CN109765163A - 一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系统及方法 - Google Patents

Abstract

一种集成化的液滴微流控‑质谱联用的分析系统及方法，该系统包括进样模块、微流控芯片、打印模块、微阵列芯片、废液池和质谱仪；细胞样品通过所述的进样模块进入到微流控芯片中进行裂解、萃取等处理；通过微流控芯片处理后得到的单细胞待分析物经过打印模块后以液滴的形式打印在微阵列芯片上，得到的细胞残液直接被收集到废液池中，最后将微阵列芯片送入质谱仪进行分析，进而得到单细胞的信息。本发明能够在强干扰基质溶液环境下实现对单细胞的封装、待分析物的提取、分离、打印、质谱高效分析。本发明可以检测出常规质谱分析中因盐的抑制而无法检测到的单细胞信息，适用于自动化、高通量、强干扰基质环境下单细胞的质谱分析和鉴定。

Description

一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系统及方法

技术领域

本发明涉及一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系统及方法，特别适用于在强干扰 基质下活单细胞的高通量的分析与检测，属于质谱分析技术领域。

背景技术

细胞是所有生物体的基本结构和繁殖单位。不同种群的细胞在形状，大小，密度，质量 等诸多方面都存在明显的差异性。即使是同种细胞，在单细跑层级也存在着诸多差别，如基 因和蛋白质表达，细胞增殖，自我更新和凋亡等方面。而对这些差别对细胞药物代谢、细胞 亚群鉴定、细胞-细胞通讯、疾病发病机理的研究具有极其重要的意义。

研究者将研究重心集中在单细胞上，诸多技术也逐渐被开发出来。其中以荧光技术最为 成熟，目前已经报道了许多基于荧光检测的集成系统应用于单细胞的分析。但是，由于光谱 带宽的限制，用荧光探针很难同时检测多种成分。相比之下，质谱法作为一种无标记技术， 可以同时检测多种组分，甚至提供未知分子的结构信息。因此将其用在单细胞水平进行多重 分析是至关重要的。但是，质谱对小分子的盐类较为敏感，同时，样品中的盐类也可能会通 过分子缔合和配位形成复杂的化合物，使得目标化合物很难在质谱中被检测出来。尤其是磷 酸盐缓冲液(PBS)作为细胞培养、保存的重要液体环境，可以稳定保持细胞内外渗透压平衡， 是单细胞活体分析的首选试剂，但是其对质谱分析的影响最大，尤其是涉及到单细胞水平的 小体积样品的检测，干扰更为明显。

用于除去样品中盐分子的影响的方法有很多，如液相色谱(LC)，毛细管电泳(CE)和固相 微萃取(SPME)等。但是，这些方法常会遇到洗脱过程导致样品稀释，不适用于单细胞这种 超小体积样品的检测，除盐效率低，需要大量的人为干预，萃取液的体积精确调控，很难做 到高通量等问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提出一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系 统及方法，可以解决现有质谱分析技术无法在强干扰基质(如PBS)环境下对单细胞进行高通 量自动分析的问题。

本发明的技术方案如下：

一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析系统，其特征在于，该系统含有进样模块、微流 控芯片、打印模块、微阵列芯片、废液池和质谱分析仪；所述的微流控芯片含有第一入口通 道、第二入口通道、第三入口通道、三相流产生结构、蛇形萃取结构和三相流分离结构；第 一入口通道、第二入口通道和第三入口通道的一端分别与三相流产生结构连通，所述三个入 口通道的另一端分别通过导管与进样模块的三个输入连接；所述三相流产生结构通过蛇形萃 取结构与三相流分离结构连接；三相流分离结构分别通过萃取液出口通道和单细胞废弃物出 口通道与打印模块连接，打印模块分别通过细胞待测分析物出口通道和废液出口通道与所述 的微阵列芯片和废液池连接；微阵列芯片通过转接板与所述的质谱分析仪连接。

本发明的另一技术特征在于，第一入口通道和第二入口通道的一端分别通过第一S形流 道和第二S形流道与三相流产生结构连通；所述第三入口通道的一端通过柱状微阵列与三相 流产生结构连通。

本发明所述的三相流分离结构由亲水区和疏水区两部分组成。所述微阵列芯片采用圆孔 阵列排布方式，圆孔直径100-300μm，圆孔中心间距450-600μm。

本发明提供的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析方法，其特征在于该方法包括如 下步骤：

1)萃取液、隔断液和细胞悬浮液分别通过进样模块的第一输入、第二输入和第三输入进 入微流控芯片的第一入口通道、第二入口通道和第三入口通道中；三种液体在微流控芯片的 三相流产生结构内形成三相流液体；

2)三相流液体进入蛇形萃取结构中，并在该结构内完成细胞的在线裂解、萃取；

3)经裂解、萃取后的三相流进入三相流分离结构，在拉普拉斯压力和芯片出入口的压力 差的共同作用下，萃取液、细胞悬浮液和隔断液在该区域被高效分离，分离后的萃取液经萃 取液出口通道流出，细胞残液经单细胞废弃物出口通道流出，隔断液在三相流分离结构处则 被均匀分至萃取液出口通道和单细胞废弃物出口通道中，萃取液出口通道流出的为萃取液和 隔断液的两相流，单细胞废弃物出口通道流出的为细胞悬浮液和隔断液的两相流；

4)从萃取液出口通道流出的两相流通过打印模块的细胞待测分析物出口通道后以液滴的 形式打印在微阵列芯片上；从单细胞废弃物出口通道流出的两相流经过废液出口通道后直接 被收集到废液池中；

5)经打印处理后含有单细胞待分析物的微阵列芯片放置转接板的卡槽内，随后喷加基质 待其表面形成结晶后，送入质谱仪进行分析。

优选地，所述的隔断液为氟硅油溶液，萃取液是辛醇和乙腈的混合溶液。

本发明由于采用以上技术方案，具有以下优点及突出性的技术效果：①本发明涉及到的 系统集单细胞封装、细胞待分析物的提取、分离、打印、质谱高效检测于一体，可以实现在 强干扰基质溶液环境下对单细胞的高通量分析；②本发明涉及到的系统可以检测出常规质谱 分析中因盐的抑制而无法检测到的单细胞信息(信噪比SNR<3)；③本发明涉及到的微流控芯 片可以实现44％的细胞封装率，其中单细胞封装效率可达88％，具有极高的单细胞封装效率； ④本发明涉及到的微流控芯片采用三相流，可以消除相邻单细胞在微流控芯片中处理过程中 发生的串扰的问题；⑤本发明涉及到的多孔微阵列芯片，可以抑制溶剂在结晶过程中的扩散， 保证单细胞待分析物的浓度，从而提高分析灵敏度；⑥本发明涉及到的系统的单细胞处理速 度快，每秒可对3-4个单细胞物质进行处理，打印。

附图说明

图1是本发明的分析系统的结构示意图。

图2是本发明的微流控芯片整体结构示意图。

图3是本发明的微流控芯片三相流分离结构示意图。

图4是本发明的打印模块示意图。

图5是微阵列芯片结构示意图。

图6a是利用本发明涉及到的系统进行分析得到的单细胞质谱信号图；图6b是采用常规 的实验室分析手段得到的单细胞质谱信号图。

图中：1-进样模块；101-第一输入；102-第二输入；103-第三输入；2-微流控芯片；201- 第一入口通道；203-第二入口通道；202-第三入口通道；204-萃取液出口通道；205-单细胞 废弃物出口通道；208-柱状微阵列；209-第一S形流道；210-第二S形流道；211-三相流产 生结构；212-蛇形萃取结构；213-三相流分离结构；214-疏水区；215-亲水区；3-打印模块； 303-细胞待测分析物出口通道；304-废液出口通道；4-微阵列芯片；401-凹槽；402-转接板； 5-废液池；6-质谱仪。

具体实施方式

本发明提供的一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系统及方法，能够在强干扰基质 溶液环境下实现对单细胞的高通量分析。此外，在本发明的描述中术语“上”、“下”等指示 的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,“第一”、“第二”等仅用于描述数量和 目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性。下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明的一种集成化的液滴微流控-质谱联用的分析系统，该分析系统含有 进样模块1、微流控芯片2、打印模块3、微阵列芯片4、废液池5和质谱分析仪6；所述的 微流控芯片2含有第一入口通道201、第二入口通道202、第三入口通道203、三相流产生结 构211、蛇形萃取结构212和三相流分离结构213；第一入口通道201、第二入口通道202和第三入口通道203的一端分别与三相流产生结构211连通，所述三个入口通道的另一端分别通过导管与进样模块1的三个输入连接；所述三相流产生结构211通过蛇形萃取结构212与三相流分离结构213连接；三相流分离结构213分别通过萃取液出口通道204和单细胞废弃物出口通道205与打印模块3连接，打印模块分别通过细胞待测分析物出口通道303和废液出口通道304与所述的微阵列芯片4和废液池5连接；微阵列芯片4通过转接板402与所述 的质谱分析仪6连接。细胞样品通过进样模块1进入到微流控芯片2中进行裂解、萃取等处 理；通过微流控芯片2处理后得到的单细胞待分析物经过打印模块3后以液滴的形式打印在 微阵列芯片4上，通过微流控芯片2处理后得到的细胞残液直接被收集到废液池5中，最后 将微阵列芯片4送入质谱仪6进行分析，进而得到单细胞的信息。

为本发明的实施例中，进样模块1由三路输入组成，第一恒压注射泵和第一注射器组成第 一输入101，第二恒压注射泵和第二注射器组成第二输入102，第三恒压注射泵和第三注射器 组成第三输入103；第一注射器、第二注射器和第三注射器内的溶液依次为萃取液、低表面能 氟硅油溶液(隔断液)和含强干扰基质的细胞悬浮液(水相)；其中，隔断液起到防止相邻的水 相串扰的作用。

结合图1，参见图2和图3所示，微流控芯片2由第一入口通道201、第二入口通道202、 第三入口通道203、萃取液出口通道204、单细胞废弃物出口通道205、第一S形流道209、 第二S形流道210、三相流产生结构211、蛇形萃取结构212和三相流分离结构213组成；第 一入口通道201和第二入口通道202的一端分别通过第一S形流道209和第二S形流道210与三相流产生结构211连通；所述第三入口通道203的一端通过柱状微阵列208与三相流产生结构211连通。

芯片基底采用石英玻璃材质，其余部分采用聚二甲基硅氧烷材质，两者之间采用等离子 体键合的方式进行连接；微流控芯片首先使用化学修饰的方法使芯片所有流道全部具有亲水 特性，这个特性可以长时间保存，随后采用层流的处理方式，使得三相流分离结构213的流道 上部分疏水区214、下部为亲水区215，最后，使用压强平衡的方法将微流控芯片的其余部分 全部处理成具有疏水特性。微流控芯片的第一入口通道201通过导管与第一输入101进行连接， 系统工作时由第一输入101向微流控芯片2内注入萃取剂，用于在强干扰基质溶液中将细胞进 行裂解、萃取待分析物；第二入口通道202通过导管与第二输入102进行连接，系统工作时由 第二输入102向微流控芯片2内注入氟硅油溶液，用于隔断液邻单细胞溶液、防止相邻的单细 胞分析发生串扰的问题；第三入口通道203通过导管与第三输入103进行连接，系统工作时由 第三输入103向微流控芯片2内注入含单细胞的强干扰基质溶液，柱状微阵列208用于隔离含单 细胞的强干扰基质溶液中尺寸较大的杂质，防止其进入三相流产生结构211；第一S形流道209 和第二S形流道210主要是为了减少外部液体压力变化对微流控芯片的影响，从而使微流控芯 片2内部的流场尽可能的稳定。从第一入口通道201进入的萃取液、第二入口通道202进入的氟 硅油溶液(隔断液)以及第三入口通道203进入的含有强干扰基质的细胞悬浮液会在三相流产 生结构211处形成交替的三相流，其中，为了方便描述将含有单细胞的强干扰基质溶液记为水 相，相邻的一段萃取液、水相、隔断液称之为一个萃取单元；通过调节第一输入101、第二输 入102、第三输入103的液体流速，可以实现一个萃取单元中的水相中含有且仅含有一个单细 胞；萃取单元通过微流控芯片2上的蛇形萃取结构212时，萃取液中的水溶性裂解液(乙腈)将 进入水相中完成单细胞的裂解，萃取液中的非水溶性萃取液(辛醇)完成对裂解后的单细胞待 分析物的萃取，蛇形萃取结构212采用S形结构设计一方面可以增加流道的长度，提高萃取的 有效时间；另一方面，在流道的弯折处，会加速液体表面流动，提高萃取效率；三相流分离 结构213经过化学修饰，流道上方区域214疏水，流道下方区域215亲水，三相流经过三相流分 离结构213后，萃取液进入萃取液出口通道204、水相进入单细胞废弃物出口通道205、隔断液 在此区域不会有明显的趋性，会均分分别进入萃取液出口通道204和单细胞废弃物出口通道 205，三相流分离结构213处的尖端结构设计也是为了便于隔断液的分离。经过微流控芯片2 的处理后，萃取液出口通道204处形成萃取液和隔断液的交替液滴，其中萃取液内含有萃取后的单细胞待分析物，为了便于描述，这里将相邻的萃取液和隔断液记为待分析单元；单细胞废弃物出口通道205处形成水相和隔断液的交替液滴，其中水相为萃取后单细胞剩余的细胞残 液，为了便于描述，这里将相邻的水相和隔断液记为残液单元；

在一个优选的实施例中，如图1和图4所示；打印模块3采用标准3D打印技术完成，打印材 料为PLA塑料，打印模块3具有一个尺寸与所述微流控芯片相配合的凹槽401，所述微流控芯片 2放置在打印模块3上不需要额外的固定装置；打印模块3上的萃取液出口通道303和废液出口 通道304的内径尺寸与导管的外径相配合。萃取液出口通道204外部连接导管，经过细胞待测 分析物出口通道303后垂直于水平面设置，同理，单细胞废弃物出口通道205外部连接导管经 过废液出口通道304后垂直于水平面设置，导出管和连接口的连接处使用速干胶进行粘黏。微 阵列芯片4位于打印模块3的细胞待测分析物出口通道303的正下方，基底采用ITO玻璃材质首 先使用旋涂工艺，获得一定厚度的超疏水涂层，随后利用一定功率参数的激光刻蚀的方法， 加工出具有等间距的微孔阵列，圆孔直径优选为100-300μm，圆孔中心间距450-600μm。此 时，圆孔内具有亲水特性，圆孔外具有疏水特性，微阵列芯片采用圆孔阵列排列方式是为了 实现单细胞的批次高通量检测。废液池5位于打印模块3的废液出口通道304的正下方，待分析 单元中的萃取液经过导管导出后以液滴的形式依次滴落在微阵列芯片4的微孔阵列的孔内，隔 断液则落在孔外，每一个圆孔内部仅含有不多于一个的单细胞信息；同理，残液单元经过导 管导出后直接进入废液池5。

上述实施中，废液池5为聚四氟乙烯离心管；在一个优选的实施例中，如图1和图4所示， 质谱仪6为MALDI质谱仪；经过打印处理后含有单细胞待分析物的微阵列芯片4放置转接板402 卡槽内，喷加基质待其表面形成结晶，随后放入质谱仪进行分析。为了进一步验证本发明提 供的一种强干扰基质下微流控-质谱联用的单细胞分析装置的可行性，我们采用MCF-7乳腺癌 细胞进行分析，图6a、6b为癌细胞的质谱分析结果图；其中含强干扰基质的细胞悬浮液经过 系统进行单细胞封装、细胞待分析物提取、分离、打印、分析后得到的单细胞质谱分析结果 如图6a所示，在700-900的区域可以观察到明显的磷脂特征峰；而常规的实验室直接分析法得 到的单细胞质谱结果如图6b所示，可以看到，在该区域得不到任何信号峰，主要是因为小分 子强干扰基质极容易和生物分子形成及其复杂的络合物，从而使质谱图的解析变得复杂，信 号会淹没在噪声中。

Claims (6)

1.一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析系统，其特征在于，该系统含有进样模块(1)、微流控芯片(2)、打印模块(3)、微阵列芯片(4)、废液池(5)和质谱分析仪(6)；所述的微流控芯片(2)含有第一入口通道(201)、第二入口通道(202)、第三入口通道(203)、三相流产生结构(211)、蛇形萃取结构(212)和三相流分离结构(213)；第一入口通道(201)、第二入口通道(202)和第三入口通道(203)的一端分别与三相流产生结构(211)连通，所述三个入口通道的另一端分别通过导管与进样模块(1)的三个输入连接；所述三相流产生结构(211)通过蛇形萃取结构(212)与三相流分离结构(213)连接；三相流分离结构(213)分别通过萃取液出口通道(204)和单细胞废弃物出口通道(205)与打印模块(3)连接，打印模块分别通过细胞待测分析物出口通道(303)和废液出口通道(304)与所述的微阵列芯片(4)和废液池(5)连接；微阵列芯片(4)通过转接板(402)与所述的质谱分析仪(6)连接。

2.如权利要求1所述的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析系统，其特征在于，第一入口通道(201)和第二入口通道(202)的一端分别通过第一S形流道(209)和第二S形流道(210)与三相流产生结构(211)连通；所述第三入口通道(203)的一端通过柱状微阵列(208)与三相流产生结构(211)连通。

3.如权利要求1所述的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析系统，其特征在于，所述的三相流分离结构(213)由亲水区(214)和疏水区(215)两部分组成。

4.如权利要求1、2或3所述的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析系统，其特征在于，所述微阵列芯片采用圆孔阵列排布方式，圆孔直径100-300μm，圆孔中心间距450-600μm。

5.采用如权利要求1或2所述系统的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)萃取液、隔断液和细胞悬浮液分别通过进样模块的第一输入、第二输入和第三输入进入微流控芯片的第一入口通道、第二入口通道和第三入口通道中；三种液体在微流控芯片的三相流产生结构(211)内形成三相流液体；

2)三相流液体进入蛇形萃取结构(212)中，并在该结构内完成细胞的在线裂解、萃取；

3)经裂解、萃取后的三相流进入三相流分离结构(213)，在拉普拉斯压力和芯片出入口的压力差的共同作用下，萃取液、细胞悬浮液和隔断液在该区域被高效分离，分离后的萃取液经萃取液出口通道(204)流出，细胞残液经单细胞废弃物出口通道(205)流出，隔断液在三相流分离结构(213)处则被均匀分至萃取液出口通道(204)和单细胞废弃物出口通道(205)中，萃取液出口通道(204)流出的为萃取液和隔断液的两相流，单细胞废弃物出口通道(205)流出的为细胞悬浮液和隔断液的两相流；

4)从萃取液出口通道(204)流出的两相流通过打印模块(3)的细胞待测分析物出口通道(303)后以液滴的形式打印在微阵列芯片(4)上；从单细胞废弃物出口通道(205)流出的两相流经过废液出口通道(304)后直接被收集到废液池(5)中；

5)经打印处理后含有单细胞待分析物的微阵列芯片(4)放置转接板(402)的卡槽内，随后喷加基质待其表面形成结晶后，送入质谱仪(6)进行分析。

6.如权利要求5所述的一种集成化的液滴微流控-质谱联用分析方法，其特征在于：所述的隔断液为氟硅油溶液，萃取液是辛醇和乙腈的混合溶液。