CN102335297B - 中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法 - Google Patents
中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法,对加兰他敏的检测限为1.0×10-9mol/L,线性范围是2.5×10-7-5.0×10-5mol/L;比常用的质谱检测方法检测限低1-2个数量级,线性范围跨越二个数量级;吡啶钌电化学发光对加兰他敏灵敏检测;磷酸盐运行缓冲溶液实现加兰他敏高效分离;纳升级的进样量且不需要对待测样品进行衍生,中药石蒜提取物溶液经过滤稀释后直接用于检测,无需干燥再提纯等繁复程序。本发明首次将毛细管电泳电化学发光检测技术应用于中药石蒜提取物中加兰他敏的检测。
Description
技术领域
本发明属于毛细管电泳电化学发光检测技术领域,具体涉及毛细管电泳电化学发光检测中药石蒜提取物中加兰他敏的方法。
背景技术
中药与先进的检测技术相融合,可以为提高中药在国际市场的竞争力,扩大中药在国际市场的份额,起到积极的促进作用。石蒜是一种传统的中药,石蒜中的生物碱有着重要的药用价值,如石蒜中的加兰他敏可用于制备治疗帕金森等病症的药物。人们一直在研究探索石蒜中活性成分检测的新方法,对石蒜提取物中加兰他敏的高效分离、灵敏检测是化学分析领域的一个重要研究内容。
目前加兰他敏的分析方法主要有气相色谱质谱联用技术[1.2]、高效液相色谱法等[3-5],最近毛细管电泳技术也被用于加兰他敏的分析尝试[6]。作为中药产品常见的质量控制方法,石蒜中加兰他敏的分析往往采用传统的高效液相色谱质谱联用技术。这种技术具有灵敏度高同时还能提供被分析物结构信息的优势。但是高效液相色谱-质谱仪设备昂贵、操作复杂,有机试剂的使用等均构成了该技术难以推广使用的技术物质障碍。
毛细管电泳是经典电泳和现代微柱分离技术相结合的产物,是一种以电渗为驱动力依据各待测组分质核比进行分离的高效液相微分离技术,适用于各种带电离子以及中性物质的分析。毛细管电泳方法具有样品试剂用量小,高效快捷,仪器简单等优势,近年来,毛细管电泳与各种检测技术连用,显示了强大的分析能力。分析对象从无机离子、有机离子、药物,到生命科学的DNA,蛋白质,多肽,核苷酸,氨基酸等生物分子。目前该技术在分析化学、生物分析化学等领域得到了广泛的应用。吡啶钌电化学发光是一种灵敏的检测技术,其原理是通过电化学方法在电极表面产生一些特殊的物质。这些物质之间或与体系中其它组分之间通过电子传递形成激发态,激发态返回到基态产生发光现象,产生的发光强度正比于被分析物浓度,从而被分析物得到检测。该方法本身无需其它额外的光源,避免了背景光源的干扰,具有选择性好,光子产率高,电化学发光反应循环可逆等特点,是一种灵敏经济的检测手段。由于吡啶钌的水溶性好,因此可与毛细管电泳体系高度兼容。毛细管电泳与吡啶钌电化学发光技术相联用,将毛细管电泳的高效分离与吡啶钌的电化学发光的灵敏检测等优势有机结合,可以为低浓度、介质复杂待测样品的分析提供科学合理的技术平台。(参考文献[1]R.Gotti,J.Fiori,M.Bartolini and V.Cavrini,J.Pharm.Biomed.Anal.42(2006)17.[2]S.Berkov,J.Bastida,F.Viladomat and C.Codina,Phytochem.Anal.,19(2008)285.[3]T.Verhaeghe,L.Diels,R.deVries,M.De Meulder and J.de Jong,J.Chromatogr.B,789(2003)337.[4]K.Ingkaninan,C.M.de Best,R.van der Heijden,A.J.P.Hofte,B.Karabatak,H.Irth,U.R.Tjaden,J.vander Greef and R.Verpoorte,J.Chromatogr.A,872(2000)61.[5]J.Maláková,M.Nobilis,Z.Svoboda,M.Lísa,M.J.Květina,J.and V.J.Chromatogr.B 853(2007)265.[6]Y.-H.Hsieh,Y.-H.Yang,H.-H.Yeh,P.-C.Lin and S.-H.Chen,Electrophoresis 30(2009)644.)
发明内容
本发明的目的是提供中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法。该方法是一种灵敏、简单、快速的毛细管电泳电化学发光检测石蒜提取物中加兰他敏的方法。
中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法的步骤和条件如下:
1.1待检品的制备
1.1.1加兰他敏标准溶液的制备
把加兰他敏标准品溶解于二次水中,制得加兰他敏标准品储备液,所述的储备液的浓度为为5.0mmol/L,储备液在4℃冰箱中冷藏保存;
用二次水将加兰他敏标准品储备液稀释成浓度为2.0×10-5mol/L的加兰他敏标准溶液;
1.1.2石蒜提取物相关溶液的制备
A.石蒜提取物溶液的制备
将石蒜研磨成粉末,过40目筛;称取0.5g中药石蒜粉末,加入25mL质量分数为85%的乙醇,40℃条件下在超声池中超声10min,然后再用索式提取器萃取2小时,收集石蒜提取物溶液;石蒜提取物溶液用0.2μL浓度为12mol/L的盐酸中和后,用0.45μm的滤膜过滤,得到纯净的石蒜提取物溶液;
B.石蒜提取物稀释溶液的制备
由步骤A得到的石蒜提取物溶液用二次水稀释,获得石蒜提取物稀释溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
C.石蒜提取物稀释加标溶液的制备
向步骤A得到的石蒜提取物溶液中加入由步骤1.1.1获得的浓度为2.0×10-5mol/L的加兰他敏标准溶液,用二次水稀释获得石蒜提取物稀释加标溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
1.2检测步骤和条件
1.2.1仪器装置
内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;
1.2.2试剂
加兰他敏的标准品,二次水;三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)3Cl2.6H2O),NaH2PO4,Na2HPO4,NaOH,盐酸,乙醇,所用试剂均为分析纯;
1.2.3溶液的制备
所有配制好的溶液在使用之前均经0.45μm滤膜过滤;
1.2.3.1背景电解质溶液的配制
①磷酸盐缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液,调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50;
②Ru(bpy)3 2+溶液的配制
用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)3 2+溶液;
③背景电解质溶液的配制
将步骤①制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤②制备的Ru(bpy)3 2+溶液混合,用二次水稀释配制背景电解质溶液;背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0mmol/L,Ru(bpy)3 2+浓度为5.0mmol/L;
1.2.3.2运行缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合,再用二次水稀释配成浓度为15.0mmol/L的运行缓冲溶液,调整运行缓冲溶液pH值为8.49;
1.2.4检测步骤
1.2.4.1分离毛细管的处理
为了保证加兰他敏高效分离,灵敏检测及分析结果的重现性,需对毛细管做以下处理:
新的毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲满过夜,使用前用0.1mol/L氢氧化钠活化10min,用二次水冲洗10min,然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡10min;
1.2.4.2中药石蒜提取物的毛细管电泳电化学发光检测
将步骤1.1.2中的步骤B得到的石蒜提取物稀释溶液和步骤1.1.2中的步骤C得到的石蒜提取物稀释加标溶液分别按下述条件进行检测:
检测电位1.20V;进样时间10s;进样高压10kV;电泳分离高压13kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液;电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液;
采用1.2.1仪器装置:内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;电化学发光采用柱端检测模式;光电倍增管偏置电压设定在800V;获得中药石蒜检测的电泳图谱。
有益效果:本发明所涉及的中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法同其它检测方法比较有如下特点:
1)选择性高,抗干扰能力强。石蒜提取物中的加兰他敏对吡啶钌的电化学发光有很强的增敏作用,具有高度的选择性。本发明的检测方法具有很好的抗干扰能力,可以对基质复杂的石蒜提取物中加兰他敏进行灵敏检验。
2)灵敏度高,线性范围宽。本发明的方法可以满足中药石蒜提取物中低浓度活性成分的分析需求,对加兰他敏的检测限为1.0×10-9mol/L,比质谱检测技术检测限低1-2个数量级。加兰他敏的线性范围为2.5×10-7-5.0×10-5mol/L,跨越二个数量级。
3)样品用量少,分离速度快。纳升级的石蒜提取物样品用量即可实现毛细管电泳电化学发光分离检测需求。本发明的检测方法不需要对待测样品进行衍生处理,中药石蒜提取物可直接用于毛细管电泳分离电化学发光检测,整个电泳过程可控制在7min以内。
4)分析成本低,方便快捷。高度集成化且性价比程度较高的电化学综合分析仪是毛细管电泳电化学发光检测的基本操作平台,辅助一些实验室常用的化学试剂即可完成检测任务;吡啶钌电化学发光光子产率高、反应循环可逆,极大的降低了试剂的消耗。同质谱等一些灵敏的检测方法相比,本发明的方法具有试剂消耗少与仪器成本低的优势。
本发明首次将毛细管电泳电化学发光检测技术应用于中药石蒜提取物中加兰他敏的检测。
附图说明
图1是对石蒜提取物进行检测的电泳谱图。其中a是石蒜提取物稀释溶液电化学发光电泳谱图,b是加入加兰他敏的石蒜提取物稀释加标溶液电泳谱图。加兰他敏标准品加标浓度为2.0×10-5mol/L。1峰为加兰他敏的电泳峰。
具体实施方式
以下实施例采用毛细管电泳电化学发光综合分析仪的分析检测体系。检测电位1.20V;进样时间10s;进样高压10kV;电泳分离高压13kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液;电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液;三电极体系包括直径500μm铂盘工作电极、铂丝对极以及Ag/AgCl参比电极;毛细管柱内径50μm;电化学发光采用柱端检测模式;光电倍增管偏置电压设定在800V;
实施例1中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法的步骤和条件如下:
中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法的步骤和条件如下:
1.1待检品的制备
1.1.1加兰他敏标准溶液的制备
把加兰他敏标准品溶解于二次水中,制得加兰他敏标准品储备液,所述的储备液的浓度为为5.0mmol/L,储备液在4℃冰箱中冷藏保存;
用二次水将加兰他敏标准品储备液稀释成浓度为2.0×10-5mol/L的加兰他敏标准溶液;
1.1.2石蒜提取物相关溶液的制备
A.石蒜提取物溶液的制备
将石蒜研磨成粉末,过40目筛;称取0.5g中药石蒜粉末,加入25mL质量分数为85%的乙醇,40℃条件下在超声池中超声10min,然后再用索式提取器萃取2小时,收集石蒜提取物溶液;石蒜提取物溶液用0.2μL浓度为12mol/L的盐酸中和后,用0.45μm的滤膜过滤,得到纯净的石蒜提取物溶液;
B.石蒜提取物稀释溶液的制备
由步骤A得到的石蒜提取物溶液用二次水稀释,获得石蒜提取物稀释溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
C.石蒜提取物稀释加标溶液的制备
向步骤A得到的石蒜提取物溶液中加入由步骤1.1.1获得的浓度为2.0×10-5mol/L的加兰他敏标准溶液,用二次水稀释获得石蒜提取物稀释加标溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
1.2检测步骤和条件
1.2.1仪器装置
内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;
1.2.2试剂
加兰他敏的标准品,二次水;三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)3Cl2.6H2O),NaH2PO4,Na2HPO4,NaOH,盐酸,乙醇,所用试剂均为分析纯;
1.2.3溶液的制备
所有配制好的溶液在使用之前均经0.45μm滤膜过滤;
1.2.3.1背景电解质溶液的配制
①磷酸盐缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液,调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50;
②Ru(bpy)3 2+溶液的配制
用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)3 2+溶液;
③背景电解质溶液的配制
将步骤①制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤②制备的Ru(bpy)3 2+溶液混合,用二次水稀释配制背景电解质溶液;背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0mmol/L,Ru(bpy)3 2+浓度为5.0mmol/L;
1.2.3.2运行缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合,再用二次水稀释配成浓度为15.0mmol/L的运行缓冲溶液,调整运行缓冲溶液pH值为8.49;
1.2.4检测步骤
1.2.4.1分离毛细管的处理
为了保证加兰他敏高效分离,灵敏检测及分析结果的重现性,需对毛细管做以下处理:
新的毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲满过夜,使用前用0.1mol/L氢氧化钠活化10min,用二次水冲洗10min,然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡10min;
1.2.4.2中药石蒜提取物的毛细管电泳电化学发光检测
将步骤1.1.2中的步骤B得到的石蒜提取物稀释溶液和步骤1.1.2中的步骤C得到的石蒜提取物稀释加标溶液分别按下述条件进行检测:
检测电位1.20V;进样时间10s;进样高压10kV;电泳分离高压13kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液;电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液;
采用1.2.1仪器装置:内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;电化学发光采用柱端检测模式;光电倍增管偏置电压设定在800V;获得中药石蒜检测的电泳图谱。(见图1)。
Claims (1)
1.中药石蒜提取物中加兰他敏的毛细管电泳电化学发光检测方法,其特征在于步骤和条件如下:
1.1待检品的制备
1.1.1加兰他敏标准溶液的制备
把加兰他敏标准品溶解于二次水中,制得加兰他敏标准品储备液,所述的储备液的浓度为5.0mmol/L,储备液在4℃冰箱中冷藏保存;
用二次水将加兰他敏标准品储备液稀释成浓度为2.0×10-5 mol/L的加兰他敏标准溶液;
1.1.2石蒜提取物相关溶液的制备
A.石蒜提取物溶液的制备
将石蒜研磨成粉末,过40目筛;称取0.5g中药石蒜粉末,加入25mL质量分数为85%的乙醇,40℃条件下在超声池中超声10min,然后再用索式提取器萃取2小时,收集石蒜提取物溶液;石蒜提取物溶液用0.2μL浓度为12mol/L的盐酸中和后,用0.45μm的滤膜过滤,得到纯净的石蒜提取物溶液;
B.石蒜提取物稀释溶液的制备
由步骤A得到的石蒜提取物溶液用二次水稀释,获得石蒜提取物稀释溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
C.石蒜提取物稀释加标溶液的制备
向步骤A得到的石蒜提取物溶液中加入由步骤1.1.1获得的浓度为2.0×10-5 mol/L的加兰他敏标准溶液,用二次水稀释获得石蒜提取物稀释加标溶液,加入二次水的体积是步骤A乙醇体积的5倍;
1.2检测步骤和条件
1.2.1仪器装置
内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;
1.2.2试剂
加兰他敏的标准品,二次水;三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)3Cl2.6H2O),NaH2PO4,Na2HPO4,NaOH,盐酸,乙醇,所用试剂均为分析纯;
1.2.3溶液的制备
所有配制好的溶液在使用之前均经0.45μm滤膜过滤;
1.2.3.1背景电解质溶液的配制
①磷酸盐缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液,调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50;
②Ru(bpy)3 2+溶液的配制
用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)3 2+溶液;
③背景电解质溶液的配制
将步骤①制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤②制备的Ru(bpy)3 2+溶液混合,用二次水稀释配制背景电解质溶液;背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0mmol/L,Ru(bpy)3 2+浓度为5.0mmol/L;
1.2.3.2运行缓冲溶液的配制
配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4,将同浓度的二者混合,再用二次水稀释配成浓度为15.0mmol/L的运行缓冲溶液,调整运行缓冲溶液pH值为8.49;
1.2.4检测步骤
1.2.4.1分离毛细管的处理
为了保证加兰他敏高效分离,灵敏检测及分析结果的重现性,需对毛细管做以下处理:
新的毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲满过夜,使用前用0.1mol/L氢氧化钠活化10min,用二次水冲洗10min,然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡10min;
1.2.4.2中药石蒜提取物的毛细管电泳电化学发光检测
将步骤1.1.2中的步骤B得到的石蒜提取物稀释溶液和步骤1.1.2中的步骤C得到的石蒜提取物稀释加标溶液分别按下述条件进行检测:
检测电位1.20V;进样时间10s;进样高压10kV;电泳分离高压13kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液;电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液;
采用1.2.1仪器装置:内径50μm未涂层融硅毛细管;直径500μm铂盘工作电极;Ag/AgCl饱和参比电极;Pt丝对极;电化学发光综合分析仪,西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产;电化学发光采用柱端检测模式;光电倍增管偏置电压设定在800V;获得中药石蒜检测的电泳图谱。
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