峰高
Hx+标-加入标准物质后待测样品的峰高
b.工作曲线法定量：
用3)所述方法标记丙氨酸标准物质，用电泳缓冲液配制浓度分别为1.0×10-11mol/L，1.0×10-10mol/L，1.0×10-9mol/L，1.0×10-6mol/L，1.0×10-7mol/L，1.0×10-6mol/L的丙氨酸标准溶液各1ml，按1)步所述电泳条件进行毛细管电泳分离，控制酸化泵与发光底液泵的流速为0.5μl/s，微弱光检测器光电倍增管电压为950V，记录发光信号，以标记丙氨酸标准溶液的摩尔浓度值的对数为横坐标，以相对发光强度值的对数为纵坐标，绘制检测丙氨酸的工作曲线(如图6，b所示)，由图可求得检测丙氨酸的线性方程为y＝0.4292x+6.9094(R2＝0.9929)，检测限为0.87×10-13mol/L。用相同方法标记待测样品，按1)步所述电泳条件进行毛细管电泳分离，控制酸化泵与发光底液泵的流速为0.5μl/s，微弱光检测器光电倍增管电压为950V，记录发光信号强度，代入上述线性方程即可求得待测样品中丙氨酸的浓度。用同样方法可以求得测定赖氨酸的工作曲线(如图6，a所示)，线性方程为y＝0.4511x+7.3048(R2＝0.9919)，检测限为0.49×10-13mol/L。用同样方法可求得待测样品中赖氨酸的浓度。

Claims (3)

1.一种吖啶酯标记物或吖啶磺酰胺标记物的毛细管电泳化学发光检测仪器，包括毛细管电泳缓冲液储液池，用以传送缓冲液的高压泵，高压电源，其特征在于：所述高压泵输出的缓冲液经分离毛细管进入接口装置，所述分离毛细管进样端设有进样器接入口，所述接口装置包括酸化毛细管，所述酸化毛细管的进液端设有酸化反应液注入泵，酸化毛细管的出样端接入化学发光检测池，所述化学发光检测池上分别设有发光底液注入泵和废液出口，所述化学发光检测池正下方放置有用于采集待测物光信号的光电倍增管，所述光电倍增管的输出端经微弱光检测器与计算机连接；所述高压电源两端分别施加于毛细管电泳缓冲液储液池和酸化毛细管出样端；所述酸化反应液为：0.04mol/L的硝酸和0.2％的H2O2水溶液按体积比2∶1～1∶2的混合溶液。
2.一种使用如权利要求1所述的检测仪器的吖啶酯标记物或吖啶磺酰胺标记物的毛细管电泳化学发光检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)待测物的标记：将待测样品与吖啶酯或吖啶磺酰胺在0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液中室温避光反应10～20分钟，所述待测样品与吖啶酯或吖啶磺酰胺的摩尔比为1∶1；所述吖啶酯或吖啶磺酰胺与磷酸缓冲溶液的摩尔比≤1∶5；
2)毛细管电泳分离待测样品：根据待测样品的性质选取相应的分离缓冲体系及分离电压进行毛细管电泳分离；
3)分离毛细管流出液的酸化：由分离毛细管出样端的酸化反应液注入泵注入酸化反应液将毛细管流出液酸化至pH＜2，使吖啶酯或吖啶磺酰胺转化成能够产生化学发光的酸式结构；所述酸化反应液为：0.04mol/L的硝酸和0.2％的H2O2水溶液按体积比2∶1～1∶2的混合溶液；
4)检测化学发光：酸化后的溶液流入化学发光检测池中，由连接检测池的发光底液注入泵注入1mol/L的NaOH溶液保持检测池中溶液pH＞13，由检测池正下方的光电倍增管记录化学发光信号；
5)定性与定量：通过电泳的保留时间进行待测样品的定性分析，通过标准加入法或绘制工作曲线的方法进行待测样品的定量分析。
3.根据权利要求2所述的吖啶酯标记物或吖啶磺酰胺标记物的毛细管电泳化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤4)注入NaOH溶液时同时加入表面活性剂Triton X-100以增强发光，所述表面活性剂的加入量为发光底液体积的2％。
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