CN101349647B

CN101349647B - 一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置及其使用方法

Info

Publication number: CN101349647B
Application number: CN2008100716637A
Authority: CN
Inventors: 陈国南; 郭隆华; 邱彬
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: CN101349647A

Abstract

本发明提供一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置及其使用方法，该装置包括毛细管电泳缓冲液储液池、高压电源、检测接口装置、光电倍增管、微弱光检测器、电脑和电化学工作站；使用方法为常规的毛细管电泳电化学发光检测方法，该装置能够实现对钌配合物及其标记物进行检测的毛细管电泳电化学发光检测，扩大毛细管电泳电化学发光的检测对象，具有很高的检测灵敏度，使用方法可操作性强，具有很高的实用价值。

Description

一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置及其使用方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置及其使用方法。

背景技术

钌配合物，特别是三联吡啶钌及其衍生物具有检测灵敏度高、发光条件简单且试剂稳定性好等优点，在分析化学领域得到了广泛的应用[Mark M.Richter.Chem.Rev.2004，104，3003]。以钌配合为发光试剂的毛细管电泳电化学发光检测方法因其具有很高的分离效率和非常微量的样品消耗，在最近几年得到了很快的发展[Gavin，P.F.，et al.J.Am.Chem.Soc.1996，118，8932；Wang，J.，et al.Anal.Chem.1999，71，5436；W.-D.Cao，J.-B，et al.Electrophoresis，23(2002)3692；Yan，J.L.，et al.Anal.Chem.2005，77，5385]。

因为电化学发光强度常常与发光试剂的浓度和共反应试剂的浓度成正比，因此电化学发光法即可以用来检测样品中发光试剂的含量，也可以用来检测样品中发光共反应试剂的含量[Mark M.Richter.Chem.Rev.2004，104，3003]。罗氏公司研制成功了多种电化学发光免疫分析装置(Roche Elecsys1010和2010等)，这些装置直接以[Ru(bpy)₃]²⁺标记抗体，当标记抗体与抗原特异结合后，采用磁性微球技术进行分离，反应时标记物直接发光。讫今为此这些检测装置在全球范围内的医学诊断领域得到广泛的应用。相比而言，检测发光共反应试剂的方法会更简便，因为这种方法不用标记。目前报导的所有毛细管电泳电化学发光检测方法均为检测共反应物。西安瑞迈电子科技公司与中科院长春应化所合作研制成功了世界上第一台商品化的毛细管电泳电化学发光检测装置[Yin，X.B.，et al.Trends in Analytical Chemistry，2004，23(6)，432]。该装置是通过在毛细管末端加入过量三联吡啶钌，用来检测电化学发光共反应物。虽然这种检测电化学发光共反应物的方法具有操作简单的优点，但它同时具有以下两方面的缺陷：首先是方法的灵敏度问题。该方法通常用来检测一些烷基胺类化合物，然而只有少数含有叔氨基的化合物能取得较高的检测灵敏度，而在检测大量的含伯氨基和仲氨基的化合物时检测灵敏度都不够理想。该方法的另外一个问题是检测对象受限。实际样品中大多数都不能作为电化学发光的共反应物，因此也不能用该方法检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置及其使用方法。该装置能够实现对钌配合物及其标记物的毛细管电泳电化学发光检测，扩大毛细管电泳电化学发光的检测对象，具有很高的检测灵敏度，使用方法可操作性强，具有很高的实用价值。

本发明的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，包括毛细管电泳缓冲液储液池，高压电源，其特征在于：所述电泳缓冲液经分离毛细管进入检测接口装置，所述检测接口装置包括基座，所述基座上开设有电泳缓冲液槽和电化学发光检测槽；所述电泳缓冲液槽中设置有分离毛细管导电接口和连接高压电源的铂电极；所述分离毛细管穿过电泳缓冲液槽进入电化学发光检测槽，所述电化学发光检测槽中还设置有三电极系统；所述电化学发光检测槽上还分别设置有电化学发光共反应试剂入口和废液出口；所述电化学发光检测槽发光检测部分的基座上开设有发光检测窗口，所述发光检测窗口正下方放置有用于采集待测物光信号的光电倍增管，所述光电倍增管的输出端经微弱光检测器与电脑连接；所述检测接口装置通过三电极系统连接电化学工作站；所述电化学工作站还连接电脑；所述高压电源两端分别施加于毛细管电泳缓冲液储液池和电泳缓冲液槽。

本发明的新型毛细管电泳电化学发光检测装置采用常规的毛细管电泳电化学发光检测方法进行检测。

本发明的显著优点为：

本发明设计了一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置，通过在电泳分离后引入高效的电化学发光共反应物，将钌配合物作为一种电化学发光标记试剂引入到毛细管电泳分析中，该方法改变了原先毛细管电泳电化学发光只能检测电化学发光共反应物的现状，实现了对电化学发光试剂本身(及其标记物)的毛细管电泳分离与检测，从而扩大了毛细管电泳电化学发光的检测对象。同时，由于该装置可实现在最佳的共反应物及其最佳浓度条件下对发光试剂的直接检测，因此该方法具有很高的检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明的毛细管电泳电电化学发光装置示意图，其中1是高压电源；2是毛细管电泳缓冲液储液池；3是分离毛细管；4是微量注射泵；5是电化学工作站；6是毛细管电泳与电化学发光的检测接口装置；7是光电倍增管；8是微弱光检测器；9是控制电脑；10是废液池。

图2是本发明的毛细管电泳与电化学发光检测装置接口俯视示意图；

图3是本发明的毛细管电泳与电化学发光检测接口装置前视示意图；

图2、图3中：3是分离毛细管；11是树脂玻璃基座；12是电泳缓冲液池；13是分离毛细管导电刻蚀接口；14是铂电极；15是分离毛细管对准装置；16是电化学发光共反应试剂入口；17是发光检测窗口；18是废液出口；19是铂对电极；20是银参比电极；21是工作电极对准装置；22是铂盘工作电极，23电化学发光检测槽。

图4是钌配合物标记蛋白质的示意图。

具体实施方式

本发明的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，包括毛细管电泳缓冲液储液池2，高压电源1：所述电泳缓冲液经分离毛细管3进入检测接口装置6，所述检测接口装置6包括基座11，所述基座11上开设有电泳缓冲液槽12和电化学发光检测槽23；所述电泳缓冲液槽23中设置有分离毛细管导电刻蚀接口13和连接高压电源的铂电极14；所述分离毛细管穿过电泳缓冲液槽12进入电化学发光检测槽23，所述电化学发光检测槽23中还设置有三电极系统；所述电化学发光检测槽23上还分别设置有电化学发光共反应试剂入口16和废液出口18；所述电化学发光检测槽发光检测部分的基座上开设有发光检测窗口17，所述发光检测窗口17正下方放置有用于采集待测物光信号的光电倍增管7，所述光电倍增管的输出端经微弱光检测器8与电脑9连接；所述检测接口装置6通过三电极系统连接电化学工作站5；所述电化学工作站5还连接电脑9；所述高压电源1两端分别施加于毛细管电泳缓冲液储液池2和电泳缓冲液槽12。

电化学发光共反应试剂入口设置在电化学发光检测槽上靠近分离毛细管进入部分；废液出口设置在电化学发光检测槽上靠近工作电极进入部分，电化学发光共反应试剂入口和废液出口位于相互垂直的两个面上。

电化学发光共反应试剂入口处还设置有发光辅助试剂输送装置；所述发光辅助试剂输送装置由微量注射泵、注射器和输液管道组成，试剂通过微量注射泵经注射器进入电化学发光检测管；所述的微量注射泵流速在0.1ml/h至100ml/h连续可调。

所述检测接口装置上还设置有对准装置和工作电极对准装置对准位置，所述分离毛细管对准装置和工作电极对准装置可以是固定在基座上的不锈钢套管、塑料套管或玻璃套管。

所述的电化学工作站为一台恒电位仪，工作电压在-3V至+3V之间连续可调；所述三电极系统的工作电极为直径为200微米至500微米的铂盘电极，参比电极为银电极，辅助电极为铂电极。

所述检测接口装置上的电泳缓冲液槽为圆柱形，体积为150微升至300微升；所述的分离毛细管导电接口为用氢氟酸刻蚀的无死体积的导电接口，刻蚀段长度在1.5毫米至2.5毫米之间。

所述装置采用常规的毛细管电泳电化学发光检测方法进行检测。

使用的电化学发光标记试剂为钌配合物，比如三联吡啶钌及其衍生物。所述的电泳条件根据常规方法按照检测对象选择。

应用本装置检测待测样品包括以下几个步骤：

步骤一，待测样品的衍生：用带有标记基团的钌配合物标记待测样品。

步骤二，应用本发明装置对衍生后的待测样品进行检测。

步骤三，数据处理。

实施例

以下实施例结合附图来叙述本发明的具体工作原理：

毛细管电泳电化学发光检测人血清白蛋白(HSA)：

步骤一待测样品的衍生：

用带有羧基的钌配合物标记蛋白上的氨基，反应步骤如图4所示，反应分三步进行，EDC首先与钌配合物上的羧基反应，形成氨基反应活性的O-酰基脲中间体，该中间体立即与NHS反应生成氨基反应活性NHS酯，这种NHS酯最后与HSA上的氨基反应生成稳定的酰胺键。

步骤二

将第一步标记后的HSA用本发明所述的毛细管电泳电化学发光检测装置进行检测。电泳条件如下：分离毛细管总长度为400mm，内径为75μm；运行缓冲液为20mmol/L，pH＝4.0的Tris-CH₃COOH缓冲液(其中加入质量分数为2.5％的PVP)；运行电压：350V/cm；进样：电动进样5s；柱后共反应试剂：浓度为100毫摩尔的三正丙胺(用磷酸调pH值为8.0)，流速为0.3ml/h；微弱光检测器高压为900V。

步骤三结果分析

以不同浓度的HSA标准溶液的电化学发光的相对强度(峰高)的对数为纵坐标，以HSA标准溶液浓度的对数为横坐标作工作曲线，得检测HSA的线性方程为y＝0.5382x+7.2809(R²＝0.9911)，检测限为2.16×10^-10mol/L。将待测样品的发光值代入工作曲线即可求得待测样品中HSA含量。

Claims

1.一种新型毛细管电泳电化学发光检测装置，包括毛细管电泳缓冲液储液池，高压电源，其特征在于：所述的电泳缓冲液经分离毛细管进入检测接口装置，所述检测接口装置包括基座，所述基座上开设有电泳缓冲液槽和电化学发光检测槽；所述电泳缓冲液槽中设置有分离毛细管导电接口和连接高压电源的铂电极；所述分离毛细管穿过电泳缓冲液槽进入电化学发光检测槽，所述电化学发光检测槽中还设置有三电极系统；所述电化学发光检测槽上还分别设置有电化学发光共反应试剂入口和废液出口；所述电化学发光检测槽发光检测部分的基座上开设有发光检测窗口，所述发光检测窗口正下方放置有用于采集待测物光信号的光电倍增管，所述光电倍增管的输出端经微弱光检测器与电脑连接；所述检测接口装置通过三电极系统连接电化学工作站；所述电化学工作站还连接电脑；所述高压电源两端分别施加于毛细管电泳缓冲液储液池和电泳缓冲液槽。

2.根据权利要求1所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述电化学发光共反应试剂入口设置在电化学发光检测槽上靠近分离毛细管进入部分；废液出口设置在电化学发光检测槽上靠近工作电极进入部分，电化学发光共反应试剂入口和废液出口位于相互垂直的两个面上。

3.根据权利要求1所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述电化学发光共反应试剂入口处还设置有发光辅助试剂输送装置。

4.根据权利要求3所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述发光辅助试剂输送装置由微量注射泵、注射器和输液管道组成，试剂通过微量注射泵经注射器进入电化学发光检测管；所述的微量注射泵流速在0.1ml/h至100ml/h连续可调。

5.根据权利要求1所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述检测接口装置上还设置有分离毛细管对准装置和工作电极对准装置对准位置，所述分离毛细管对准装置和工作电极对准装置是固定在基座上的不锈钢套管、塑料套管或玻璃套管。

6.根据权利要求1所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述的电化学工作站为一台恒电位仪，工作电压在-3V至+3V之间连续可调；所述三电极系统的工作电极为直径为200微米至500微米的铂盘电极，参比电极为银电极，辅助电极为铂电极。

7.据权利要求1所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置，其特征在于：所述检测接口装置上的电泳缓冲液槽为圆柱形，体积为150微升至300微升；所述的分离毛细管导电接口为用氢氟酸刻蚀的无死体积的导电接口，刻蚀段长度在1.5毫米至2.5毫米之间。

8.一种使用如权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的新型毛细管电泳电化学发光检测装置进行检测的方法，其特征在于：所述装置采用常规的毛细管电泳电化学发光检测方法进行检测。

9.根据权利要求8所述的使用新型毛细管电泳电化学发光检测装置进行检测的方法，其特征在于：使用的电化学发光标记试剂为钌配合物，电泳条件根据常规方法按照检测对象选择。

10.根据权利要求9所述的使用新型毛细管电泳电化学发光检测装置进行检测的方法，其特征在于：所述的钌配合物为三联吡啶钌及其衍生物。