CN102661948B - 毛细管电泳-化学发光检测接口装置及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置及其制作方法，该接口装置包括一有机玻璃、反应毛细管和分离毛细管，该有机玻璃中部设置有横向贯穿通道和纵向发光检测窗口，该横向贯穿通道内设有反应毛细管，该反应毛细管外壁与横向贯穿通道内壁之间设置有至少两个的定位垫圈，该分离毛细管的一端部插入反应毛细管的进料端，其另一端部穿出安装在横向贯穿通道相应端口上的橡皮塞，该分离毛细管的径向两旁侧还设置有发光试剂通道和电极安装通道。本发明制作成本低、接口小巧，操作简便，较好解决了由于CL试剂的引入而造成分离效率、灵敏度和稳定性降低等问题，具有CE的高分离效率和CL检测的高灵敏度，可用于生物样品、食品和环境样品分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置及其制作方法，适用于生物样品、食品和环境样品分析。
背景技术
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）具有高效、快速、进样体积小、分离范围广、运行成本低、溶剂消耗少、操作简单和抗污染能力强等特点，尤其适合于复杂样品分析，是分析科学最具活力的前沿研究领域之一。但商品化的CE仪器多选用紫外检测器（UV），最低检出限一般在10-5~10-6mol/L，难以满足复杂样品中极低含量成分分析的要求，限制了CE在复杂样品分析研究领域中的应用。
化学发光(chemiluminescence，CL)检测无需外加光源，背景噪声小，具有灵敏度高（可以得到和激光诱导荧光相媲美的高灵敏度）、线性范围广、分析速度快、仪器设备简单等优点，是一种有效的痕量分析技术。但CL法固有的选择性差的缺点限制了它在实际分析中的应用。CL和高分离效率的CE结合，直接用于复杂样品中痕量成分的分离与测定，可同时解决选择性差和灵敏度低的问题，给CL研究和CE技术提供了发展机会。CE-CL联用技术已被应用于生物样品、食品和环境样品分析中，分析对象已涉及蛋白质、氨基酸、生物碱、糖类和金属离子等。但到目前为止CL在CE 的检测方式中运用的相对较少，主要是因为将二者联用仍然存在着一些困难，因此CE-CL检测接口的研制仍是CE-CL分析领域的研究热点。
在CE-CL联用技术中，需要向该检测体系引入一种或两种反应试剂来引发CL反应，为了取得良好的分离效率和灵敏度，涉及分析物和化学发光试剂混合模式的接口设计是一个非常关键的因素。依据柱后流体混合的模式和检测位置，通常可分为离柱合并流型、在柱同轴流型、离柱同轴流型和柱端液池型。
（1）离柱合并流型：电泳高压区和发光检测区隔离开来，可消除化学发光试剂的电分解，但分析物和发光试剂混合时被稀释，并产生涡流扩散，导致峰展宽，降低了灵敏度和分离效率。
（2）在柱同轴流型：接口结构简单，在CE-CL系统中应用较广泛。但因CL试剂在引入过程中受CE高压电场的作用，化学发光反应发生在高压电场区，这样会导致化学发光试剂的电分解，在电场存在下还有可能迁移进入分离毛细管；分析物与发光试剂的混合不够均匀稳定，会影响分析的准确性与重现性，同时也容易引起涡流扩散，而导致电泳峰的展宽，降低柱效。
（3）离柱同轴流型：把接地电极从反应毛细管的末端移至前端，占据四通接口中一个接口位置，浸入化学发光反应液中。这样既提高了电流的稳定性，还可使电泳分离条件与化学发光条件相匹配。虽然这种检测接口装置可以有效的防止发光试剂的电化学分解，但仍有可能在电场作用下迁移进入分离毛细管，试剂流动与电渗之间也可能存在的不匹配性，从而在某些应用中产生额外的麻烦。
（4）柱端液池型：直接将分离毛细管的末端插入一个含有化学发光反应试剂的蓄液池中，接地电极直接固定在末端的液池里。结构简单、稳定且易安装，消除了试剂流动与电渗之间存在的不匹配性。但化学发光试剂有可能电分解，在电场存在下还有可能迁移进入分离毛细管，柱后液池内的溶液必须要不断更新，另外由于液池内较大的检测死体积会导致分离效率和灵敏度的降低。
近年来，国内外研究者也不断设计出一些新型CE-CL接口。Zhike He等开发了一种在柱狭缝/柱后反应接口（On-column Fracture/End-column Reaction Interface）。该接口可同时引入两种以上发光试剂，解决了CE分离和发光条件的兼容性问题，且发光反应与电场隔离，有效防止发光试剂的电化学分解和迁移，具有离柱和在柱接口的优点。Jieke Cheng 等对柱端液池型进行改进，设计了旋转池型的CE-CL接口，通过旋转检测池，分离毛细管出口端的化学发光试剂得到及时更新，解决了常规同轴流接口中因气泡形成而使电泳中断的问题。Dumke 等通过把鲁米诺和辣根过氧化物酶固定在毛细管内，将广泛使用的商品化CE仪器进行改造用于CL 在线检测，虽然提高了CE-CL检测的可操作性，但是灵敏度比大多数CE-CL检测低了2-3个数量级，且毛细管内固定CL试剂也较困难，重现性也不够好。
尽管研究者已开发出各种不同的CE-CL联用接口，但这些接口装置仍处于实验室自行加工阶段，有各自的优缺点，都不能同时解决由于CL试剂的引入而造成分离效率、灵敏度和稳定性降低等问题；且氢氟酸刻蚀后毛细管容易碎，不易操作；因此在还没有十分成熟的CE-CL联用仪器出现之前，开发高灵敏和高稳定的CE-CL检测接口，扩大CE-CL技术的应用范围，对生命科学和生物医学的发展具有重要意义。此外，加速研制CE-CL检测接口使仪器商品化意味着先占得商机。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置及其制作方法，该接口装置制造成本低、接口小巧，操作简便，较好解决了由于CL试剂的引入而造成分离效率、灵敏度和稳定性降低等问题，具有CE的高分离效率和CL检测的高灵敏度。
本发明的技术方案在于：一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置，包括一有机玻璃、反应毛细管和分离毛细管，所述有机玻璃中部设置有横向贯穿通道和与横向贯穿通道垂直相交的纵向发光检测窗口，所述反应毛细管设置在横向贯穿通道内，所述反应毛细管外壁与横向贯穿通道内壁之间设置有至少两个的定位垫圈，所述分离毛细管的一端部插入反应毛细管的进料端，所述分离毛细管的另一端部穿出安装在横向贯穿通道相应端口上的橡皮塞，所述分离毛细管的径向两旁侧还设置有发光试剂通道和电极安装通道。
上述有机玻璃上还开设有通向定位垫圈的注胶孔，所述注胶孔用于注入胶水，以利固定定位垫圈。
上述反应毛细管的废液排出端连接有废液排出导管，所述废液排出导管的孔径大于反应毛细管的孔径，以利废液的及时排出。
上述有机玻璃的表面平整，其长度为3.5cm，宽度为2.0cm，厚度为0.8~1.2cm；所述横向贯穿通道的孔径为0.2~0.4cm；所述纵向发光检测窗口为直径为0.8~1.2cm的圆形通孔，所述发光试剂通道和电极安装通道的孔径为0.05~0.20 cm。
本发明的另一技术方案在于：一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置的制作方法，按以下步骤进行：
（1）有机玻璃的处理：取一块有机玻璃；从左侧面沿水平方向往右钻取横向贯穿通道，作为接口设计的主通道；在有机玻璃前后端面中间部位打通一个纵向圆孔，作为检测窗，并在检测窗的两旁侧钻出用于向定位垫圈注入胶水的注胶孔；最后，在靠近有机玻璃左侧的上下两表面各钻一个孔道，作为发光试剂通道和电极安装通道；
（2）反应毛细管的安装：采用点样毛细管作为发光反应池，在点样毛细管上套入若干个定位垫圈（橡皮圈）后，将其插入横向贯穿通道中。因为实验所用的钻孔器孔径比反应毛细管大，为了固定反应毛细管，防止因抖动影响检测效果，在定位垫圈位置上注入胶水（AB胶），并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞，起固定和密封的作用；
（3）分离毛细管的处理：采用明火去除聚亚酰胺涂层，并用蘸有无水乙醇的棉花擦拭烧过的痕迹，作为检测管段，将分离毛细管插入反应毛细管中，调整分离毛细管插入的长度，并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞，起固定和密封的作用。
上述有机玻璃的表面平整，其长度为3.5cm，宽度为2.0cm，厚度为0.8~1.2cm；所述横向贯穿通道的孔径为0.2~0.4cm；所述检测窗为直径为0.8~1.2cm的圆形通孔，所述发光试剂通道和电极安装通道的孔径为0.05~0.20 cm。
上述反应毛细管的废液排出端连接有废液排出导管，所述废液排出导管的孔径大于反应毛细管的孔径，以利废液的及时排出。
本发明的优点在于：
（1）采用有机玻璃制作接口，成本低、接口小巧，操作简便，易于商品化。
（2）用直径约为0.9mm的点样毛细管作为反应毛细管，分离毛细管可通过固定的橡皮塞直接插入反应毛细管，易于更换分离毛细管，且死体积和稀释效应较小，由于反应管径大于分离毛细管径，pH值环境取决于柱后CL试剂的pH值，更容易解决CE分离体系和CL检测体系的兼容性问题。同时对快速发光反应而言，内径大发光面也大，提高了发光强度。
（3）发光试剂由医用双道微量注射泵注入，只要选择合适管径的试剂引入导管，就可较精确控制发光试剂的流速，使试剂流动与电泳速度相匹配。
（4）电泳过程中分离毛细管进样端比出口端高约10cm，可较有效防止发光试剂的电迁移。
（5）废液出口的设计使废液能及时导出反应毛细管，提高检测准确度。
综上所述，本发明设计了一种新型的离柱同轴流型接口装置，设计成本低、接口小巧，操作简便，较好解决了由于CL试剂的引入而造成分离效率、灵敏度和稳定性降低等问题，具有CE的高分离效率和CL检测的高灵敏度，可望用于生物样品、食品和环境样品分析。
附图说明
图1是实施例中的毛细管电泳-化学发光检测接口装置结构剖视图。
图2是图1的俯视结构剖视图。
图3是实施例中的枳实提取液和辛弗林标准品电泳图。
图中：1有机玻璃 2反应毛细管 3分离毛细管 4横向贯穿通道 5纵向发光检测窗口 6定位垫圈 7橡皮塞 8发光试剂通道 9电极安装通道 10注胶孔 11废液排出导管。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图，作详细说明如下。
参阅图1和图2，重点参阅图1，本发明的毛细管电泳-化学发光检测接口装置，包括一有机玻璃1、反应毛细管2和分离毛细管3，所述有机玻璃1中部设置有横向贯穿通道4和与横向贯穿通道4垂直相交的纵向发光检测窗口5，所述反应毛细管2设置在横向贯穿通道4内，所述反应毛细管2外壁与横向贯穿通道4内壁之间设置有至少两个的定位垫圈6，所述分离毛细管3的一端部插入反应毛细管2的进料端，所述分离毛细管3的另一端部穿出安装在横向贯穿通道4相应端口上的橡皮塞7，所述分离毛细管3的径向两旁侧还设置有发光试剂通道8和电极安装通道9。
重点参阅图2，在本实施例中，所述有机玻璃1上还开设有通向定位垫圈6的注胶孔10，所说注胶孔10用于注入胶水，以利固定定位垫圈6。
在本实施例中，所述反应毛细管2的废液排出端连接有废液排出导管11，所述废液排出导管11的孔径大于反应毛细管2的孔径，以利废液的及时排出。
在本实施例中， 所述有机玻璃的表面平整，其长度为3.5cm，宽度为2.0cm，厚度为0.8~1.2cm；所述横向贯穿通道的孔径为0.2~0.4cm；所述纵向发光检测窗口为直径为0.8~1.2cm的圆形通孔，所述发光试剂通道和电极安装通道的孔径为0.05~0.20 cm。
上述毛细管电泳-化学发光检测接口装置的制作方法，按以下步骤进行：
（1）有机玻璃的处理：取一块横截面平整的长3.5cm，宽2.0cm，厚约1cm的有机玻璃1；从左侧面沿水平方向往右钻取横向贯穿通道4，孔长3.5cm，直径约0.3cm，作为接口设计的主通道；在有机玻璃1前后端面中间部位打通一个纵向直径约1cm的圆孔，作为纵向发光检测窗口5，并在纵向发光检测窗口5的两旁侧钻出用于向定位垫圈6注入胶水的注胶孔10；最后，在靠近有机玻璃1左侧的上下两表面各钻一个直径约0.15cm，深约0.6cm的孔道，作为发光试剂通道8和电极安装通道9；
（2）反应毛细管的安装：采用内径约0.9mm，长2cm的点样毛细管作为发光反应池，在点样毛细管上套入若干个定位垫圈6（橡皮圈）后，将其插入横向贯穿通道中。如图1所示，因为实验所用的钻孔器孔径比反应毛细管大，为了固定反应毛细管，防止因抖动影响检测效果，在定位垫圈6位置上注入胶水（AB胶），并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞7，起固定和密封的作用；
（3）分离毛细管的处理：采用明火去除聚亚酰胺涂层，并用蘸有无水乙醇的棉花擦拭烧过的痕迹，作为检测管段，将分离毛细管插3入反应毛细管2中，调整分离毛细管插入的长度，并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞7，起固定和密封的作用。
上述反应毛细管2的废液排出端连接有废液排出导管11，所述废液排出导管11的孔径大于反应毛细管的孔径，以利废液的及时排出。
采用上述接口装置的一种毛细管电泳-化学发光检测仪器，包括毛细管电泳高压电源（±30kV，0.3mA）、双道微量注射泵、超微弱发光分析仪、弹性石英毛细管（60cm×75μm i.d.）、点样毛细管（约0.9mm i.d.）、有机玻璃、上述的接口装置与外部连接的导管若干、固定橡皮圈若干、橡皮塞两个、AB胶、钻孔设备、暗箱、色谱工作站、计算机。
将分离毛细管插入反应毛细管中，调整分离毛细管插入的长度，使检测窗口恰好置于光电倍增管检测中心位置。发光试剂是通过固定在微量注射泵上的10mL注射器由外接的导管引入检测系统中，发光反应在分离毛细管检测窗口出口处发生。分离和检测都是在暗箱中进行，防止噪音和外界光源的干扰。发光信号由超微弱发光分析仪检测，并通过色谱工作站采集记录。毛细管电泳高压源提供高压电泳驱动使毛细管中的样品溶液运行
根据查阅的文献可知，酸性高锰酸钾是最常用的发光试剂之一，能跟许多生物碱发生快速的氧化还原反应，产生化学发光。同时，甲醇能对高锰酸钾的发光反应起良好的增敏作用。基于此原理，我们设计了生物碱辛弗林-甲醇-酸性高锰酸钾化学发光体系对检测接口性能进行检验。
在初步优化分离条件和发光条件后，确定以60mM Na2B4O7-60mMNaH2PO4缓冲液（pH=8.30）含30%甲醇为运行缓冲液，辛弗林在7分钟内出峰，理论塔板数为7282。迁移时间和峰高的日内相对标准偏差（RSD）分别为1.5% 和2.2%，线性范围为5.00-30.0μg/mL，检出限(S/N=3)为1.16μg/mL。该方法成功应用于中药枳实和模拟尿样中辛弗林的测定，测得中药枳实中的辛弗林平均含量为0.574mg/g，与药典中的记录一致。枳实提取液与辛弗林标准品的对照谱图如图3所示。检测条件：60mM Na2B4O7-60mMNaH2PO4缓冲液（pH=8.30）含30%甲醇，分离电压18kV，进样条件：18kV×8s，高锰酸钾浓度：2.5×10-4M，硫酸浓度：4.0M，泵速：6mL/h。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种毛细管电泳-化学发光检测接口装置的制作方法，其特征在于，按以下步骤进行：
（1）有机玻璃的处理：取一块有机玻璃；从左侧面沿水平方向往右钻取横向贯穿通道，作为接口设计的主通道；在有机玻璃前后端面中间部位打通一个纵向圆孔，作为检测窗，并在检测窗的两旁侧钻出用于向定位垫圈注入胶水的注胶孔；最后，在靠近有机玻璃左侧的上下两表面各钻一个孔道，作为发光试剂通道和电极安装通道；
（2）反应毛细管的安装：采用点样毛细管作为发光反应池，在点样毛细管上套入若干个定位垫圈，然后将其插入横向贯穿通道中，再在定位垫圈位置上注入胶水，并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞，起固定和密封的作用；
（3）分离毛细管的处理：采用明火去除聚亚酰胺涂层，并用蘸有无水乙醇的棉花擦拭烧过的痕迹，作为检测管段，将分离毛细管插入反应毛细管中，调整分离毛细管插入的长度，并在横向贯穿通道的相应端口上安装橡皮塞，起固定和密封的作用。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳-化学发光检测接口装置的制作方法，其特征在于：所述反应毛细管的废液排出端连接有废液排出导管，所述废液排出导管的孔径大于反应毛细管的孔径，以利废液的及时排出。
3.根据权利要求1所述的毛细管电泳-化学发光检测接口装置的制作方法，其特征在于：所述有机玻璃的表面平整，其长度为3.5cm，宽度为2.0cm，厚度为0.8~1.2cm；所述横向贯穿通道的孔径为0.2~0.4cm；所述检测窗为直径为0.8~1.2cm的圆形通孔，所述发光试剂通道和电极安装通道的孔径为0.05~0.20 cm。
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