CN1469123A - 一种蛋白质分析用微流控芯片及其在蛋白质分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：该芯片由四个基本单元顺序连接构成，每上一个基本单元的出样端与下一个基本单元的进样端相接；第一个基本单元为蛋白质的等电聚焦分离单元；第二个基本单元为蛋白质的筛分电泳单元，筛分介质选自纤维素、琼脂糖的有机聚合物；第三个基本单元为蛋白质的蛋白酶酶解单元，微通道全部或部分内壁键合特异性蛋白酶或填充带有特异性蛋白酶的填料；第四个基本单元为蛋白质的酶解产物到质谱的输送的接口单元。用本发明芯片对蛋白质进行分析能够在短的时间内获取大量信息，并且操作简单。
Description
技术领域：
本发明涉及蛋白质的分析技术，特别提供了一种专门用于蛋白质分析的微流控芯片。
背景技术：
蛋白质组的研究是后基因组时代的基本任务之一。蛋白质组学研究的发展更多地依赖分析手段的发展，目前用于蛋白质分析的主要技术为二维凝胶电泳、计算机图象分析、蛋白质鉴定技术、高效液相色谱、毛细管电泳等。在生物学上应用最广的是二维凝胶电泳，该方法虽然比较成熟，但由于不能实行自动化操作、以及由于技术本身的原因而不能进行高电场下的分析，整个分析过程烦琐而耗时，而且该方法定量不准确。
蛋白质的鉴定技术主要有氨基酸序列分析，组成分析、肽质量指纹谱，这些要求蛋白质样品是单一样品，并且纯度要求很高，而蛋白质纯化本身就是一个非常复杂的过程。
高效液相色谱虽然可以进行较快速的分析，但是该技术是基于蛋白质在固定相中的保留不同进行分析的，这意味着蛋白质间的分析是基于蛋白质的疏水性的差别进行分离的，且不能同时进行多样品分离，这对于大量蛋白质样本的分析是不够的。
在毛细管电泳的各种分离模式中，适合蛋白质分析的模式主要是等电聚焦电泳和有胶或者无胶筛分电泳，它们分离的原理分别是基于蛋白质的等电点和分子大小不同进行分析的，是基于具有相同等电点的蛋白质不可能具有相同的分子尺寸。将二者联接起来进行蛋白质的二维毛细管电泳是最佳的分析方法，但是在两根毛细管柱联接是需要专业人员操作，不具有普遍性，对于蛋白质组的研究是非常的不利的。
目前使用的蛋白质的分析手段，主要是对蛋白质样品进行分离分析，得到样品的一维信息，要得到较多的信息需要多种分析手段结合使用，比如将蛋白质分离后，进行蛋白质的收集，将收集得到的蛋白质进行蛋白酶的酶水解，主要使用特异性的蛋白酶，得到的水解产物(主要是肽片段)进行分离分析，主要采用高效液相色谱/质谱，毛细管电泳/质谱，质谱进行分析，这样的过程比较烦琐，且有很多过程不能实现自动化，而要耗费很长的时间。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种蛋白质分析用微流控芯片，用该芯片对蛋白质进行分析能够在短的时间内获取大量信息，并且操作简单。
本发明提供了一种蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：该芯片由四个基本单元顺序连接构成，每上一个基本单元的出样端与下一个基本单元的进样端相接；
第一个基本单元为蛋白质的等电聚焦分离单元；
第二个基本单元为蛋白质的筛分电泳单元，筛分介质选自纤维素、琼脂糖的有机聚合物；
第三个基本单元为蛋白质的蛋白酶酶解单元，微通道全部或部分内壁键合特异性蛋白酶或填充带有特异性蛋白酶的填料；
第四个基本单元为蛋白质的酶解产物到质谱的输送的接口单元。
本发明蛋白质分析用微流控芯片中，基本单元可以选择最为简单的十字交叉结构。第三个基本单元可以具有多个通道。
本发明蛋白质分析用微流控芯片中，蛋白酶为任何已知的和未知的特异性蛋白酶，可以选自选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
本发明蛋白质分析用微流控芯片材料为可以石英、玻璃、或者PMMA、PDMS聚合物。
本发明蛋白质分析用微流控芯片中，第一个和或第二个基本单元最好是被修饰的。对于石英或者玻璃芯片可以进行静态修饰，即将有机聚合物或者蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白质有牛血清白蛋白；或者进行动态修饰，即在缓冲液中加入添加剂，主要是表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。对于塑料芯片进行表面修饰，包括等离子体处理、光照射处理的物理方法，或者亲水或者疏水性处理的化学方法。
本发明蛋白质分析用微流控芯片可以用于氨基酸序列分析、组成分析、肽质量指纹谱等任何蛋白质的分析。
应该指出，蛋白质的分离分析技术、酶解分析技术都已经是较为成熟的技术，本发明将等电聚焦分离和筛分电泳分离的二维分离技术与酶解分析技术两者有机地结合于一个微流控芯片上，由于微流控芯片众所周知的优点，使蛋白质的分析更为快速便捷、准确可靠。
附图说明：
图1为一种结构的蛋白质分析用微流控芯片原理示意；
图2为另一种结构的蛋白质分析用微流控芯片原理示意；
图3为实施例1母鸡卵白蛋白芯片电泳谱图；
图4为实施例2火鸡卵白蛋白芯片电泳谱图。
具体实施方式；
芯片设计如图1、2所示，材料为石英、玻璃、任何有机材料如PMMA、PDMS等等。整个芯片集成了四个基本单元，第一个基本单元为蛋白质的第一维分离，由进样通道和分离通道构成的十字交叉结构组成，进行蛋白质的等电聚焦分离；第二个基本单元为蛋白质的第二维分离，同样由进样通道和分离通道构成的十字交叉结构组成，其中进样通道与第一个基本单元的分离通道相交叉形成十字结构，以用于第一维样品向第二维引进的接口，进行蛋白质的筛分电泳分析，筛分介质为各种形式的有机聚合物，如纤维素、琼脂糖等；第三个基本单元为蛋白质的蛋白酶酶解单元，由内壁键合蛋白酶的微通道或者填充带有蛋白酶的填料的一系列的微通道与第二各基本单元中的分离通道相交叉形成的十字结构组成，该微通道部分被涂层或者被填充，根据样品的复杂性程度确定所需要的通道的数目，复杂样品可以将第二个基本单元分离得到的不同的样品引进不同的通道，防止由于样品过于复杂，在酶解过程中造成混乱；第四个单元是酶解产物到质谱的输送，主要由第三个基本单元的微通道与质谱联接的接口构成，质谱为各种形式的质谱。在第一、第二个基本单元的通道内进行蛋白质的分析，需要进行各种形式的表面修饰，以防止蛋白质在通道内壁的吸附，第三个基本单元内的通道可以不进行修饰，也可以进行修饰，可以根据要分析样品的形式来确定。修饰过程可是任何形式的物理或者化学修饰。对于石英和玻璃芯片修饰方法主要有静态和动态两种修饰方法，静态修饰主要是指将一些有机聚合物或者某些蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白质有牛血清白蛋白等。动态修饰重要是指在缓冲液中加一些添加剂，主要是一些表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂等。对于塑料芯片的表面修饰，主要是物理或者化学方法，物理方法有等离子体处理、光照射处理等，化学方法主要是根据材料的不同对通道表面进行亲水或者疏水性处理。
实施例1：
以母鸡卵白蛋白为例，该蛋白质的分子量为43kDa，由386个氨基酸组成。使用的芯片为按图1设计的芯片，材料为石英，通道尺寸为50μm×20μm，第一、第二单元中的通道用线性聚丙烯酰胺修饰，第三单元中的通道中，在十字交叉到出口端的方向的通道上用胰蛋白酶进行修饰。100mg/mL的母鸡卵蛋白质在进行第一单元的分析，进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，选用的缓冲液为20mmol/L氢氧化钠和4％甲基纤维素溶液为阴极电解质，100mmol/L磷酸作为阳极电解质，进样中进样电场为200V/cm，分离电场为260V/cm，时间大约需要60秒；然后在电场作用下部分样品进入第二单元，第二单元中进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，通道中注入2％聚丙烯酰胺凝胶，缓冲液为20mmol/L的硼砂和2％SDS，进入，进样电场为260V/cm，分离电场为260V/cm，该过程需要80秒；样品在电场的作用下进入第三单元，第三单元的进样通道为0.5厘米，酶水解通道为7厘米，进样电场为260V/cm，分离电场为200V/cm，缓冲液为磷酸盐溶液(67mmol/L、pH7.6)和1mmol/L荧光胺，该过程大约需要200秒，荧光胺对得到的肽段进行标记，激光诱导荧光检测，得到的芯片电泳图谱如图3所示。
实施例2.
利用火鸡卵白蛋白做样品，该蛋白质的分子量为43kDa，也是由386个氨基酸组成，有36个氨基酸与母鸡卵白蛋白不同。使用的芯片为按图1设计的芯片，材料为石英，通道尺寸为50μm×20μm，第一、第二单元中的通道用线性聚丙烯酰胺修饰，第三单元中的通道中，在十字交叉到出口端的方向的通道上用胰蛋白酶进行修饰。100mg/mL的火鸡卵蛋白质在进行第一单元的分析，进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，选用的缓冲液为20mmol/L氢氧化钠和4％甲基纤维素溶液为阴极电解质，100mmol/L磷酸作为阳极电解质，进样中进样电场为200V/cm，分离电场为260V/cm，时间大约需要60秒；然后在电场作用下部分样品进入第二单元，第二单元中进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，通道中注入2％聚丙烯酰胺凝胶，缓冲液为20mmol/L的硼砂和2％SDS，进入，进样电场为260V/cm，分离电场为260V/cm，该过程需要80秒；样品在电场的作用下进入第三单元，第三单元的进样通道为0.5厘米，酶水解通道为7厘米，进样电场为260V/cm，分离电场为200V/cm，缓冲液为磷酸盐溶液(67mmol/L、pH7.6)和1mmol/L荧光胺，该过程大约需要200秒，荧光胺对得到的肽段进行标记，激光诱导荧光检测，得到的芯片电泳图谱如图4所示。
实施例3.
以牛血清白蛋白、转铁蛋白和刀豆球蛋白A混合物为样品，它们的等电点分别为5.82、7.31和5.42；分子量分别为69.3kDa、35.8kDa和10.6kDa。样品为200mg/L，所使用的芯片为按图1所设计的芯片，材料为石英，通道尺寸为50μm×20μm，第一、第二单元中的通道用线性聚丙烯酰胺修饰，第三单元中的通道中，在十字交叉到出口端的方向的通道上用胰蛋白酶进行修饰。第一单元中进样通道为0.5厘米，分离通道为4厘米，以20mmol/L氢氧化钠和4％甲基纤维素溶液为阴极电解质，100mmol/L磷酸作为阳极电解质，形成电泳梯度是的电场为600V/cm，进样电场为300V/cm，分离电场为400V/cm，转铁蛋白和其他两个蛋白可以分开，而牛血清白蛋白和刀豆球蛋白不能完全分开，出峰顺序为转铁蛋白、牛血清白蛋白和刀豆球蛋白，此过程可以在80秒内完成。三种蛋白质在电场的作用下进入第二单元，进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，进样电场为400V/cm，分离电场为260V/cm，运行缓冲液为CE-SDS筛分分离运行缓冲液(Bio-Rad)，牛血滑白蛋白和刀豆球蛋白逐渐拉开，分子量较大的牛血清白蛋白在后，刀豆球蛋白在前，整个过成在100秒内完成；在电场的作用下三种蛋白质引入第三单元的三个酶解通道中进行胰蛋白酶酶水解，进样通道为0.5厘米，酶水解通道为7厘米，进样电场为260V/cm，分离电场为200V/cm，使得蛋白质充分的酶解，缓冲液为磷酸盐溶液(67mmol/L、pH7.6)同时控制电压使得三个通道中的蛋白质的酶解产物顺序进入质谱，进行分析，该过程在一个小时内完成，所得到的结果与实际相符合。
实施例4.
牛血清白蛋白、转铁蛋白和刀豆球蛋白A混合物为样品，它们的等电点分别为5.82、7.31和5.42；分子量分别为69.3kDa、35.8kDa和10.6kDa。样品为200mg/L，所使用的芯片为按图2所设计的芯片，材料为石英，通道尺寸为50μm×20μm，第一、第二单元中的通道用线性聚丙烯酰胺修饰，第三单元中的通道未进行处理，三个收集孔用胰蛋白酶进行修饰，三个收集孔为直径为100μm、深为100μm的孔。第一单元中进样通道为0.5厘米，分离通道为4厘米，以20mmol/L氢氧化钠和4％甲基纤维素溶液为阴极电解质，100mmol/L磷酸作为阳极电解质，形成电泳梯度是的电场为600V/cm，进样电场为300V/cm，分离电场为400V/cm，转铁蛋白和其他两个蛋白可以分开，而牛血清白蛋白和刀豆球蛋白不能完全分开，出峰顺序为转铁蛋白、牛血清白蛋白和刀豆球蛋白，此过程可以在80秒内完成。三种蛋白质在电场的作用下进入第二单元，进样通道为0.5厘米，分离通道为2厘米，进样电场为400V/cm，分离电场为260V/cm，运行缓冲液为CE-SDS筛分分离运行缓冲液(Bio-Rad)，牛血清白蛋白和刀豆球蛋白逐渐拉开，分子量较大的牛血清白蛋白在后，刀豆球蛋白在前，整个过成在100秒内完成；在电场(260V/cm)的作用下三种蛋白质分别引进三个收集孔，该过程的缓冲液为67mmol/L磷酸盐溶液(Ph7.6)。经两次重复前面步骤，放置3分钟，依次在三个收集孔到该单元的十字交叉方向上施加400V/cm电场10秒，转到分离模式，施加电场260V/cm，进行质谱分析，该过程在2个小时内完成，得到的结果与实际结果相符。
Claims (10)
1、一种蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：该芯片由四个基本单元顺序连接构成，每上一个基本单元的出样端与下一个基本单元的进样端相接；
第一个基本单元为蛋白质的等电聚焦分离单元；
第二个基本单元为蛋白质的筛分电泳单元，筛分介质选自纤维素、琼脂糖的有机聚合物；
第三个基本单元为蛋白质的蛋白酶酶解单元，微通道全部或部分内壁键合特异性蛋白酶或填充带有特异性蛋白酶的填料；
第四个基本单元为蛋白质的酶解产物到质谱的输送的接口单元。
2、按照权利要求1所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：所述基本单元为十字交叉结构。
3、按照权利要求2所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元具有多个通道。
4、按照权利要求1所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：所述特异性蛋白酶，选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
5、按照权利要求1所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：所述芯片材料为石英、玻璃、或者PMMA、PDMS聚合物。
6、按照权利要求1所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：所述第一个和或第二个基本单元是被修饰的。
7、按照权利要求6所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：对于石英或者玻璃芯片进行静态修饰，将有机聚合物或者蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白质有牛血清白蛋白。
8、按照权利要求6所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：对于石英或者玻璃芯片进行动态修饰，在缓冲液中加入添加剂，主要是表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。
9、按照权利要求6所述蛋白质分析用微流控芯片，其特征在于：对于塑料芯片进行表面修饰，包括等离子体处理、光照射处理的物理方法，或者亲水或者疏水性处理的化学方法。
10、权利要求1所述蛋白质分析用微流控芯片用于氨基酸序列分析、组成分析、肽质量指纹谱。
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