CN110412104A - 一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种温度控制毛细管电泳‑化学发光联用的接口及其制作方法,接口包括加热保温装置模块和流通池模块,加热保温装置模块包括内置加热片的加热保温套、加热片盖和流通池盖;流通池模块包括分离毛细管、反应毛细管、高压电极、发光试剂室;分离毛细管从流通池的左端插入,反应毛细管从流通池的右端插入;发光试剂室留有两个发光试剂入口,高压电极与发光试剂入口相邻;流通池内的分离毛细管横向穿过发光试剂室插入到反应毛细管中,两毛细管之间留有间隙;反应毛细管插入始端与发光试剂室相通;分离毛细管末端出口处的位置是检测区。本发明组装方便,操作简单,实现精准、实时控制接口温度,提高了实验的灵敏度、重现性和稳定性。
Description
技术领域
本发明设计化学反应器械,尤其是一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口及其制作方法。
背景技术
毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE),又称高效毛细管电泳(highperformance capillary electro-phoresis,HPCE),是以熔融石英毛细管为分离通道并采用高压直流电场为驱动力,利用待测组分在电场中淌度的不同而实现分离。与高效液相色谱法等相比,CE拥有更广泛的应用范围和更高的分离效率,每米理论塔板数可高达几十万至几百万,在分析结构相似物质或手性对映体时的优势尤为明显。此外,CE具有进样体积小,分离柱效高、分析样品应用范围宽、分析速度快、易实现自动化等特点,在药物检测、环境监测、食品分析、生命科学等领域得到了广泛关注。然而,在CE分析中,极小的样品量(通常在皮升—纳升范围内)带来了实现高灵敏度检测的挑战,限制了CE在复杂样品分析研究领域中的应用。
化学发光(chemiluminescence, CL)通常指在没有光、电等外来激发,仅由化学反应过程提供能量而产生光辐射的现象。因其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单廉价、易微型化等特点,成为痕量分析领域关注的热点。毛细管电泳-化学发光联用技术,可实现微量、高效分离与简易、灵敏检测的良好结合,既满足了毛细管电泳中微小进样量对高灵敏度检测的要求,又排除共存组分对化学发光检测的干扰。其良好的应用前景,促使科研工作者进行长期的研究与探索。迄今为止,CL检测系统已成功用于分离金属离子,氨基酸,药物,生物标记物和生物大分子,如蛋白质,酶和DNA片段。这些结果表明CL是CE系统的有前途和强大的检测技术。但CL检测应用于CE系统中最大的挑战是如何在线引入一种或两种CL试剂。因此,构建适合的CL试剂引入和检测界面对CE-CL检测系统的灵敏度和分离效率具有重要影响。
在整个CE-CL系统中,接口模式对检测灵敏度和分离效率有显著影响。近年来 ,将CE与CL联用的研究工作取得了较大进展, 到目前为止,主要的接口模式有:在柱套管式、柱后套管式、柱端液池式和微芯片电泳式。Xu等设计了同轴流动柱上的CE-CL检测接口,在该CE-CL系统中使用三根毛细管。试剂毛细管通过重力将化学发光试剂输送至反应毛细管,从分离毛细管出来的分析物在反应毛细管中与化学发光试剂相遇,发生化学反应。同时在光电倍增管(PMT)和反应毛细管的检测窗口之间放置光通量调节器, CL信号在PMT中被放大,然后数据采集软件记录光电流。然而,在柱检测模式中,检测窗口始终处于电路中,这可能会存在一些由高压引起的问题。Han等实验室自组装了CE-CL系统,设计了离柱套管式检测接口,制作一个有机玻璃四通:分离毛细管和反应毛细管分别占用一个通道,其它两个通道分别由CL试剂和接地电极占用。反应毛细管的出口比另一端低2 cm,使检测样品及缓冲液等顺利流出,流向检测窗口(烧掉1cm的反应毛细管上的聚酰亚胺并放在PMT前面),用超弱发光分析仪(BPCL)采集CL信号,然后使用带有BPCL软件的计算机记录。整个CL检测系统放置在一个大的暗箱中,排除杂散光。Zhu 等在实验室建立的柱端液池式CE-CL检测系统由分离和检测两部分组成。这种检测模式不仅搭建起来简单而且灵敏度较高,但是,试剂需要按时地更换,这使操作更加繁琐。此外,该模式的分离效率可能因试剂缺乏流动效应而降低。Zhao等设计具有扩展的Y形CL检测池的玻璃/聚二甲基硅氧烷(PDMS)微芯片(MCE),由于微流体通道非常小,通常将CL试剂加入到柱后的运行缓冲液或反应介质溶液中,导致较高CL背景,因此MCE测定的检测灵敏度可能较差。
尽管研究者已开发出各种不同的CE-CL联用接口模式,但这些接口装置仍处于实验室自行加工阶段,有各自的优缺点,都不能同时解决由于CL试剂的引入而造成分离效率、灵敏度和稳定性降低等问题;所涉及的接口未考虑温度对CL反应的影响,基本没有控温装置对CL反应进行温度控制,造成CL检测的重现性和稳定性较差,也无法通过提高CL反应温度来提高检测的灵敏度。因此在还没有十分成熟的CE-CL联用仪器出现之前,开发温控、高灵敏度、高稳定性、高重现性和方便的CE-CL检测接口,扩大CE-CL技术在生物样品分析中的应用,对生命科学和生物医学的发展具有重要意义。
例如申请人在2016年1月27日提交的发明专利申请,公开一种化学发光反应的控温毛细管电泳接口,虽能一定程度上提高灵敏度,但是效果有限。
发明内容
本发明提出一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口及其制作方法,本发明制作成本低,组装方便,操作简单,以复合式结构实现了对化学发光检测温度的精准控制,提高了实验的灵敏度、重现性和稳定性。
本发明采用以下技术方案:
一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口及其制作方法,其特征在于:所述的毛细管电泳接口包括加热保温装置模块和流通池模块;所述的加热保温装置模块包括内置加热片的加热保温套、加热片盖和流通池盖;所述的流通池模块包括分离毛细管、反应毛细管、高压电极、发光试剂室;所述的分离毛细管从流通池模块的左端插入,反应毛细管从流通池模块的右端插入;所述的发光试剂室留有两个发光试剂入口,所述的高压电极与发光试剂入口相邻;流通池内的分离毛细管横向穿过发光试剂室插入到反应毛细管中,分离毛细管与反应毛细管之间留有间隙;反应毛细管插入始端与发光试剂室相通;所述的分离毛细管末端出口处的位置是检测区。
相比申请人之前的发明,本申请采用分开注入发光试剂,即化学发光试剂从两个发光试剂入口注入,在化学发光试剂室相遇混合,相比混合注入,分开注入有更高的灵敏度和重现性。
本申请还通过加热保温装置模块实现了精准、实时控制接口温度,提高了实验的灵敏度及重现性和稳定性。
作为优选,所述加热保温套材料为聚甲醛。
作为优选,所述反应毛细管为直径1.0mm的标准熔点毛细管。
作为优选,所述加热保温装置模块包裹在流通池模块外围。
本发明还提供上述接口的制作方法,依次分为以下步骤:
A1、首先从有机玻璃左端到右端横向打通一个圆柱形通道Ⅰ,使通道Ⅰ保持在中心同一条直线上,然后在流通池左端的两侧面分别钻发光试剂入口孔Ⅱ、发光试剂入口孔Ⅳ、高压电极口孔Ⅲ,然后在与通道Ⅰ垂直的平面且靠近右端部分分别打通圆柱形通道a和通道b,其中通道a为透光的检测区,通道b为胶塞放置处,通道b左边为发光试剂室;
A2、取两个硅胶塞,在其中心钻小孔,使其刚好能穿过反应毛细管;将一硅胶塞填充到通道b中阻塞通道b,另一个硅胶塞穿在反应毛细管上,然后反应毛细管从右端经过检测区插入通道Ⅰ中,使反应毛细管插入始端刚好横向穿过通道b中的硅胶塞的中心到达发光试剂室,穿在反应毛细管上的硅胶塞放置在通道Ⅰ的右端使分离毛细管处于固定且水平状态;
A3、选择合适长度且直径小于反应毛细管内径的分离毛细管和与通道Ⅰ内径相当的锥形塞,将反应毛细管穿过锥形塞的中心,把锥形塞塞入通道Ⅰ的左端,保持分离毛细管的末端悬空在反应毛细管的中间部分;
A4、取合适长度标准熔点毛细管穿上直径略大于孔Ⅱ、Ⅳ的锥形塞中,然后插入孔Ⅱ和孔Ⅳ, Pt电极也穿上硅胶塞,插入孔Ⅲ,此时各封闭的锥形塞与通道b填充的锥形塞构成发光试剂室;
作为优选,所述加热保温装置采用电阻加热片,并配有一个铂探头。
作为优选,所述发光试剂室内的发光试剂由外部医用双道微量注射泵注入。
作为优选,本发明加热保温套颜色为黑色,耐高温,并具有保温特点。
本发明采用直径约为1.0mm标准熔点毛细管为反应毛细管,透光性好,内径大,发光面广阔,提高了发光强度,组装方便,接口耐用,在组装时采用同轴方式与分离毛细管进行套接,能有效避免反应接口组装的麻烦、毛细管壁破碎、在管间隙中滞留气泡等问题。
本发明中,采用电脑控制并可随意设置待加热温度值,以1摄氏度为最小设置单位,加热精度控制在0.2摄氏度,最高可加热到70摄氏度,可以实时监控加热保温套的温度。
本发明中,流通池放入加热保温套的方形槽中,加热片放入保温套背部浅方形槽中,加热片盖固定加热片与保温套。流通池盖固定流通池与保温套,同时将整个装置固定在样品室内。
本发明中发光试剂室空间大,易于化学发光试剂的流动和更新。
本发明中,发光试剂室内的发光试剂由外部医用双道微量注射泵注入,该注入方式的速度可调节且调节精度高,注入速度不易突变,使得反应毛细管内的发光试剂流速易于同电泳速度匹配,提升化学发光反应的效果。
通过实施上述技术方案,本发明具有如下的有益效果:本发明制作成本低,组装方便,操作简单,以复合式结构实现了对化学发光检测温度的精准控制,提高了实验的灵敏度、重现性和稳定性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细说明:
附图1是加热保温装置模块中内置加热片的加热保温套、加热片盖、流通池盖的示意图;
附图2是本发明所述一种化学发光反应的控温毛细管电泳接口的结构示意图;
附图3是本发明所述接口制作过程A1步骤中的示意图;
附图4是本发明所述接口制作过程A2步骤中套有胶塞的反应毛细管的示意图;
附图5a是本发明所述接口在具体应用时,不同温度下水杨酸化学发光强度的对比示意图;附图5 b是本发明所述接口在具体应用时,不同温度下辛弗林化学发光强度的对比示意图;
附图6a、6b是本发明的接口(图6b)和对比例1(图6a)的接口的对比测试结果。
附图中:1-加热保温装置模块;2-内置加热片的加热保温套;3-加热片盖;4-流通池盖;5-流通池模块;6-通道Ⅰ;7-发光试剂入口;8-高压电极孔;9-发光试剂入口;10-分离毛细管;11-反应毛细管;12-发光试剂室;13-检测区;14-硅胶塞;15-硅胶塞;16-硅胶塞;17-高压电极;18-通道b;19-通道a。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1:
如图1、图2、图3、图4所示,一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,所述的毛细管电泳接口包括加热保温装置模块1和流通池模块5,所述的加热保温装置模块1包括内置加热片的加热保温套2、加热片盖3和流通池盖4,所述的内置加热片的加热保温套2用于加热温度,材料为聚甲醛;加热保温套形成有一个凹槽,用于放置流通池模块,所述的加热片盖3用于固定加热片并使其与加热保温套2充分接触;所述的流通池盖4用于固定流通池到保温套,同时将整个加热保温套装置固定到样品室内;所述的流通池模块5包括分离毛细管10、反应毛细管11、高压电极17、发光试剂室12,所述的分离毛细管10用于待测物的注入和分离,其从流通池的左端插入,反应毛细管11从流通池的右端插入,所述的高压电极17与发光试剂入口相邻;所述的流通池模块5内的分离毛细管10横向穿过发光试剂室12插入到反应毛细管11中,两毛细管因内径不同而留有间隙;所述的发光试剂室12留有两个发光试剂入口,反应毛细管11插入始端与发光试剂室12相通以导出发光试剂;所述的反应毛细管内部发光试剂流动方向从左到右;所述的分离毛细管10末端出口处的位置是检测区13。
所述反应毛细管11为直径约1.0mm的标准熔点毛细管。
所述加热保温装置模块1固定在流通池模块5外围。
所述接口的制作依次分为以下步骤:
A1、首先从有机玻璃(聚甲烯酸甲酯)左端到右端横向打通一个直径为4.0-10mm的圆柱形通道Ⅰ6,本实施例为4mm,使通道保持在中心同一条直线上,作为接口设计的主通道。然后在流通池左端的两侧面分别钻孔Ⅱ7、Ⅲ8、Ⅳ9(d=3.0 mm),孔Ⅱ7和孔Ⅳ9分别为发光试剂入口,孔Ⅲ8为高压电极口,然后在与孔Ⅰ垂直的平面上靠近右端部分分别打通一个直径15mm和3.0mm的圆柱形通道a19和b18,其中通道a为透光的检测区。通道b左边为发光试剂室12。
A2、取六个尺寸不一圆锥形且具有弹性的硅胶塞,三个直径略大于孔Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,两个直径略大于通道Ⅰ,一个直径略大于通道b。在胶塞中心钻小孔,使其刚好能穿过反应毛细管11。将一胶塞14填充到通道b中阻塞通道b,另一个胶塞15穿在反应毛细管11上,然后分离毛细管10从右端经过检测区13插入通道Ⅰ中,使分离毛细管10插入始端刚好横向穿过通道b中的胶塞的中心到达发光试剂室12,穿在反应毛细管11上的另一胶塞15放置在通道Ⅰ的右端使分离毛细管处于固定且水平状态。
A3、选择合适长度且直径小于反应毛细管11内径的分离毛细管10,将其穿过锥形塞16的中心,把锥形塞塞入通道Ⅰ的左端,保持分离毛细管10的末端悬空在反应毛细管11的中间部分。
A4、取合适长度标准熔点毛细管(d=1.0mm)穿上直径略大于孔Ⅱ、Ⅳ的锥形塞中,然后插入孔Ⅱ和孔Ⅳ,Pt电极17也穿上硅胶塞,插入孔Ⅲ。此时各封闭的锥形塞与通道b填充的锥形塞构成发光试剂室12。经过测试,塞紧硅胶塞的各孔不会漏液。为了塞口能够更加牢固,在各孔硅胶塞外边涂上透明玻璃胶。另外,反应毛细管的出口端用硬质塑料管导出废液。
所述加热保温装置1采用电阻加热片,并配有一个铂探头。
所述发光试剂室12内的发光试剂由外部医用双道微量注射泵注入.
采用上述接口装置的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口仪器,包括毛细管电泳高压源(±30KV,0.3mA)、双道微量注射泵、超微弱发光分析仪、弹性石英毛细管(60cm×75μm i.d)、有机玻璃、上述接口装置与外部连接若干导管、橡皮塞若干、AB胶、暗箱、色谱工作站、计算机。
将分离毛细管插入反应毛细管中,调整分离毛细管插入长度,使检测窗口恰好置于光电倍增管检测位置中心。发光试剂是通过固定在微量注射泵上的10mL注射器由外接的导管引入检测系统中,发光反应在分离毛细管检测窗口出口处发生。分离和检测都是在暗箱中进行,防止噪音和外界光源的干扰。发光信号由超微弱发光分析仪检测,并通过色谱工作站采集记录。毛细管电泳高压源提供电泳驱动使毛细管中的样品溶液运行,在电泳效应的作用下,待测成分从待测物中分离并在电场作用下朝分离毛细管的末端出口移动,进入反应毛细管中。操作者把加热保温装置放在流通池的外围,利用软件系统控制温度,使流通池被充分加热;待测物由于在分离毛细管中移动,因此不被加热,其电泳分离不受影响,待测成分在电场作用下被完全分离,由于分离毛细管末端出口位于反应毛细管内腔,因此当待测成分从分离毛细管末端出口流出时,直接与被加热的发光试剂产生化学反应而发光,操作者根据化学反应中产生的光,来对待测成分进行分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的覆盖范围。
根据查阅文献可知,酸性高锰酸钾是常用的发光试剂之一。研究表明,许多有机化合物可被高锰酸盐在酸性或碱性缓冲液中氧化,产生化学发光。基于此原理,我们利用高锰酸钾化学发光体系分析测定水杨酸和辛弗林来检测接口的性能。
利用本发明涉及的检测接口,我们成功分析了水杨酸和辛弗林在不同温度的发光强度,如附图5a和5b所示。随着温度的增加,两种物质的发光强度都有不同程度的提升,其中水杨酸的发光强度增长率(和室温26℃比较)从35℃的30%增加到65℃的102%。辛弗林的发光强度增长率(和室温26℃比较)从35℃的28%增加到65℃的413%。验证了本发明所涉及的检测接口可以通过增加检测温度来提高实验的灵敏度。在恒温45℃时水杨酸的迁移时间和峰高的日内相对标准偏差(RSD)分别为2.0% 和1.9%,日间相对标准偏差(RSD)分别为2.6% 和3.0%。在恒温55℃时辛弗林的迁移时间和峰高的日内相对标准偏差(RSD)分别为0.8% 和1.8%,日间相对标准偏差(RSD)分别为2.9% 和2.6%。证明了本发明所涉及的检测接口可以提高实验的重现性和稳定性。
对比例1:
采用申请人的专利2016100543825的电泳接口。
对本申请的接口和对比例1的接口进行对比测试,结果见附图6a和6b:
采用对比例1中电泳接口的混合注入发光试剂的方式,在240s附近出现较小的峰为醇溶剂峰,水杨酸几乎不出峰。这可能是因为混合注入CL试剂的方式,在CL试剂运输到反应毛细管的过程中,高锰酸钾一直处于酸性介质中,在到达反应区域之前大部分已经分解了,不能与水杨酸充分反应,管路的内壁也会不断地吸附高锰酸钾的分解产物,使管路内径变小,时间长了还会堵塞管路。混合注入方式比分开注入方式的基线高一倍左右,也表示高锰酸钾在与分析物反应前已经在不断分解。分开注入CL试剂的方式大大地减少了高锰酸钾在酸性介质中存在的时间,而且其在水介质中分解速度较慢。水杨酸出峰明显,说明分开注入方式具有更好的稳定性和灵敏度。
Claims (10)
1.一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:包括加热保温装置模块和流通池模块;所述的加热保温装置模块包括内置加热片的加热保温套、加热片盖和流通池盖;所述的流通池模块包括分离毛细管、反应毛细管、高压电极、发光试剂室;所述的分离毛细管从流通池模块的左端插入,反应毛细管从流通池模块的右端插入;所述的发光试剂室留有两个发光试剂入口,所述的高压电极与发光试剂入口相邻;流通池内的分离毛细管横向穿过发光试剂室插入到反应毛细管中,分离毛细管与反应毛细管之间留有间隙;反应毛细管插入始端与发光试剂室相通;所述的分离毛细管末端出口处的位置是检测区。
2.根据权利要求1所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:所述加热保温套材料为聚甲醛。
3.根据权利要求1所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:所述反应毛细管为直径1.0mm的标准熔点毛细管。
4.根据权利要求1所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:所述加热保温装置模块包裹在流通池模块外围。
5.一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口的制作方法,其特征在于:所述接口的制作依次分为以下步骤:
A1、首先从有机玻璃左端到右端横向打通一个圆柱形通道Ⅰ,使通道Ⅰ保持在中心同一条直线上,然后在流通池左端的两侧面分别钻发光试剂入口孔Ⅱ、发光试剂入口孔Ⅳ、高压电极口孔Ⅲ,然后在与通道Ⅰ垂直的平面且靠近右端部分分别打通圆柱形通道a和通道b,其中通道a为透光的检测区,通道b为胶塞放置处,通道b左边为发光试剂室;
A2、取两个硅胶塞,在其中心钻小孔,使其刚好能穿过反应毛细管;将一硅胶塞填充到通道b中阻塞通道b,另一个硅胶塞穿在反应毛细管上,然后反应毛细管从右端经过检测区插入通道Ⅰ中,使反应毛细管插入始端刚好横向穿过通道b中的硅胶塞的中心到达发光试剂室,穿在反应毛细管上的硅胶塞放置在通道Ⅰ的右端使分离毛细管处于固定且水平状态;
A3、选择合适长度且直径小于反应毛细管内径的分离毛细管和与通道Ⅰ内径相当的锥形塞,将反应毛细管穿过锥形塞的中心,把锥形塞塞入通道Ⅰ的左端,保持分离毛细管的末端悬空在反应毛细管的中间部分;
A4、取合适长度标准熔点毛细管穿上直径略大于孔Ⅱ、Ⅳ的锥形塞中,然后插入孔Ⅱ和孔Ⅳ,Pt电极也穿上硅胶塞,插入孔Ⅲ,此时各封闭的锥形塞与通道b填充的锥形塞构成发光试剂室。
6.根据权利要求1所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:所述加热保温装置采用电阻加热片,并配有一个铂探头。
7.根据权利要求1所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用的接口,其特征在于:所述发光试剂室内的发光试剂由外部医用双道微量注射泵注入。
8.根据权利要求5所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用接口的制作方法,其特征在于:通道Ⅰ的直径为4.0-10mm。
9.根据权利要求5所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用接口的制作方法,其特征在于:在各孔硅胶塞外边涂上透明玻璃胶。
10.根据权利要求5所述的一种温度控制毛细管电泳-化学发光联用接口的制作方法,其特征在于:反应毛细管的出口端用硬质塑料管导出废液。
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