CN101393124A - 一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法 - Google Patents

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林炳承
於林芬
吴大朋
秦建华
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Abstract

本发明提供了一种基于微流控芯片的简单、快速、高通量地单细胞内涵物分析方法：即十字型PDMS芯片，经过环氧聚合物涂层处理完全后抑制了通道表面电渗流，细胞在静压力作用下进样，在十字交叉口受到电场力作用偏转入分离通道，然后在背景缓冲液中SDS作用下在0.5s内快速裂解，释放出的内涵物经电泳分离，激光诱导荧光检测。相对于现有技术而言，本发明具有简单、快速和通量高的优点，可以从细胞水平上研究生命活动的本质，有检测活性周期较短的不稳定中间产物的可能性，了解生命活动的本质，为疾病早期诊断和生命科学提供更好和更多的有用信息。

Description

一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法
技术领域：
本发明主要涉及在十字型经过涂层无电渗流的PDMS芯片上简单地实现高通量细胞内涵物分析的方法。
背景技术：
传统的分析细胞内涵物方法以大量细胞为前提，获取某一内涵物(例如蛋白质，核酸等)含量的总值，由该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该物质的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受；但在另外一些场合下，如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时传统的方法将会平均掉该特异变化。因此，单个细胞层面的分析有助于疾病的早期诊断。此外，与传统的方法相比，单细胞分析在信息的获取上相对准确，能检测活性周期较短的不稳定中间产物。
从技术角度来看，单个细胞的分析可以分为完整的单细胞分析和破碎的单细胞分析。本发明仅涉及到后一种技术。在该技术中影响单细胞分析的一个瓶颈问题是如何快速、有效裂解细胞。目前用于芯片的细胞裂解的方法主要有化学试剂融膜法、Tesla线圈融膜法[文献J.chromatogr.B：Biomed.Appl.1996.677，233-240]、脉冲激光融膜法[Anal.Chem.1998.70，4570-4577]、超声融膜法[Anal.Chem.2000，72，318-322]以及脉冲交变电压法[Anal.Chem.2003，75，5646-5655]等，但这些方法大多仪器设备昂贵，操作复杂，很难与后续的电泳分离检测耦联，通量低等。目前文献已经报道的基于微流控芯片的在线快速细胞融膜方法主要有Ramsey等报道的脉冲交流电叠加直流电的方法快速细胞融膜法[Anal.Chem.2003，75，5646-5655]，以及方肇伦等报道的通过几组低电压的切换将细胞沉积在通道壁上，然后结合高PH值缓冲液和高电压的快速细胞融膜法[Lab on a Chip.2004，4，47-52]。在细胞融膜法中化学试剂法(最常用的是SDS)是最简单的，不需要其它设备。目前已有文献报道微流控芯片SDS裂解细胞[Electrophoresis，2000，21，767-773.；Electrophoresis，2005，26，3689-3696；Proceedings of the Ieee，2004，92，115-125；J Chromatogr A，2006，1117，228-233]，其裂解时间为2～30s；而对于细胞内酶控制的反应其反应分子浓度会在小于1s内发生1个数量级以上变化[Nature，1993，361，315-325]，主要是由于激酶和磷酸酯酶将细胞外信号传导入细胞内激发这类酶控制的反应，对于检测这类信号传导过程中反应分子的浓度，就需要在1s内快速裂解细胞并阻止反应发生。虽然脉冲激光法和脉冲交变电压的方法能快速裂解细胞，但这两种方法都需要复杂昂贵的设备，且操作比较繁琐，需要实时观察，分析通量低等。本发明在简单的十字型PDMS芯片上经过环氧聚合物涂层修饰的方法[Dapeng Wu，Jianhua Qin and Bingcheng Lin；Lab ona chi Advance Articles DOI：10.1039/b708877a]完全抑止电渗流的情况下，细胞在微通道内能被0.2％SDS在500ms左右快速裂解。而细胞在有电渗流存在的微通道中，20～30s也并完全裂解。通过染料分子模拟SDS分子在有无电渗流的微通道中的分布的情况，发现细胞快速裂解的主要原因是：在有电渗流存在时，分离通道中的荧光强度立刻减弱即背景缓冲液中的SDS分子随着电渗流快速整体前移，很少SDS分子扩散到细胞周围；而在无电渗流存在时，分离通道中的荧光强度逐渐减弱，SDS分子在细胞周围的浓度比较高，造成细胞快速裂解。基于这种简单、快速、高效的SDS细胞裂解，结合激光诱导荧光的高灵敏度检测，本发明测得了K562细胞内的谷光苷肽和罗丹明123。在细胞浓度5×106cells/mL下，其分析通量可达到每分钟8～15个细胞。
发明内容：
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，该方法可以简单、快速、高通量地分析单细胞内涵物。
本发明提供了一种使用微流控芯片简单、快速、高通量的单细胞内涵物分析方法；
所述的微流控芯片为十字型聚二甲基硅氧烷PDMS芯片，由细胞池、空池、缓冲池、废液池构成；
方法过程为：
将十字型PDMS芯片放入等离子体中进行等离子化处理，然后快速取出不可逆封接，加入环氧聚合物涂层液，室温静置10～30分钟，抽干后放入80～120℃烘箱10～30分钟，然后水洗保存备用；
将细胞预标记上染料，与荧光染料孵育10～60分钟，然后用磷酸缓冲液PBS清洗两次，重新悬浮于PBS中，使细胞液的浓度控制在1×106～5×106cells/mL范围内，使单个细胞连续进样；
将细胞悬浮液加入到细胞池中，在缓冲液池和废液池中加入等量的0.1％～0.4％十二烷基磺酸钠SDS的硼酸缓冲液，空池中不加缓冲液；
细胞悬浮液在静压力作用下从细胞池流向空池，在十字交叉口处受到水平方向电场力的作用偏转入分离通道；
细胞在分离通道中在SDS作用下快速裂解，释放出内涵物，内涵物经电泳分离并采用激光焦斑检测，从而实现了对细胞内涵物的分析。
本发明提供的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，所述的细胞液的浓度范围为1×106～5×106。
本发明提供的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，所述的水平方向的电场范围为300～800伏/厘米。
本发明提供的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，所述的十二烷基磺酸钠的细胞裂解试剂的浓度范围为0.1％～0.4％。
本发明提供了用于单细胞内涵物分析方法的微流控芯片，所述的微流控芯片为十字型PDMS芯片，其垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池，缓冲池和废液池的两端分别接高电压和接地。
本发明提供的微流控芯片，所述的十字型PDMS芯片表面经环氧聚合物涂层处理，方法参见文献[Dapeng Wu，Jianhua Qin and Bingcheng Lin；Labon a chi Advance Articles DOI：10.1039/b708877a]，涂层后芯片电渗流基本为零。在无电渗流的微通道中，SDS分子不会随着电渗流整体前移，而是与细胞悬浮液充分混合，从而细胞周围的SDS分子浓度较高，使细胞快速裂解。
本发明与现有的液相色谱、核磁共振、微孔板等手性选择剂筛选方法相比，具有直接、快速、操作简单和样品用量少等优势。
总之，本发明可在一块简单的十字型PDMS芯片上，无需其它复杂的单细胞捕获或裂解装置，仅用化学试剂SDS即可在亚秒内快速裂解细胞，实现单细胞的连续分析，且分析通量可以达到8～15个细胞，10分钟内可分析上百个细胞；相对于现有技术而言，本发明具有简单、快速和通量高的特点，可以从单细胞水平上研究细胞内重要物质的变化，有检测活性周期较短的不稳定中间产物的可能性，了解生命活动的本质，为疾病早期诊断和生命科学提供更好和更多的有用信息。
附图说明：
图1为微流控芯片结构示意图；
图2为细胞裂解示意图；
图3为染料分子罗丹明123在微通道中的流型分布图，其中A为无电压时在静压力作用下的夹流进样的流型图；B为在有电渗流情况下通道中罗丹明123分布图；C为在无电渗流情况下通道中罗丹明123分布图；
图4为细胞内罗丹明123的电泳图谱；
图5为细胞内罗丹明123和谷光甘肽的电泳图谱。
具体实施方式：
新制的PDMS芯片和洗净的载玻片，放入等离子体中，冲入氧气等离子化1s后快速取出，迅速不可逆封接，往缓冲池中加入环氧聚合物涂层液，静置15分钟后，抽干，放入到110度烘箱烤10分钟后取出，水洗5分钟后保存备用。细胞用5×10-6M的Rh-123和1×10-4MNDA孵育30分钟后，用PBS清洗两遍，最后细胞浓度控制在1×106～5×106cells/mL，重新悬浮在PBS中备用。水平分离通道的缓冲池和废液池中各加入10ul20mM硼酸缓冲液(内含0.2％SDS)，在细胞池中加入10ul细胞悬浮液，细胞废液池放空，细胞在静压力作用下流向空池，在分离通道两端分别施加1200V或1500V电压，此时细胞在电场作用下偏转入分离通道被SDS快速融解，释放出的罗丹明123和谷光苷肽在电压驱动下流过激光焦斑，激光波长473nm，激发的荧光由光电倍增管收集。
实施例1 检测K562细胞内预先标记的罗丹明123染料分子
本实验所用芯片为图1所示十字型PDMS芯片，通道宽70μm，深25μm，长3cm。将10μL 20mM硼酸缓冲液(内含0.2％SDS)加入缓冲池和废液池中，在细胞池中加入10μL细胞悬浮液，细胞废液池放空，细胞在静压力作用下向空池流动，在分离通道两端分别施加1200V，在距离十字交叉口1cm处激光诱导荧光检测，结果见图4。从图中可以看出，在350秒内测得了40多个细胞，显示了较高的通量。
实施例2分离与检测K562细胞内的Rh-123和GSH
本实施例实施过程与实施例1基本一致，区别在于分离电压变为1500V，检测距离增加到2.2cm，检测结果见图5，从图中可以看出，可见Rh-123和GSH达到了基线分离。

Claims (6)

1、一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，其特征在于：使用专用的微流控芯片分析单细胞内涵物；
所述的微流控芯片为十字型PDMS芯片，由细胞池、空池、缓冲池、废液池构成；
方法过程为：
将十字型PDMS芯片放入等离子体中进行等离子化处理，然后快速取出不可逆封接，加入环氧聚合物涂层液，室温静置10～30分钟，抽干后放入80～120℃烘箱10～30分钟，然后水洗保存备用；
将细胞预标记上染料，与荧光染料孵育10～60分钟，然后用磷酸缓冲液PBS清洗两次，重新悬浮于PBS中，使细胞液的浓度控制在1×106～5×106cells/mL范围内，使单个细胞连续进样；
将细胞悬浮液加入到细胞池中，在缓冲液池和废液池中加入等量的0.1％～0.4％十二烷基磺酸钠SDS的硼酸缓冲液，空池中不加缓冲液；
细胞悬浮液在静压力作用下从细胞池流向空池，在十字交叉口处受到水平方向电场力的作用偏转入分离通道；
细胞在分离通道中在SDS作用下快速裂解，释放出内涵物，内涵物经电泳分离并采用激光焦斑检测，从而实现了对细胞内涵物的分析。
2、按照权利要求1所述的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，其特征在于：所述的细胞液的浓度范围为1×106～5×106cells/mL。
3、按照权利要求1所述的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，其特征在于：所述的水平方向的电场范围为300～800伏/厘米。
4、按照权利要求1所述的基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，其特征在于：所述的SDS的硼酸缓冲液的浓度范围为0.1％～0.4％。
5、一种权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片为十字型PDMS芯片，其垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池，缓冲池和废液池的两端分别接高电压和接地。
6、按照权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于：所述的十字型PDMS芯片经过环氧聚合物涂层处理后，抑制了通道表面的电渗流。
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