CN101281202A - 毛细管电泳-化学发光法分离检测氨基酸的装置与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用毛细管电泳分离－过氧草酸酯化学发光法分离检测氨基酸的装置和方法。本发明的装置0－30kV高压电源用作电泳驱动电源，两根化学发光试剂引入毛细管一端连接微泵注射器，另一端由下往上插入化学发光反应管。电泳毛细管一端插入电泳缓冲液，另一端由上往下插入一不锈钢金属注射针头中，其末端置于注射针头的尖觜末端部分并使其出口刚好露置于PMT下面。承载电泳毛细管的金属注射针头由上往下插入反应玻管中，一端与高压电源负极相连的铂丝连接金属注射针头作为接地电极(阴极)。插入反应玻管中的电泳毛细管末端与化学发光试剂引入毛细管末端相距2mm，PMT固定在反应管的正上方，使发光信号尽可能被接收。本发明的装置能有效地保持电泳过程中电流稳定，分离效率与检测灵敏度高，具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸的分离检测装置和方法，特别是一种采用毛细管电泳分离-过氧草酸酯化学发光法分离检测氨基酸的装置和方法。
背景技术
毛细管电泳(CE)分离技术具有简单、高效、快速、非常少的样品使用量等优点，自从1980年首次被发明后，已发展成为一种经典的分离分析技术，目前已在化学、生物、医学及环境等领域获得广泛应用。但由于CE溶质区带的超小体积，需要高灵敏度的检测方法与之匹配，以及电泳过程中产生焦耳热和气泡等问题，因此，高灵敏检测方法及其相应电泳-检测系统的研制是CE技术发展的关键问题。目前已采用的检测方法有紫外-可见吸收光谱、激光诱导荧光、电化学、电化学发光、放射性同位素、化学发光(CL)、质谱等。CL应用于毛细管电泳检测是一种非常理想的技术，相对于其它光度方法如荧光法等，CL不需要激发光，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而具有比荧光法等方法更高的信噪比与检测灵敏度。同时，由于CL不需要激发光源，因而检测装置更简单、更便宜。CL目前已成功应用于CE-CL系统分析蛋白质、NDA、多肽、金属离子、氨基酸和其它物质等，已采用的CL系统包括鲁米诺、吖啶酯、三联吡啶钌、过氧草酸酯等。过氧草酸酯发光系统是基于过氧草酸酯被H2O2氧化生成一高能态的1，2-二氧杂环丁烷二酮中间体，后者将能量传递给反应体系的另一种物质(通常为荧光物质)，使这种荧光物质受激发而发荧光。过氧草酸酯发光体系具有高的发光强度，无需催化剂和增强剂等优点，因而应用于CE-CL系统，是一种理想的发光体系。但是，由于过氧草酸酯难溶于水及遇水水解而降低发光，因此只能溶于有机溶剂，但有机溶剂影响分析物的电泳行为，特别是，有机溶剂在电泳过程中由于受来自强大电流产生的焦耳热的影响，易受热挥发而产生气泡，此外，H2O2分解及化学发光反应过程中也产生气泡，这些气泡的产生容易导致电泳过程中的电流中断，从而严重影响分离与测定。因此，设计CE-CL装置，特别是CE-CL的电极模式及混合、反应界面等，以减少气泡的产生、避免电流中断，对过氧草酸酯CE-CL系统至关重要。在已有文献报导的方法中，通常采用一四通(或三通)固定分离毛细管与反应毛细管，电泳毛细管的末端插入反应毛细管中，接地电极插入四通的一个接口处或者是反应毛细管的末端。实验发现，采用这种装置，电流不稳定，电泳容易中断。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置。
本发明的目的之二在于提供该装置分离检测氨基酸的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置，包括高压电源、电泳毛细管、金属注射针头、反应管、引入毛细管和微泵注射器，其特征在于反应管为一斜置的无色透明的玻璃管，上端开口，下端密封；两根引入毛细管的一端分别连接两个微泵注射器，而另一端由反应管的密封端插入反应管中；电泳毛细管的一端插入电泳缓冲液中，而电泳毛细管的另一端插入一不锈钢金属注射针头中，并使电泳毛细管的末端置于金属注射针头的尖觜的末端；金属注射针头的尖觜端由反应管的开口端插入反应管，金属注射针头的尖觜的末端与两根引入毛细管末端间的距离为2±0.5mm；高压电源的负极通过铂丝连接金属注射针头的另一端；铂丝的一端连接高压电源的正极，而另一端插入电泳缓冲液中；光电倍增管PMT放置于反应管的正上方，接收反应管内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置；从反应管中流出的废弃液进入废液瓶中。
上述的反应管的开口端比密封端高1±0.5cm。
一种分离检测氨基酸的方法，该方法采用上述的毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置，其特征在于该方法的工艺步骤如下：
a.经清洗后的电泳毛细管中首先充满电泳缓冲液，然后进样；将进样端插入电泳缓冲液，另一端插入反应管内的金属注射针头中，并使电泳毛细管的末端置于金属注射针头的尖觜的末端，其出口刚好露置于PMT下面；
b.两种化学发光试剂，一种为5mmol/L TCPO乙酸乙酯溶液，另一种为0.5mol/LH2O2丙酮溶液，分别由两支微泵注射器以10μl/min的流速注入试剂引入毛细管，并使两种化学发光试剂充满反应管；
c.开启高压电源(1)，光电倍增管PMT(11)接收反应管(9)内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置(10)，即完成样品中的氨基酸的分离检测。
与现有技术相比，本发明的装置采用接地电极模式与反应混和模式，从电泳毛细管迁移出来的电解质首先与充当接地电极的金属注射针头接触，这样能有效地保持电泳过程中电解质溶液始终与接地电极接触，避免电泳过程中的电流中断，同时，反应管斜置，上端开口而下端封闭，这样有利于气泡的导出。电泳毛细管末端与化学发光试剂引入毛细管末端以相对的方向靠近，这样能使化学发光试剂与分析物充分混和，使反应充分完全。实验结果表明，使用该本发明的CE-CL装置，电泳与检测过程中的电流稳定，分离效果包括分离度、峰形、峰位、重复性等与检测灵敏度都达到理想的效果。本发明的装置能有效地保持电泳过程中电流稳定，分离效率与检测灵敏度高，具有实际应用价值，作为一种简单、稳定、高效、灵敏、通用的CE-CL系统，可应用于氨基酸、核酸、蛋白质、药物等物质的分离和测定。
附图说明
图1为本发明的毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置的结构示意图。
图2为实施例一的天冬氨酸与亮氨酸混合物的电泳分离图，荧光物质为丹磺酰氯。
图3为实施例二的丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和天冬氨酸四种混合物的电泳分离图，荧光物质为萘-2，3-二乙二醛(NDA)。峰位：1，L-Ser；2，L-Val；3，Leu；4，Asp
具体实施方式
试剂与材料：氨基酸，丹磺酰氯-氨基酸，3，5，6-三氯吡啶-2-酚(TCPO)，H2O2，十二烷基硫酸钠(SDS)，硼砂，氰化钾，甲醇，乙酸乙酯等均为分析纯，购于Sigma-Aldrich；萘-2，3-二乙二醛(NDA)，分析纯，购于Molecular Probe。
0-30kV高压电源，美国Glassma High Voltage公司；50cm×75μm ID及75cm×250μmID毛细管，美国Polymicro Technologies公司；60mm×1.5mm ID玻管，美国Kimble公司；R374光电倍增强管，日本Hamamatsu公司；40mm×1.2mm ID金属注射针头，美国Becton Dickinson公司；1mL微泵注射器，美国Bioanalytical System公司。
CE-CL装置参见图1，0-30kV高压电源1用作电泳驱动电源，反应管9(60mm×1.5mmID)为一斜置的无色透明的玻璃管，上端开口，下端密封，开口端比密封端高1±0.5cm；两根引入毛细管12、1375cm×250μm ID的一端分别连接两个微泵注射器14、15(1mL)，而另一端由反应管9的密封端插入反应管9中；电泳毛细管4的一端插入电泳缓冲液3中，而电泳毛细管4(50cm×75μm ID)的另一端插入一不锈钢金属注射针头5(40mm×1.2mm ID)中，并使电泳毛细管4的末端置于金属注射针头5的尖觜的末端；金属注射针头5的尖觜端由反应管9的开口端插入反应管9，金属注射针头5的尖觜的末端与两根引入毛细管12、13末端间的距离为2±0.5mm；高压电源1的负极通过铂丝6连接金属注射针头5的另一端；铂丝2的一端连接高压电源1的正极，而另一端插入电泳缓冲液3中；光电倍增管PMT 11放置于反应管9的正上方，接收反应管9内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置10；从反应管9中流出的废弃液进入废液瓶8中。整个化学发光检测系统被置于一密封暗箱中以减少背景和噪音。
实施例一：样品为天冬氨酸与亮氨酸的混合物，荧光物质为丹磺酰氯。电压为2.2kV，电泳缓冲液3为0.1mol/L硼砂溶液(pH 9.0)，所有溶液在使用前均经0.22μm聚四氟乙烯微孔滤膜过滤。具体步骤如下：
a.电泳毛细管4经1mol/L NaOH、1mol/L HCl、去离子水和电泳缓冲液各清洗30分钟。首先使电泳毛细管4内充满电泳缓冲液3，然后流体动力学进样10s，高度差为20cm。将进样端插入电泳缓冲液3中，另一端插入反应管9内的金属注射针头5中，并使电泳毛细管4的末端置于金属注射针头5的尖觜的末端；
b.两种化学发光试剂，一种为5mmol/L TCPO乙酸乙酯溶液，另一种为0.5mol/LH2O2丙酮溶液，分别由两支微泵注射器14、15注入试剂引入毛细管12、13中，流速为10μl/min，并使两种化学发光试剂充满反应管9；
c.开启高压电源1，光电倍增管PMT 11接收反应管9内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置10，并进行处理，即完成样品中的氨基酸的分离检测。
分离结果，参见图2，从图中可以看出，氨基酸混合物不仅能得到高效分离，而且还具有非常好的峰形，峰形尖锐而对称，分离时间分别为10分钟。混和物分离的线性响应方程分别为Y＝0.655C-0.37(r2＝0.9997)和Y＝1.36C-1.8(r2＝0.9991)(Y为峰高，C为浓度μM)，峰高及迁移时间的相对标准偏差分别为2.3％和1.2％，最低检测限(信噪比为3)分别为2.0nmol/L和1.1nmol/L。
实施例二：样品为丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和天冬氨酸四种混合物，荧光物质为萘-2，3-二乙二醛(NDA)。电压为1.85kV，电泳缓冲液的组成为25mmol/L硼砂(pH 9.2)，含25mmol/L SDS和7.5％甲醇。所有溶液在使用前均经0.22μm聚四氟乙烯微孔滤膜过滤。具体步骤与实施例一相同，分离检测结果参见图3。
Claims (3)
1.一种毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置，包括高压电源、电泳毛细管、金属注射针头、反应管、引入毛细管和微泵注射器，其特征在于反应管(9)为一斜置的无色透明的玻璃管，上端开口，下端密封；两根引入毛细管(12、13)的一端分别连接两个微泵注射器(14、15)，而另一端由反应管(9)的密封端插入反应管(9)中；电泳毛细管(4)的一端插入电泳缓冲液(3)中，而电泳毛细管(4)的另一端插入金属注射针头(5)中，并使电泳毛细管(4)的末端置于一不锈钢金属注射针头(5)的尖觜的末端；金属注射针头(5)的尖觜端由反应管(9)的开口端插入反应管(9)，金属注射针头(5)的尖觜的末端与两根引入毛细管(12、13)末端间的距离为2±0.5mm；高压电源(1)的负极通过铂丝(6)连接金属注射针头(5)的另一端；铂丝(2)的一端连接高压电源(1)的正极，而另一端插入电泳缓冲液(3)中；光电倍增管PMT(11)放置于反应管(9)的正上方，接收反应管(9)内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置(10)；从反应管(9)中流出的废弃液进入废液瓶(8)中。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置，其特征在于所述的反应管(9)的开口端比密封端高1±0.5cm。
3.一种分离检测氨基酸的方法，该方法采用根据权利1所述的毛细管电泳-化学荧光法分离检测氨基酸的装置，其特征在于该方法的工艺步骤如下：
a.经清洗后的电泳毛细管(4)中首先充满电泳缓冲液，然后进样；将进样端插入电泳缓冲液(3)，另一端插入反应管(9)内的金属注射针头(5)中，并使电泳毛细管(4)的末端置于金属注射针头(5)的尖觜的末端；
b.两种化学发光试剂，一种为5mmol/L TCPO乙酸乙酯溶液，另一种为0.5mol/LH2O2丙酮溶液，分别由两支微泵注射器14、15以10μl/min的流速注入试剂引入毛细管12、13中，并使两种化学发光试剂充满反应管9；
c.开启高压电源(1)，光电倍增管PMT(11)接收反应管(9)内的化学发光信号并将信号输入信号接收装置(10)，即完成样品中的氨基酸的分离检测。
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