CN102471748A - 伴随细胞观察采集细胞液和成分分析法以及采集细胞液·分析装置 - Google Patents

Abstract

如果可能简便而迅速检测出至少单个细胞内溶液的分子的话，在同时进行细胞动态的观察方面，就可提供能迅速阐明生命现象的动态和分子机构的手段。同时探索从多个被检测出的分子当中，造成细胞所处状态的活性分子的手段作为课题而提出。即使是单个细胞，也可直接用细管吸取其细胞内液，并直接送入分析装置中。这个手段要在显微镜等放大观察镜下边观察边进行，尤其在进行质谱分析时，用纳米喷雾电离细管直接吸取捕捉细胞内液，混合电离辅助溶媒后，直接用喷雾法导入到质谱仪中，即使是单个细胞，也可检测出其内液中的分子成分。这个捕捉到的分子谱峰值与不同状态的细胞数据群之间用差解析或者t-检验法，来确定具有状态特异峰值的分子。

Description

伴随细胞观察采集细胞液和成分分析法以及采集细胞液·分析装置

技术领域

本发明是关于伴随细胞观察实时的采集细胞内溶液和成分分析法以及采集细胞液·分析装置。

背景技术

细胞里的分子机构是引起生命现象的根本物质，并且是生命科学应该弄清的永远的课题。但是到目前为止还没有一种分析手法能在直接观察活细胞的动态变化的同时，实时的或者经时的对该细胞的庞大的分子群和离子群进行检测和鉴定，对关键的分子进行分析，进而迅速的弄清分子机构和对细胞形态等现象的观察之间的关系。如果能开发出这样的手法和装置，不仅是发现生命现象还包括发现病情以及检测病情的标记分子的时间，或是发现能成为医药品的候补分子的时间要比以往大幅度的缩短，为人类带来的好处将是无法估量的。

到现在为止，因为一般像这样的分析法的灵敏度很低，将细胞放在某一个被设定的状态下，设定像刺激等一些外部因子等的条件前后，收集多个细胞，研碎，然后花费功夫和时间作凝胶电泳进行运用免疫现象等生物体亲和性质的分子检测，使用标记化合物的检测法等各种各样的分子解析，结果是根据不超出多数细胞的平均值范围的数据来发现生命体里的新分子和推测分子机构。可以说这是平均值的科学。但是通过多年来我们在录像显微镜下观察细胞的经验，我们认识到在同样的环境下细胞的应答也不一样。

图1的照片200是承担过敏性反应的大鼠肥大细胞在用钙离子载体刺激后的颗粒放出数的经时变化的捕捉结果。从像这样一系列的录像画面中，用显微镜观察此细胞而得到的录像画面来进行连续时间差别像解析，仅捕捉颗粒的放出(破碎)，它的一个例子是照片201。右边是在同一个培养皿中的同样的生育条件下培养的细胞的结果，表示在显微镜视野里的不同细胞的颗粒放出数的时间变化。像这样在相同的环境下，接受同样的刺激，有的细胞立刻放出许多的颗粒，有的细胞不怎么放出颗粒。就是说每一个细胞都有自己的个性。这个事实是我们通过用录像显微镜观察记录细胞，分析细胞之后才首次明白的。

像这样仔细观察细胞的举动会发现每一个细胞的反应和动态大不一样，有各种各样的变化。这个原因是，看起来是同样的细胞可是内容成分等不同的细胞而造成的，或者是，每个细胞不同的成熟度以及该细胞在细胞周期中所在位置的不同，就是考虑到微小环境下微小领域等种种不同的条件。但是如果是这样的话，我们有必要重新考虑到目前为止从收集很多细胞来进行分析的所谓平均值的科学当中而得出的结果的可信度。为了调查真正的细胞内分子的动态和分子机构，观察一个细胞的举动的同时能够解析一个细胞内分子和细胞外放出分子的动态是很理想的，这是解析生命分子机构所必需具备的条件。这不仅是微小领域里发生的所有现象，特别是有机体的细胞的合乎目的举动，因为是经过几十亿年的进化而形成的系统，所以颇有意义。弄清结果会给人类带来影响，它的成果会广泛的应用于人类的健康·医疗等领域。可以说，实时的观察细胞，边观察一个细胞的举动边将它与分子动态相关联的解析手法的开发，会成为世界生命科学的解析手法的范例，它的解析速度会被大幅度的加快。可以说这是到目前为止谁都渴望的生命科学的梦想。

另一方面，近年来伴随着纳米技术的发展，一边观察微米，副微米领域的微小领域物质的变化，一边伴随着观察实态来捕捉分子变化是十分必要的。不仅限于纳米技术，并且化学，材料化学等所有微小领域里，作为追踪分子变化的有效手法是十分有用的，这种手法的确立倍受期待。在此说明书里，将这个最复杂，称为生命体的这个有机体，还有许多弄不清楚的部分的细胞作为微小领域空间体，举它最难适用的例子来说明此项发明，将“细胞”换成观察下的“微小领域空间”本发明的适用范围也完全一样。

本发明的适用范围广泛，一般来说，以液体作为核心成分的试样全部都成为对象。能够一边观察到在微小领域里的变化，一边采集其中变动的分子群，并且直接用质谱分析法或ICP质谱分析等高灵敏度分子·原子检测法来检测，分析这个分子·原子组成的变化，探索分子·原子的蠢动，研究离子和分子水平的机构，这是至今为止在世界上没有被实现的，比以往的方法更快速更直接。

到目前为止曾经有过利用质谱分析来解析细胞内分子，比如细胞集团的蛋白质成分的分析(专利文件1)。此外，还有用多数的亲和微型柱从生体液中特异的提取出复数的生体分子，然后用质谱仪进行分析的系统(专利文件2)。

[专利文件1]日本特表2002-537561

[专利文件2]日本特表2005-503537

发明内容

发明要解决的问题

虽然细胞的应答不一样，至今为止将只能用于大部分多细胞集团体系上的细胞内分子机构解析手段用在一个细胞上，边观察它的举动包括细胞的个性，边实时的捕捉一个细胞或是细胞内细胞器的成分，能够实现分子解析和定量的高灵敏度并且高速直接的有很高的可靠性的手法是本发明的课题。像正常生体组织中的癌组织那样的细胞集合体其中的一个生体组织中的不同形态和举动的细胞或细胞间隙，能够直接取出以细胞为单位的成分，跟形态的微视情报一起检测出分子·原子的结构，并且通过与被实施病态或异常或物理·化学·生物学的处理的东西，(健全或正常或不被做处理的)互相间做比较，比较分子·原子的谱图，迅速的并直接的评价比较该成分的状态间的增减·消灭·发生，提供支援原子·分子水平的机构解明的分析手段。而且细胞是有生命的，它的形态学的举动与细胞内的分子动态相联动的时候很多。所以要想弄清将生命现象的离子和分子为对象的机构，希望能同时使用上述的手段和细胞的形态观察。

另外，被确立的培养细胞和生体组织中的细胞会应答来自外界的各种各样的因子，解明它显现功能的机构，能提供查找来自外界的因子与细胞内分子变动的关联方法是很必要的。本发明能够同时将有个性的至少每一个细胞的举动分析和分子动态分析以及分子探索分析得以实现，能够给予迅速直接的弄清生命现象的分子机构手段。并且伴随着近年纳米技术的发展，一边观察200μm以下的微小领域的物质变化，一边同时捕捉它的分子变化和观察实态变的很必要，能成为可以从视觉上看到它的微小领域的变化并且弄清分子机构等手段。

现在关于各种疾病网罗性的遗传因子分析被推进，与疾病相关联的许多遗传因子及其蛋白质等表现产物已被阐明，不过疾病的原因只是那样的遗传因子蛋白质水平的分析的话，就不一定能提出充分的具体的有针对性的建议。为了更深刻明快的对疾病原因进行分析的可能性的提高，使与疾病相关的细胞内低分子动态的解析成为可能的事，就人体组织来说，从遗传因子指令到RNA和蛋白质等执行部门，以致在各种各样的现场最前线工作的所有的低分子群，能够将它们的分析法确立，生命现象的全体图才能被首次理解。

例如，像iPS万能细胞一样，围绕再生医疗，细胞分化因子的探索非常重要，不过很多都是低分子的那个因子的网络分析法，它以往只能用在多个细胞集团体系。但是我们通过显微镜观察知道分化的细胞，不是全部，只是细胞集团中的一部分。本发明是首次一边从形态来观察它的分化的进展，一边从形态学的角度只选择发生分化了的细胞，并同时能够进行分子分析的手段。

另外，在饮食品领域，葡萄酒、日本酒、啤酒、威士忌酒、烧酒等酒精性饮料，酱油、大酱等发酵食品，咸菜、朝鲜泡菜、西式咸菜等蔬菜果实加工品，酸奶、奶酪等制酪农业食品，关于酵母、乳酸菌等微生物细胞的遗传因子水平的分析、研究在进行着，但是想研究风味、香味等微妙的品质的情况下，只靠这些遗传因子的解析和蛋白质的分析就有限度了。期盼与酵母、乳酸菌等发酵有关的微生物的细胞内低分子动态的分析手段的出现，并期盼它的结果跟遗传因子解析和蛋白质的解析结果相统一。像上述那样，在发酵食品工业中不仅是微生物的研究，为了在发酵过程中的风味、香味等的微妙品质管理，通过培养液等微量抽样进行低分子动态的分析手段也被期望。

另外关于植物研究，在一般的植物生理学·发生学等各种研究领域里，与动物细胞相比一般未阐明的事项很多，想弄清掌管植物的分化、形状、颜色、香味的分子机构等的话，低分子的动态研究就被期待。近年来从粮食情况等方面来看，转换遗传基因的植物需求增高，不仅是生态风险评价，转换遗传基因后的安全性评价是非常重要的课题，期盼着追踪细胞内外的低分子动态的变化的手段的出现。

更进一步在一般的化学品制造产业等领域里，例如，像有机半导体、有机导电体，有机光学材料那样要求高纯度的制品的制造过程中，或在食品添加物等的健康方面的质量保证是很重要的制品的制造过程中，微量的因子会给物理化学的性能或安全性等的质量要求带来影响的制造工序里，为了对像这样的微量因子加以监测、控制等、制造管理、质量管理，在微小领域里迅速的分子动态的分析被期望。

可是要实现上述的课题，首先重要的是能够检测超微量的一个细胞里的物质或一个细胞内细胞器里的物质。质谱仪的现在的检测灵敏度，进行分子探索的时候经常使用四级杆-飞行时间混合质谱仪(俗称Q-TOF)和傅里叶变换型质谱仪(俗称FT/MS)。它的检测限度最高才是1μmole/L(1μM)左右，直径为10μm的一个细胞的体积大约是1皮升(picoliter)(以下表示为1pL)，就能检测出的分子数来说每一种分子100万个左右。可是到目前为止，用MALDI电离法有过检测出一个细胞的分子的例子，不过其谱峰中只是容易离子化的分子的谱峰被检测出来，与细胞内所含分子数相比数量太少，从而我们知道它不会成为网络性的分子检测法。

另外MALDI-TOF法，最近TOF-TOF法和离子阱-TOF法的装置在市场上出售，已经可以进行简单的MS/MS分析了，但是缺乏分子鉴定能力和定量性。并且在一个细胞里添加基质，在这个基质变成结晶的过程中不知道细胞在哪里，更不用说将这个试样板放入质谱仪里，用摄像机观察并用激光瞄准微米大的一个细胞，这不是那么容易的。并且，边观察细胞的某个状态，就在这时想把细胞取出，放在MALDI试样板上操作的时间里细胞的状态在不断的发生变化，最后添加接近饱和浓度的有机分子溶液的基质，谁都不知道发生了什么，所包含的细胞成分从在活细胞里的时候发生了什么样的变化。

鉴定分子所需要的MS/MS分析等能在上述的质谱仪里将分子导入成离子，并且像MS/MS分析那样，选分子各一种并逐渐的切断分子(导入碰撞室)要得到碎片离子的波峰，在分析所有种类的分子的时候，有必要持续不停的将试样里的分子转化成离子。但是，一个细胞的体积仅有1皮升，用以往的电喷雾离子法的话，瞬间试样就会消失，不能确保需要至少几分钟的试样离子化的持续时间。

用于解决问题的方案

为了解决上述的课题，本发明由以下的部分组成。本发明的一个特色是，提供在观察细胞的动态的同时采取构成上述细胞或从上述细胞中分泌出的细胞成分并进行实时质谱分析的方法，其具有以下阶段：

用显微镜对细胞的动态进行观察的同时，对上述细胞的特定领域，插入前端部口径与上述特定领域的大小相对应的纳米喷雾电离细管的阶段，

从上述细管的前端部采取上述特定的领域内的细胞成分，并留在前端部的采取阶段，

从上述纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒的阶段，

在质谱仪的试样导入口与上述纳米喷雾电离细管之间加上电场，使上述细胞成分被纳米喷雾电离后作为试样导入上述质谱仪的阶段，

对作为试样被导入上述质谱仪中的上述细胞成分进行质谱分析的阶段。

本发明的另外一个特色是，提供一种在观察细胞的动态的同时采取构成上述细胞或从上述细胞中分泌出的细胞成分并进行实时质谱分析的系统，该系统具有：

用于观察包含作为质谱分析对象的细胞成分的细胞动态的显微镜，

纳米喷雾电离细管，其具有为采取上述细胞的细胞成分所用的口径在上述细胞的大小以下的前端部和用于导入电离辅助溶媒的后端部，能对作为质谱分析对象的上述细胞成分进行电离，

具有试样导入口的、对作为试样被导入的电离后的细胞成分进行质谱分析的质谱仪，

在上述质谱仪的试样导入口和上述纳米喷雾电离细管之间加上电场的施加电场装置，

在该系统中，侵入用显微镜观察的细胞内由上述纳米喷雾电离细管的前端部采取特定领域的细胞成分的同时，从上述纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒后，在上述质谱仪的试样导入口和上述纳米喷雾电离细管之间加上电场，对上述细胞成分进行电离并作为试样导入上述质谱仪里进行质谱分析。

在上述方法及系统令人满意的状态下，作为纳米喷雾电离细管的构造，上述纳米喷雾电离细管的前端部的口径为0.1到100μm。上述纳米喷雾电离细管的前端部的里侧为结合分子亲和基的结构，从而能特异性捕捉分子。另外，上述纳米喷雾电离细管的里侧或外侧至少一方有导电性，上述纳米喷雾电离细管在加上上述电场时有电极的作用，或者是有从上述纳米喷雾电离细管的后端侧向其前端侧延伸的细导线，加上上述电场时上述细导线有电极的作用。以具有内部是脂溶性的细胞膜作为隔壁的细胞为分析对象的时候，上述纳米喷雾电离细管的外侧为疏水性，以具有由亲水性材料形成的细胞膜和细胞壁作为隔壁的细胞为分析对象的时候，上述纳米喷雾电离细管的外侧为亲水性。

在别的令人满意的状态下，采取细胞成分时，上述纳米喷雾电离细管的前端部在接近观察中的细胞为止，一直由外侧向其内部的空隙气压加压，以免包括细胞培养液在内的周边成分混入到其前端部，当上述纳米喷雾电离细管的前端部到达观察中的细胞后，解除上述加压，由上述的前端部吸取作为质谱分析对象的细胞成分。并且，从含有液体的组织内形成的穴中使细胞内或组织内成分流出，从而由上述前端部采取作为质谱分析对象的细胞成分。

在别的令人满意的状态下，上述电离辅助溶媒是含有挥发性酸或碱的混合溶媒，导入上述电离辅助溶媒之后，对上述纳米喷雾电离细管使用振动、离心力或压力中的至少一种，将上述电离辅助溶媒填满上述前端部。

在别的令人满意的状态下，上述纳米喷雾电离细管的前端部是由操作器控制其三维位置，在作为观察对象的细胞和上述质谱仪之间设置了操作器，并与上述纳米喷雾电离细管的后端侧连接，上述方法及系统使用上述的操作器实现。上述操作器在采取上述细胞成分时，引导上述前端部到达正在观察中的细胞内的作为质谱分析对象的采取位置，在向上述质谱仪导入上述细胞成分时，引导上述前端部到达上述质谱仪的试样导入口。

在别的令人满意的状态下，细胞成分的采取是经上述纳米喷雾电离细管的前端部采取下述细胞成分：在空间位置不同的多个细胞成分，细胞的每个经时变化的细胞成分，或者对细胞进行多个不同处理时的细胞的处理前与处理后的细胞成分，质谱分析是：导出空间的、经时的、或在处理前后不同的多个细胞成分的各个质谱，抽取导出的各个质谱之间的差异，评价或确定在显微镜下观察的细胞中的与空间及时间的差异有关的分子。

在别的令人满意的状态下，质谱分析是：事先在计算机内存入已知的质谱，在纳米喷雾电离中导出作为试样被导入的细胞成分的质谱，并抽取上述细胞成分的上述质谱和上述已知的质谱的差异，解析上述细胞成分，对通过滤质器所抽取的上述细胞成分里的特定分子进行高维的质谱分析，从而鉴定分子。

根据本发明的其他特征，提供纳米喷雾电离细管，其为采取构成细胞的细胞成分的同时为了进行质谱分析而对上述细胞成分进行纳米喷雾电离的纳米喷雾电离细管，其具有：

口径的大小在上述细胞内的特定领域以下的前端部、

用于导入电离辅助溶媒的后端部、和

在上述纳米喷雾电离细管内部延伸至前端的具有溶媒亲和性表面的溶媒路径细线、

上述纳米喷雾电离细管的外侧为疏水性、

上述前端部的外侧或里侧至少有一方具有导电性，或者能插入在内部从后端侧延伸至导入的电离溶媒的细导线，使得能在其与质谱仪之间加上电场。

发明的效果

根据本发明，到目前为止，收集大部分的集合体或许多细胞，经过研碎等预处理后，收集细胞内成分，解析分子，在只有平均值的科学的时代，细胞内液的有机分子成分和无机成分的分析，到至少一个细胞，或是其一个集合体的生体组织中的细胞里的至少一个细胞内外成分或是细胞内一个细胞器为止能够直接取出，能够迅速并且直接的对此成分进行分析。并且，总是应答合乎目的的变化外部因子的细胞，它的举动和细胞内分子动态相联动的情况很多，通过实时地在显微镜下观察细胞和检测分子，能够从形态变化和分子变化的两个观点来弄清生命现象的合乎目的的分子机构。在观察细胞中，边观察以往的同位素标记或荧光标记等已知的示踪分子的举动，边能够在与其变化的关联性里，追踪不仅是已知分子的新的功能还有未知分子的发现和其功能以及它们的分子机构。在细胞里和生体组织中的细胞里，存在庞大的种类及数量的分子，应对来自外界的各种因子，持续变化，检测出多数不怎么被人知道的关键的活性分子，虽然有时被别的共存分子所掩饰，但是找出细胞在应答外部因子等变化的前后或细胞所在的状态中的质谱差，以及用t检验、多种变量的解析等统计学手法适用于质谱的分子谱峰，能够评价并探索此时的变动，或某个状态里特殊的分子。因为是有个性的细胞，根据本发明，至少一个一个的，能够同时阐明其形态学的举动分析及分子探索分析的任意组合或全部，并迅速直接的提供弄清生命现象的分子机构的手段。

更进一步，本发明是，分析时不对细胞施加压力，用高灵敏度高速并直接的具有高度信赖性的手法，能够追踪作为生命现象的成分的一个一个细胞的举动和同时在那个细胞里的分子动态。其中一个是，特别是采取细胞成分用的细管的前端外侧作疏水或亲水处理，在刺入细胞等微小空间体时，提高细管外侧与细胞膜等构成隔壁的成分的亲和性，在刺入细胞膜等的时候，细胞膜不会变形，非常顺利的插入，将刺入细胞对细胞膜的损伤并且细胞应答的影响降低到最小限度，进而内容成分的遗漏也减少了。对于细胞内或微小空间体内的物质，在细管前端内部表面与分子亲和基结合，或根据各种各样的目的改变被充填在那儿的树脂的表面物性，能够除去在质谱分析中妨碍分子电离的盐，还能够使分子离子的捕捉变得更有效率或有选择性的浓缩，能实现分子离子有选择性的高效率的捕捉，溶出。细管外侧是疏水性的时候，细管在接近细胞为止，混入前端部的细胞培养液成分因为与水相排斥被控制到最小限度，细管内空气的加压调整能使防止混入前端部的培养液成分的操作简略化。在显微镜下，引导细管前端到10微米左右的细胞的位置是非常难的事，用使其电动化的操作器，在显微镜的视野外，每次安装的位置都有一些不同(但是在微观世界里是有致命大的不同)，确认细管前端的位置，根据它的数值，从固定在显微镜下的视野中央的细胞焦点到算出的位置的附近为止，能够自动接近，能够谋求捕捉细胞内外成分的操作的高速化。

结果是，对于有个性的细胞，至少一个一个的，高信赖并高效率的对很多细胞一个一个的进行网罗的分子分析，它的举动分析和分子动态分析及分子探索分析的任意组合或全部能够同时进行，是迅速并直接的阐明生命现象的分子机构的手段。到目前为止大多是收集细胞的集合体或多数的细胞，研碎等预处理后，收集细胞内成分，解析分子，不仅是花功夫和时间，结果才是反映平均值，并且基本不会反映细胞的时间、空间的特征的细胞的分子成分的分析变得具有细胞内细胞器的空间特异性，实现加上经时的形态变化的，细胞内外的时间、空间特异性的高度分析。内脏器官和像癌组织等不均等的细胞集合体的病态组织作为标的时，生体组织中不同状态下的细胞里，直接取出至少一个细胞内成分，能够进行高速的分子解析、比较，几乎实时的迅速并直接的抽取疾病的关键分子和包含分子动态的成分分析。

求出细胞在应答外部因子等变化的前后或细胞所处的状态间的质谱差，或加以t检验、回归分析、主成分解析、群(cluster)解析等的统计学的评价，此时能够抽取发生变动的分子，或某个状态下的特殊分子。这时，在测定过程中，微量试样的很短的纳米喷雾时间内，实时的选择被抽取的分子谱峰，在碰撞室里碎片化，用MS/MS分析或高分辨率质谱分析迅速的决定其分子的结构，能够高速的阐明分子机构，高速的发现包括医药品候补分子在内的新分子。

在细胞状态间蠕动着的分子的动态，再生医疗等的细胞分化因子的高速探索，控制细胞分化，发现并控制细胞增殖因子的方法，癌细胞等细胞种的分子诊断和分子探索，鉴定细胞种，从皮肤等生体组织渗出的液体等，用针轻微刺皮肤时出的一点血，仅仅用这一点血来进行临床检查，用一个肝脏细胞来调查个人的药物代谢，实现定制医学(Tailor-made medicine)，轻微的刺一下植物探索它的内部成分，以往用一种化合物来设计医药品，根据中医处方里常见的多成分的协调作用，能够更自然的阐明医药品作用的分子机构，探索及开发多个协调型医药化合物等，高速的开展有助于各种各样的人类的生命和健康的分析。

现在关于各种疾病，与正在进行网罗的解析的多数遗传因子及其发现产物的蛋白质等相关联，能明确的得出细胞内的低分子动态。在饮食品领域中，能够提供研究风味、香味等微妙的品质的细胞内的低分子动态的解析手法。

一般来讲，在比起动物细胞尚未弄清的事项还有很多的植物研究里，掌管植物的分化，形状，颜色，香味的低分子在细胞内动态中的作用，从近年来的粮食情况等关系，在改编遗传因子而带来的安全性评价中也能利用追踪细胞内的低分子的动态。

在一般的化学品制造产业等领域里，例如，向有机半导体、有机导电体，有机光学材料那样要求高纯度的制品的制造管理过程中，或在食品添加物等的健康方面的质量保证是很重要的制品的制造过程中，微量的副生物会给物理化学的性能或安全性等的质量要求带来不良影响的制造工序里，能够对像这样的副生物加以监测、制造管理、质量管理等，在微小领域里检测分子和解析分子。

附图说明

[图1]在过敏性细胞的过敏应答过程中放出颗粒的瞬间和各个细胞的颗粒放出数量的时间变化。

[图2]纳米喷雾电离细管尖端(下图)和它的动作图(上图)

[图3]边在显微镜下观察细胞，边用纳米喷雾电离细管尖端吸取细胞内溶液的图。

[图4]作为纳米喷雾电离细管尖端，该尖端的表面上导电性涂布的时候(上图)以及没有用导电性涂布且为了使捕获的细胞内溶液电离作为喷雾导入质谱分析而在尖端内部添加使被捕获的细胞内溶液电离的电离辅助溶媒后，插入高压电场端子(下图)。

[图5]构成下述系统的例子：用纳米电离细管尖端刺在显微镜下观察着的细胞，吸取一个细胞内成分，添加合适的电离溶媒后，立刻导入质谱仪，边观察细胞的动作和形状等现象，边实时地用质谱分析法检测细胞内液里的分子。

[图6]比较从不同状态的细胞a和b中检测出的质谱，在这里取它们之间的差，抽取出某个状态下特殊的谱峰(20(a-b))，选择那个谱峰所表示的分子，由在碰撞室里断片化所得到的质谱((MS/MS谱(21))来确定分子结构的分子探索及分子鉴定过程的原理图。

[图7]从不同状态的细胞a和b中检测出的质谱的t检验的结果，状态a的特殊的谱峰(t值95％以上)的抽取例子和其精密质量数及其检测条件和t值。

[图8]在某个状态下11个细胞里发现的特殊的表示相同m/z值的峰的强度(左边的组(27))，与作比较的6个细胞的谱峰强度(基本是零(右边的组(28)))的组依赖关系。

[图9]从在观察下的肥大细胞中取出细胞内液，经过本发明的一系列的过程探索分子的例子。

[图10]一个肥大细胞的模型RBL-2H3细胞里的颗粒203及细胞质204的成分的质谱图。同时记载颗粒里及细胞质里所能见到的各个m/z的质谱的放大图205-210和由各个m/z所表示的谱峰的t检验得出的t值。在这种情况下，t值表示，仅在颗粒中有的话接近100，仅在细胞质中有的话接近-100。

[图11]图10里所见到的五个分子的谱峰的MS/MS解析。

[图12]从图10，11的结果得出五个分子的代谢过程和所在位置。

[图13]从肥大细胞的模型RBL-2H3细胞里的一个颗粒内部成分解析中得出的以组氨酸为中心的代谢图。

[图14]检测肥大细胞的模型RBL-2H3细胞受到钙离子载体刺激后向细胞外放出的成分。

[图15]用一个细胞的质谱来对七种细胞进行分类：主成分解析结果得分绘图(score plot)221和装载绘图(loading plot)222。

[图16]根据维甲酸将P19细胞进行细胞分化诱导，其前后的形态变化和一个细胞的质谱及分子探索。

[图17]用HepG2细胞检测一个细胞的药物代谢物质。

[图18]应用一个细胞质谱分析检测法采取一点血液检测血液内成分。

[图19]以植物(天竺葵)的叶子和茎为对象的直接分析一个细胞和分子探索。

[图20]利用示踪分子追踪一个细胞内外的分子的方法。

[图21]检测奎纳克林被侵吞到肥大细胞的模型细胞体系中的部位例子。

[图22]追踪同位素标记组氨酸被肥大细胞的模型细胞体系侵吞的例子。

[图23]为了校正谱峰强度用溶媒的谱峰作内部标准的方法。

[图24]用纳米喷雾电离细管捕获细胞内部成分和导入质谱分析的系统构成图。

[图25]用纳米喷雾电离细管捕获细胞内部成分时的尖端前端计测方法和微型操作器的驱动方法。

[图26]用纳米喷雾电离细管捕获细胞内部成分和导入质谱分析的自动化系统的构成图。

[图27]附加了浮游细胞捕获法的用纳米喷雾电离细管捕获细胞内部成分和导入质谱分析的自动化系统的构成图。

[图28]纳米喷雾电离细管的导电材料涂布的例子。

[图29]在纳米喷雾电离细管内部配置试样溶媒亲和性细心材(溶媒路径细线)和导电性细心材。

[图30]比较在纳米喷雾电离细管内部配置试样溶媒亲和性细心材(溶媒路径细线)和不配置此物品之间的纳米喷雾的稳定性。

[图31]用具有疏水表面的纳米喷雾电离细管刺入细胞内的图像。

[图32]在能够用纳米喷雾电离法分析一个细胞的电离细管前端部分子溶出的图像。

[图33]向细胞内成分捕获液添加电离辅助溶媒的方法。

[图34]纳米喷雾电离细管前端里侧的各种修饰方法。

[图35]纳米喷雾电离细管前端里侧的各种树脂填充方法。

[图36]用悬浮树脂对被吸取后的细胞内成分进行浓缩及溶出检测。

[图37]用固定树脂或里侧涂敷将被吸取后的细胞内成分浓缩及溶出检测。

[图38]孔型细胞内成分的电离导入方法。

[图39]将细胞内成分捕获液里的成分扩增或热变性处理的方法。

[图40]解决纳米喷雾电离细管前端的堵塞的方法。

[图41]为了简单的进行吸取操作，改善纳米喷雾电离细管和周围的器具。

[图42]一个细胞的纳米喷雾电离法的各种加上电压的方式。

[图43]吸取极小量的体积和稀释比率的评价方法。

[图44]本手法的数据处理系统的操作内容和协作图。

[图45]使用nano LC用分离进行细胞内成分分析的例子。

[图46]用甾类化合物处理淋巴细胞的前后的每个部分的质谱(三维表示)。

[图47]在t检验中，从图20的谱峰群里作为特征明显的被抽取的质谱峰。

[图48]m/z 302.3的质谱的所在群。

[图49]m/z 302.3的MS/MS质谱及被鉴定的分子结构。

[图50]m/z 302.3的谱峰的经时变化的函数回归解析。

[图51]用一个细胞的纳米喷雾电离细管捕捉成分和MALDI-TOF检测。

[图52]一个细胞原子吸收或ICP、ICP-MS分析法。

[图53]用微米电泳芯片进行一个细胞分析的例子。

[图54]用微分离毛细管分析一个细胞的例子。

[图55]根据不同状态的细胞来进行纳米分离的例子。(a)甾类化合物处理前。(b)甾类化合物处理后。

[图56]使用试样板用孔对多个细胞内成分进行质谱分析的例子1。

[图57]使用试样板用孔对多个细胞内成分进行质谱分析的例子2。

[图58]使用试样板型纳米喷雾对多个细胞内成分进行质谱分析的例子。

[图59]细胞分类器型高速的对一个细胞进行质谱分析的系统。

[图60]细胞分类器型高速的对一个细胞进行质谱分析的系统(正离子和负离子同时型)。

[图61]细胞分类器型高速的对一个细胞进行质谱分析的一体型系统的构成图。

[图62]用细胞分类器获得的散布图及密度图。

[图63]从质谱仪里同时得到的主成分解析结果及MS质谱。

附图标记说明

1纳米喷雾电离细管(表面金属涂布型)

1′纳米喷雾电离细管(试样溶液电极插入型)

2质谱仪

3试样溶液或从细管后部添加了电离辅助溶媒的混合液

4高电压(这时是正离子模式的例子，尖端侧为+)

5纳米喷雾

6细管表面的金属涂布部

7纳米喷雾电离细管的主体部(这个例子是绝缘体)

8细胞

9显微镜载物台

10捕获的细胞液

11物镜

12录像机

13吸取操作

14溶液插入电极部

15培养皿

16细胞培养液

17监视器

18计算机

19在培养皿里培养细胞的录像显微镜的画面

20从画面里细胞中的目标细胞内液得到的质谱

21a从细胞a中捕获细胞内液而得到的质谱

21b从细胞b中捕获细胞内液而得到的质谱

22作为21a与21b的差得出的质谱峰

23选择22里的谱峰作为母峰得来的MS/MS质谱

24质谱峰的名字

25m/z数值

26t检验值

27表示在属于某个状态下的11个细胞群(27)里发现的特殊的m/z值的谱峰，从各个细胞中测出的各个谱峰强度

28在与27不同状态下的6个细胞群(28)中发现的、m/z值与27相同的谱峰强度

29用纳米喷雾细管尖端1从细胞中捕获细胞内液时的显微镜录像画面

30从细胞A中捕获细胞内液得到的质谱

31从细胞B中捕获细胞内液得到的质谱

32从细胞A中捕获细胞内液得到的质谱和从细胞B中捕获细胞内液得到的质谱之间的t检验结果

33在细胞A中检测出的特殊分子谱峰当中的一个m/z＝112.0909的MS/MS解析结果从而得到的断片质谱

34在细胞A中检测出的特殊分子谱峰m/z＝112.0909的MS/MS解析结果从而确定组胺的化学结构

35驱动刺入细胞的纳米喷雾电离细管到达细胞位置的座的X-Y-Z驱动台(在这个图里为电动型，此外还有手动的粗调轮·微调轮型)

35′驱动固定细胞用的细管到细胞位置的座的X-Y-Z驱动台

36驱动刺入细胞的纳米喷雾电离细管到细胞位置的座的轴向调节器(在这个图里为电动型，此外还有手动的活塞驱动型)

36′驱动固定细胞用的细管到细胞位置的座的轴向调节器

37用驱动刺入细胞的纳米喷雾电离细管到细胞位置的轴向调节器刺入细胞及吸取后拉回移动的方向

37′用驱动固定细胞用的细管到细胞位置的轴向调节器刺入细胞及吸取后拉回移动的方向

38刺入细胞的纳米喷雾电离细管座的驱动控制装置

38′固定细胞用的细管

39刺入细胞的纳米喷雾电离细管座的驱动终端(在这个图里为操纵杆，此外还有活塞驱动型回转体)

40细胞成分吸取驱动用的管子

41细胞成分吸取用活塞(可以用注射器代替)

42细胞成分吸取用活塞驱动装置

43检测纳米喷雾电离细管前端用的物镜1

44录像机1

45检测纳米喷雾电离细管前端用的物镜2

46录像机2

47检测纳米喷雾电离细管前端用的监视器

48纳米喷雾电离细管前端指定位置的记号(监视器的画面上)

49控制用计算机

50吸取·输送液体的泵

51吸取管

52输送液体的管

53导电性材料

54纳米喷雾电离细管外侧的涂布

55外侧无涂敷的纳米喷雾电离细管(54)的细胞刺入部

56试样溶媒亲和性细心材(溶媒路径细线)

57导电性细心材

58里侧涂布

59纤维状或链状充填物质

60表面结合的毛刷状的物质

61疏水性物质表面结合体或涂布

62阳离子性物质表面结合体或涂布

63阴离子性物质表面结合体或涂布

64抗体等受体结合表面

65抗原或底物等的结合表面

66酶等的结合表面

67核酸类的结合表面

68具有像从61到67那样的结合体的充填剂或分子筛充填剂

69烧结材料

70捕捉分子的溶液

71微型移液管

72溶出的溶媒和电离辅助溶媒的混合液

73孔型纳米喷雾部

74燃烧器或火炬

75热水(PCR的时候热循环仪)

76在捕捉的细胞液里添加处理用的添加试样液

77做PCR扩增、热变性等处理的试样液

78做了PCR扩增、热变性等处理的试样液

79放电

80在细胞液等捕捉试样液里添加溶出·电离溶媒

81镊子

82激光

83镜子

84柱面透镜

85加到细胞外液里的标记分子或可以追踪的同位素分子

86移动到细胞里并在细胞内液里，或被侵吞到细胞内器官里的标记分子或追踪用同位素分子

87被侵吞到膜里的或者结合在膜上的标记分子或追踪用同位素分子

88移动到细胞里的过程中代谢或者被修饰的标记分子或追踪用同位素分子

89被侵吞到细胞内器官里的标记分子或追踪用同位素分子

89’被侵吞到细胞器内的标记分子或追踪用同位素分子的代谢物质

90移动或者被侵吞到核里的标记分子或追踪用同位素分子

91分泌或再放出到细胞外液里的代谢或者被修饰的标记分子或者追踪用同位素分子

92用本手法从RBL-2H3细胞中捕捉到细胞质成分的质谱

9392中用○记号圈上的部分的放大质谱

94用本手法从RBL-2H3细胞中捕捉到细胞内颗粒里的成分质谱

9594中用○记号圈上的部分的放大质谱

96m/z 400.2的MS/MS质谱

9796的质谱所表示的奎纳克林的分子结构式

98作为校正MS质谱谱峰强度的标准谱峰能够使用的溶媒质谱和其中作为标准谱峰使用的特殊谱峰(放大图)

99测量吸取极少量的体积的方法

100用显微镜观察到纳米喷雾电离细管前端里的捕获的部分的放大图

101在吸取的极少量试样里添加少量溶媒等的稀释比率评价法

102从纳米喷雾电离细管后部添加少量添加液的手法

103从纳米喷雾电离细管前端部吸取少量添加液的手法

104根据102或103的手法形成的前端部内液体的显微镜的放大图

105为了简单进行吸取操作，将吸取装置的简易结合部作为一部分而形成的纳米喷雾电离细管

106以不传播振动的方式将105和吸取活塞注射筒(41)或吸取泵结合的延伸管的一个例子

107根据105吸取试样·添加电离溶媒后，用纳米喷雾电离细管向质谱仪导入试样的装置的一个例子(夹紧装置)

108甾类化合物处理前的细胞的每个部分的质谱(三维表示)

109甾类化合物处理后的细胞的每个部分的质谱(三维表示)

110108和109的质谱群中取差，用t检验法(用统计学来评价群的属性)研究与处理前相比减少的谱峰群。95％下与处理前不同的谱峰群的一览表

111108和109的质谱群中取差，用t检验法(用统计学来评价群的属性)研究处理后增加的谱峰群。95％下与处理前不同的谱峰群的一览表

112表示的是：在111找到m/z 302.3的谱峰，在用甾类化合物处理前发现的位置，处理前的TIC(全部离子色谱仪)中发现的位置

113那时的MS质谱(谱峰很小)

114113的放大图

115表示的是：在111找到m/z 302.3的谱峰，在用甾类化合物处理后发现的位置，处理前的TIC中发现的位置

116那时的MS质谱(谱峰很大)

117t检验的图(很清楚地发现处理后的增加)

118m/z 302.3的谱峰的MS/MS质谱

119在数据库里的二氢神经鞘氨醇的标准MS/MS质谱

120二氢神经鞘氨醇的结构

121研究m/z 302.3的质谱谱峰强度与此时的特性曲线函数(时间变量)的一致性的回归分析(证实随着函数的变化而变化)

1227种细胞的一个细胞质谱和它的主成分解析得出的得分绘图(score plot)

123122里的各个谱峰的主成分解析得出的装载绘图(loading plot)

124本手法的数据处理系统的操作内容和协作图

125防止液体漏出的圆环

126加压泵

127nano LC泵

128nano LC用试样喷射器

129nano LC分离柱(事前处理浓缩柱也可以，或是连接两者的也可以)

130nano LC用检测器

131nano LC用纳米喷雾发射器

132nano注射加压注射筒

133微量分离一个细胞的芯片

134分离一个细胞成分用的微通道(里侧可以有凝胶和树脂)

135一个细胞成分的浓缩泳动带

136试样导入口

137电极槽

138纳米喷雾用导电部

139微分离一个细胞的毛细管

140用不同状态的细胞进行的纳米分离例子(a)甾类化合物处理前(b)甾类化合物处理后

141从各个数据中得到的MS部分的质谱

142兼用于培养细胞的细胞成分解析用孔

143细胞培养液

144捕获细胞用的过滤器

145导电涂布或导电性底部和中心突起管部

146细胞液溶出电离溶媒或在各个阶段后分别注入

147溶出细胞内成分的电离溶液

148隔膜(间隔膜)

149纳米喷雾针(扎入142的孔底，穿破隔膜(148)，纳米喷雾溶出细胞内成分的电离溶液的导电性细管)

150兼用于培养细胞的细胞成分解析用孔板

151送液泵

152鞘流用送液泵

153鞘流

154原子吸收或ICP等离子体导入用喷雾器

155细胞分类器的细胞检测部

156细胞分类器的检测部激光源

157激光源止挡(stopper)器

158前方激光小角散射光

159前方激光小角散射光检测器

160在细胞分类器里一个一个的流动着的细胞

161鞘流

162前端带电的电极

163在带电的液滴里有一个细胞

164计时脉冲发生器的驱动装置

165为形成含有一个细胞的带电液滴的高电压脉冲(根据细胞的特性的检测结果决定是+还是-或是不带电)

166与落下的含有细胞的带电液滴的时机相同，将正离子高电压脉冲或负离子高电压脉冲作为脉冲纳米喷雾或脉冲电极或脉冲激光信号传送

167电离溶媒的脉冲纳米喷雾装置

168加上空间脉冲电场用的电极

169脉冲电离激光

170细胞含有的液滴被脉冲波变成微细液滴，导入质谱仪

171与含有+电荷细胞的液滴的落下时机相同的正高电压脉冲

172正离子模式专用质谱仪

173与含有-电荷细胞的液滴的落下时机相同的负高电压脉冲

174负离子模式专用质谱仪

175含有+电荷细胞的液滴被脉冲波变成微细的+电荷液滴

176含有-电荷细胞的液滴被脉冲波变成微细的-电荷液滴

177细胞分类器

178细胞分类器及质谱仪的控制·数据解析系统

179用细胞分类器获得的散布图及密度图等的监视器

180表示从质谱仪同时得到的主成分解析的结果及MS质谱的监视器

181计算机

182血球的散布图

183只选择淋巴球，荧光标记的密度图

184在被选择的淋巴球的正离子模式的MS质谱中推断主成分解析的结果(明白有3个组)

185主成分解析中被分成的3个组的各个MS质谱

200在过敏性细胞的过敏应答过程中放出颗粒的瞬间的录像显微画面(下面是在明视野像里看到的图像，箭头记号的颗粒在右下图中消失，上面是使荧光物质侵吞到颗粒里并看到其消失，箭头记号的颗粒(左)消失了(右))

201像图200的下面的图那样的明视野像的录像画面连续差像解析图的一个，用差像只抽取在颗粒消失的瞬间时画面里有变动的颗粒

202根据像图201那样的画面解析，调查在显微镜视野里的同样条件下的细胞的颗粒的放出数的经时变化图

203RBL-2H3细胞的一个颗粒里含有的成分的质谱

204一个RBL-2H3细胞的细胞质里含有的成分的质谱

205RBL-2H3细胞的一个颗粒里含有的成分中，m/z 112(下面记载着t值)附近的质谱放大图

206RBL-2H3细胞的一个颗粒里含有的成分中，m/z 156(下面记载着t值)附近的质谱放大图

207RBL-2H3细胞的一个颗粒里含有的成分中，m/z 177(下面记载着t值)附近的质谱放大图

208一个RBL-2H3细胞的细胞质里含有的成分中，m/z 177(下面记载着t值)附近的质谱放大图

209一个RBL-2H3细胞的细胞质里含有的成分中，m/z 205(下面记载着t值)附近的质谱放大图

210一个RBL-2H 3细胞的细胞质里含有的成分中，m/z 221(下面记载着t值)附近的质谱放大图

211一个RBL-2H3细胞里的含有成分中，m/z156的谱峰的MS/MS质谱

212一个RBL-2H3细胞里的含有成分中，m/z112的谱峰的MS/MS质谱

213一个RBL-2H3细胞里的含有成分中，m/z205的谱峰的MS/MS质谱

214一个RBL-2H3细胞里的含有成分中，m/z221的谱峰的MS/MS质谱

215一个RBL-2H3细胞里的含有成分中，m/z177的谱峰的MS/MS质谱

216用本发明进行一个细胞的分析，得出细胞里的色氨酸的代谢物质和组氨酸的代谢物质在细胞里局部存在的位置模式图

217用本发明进行一个细胞及一个颗粒的直接分子解析，得出的组氨酸的代谢物质在一个颗粒里的代谢图

218将RBL-2H3细胞用钙离子载体刺激时放出颗粒的画面

219将RBL-2H3细胞用钙离子载体刺激时，捕获到细胞外成分时的质谱

220在219里，组胺的谱峰的附近的放大图和组胺的结构式

223用维甲酸将P19细胞进行细胞分化诱导前的形态和采取一个细胞的试样

224用维甲酸将P19细胞进行细胞分化诱导后的神经分化细胞的形态和从中只选择性的采取一个细胞的试样

225用维甲酸将P19细胞进行细胞分化诱导前的一个细胞的质谱

226用维甲酸将P19细胞进行细胞分化诱导后的一个细胞的质谱

227在上述分化诱导前后，在分化后显示特殊的t值的谱峰的m/z和t值

228227的谱峰的MS/MS质谱和鉴定了的分子结构

229上述m/z 118.1的谱峰强度的分化阶段依赖关系

230采取一个Hep G2细胞的录像观察画面

231药物奎纳克林的药物代谢过程

232在一个细胞里捕捉奎纳克林的药物代谢物质的质谱

233用刺针从耳垂采取一滴血液

234刺针(金属制)

235血液

236添加的电离辅助溶媒

237直接采取血液后用本发明测定的质谱的结果

238为了做比较，只有电离辅助溶媒的质谱

239植物(天竺葵)叶子的显微镜放大图和直接采取一个细胞试样的样子

240根据本发明得到的直接采取植物(天竺葵)叶子的一个细胞的试样的质谱

241植物(天竺葵)茎的显微镜放大图和直接采取一个细胞的试样的样子

242根据本发明得到的直接采取植物(天竺葵)茎的一个细胞的试样的质谱

243根据t检验得到的叶子里特殊的谱峰和茎里特殊的谱峰的探索表

244叶子和茎的m/z 178的局部存在的样子

245叶子和茎的m/z 311的局部存在的样子

246导入稳定性同位素的组氨酸

247在含有导入稳定同位素的组氨酸的培养基里放置的大鼠肥大细胞的质谱

248组氨酸和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后1分钟)

249组氨酸和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后10分钟)

250组氨酸和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后60分钟)

251组氨酸代谢物质之一的组胺和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后1分钟)

252组氨酸代谢物质之一的组胺和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后10分钟)

253组氨酸代谢物质之一的组胺和其同位素的谱峰(注入稳定性同位素后60分钟)

254用有溶媒路径细线的纳米喷雾电离细管(细管)检测一个细胞试样时的总离子色谱(TIC)

255用没有溶媒路径细线的市面上出售的纳米喷雾电离细管(细管)检测一个细胞试样时的总离子色谱(TIC)

256在前端捕捉的细胞成分液中，添加电离辅助溶媒，使高分子到低分子的沉淀成分通过用电离辅助溶媒的喷雾向前端移动，同时被提取溶离的样子

257在前端捕捉的细胞成分液中，前端里侧的分子亲和基捕捉的分子成分，随电离辅助溶媒的喷雾向前端移动的同时，被提取溶离的样子

258在前端捕捉的细胞成分液中，与在前端处配置的树脂表面的基团有分子亲和性而被捕捉的分子成分，随电离辅助溶媒的喷雾向前端移动的同时，被提取溶离的样子

259加上直流高电压

260加上脉冲高电压

261加上与直流高电压偏压重叠的正弦波电压

262加上与直流高电压偏压重叠的矩形波电压

263加上与直流高电压偏压重叠的锯形波电压

264MALDI-TOF用试样板

265一个细胞内成分的液滴或在纳米喷雾点样之后，添加激光脱附电离用的基质溶媒液

266一个细胞成分的MALDI-TOF质谱

具体实施方式

一个细胞的大小，有从直径为1微米的很小的细胞，到像鸡蛋那样用肉眼能充分看得见大小的细胞，在其中，像神经和鸡蛋等大的细胞，细胞内的容积也大，含有的成分也多种丰富，也就容易取出细胞内的成分。所以解决课题的主要目标是，考虑取出细胞内成分很困难的直径为10微米左右的普通大小的细胞就能应付几乎所有的情况。

但是，那个细胞内体积在1皮升以下，细胞内细胞器就是其1/10以下。并且其中包含的分子数在一种分子为100万分子左右，是现在的质谱仪的检测界限，灵敏度也成为非常严格的对象。像那样的微小世界里的操作，和用超微量的试样体积将超微量的分子电离、检测、分析是很大的课题。而且，实时性很重要，能够捕捉细胞在发生某种变化的瞬间，那一瞬间，能够吸取被指定的一个细胞里的位置的成分是有必要的。

图2是在本发明里用质谱分析法检测细胞内分子时使用的纳米电气喷雾电离装置的一个实施例子，纳米喷雾电离细管1是将那样的绝缘体(多数为玻璃和塑料)细管或金属细管直接地或者是经过加热等工序延长、使前端的内部直径优选变细为0.1到100微米左右之间的细管，在这个细管外侧将金属(金或镍等)用溅射法或蒸镀法进行表面涂布6。在这个细管里放入试样溶液，添加电离辅助液(在正离子模式的时候通常用甲酸、乙酸，有时用氨或甲酸氨等挥发性的盐，在负离子模式的时候用氨等，也用与乙腈或乙醇等的混合溶媒，肽或蛋白质、核酸等作为对象时，也用提高有机溶媒的水含量的混合溶媒等)，在1的前端，用离心力和压力将试样调整溶液填满到细管前端。

在这项操作之后，与质谱仪2的试样导入口几乎在同一个轴上，离这个导入口数mm到数cm处设置1的前端，在1的导电性涂布部6和质谱仪2的试样导入口之间，理想的是加上数百V到数kV的高压直流电场4，生成非常微小的带有电荷的雾状液滴。这是纳米喷雾5。以往的电气喷雾法是，试样液从加上高压电场的细管里出来时被很强的气流所碰撞，像喷雾器那样将试样液雾化。虽然将试样分子电离，此时形成的雾状液滴很大，并且将很大的液滴导入质谱仪并不好，所以只把喷雾边缘的小雾滴部位导入质谱仪。这样，与扔掉几乎全部试样相同，不到那个地步也不可能导入、检测超微量的一个细胞的成分。只凭借电场引起的纳米喷雾所生成的雾状液滴是非常微小的，其流速为每分钟数纳升到数十纳升，并且液滴很小，电离细管和测定仪器的试样导入口是几乎同轴方向的在一条直线上，能在数mm到数cm的间隔处设置，其中多数被直接导入质谱仪，电离效率很高引人注目。纳米喷雾、纳米喷雾电离细管，能将前端的口径制作成数微米左右，具有在前端处吸取一个细胞的体积的最合适的大小。用此纳米喷雾电离细管吸取细胞成分，在前端处保持其成分，移动容器，不使试样散失，使试样局部存在，直接的高效率的电离，导入测定仪器，这些是本发明的特征要素。

像这样的纳米喷雾电离细管1，即使里侧被导电涂布，或里侧和外侧的两方被导电涂布，或全体用像金属那样导电性的物质形成，或细管本身没有导电性而在细管里的试样溶液里直接插入电极、加上电场也能起作用。像这样，实现纳米喷雾电离的电离细管1能从细胞中吸取数nL左右的溶液，同时理想的是，从电离细管后端添加、掺入上述电离辅助液，使超微量的细胞成分液局部存在于前端处，稳定的进行纳米喷雾(像后述那样，关于稳定化也有结构要素。参照图29，30)，直接使用这个尖端1来吸取整个细胞或细胞内液(或必要时也吸取细胞外液)，就那样在细管前端里保持住细胞液，并且仅仅从与其前端相反的后方添加、掺入上述电离辅助液，用简单的操作调制细胞内液并直接导入进行质谱分析的电离试样，这是被首次发现，并在世界上首次确立这个方法。因此，用非常简单的操作，像细胞内液那样的超微量的体积中至今还未能检测出的仅有一点的分子和离子，吸取捕获它们，现在的质谱仪的灵敏度也可以，用质谱法直接的，并且细胞发生变化时也能边直接观察着，或者细胞内的细胞器等特殊部位的，检测出细胞液里含有的分子，鉴定分子等分子探索和鉴定，进而能够高速的阐明分子机构。

图3是模式性的表示，用上述纳米喷雾电离细管1，刺在显微镜载物台9上的培养皿里培养的细胞8的样子。在此同时用物镜11和适当的照明光学系统(在此省略记载)的组合同时观察到细胞8，为了得到可以进行画面解析等的录像画面，调整录像机12使CCD等的摄像元件的位置在物镜的成像焦平面上。根据这样的设置，不仅是用眼睛，用放大的录像画面监视细胞、记录细胞的举动，还能用画面解析法对细胞等对象的差、位置·面积变化等动态变化进行自由的捕捉，还可以边观察被用荧光标记的分子或离子的局部存在、移动和增减等，边在细胞发生变化的瞬间等任意的时机，像吸取操作13那样吸取细胞8的内液和细胞器或观察到的微小区域内的局部成分，像这样能够在细管1的前端里直接捕获细胞内液等，并且几乎能实时的用纳米喷雾电离法将试样电离导入质谱仪。

图4的上图与1图同样为在本发明中用质谱法检测细胞内分子时用的纳米电气喷雾电离装置的实施例，纳米喷雾电离细管1是在此细管外侧施加金属涂布6。但是，像下图的纳米喷雾电离细管1’那样，没有导电性涂布部6、前端是微细口的细管，在内部的试样调整溶液里插入外接高压电极14，直接在试样液里加上4数百V到数kV的高电压，也能引起纳米喷雾。并且这个细管，像气体色谱法里经常使用的毛细管那样的不是锥形的细管也可以。用这个细管吸取的成分，使毛细管内的分离媒介物(像整体柱等)就那样的移动，分离后，从溶出端处用纳米喷雾电离法能将成分导入质谱仪(参照后述图45)。这时的电离法，对于极性低的分子来讲，还要在喷雾区域里照射紫外激光、氙灯、氘灯等的高亮度光，也可以引起光激发电离法。并且，不更加扰乱引起纳米喷雾的电场梯度面，像在纳米喷雾电离细管和放电端子处交替的加上高电压，能引起大气压化学电离法的电晕放电，以下是来说明，用最广的应用范围、简单的操作可以实现的纳米电气喷雾电离法。

图5是像这样形成的统一型的系统的实施例，用录像显微镜11，12观察左侧的培养皿15里的培养液16中培养的细胞8，边放大观察，边同时记录细胞的动态或画面解析，捕捉其变化。在监视器17的左侧画面19中可以看到它的画面。来自录像机的信号被传到计算机18的录像板上，作为被进行画面解析的数据记录并存储下来。将细胞8作为目标，用该纳米喷雾电离细管(以下称为“电离细管”)1或1’刺入该细胞，并且吸取被捕获的细胞内液，原封不动的或混合电离辅助溶液后，直接手动或自动的固定在质谱仪的纳米喷雾离子源上，尖端和质谱仪2的试样喷雾导入口之间加上高电压，发生纳米喷雾，能用质谱分析法(离子阱质谱法、串联四极杆质谱法、Q-TOF法、离子阱-TOF法、FT-MS法等、或是这些的组合等)检测出捕获的细胞内液里的多数的分子。它的质谱20也并排的显示在监视器的画面里。根据这样的系统，至今为止未曾有的，边观察细胞，边在任意的时机，或活细胞的形态变化或合乎目的举动的瞬间里，能够直接检测探索细胞里(或细胞外)的分子。因为吸取细胞内液所捕捉的量是微量的，捕捉而造成的细胞内液的减少有可能会给细胞的举动带来影响，但是在此之后到细胞内液量的大幅度减少为止，能够数次连续捕捉细胞内液、检测分子。至少最初捕获细胞内成分时，这个分析操作给细胞带来的影响是最小的。

细胞内或生体组织中的细胞里，存在着庞大的数量的分子，应答来自外界的各种各样的因子，持续变化，检测微量的重要的多数的活性分子，有时被共存的其它的大量的分子所掩盖。例如在细胞外加入刺激物质，将细胞添加到细胞外液中，形成抗原等刺激因子等应答外部因子的环境，和时间共同发生很大变化的细胞周期中，找到使这个细胞发生变化的分子是什么的手段很必要。在本发明中，细胞活着的状态下表现出某种形态学的变化时，能够直接检测出细胞内外的分子，可以说能够检测出细胞内外的分子，其次，如何抽取或探索重要分子的手法的提供是不可少的。

在本发明中查找重要的分子，求从两个不同状态下的细胞成分液中得出的质谱21a和21b的差(这时以质谱作一个例子，ICP质谱分析等分子和离子归属性高、能明确测定谱峰的分析手法的话，哪一个都行)(参照后述图52)。因此，像22(a-b)那样能得到质谱差。质谱的时候，因为一个谱峰是由一个分子带来的，用质谱仪的前端的滤质器选择此分子量，随后在被称为碰撞室的地方进一步导入气体分子与被选择的分子互相碰撞毁坏(称为碎片化)，将被选择的分子的毁坏了的分子碎片进一步的在质谱仪里的后端的滤质器和飞行时间型质谱分析部进行捕捉，能得到像23那样的质谱。称此为MS/MS，或更进一步实行高维的MS/MS/MS分析。用能看到这个质谱的分子的特殊碎片方式，能够鉴定这个分子(图6)。

图7是，在图6中出现的各个细胞状态的全部质谱中的谱峰里，将设定的某个界限值以上的强度的谱峰全部用计算机程序，对想做比较的两个状态的细胞之间的数据进行比较，用t检验调查状态A里特殊的谱峰的例子。谱峰名24在此原封不动的使用m/z，其与其精确质量m/z 25以及属于状态A还是被作比较的状态B的其中一方的t值26像一览表那样表示出来。由该图看出，从一个细胞得出的多数质谱中，A的状态里特殊的谱峰从上按顺序数，与属于状态A的属性指数的t值被同时表示，t值为100，是表示完全100％的状态A的特殊的谱峰。将这样的t检验作为指标，检测某个状态某个时间或某个刺激后的特殊的或在某个细胞的处理(添加药物等)中特殊的谱峰(质谱分析时就是分子)，从而进行某个分子在某个状态某个时刻特殊的出现、或增减或消失等的分子探索，能够得到调查分子机能及全体分子的机构的有用的情报。在解析手法里，其它的有主成分解析、群(cluster)解析等的多元分析之外，相关解析或回归解析等也有效。

图8是显示图7所表示的在t检验中看到的一个m/z 112.1的谱峰在哪个试样里能特殊发现的例子。左侧的11个细胞的试样里发现了这个谱峰，右侧的6个细胞试样里没能检测出这个谱峰。总之，这个谱峰所表示的分子是，在左侧11个细胞的状态里是特殊的，只有在这个状态里才能出现的分子。此出现的概率，表示对于某个状态的依赖性或属性在其t值中为99％。像这样，以有个性的细胞的举动和其分子机构的生命科学作为终点的研究，根据本发明，至少对于一个一个的细胞来讲是可能的。一个一个的细胞的举动分析和分子动态分析及分子探索分析的任意的组合或全部的组合能够同时进行，本发明提供了迅速的直接的阐明生命现象和其分子机构的手段。

在图9中综合的表示出上述的实施例。用纳米喷雾电离细管(电离细管)1位置特异性地捕捉细胞8里的细胞质和细胞内细胞器的颗粒里的成分，之后，在捕捉试样液里混合上述电离辅助液，在此电离细管和质谱仪的试样导入口之间加上高电压，引起纳米喷雾，将试样分子电离，照原样导入质谱仪，比较得到的颗粒里的成分的质谱30和细胞质成分的质谱31，其中关于m/z 112.1的谱峰，将细胞质及颗粒的不同的细胞内部间的属性用t检验进行评价32。结果是此谱峰强度是在从颗粒捕捉到的质谱群A里有，不在从细胞质里捕捉到的质谱群B里。用滤质器选择m/z 112.1的质谱峰所表示的东西，根据MS/MS解析，确定其分子构造，从其MS/MS类型能够鉴定组胺，能确定颗粒里特殊存在的东西是组胺。此外还找到了其它各种各样的分子。这些分子不仅仅与同时被观察到的细胞举动和部位特殊性之间建立关系，还通过与其它被检测出的分子群之间建立关系，不仅能知道生命现象的分子机构，作为新的医药品的候选，或者要是癌细胞的话能关联到发现病因分子和阐明机构，并且开展到开发诊断方法。到目前为止在世界上还未曾有过，用这样的分析过程，从一个细胞里，在这样短的时间内，并且边观察其细胞的举动，边检测分子，从很多的分子谱峰中，评价某个分子谱峰包括细胞的举动或归属所处的细胞的状态的归属度，进而到鉴定其分子的例子。

图10是，用过敏起因细胞的肥大细胞的模型RBL-2H3细胞系实施本发明的例子。这个细胞是像图1所表示的那样在细胞里面有颗粒，有选择性的在其颗粒中储存所谓引起过敏性反应的分子化学介质的组胺和血清素。质谱203是有选择的用本发明手法确定的电离细管来采取细胞里的一个颗粒内的成分，用纳米喷雾电离法导入到质谱仪里从而得到的质谱。在放大其中一部分的质谱里检测出被认为是205里m/z 112的组胺，206里的m/z 156的组氨酸，207里的m/z 177的血清素的谱峰。

另一方面质谱204是，有选择性的用本发明手法确定的电离细管采取一个细胞的细胞质，用纳米喷雾电离法导入到质谱仪里从而得到的质谱。在放大其中一部分的质谱里检测出被认为是209里的m/z 205的色氨酸，210里的m/z 221的5-羟色氨酸，并且在此还有208里的m/z 177的血清素的谱峰。

但是，仅有这个母蜂的话，相同质量数的物质在自然界里还会有很多，不能确定。要确定有两个方法。一个是用质谱仪里的滤质器只选择这个谱峰，顺便用在气体分子碰撞等的分子碰撞室中毁坏被选择的分子，用质谱捕捉其分子碎片(断片)，从其特殊的断裂方式鉴定分子，就是所谓的MS/MS法。另一个是用像FT/MS装置那样的高分辨能力的质谱仪，高质量精确度来检测出谱峰，用精确质量数证明没有其它的候选。

在此像图11所表示的那样，对图10的各个谱峰进行MS/MS分析。其结果是，从MS/MS质谱211和数据库(像Maaa Bank.jp(http://www.massbank.jp/index.html))的比较中，能够鉴定m/z 156.098的谱峰确实是组氨酸、质谱212中m/z112.098的谱峰是组胺、质谱213中的m/z 205.107的谱峰是色氨酸、质谱214中的m/z 221.156的谱峰是5-羟色氨酸、还有质谱215中的m/z 177.118的谱峰是血清素。到目前为止，以往是收集很多的细胞研碎做前处理，有时用分离法，仅仅是调整试样就花费半天时间。此后，才测定分子。而且得到的结果是平均值，不能反映出某个细胞的明确的状态。

在本发明中，在得到这个结果为止，观察细胞、采取试样成分要花30分钟，测定要花30分钟，最短要1个小时左右能鉴定分子，其明朗的结果和用与以往无法相比的短时间进行分析是它的特征。

各个谱峰是否能在颗粒里特异的检测出来、还是能在细胞质里特异的检测出来，或是这两者都不能检测出来，用t检验进行解析的结果记载在图10的放大质谱图上的m/z值的下面。这个时候，使完全在颗粒这一侧的t值为+100％、在细胞质这一侧的t值为-100％进行解析，所以m/z 112的组胺、m/z156的组氨酸表示在颗粒里面特殊存在。另一方面，m/z 205的色氨酸、m/z 221的5-羟色氨酸几乎在细胞质里面存在。意想不到的是，所谓在颗粒里储存的m/z 177的血清素，用这个分析首次知道在颗粒里和在细胞质里大约同样程度存在。像这样用本发明，不仅能鉴定分子、还能直接的并且短时间的表示分子在一个细胞的内外的局部存在。

综合上述的结果，像图12所表示的那样，能够推测这些分子在一个细胞里的代谢路径。综合已知的代谢路径和用上述分析法所知道的分子的局部存在，在细胞质里血清素是从色氨酸经过5-羟色氨酸被生物合成的，通过运送被送到颗粒里面，这种想法应该是妥当的。但是，组胺是从与其同样在颗粒里局部存在的组氨酸被生物合成的，应该就那样积存在颗粒里。像这样能够明白细胞里的分子的代谢路径和其局部存在，真正的弄清分子机构，表示能在短时间内并直接的利用本发明。现在用质谱法进行代谢分析(俗称代谢组学)很盛行，但这些全是将多数的细胞作为试样使用，用本发明，可以说能够首次带来实现实时的一个活细胞代谢组学的时代。

用上述手法验证了能够追踪一个细胞里的更进一步一个颗粒里的分子代谢。采取细胞里一个颗粒的内容物，像上述那样解析更多的谱峰，像图13那样，查找一个细胞里的一个颗粒中的分子代谢过程(这也称为一个颗粒内的代谢图)。各个分子名字的下方的四方框里记载着m/z和它的t值。其结果，与以往用多数的细胞确定的代谢图相比较，在路径上有“？”符号的咪唑-4-乙酸盐在颗粒里面基本没有，在细胞质里有很多，这表示在颗粒里缺少代谢过程的可能性。像这样作为能够追踪分子的代谢·运送过程和一个细胞内的局部存在性的手法，可以利用本发明。

本手法也能用于检测放出到细胞外的分子成分。图14是与上述相同的RBL-2H3细胞，像218的录像画面那样，将颗粒放出到细胞外(称为开口放出)的时候，吸取采集其细胞周围的细胞外液，进行同样的分析。因为放出到细胞外液里的颗粒内成分立即在培养液中被稀释，是特别需要高检测灵敏度的情况，得到质谱219，放大其中一部分的质谱220里面，检测出颗粒里局部存在的组胺的谱峰。

质谱是一个分子表现出一个谱峰。因此，复杂的分子结构的不同种类的细胞是，使细胞共同的多数的分子谱峰和各个种类的特殊分子谱峰混在一起，表示某种细胞的质谱。同时，其成分的变动反映了被认为是细胞的不同举动的一个原因的细胞周期的不同、微小领域里的环境的不同等，也能够评价相同内脏器官中会癌变的部位及不会癌变的部位、或是正在发展中的中间部位等的差异，能够利用到病态因子解析中。

像这样的质谱的谱峰构成的不同，例如用主成分解析等多元分析就很有可能进行统计学并且效率高的解析。

图15是，通过比较不同种类的细胞之间的一个细胞的质谱，尝试能否辨别细胞种类。表示在5种不同的细胞种类里捕捉到的细胞质的质谱和细胞的显微镜图像。唯有这些它的差是不明显的，以它们的质谱为基础进行主成分解析。用本手法一个一个的分析7种细胞系的细胞，将其质谱进行主成分解析的例子。图15的122里是各个细胞的形态图像和其质谱，还有其主成分解析的结果得到的二维得分绘图(score plot)中各个谱峰对于第一主要成分和第二主要成分的贡献的二维图画，做成这个图就能明白各个细胞种类会形成占有某个区域的群体。因此，我们知道了细胞种类的分类，就是说，每个细胞里的低分子的种类的分布在细胞内是不一样的。这表明本手法是能把像确认有关细胞分化的分子成分和细胞周期等的，细胞内分子变化与状态结合起来的方法。图15的123是，用二维装载绘图(loading plot)表示其质谱中的各个谱峰(图中的各个点相当于各个谱峰)的分布。中心区域是共同性高的分子谱峰，越往周围去越是特殊性高的谱峰，因此能够表示哪一个谱峰是细胞种类特殊的成分，以后进行MS/MS解析也能用于辨别谱峰。

现在面向着再生医疗的确立，iPS万能细胞等细胞分化因子的探索和分化控制法的确立正引起人们的注目。历来关于细胞分化，从遗传基因和蛋白质等所谓指挥塔的遗传基因，到被翻译的蛋白质为止，就是说关于上游的分子，尽管是平均值的科学但是也经过了非常好的研究。可是最终产物的低分子的举动，因为基本没有什么分析方法，所以没有被研究。但是，细胞分化因子里有很多低分子被人们所知，其研究是特别重要的。

因此本发明验证了这个细胞分化机构及因子的探索里具有什么样的可能性。图16是用一个细胞追踪经过维甲酸处理分化为神经细胞的P19细胞的分化。画面223是分化前的P19细胞的形态，用电离细管捕捉其细胞质成分。维甲酸处理这个细胞后，像画面224那样，两天后细胞分化为带有突起的神经细胞。但是从这个图中能知道，不是所有的细胞都分化，有必要仅从分化了的细胞中采取细胞质。在此，我们认识到能用一个细胞而且有部位选择性的采取试样成分的本发明，在这个领域的应用里占有优势。

上述的细胞分化的前后的质谱分别是225和226。根据其谱峰的t检验，抽取分化后增加的谱峰，其t值是-99.37％以上的谱峰归纳在表227里。可以说这些分子是通过细胞分化显著增加的谱峰。用MS/MS解析其中的m/z 118.1的谱峰，像图16的228那样得知是甜菜碱，它的谱峰像图16的229那样，伴随着分化一起增加。现在，对于其它的分子谱峰也在进行解析，正在综合的阐明细胞的分化与这些发生增减的分子的关系。这个手法能有效地利用在当今话题中的iPS细胞的分化因子的探索和机构的阐明中，今后将成为能够加速再生医疗的技术开发的分析手法。进而，从受精卵的受精后的卵裂开始的发育过程里的各个部位的命运的解析领域里，也可以利用本发明。

现在，因为抗癌药等给人带来很大负担的药物的副作用因人而异，调查每个人所使用的药物在体内的代谢状况，设计最适当的药物治疗方案的定制医学(Tailor-made medicine)的开发正在进行之中。本发明，能利用在定制医学(Tailor-mademedicine)上，并且还能利用在制药企业有效的研究开发医药品的药物代谢。为了验证，用人体肝脏细胞的模型细胞系的HepG2(画面230)，验证了用一个细胞能否追踪药物代谢。将作为疟疾的特效药被使用的奎纳克林作为药物，其代谢物像图17的231那样的物质已被人们所知。将它注入到该细胞的培养液中，用一个细胞捕捉细胞质里的成分的质谱232。其结果，得知包含代谢物都能够被检测出来。医药品分子的时候，其母化合物和其代谢物已经被知道的物质有很多，问题是要是知道其代谢的状况，以及细胞内的各个部分或在组织里的代谢机构和代谢方式就足够的情况很多，注重定量性的情况很多。像这样在被决定的分子的高灵敏度的定量分析中，经常使用串联四极杆质谱仪，根据分子不同而不同，一般来讲，比上述使用的四极杆-TOF型(Q-TOF型)质谱仪灵敏度高出数10倍到100倍左右。并且MRM能够陆续改变两个滤质器的经过m/z的设定的组合，检测出已知分子群，要是已经决定的分子群，能够高灵敏度的连续测定多个目标分子种。利用这个灵敏性，尽管并用注入试样后色谱柱内空间扩大引起灵敏度下降的色谱时(LC-MS分析)，也能用纳米液体色谱分析来分离一个细胞的成分，扩大检测分子的灵敏度和定量性及网罗性。

今后，在医院接受诊断时，本发明具有能够回避用痛苦的打针来抽血的可能性。像图18那样，用针轻轻的刺耳垂等，就那样的采取一滴血液，根据本发明的手法要是能用纳米喷雾电离进行质谱分析的话，临床检查的多项化验就有可能被一次微量的采血和测定其质谱所取代。现在使用中的血液中逸出酶群，在捕捉的试样里添加纳升水平的各种特殊的基质，发生一定时间的反应后，消除从基质形成的各种酶特殊的生成物，要是已经决定了的分子就可以用高灵敏度的串联四极杆质谱仪测定。实际验证其中的一部分，仅用从耳垂采取的血液就得到了质谱237。为了证实，与添加了电离溶媒的质谱238相比较，得知能够检测出不同分子谱峰。合乎临床检查项目的分子谱峰的检测法和解析法也用与上述相同的手法能够被决定。虽然图18里电离细管不被用于刺入皮肤等的生体组织，但是也可以使用电离细管直接刺入。那种情况下，在细管外部，镀一层硅油和糖链高分子等使刺入能够顺利进行的润滑性材料也可以。作为其他的体液，尿、唾液、眼泪、汗等也能利用本测定方法。

到此为止测定的对象是动物细胞，对于植物细胞，作为食品材料的分析和残留农药的分析、植物种类的鉴定、植物的营养状态或病态的监控、有用成分的检索和含有量的分析等，有各种各样的应用。

图19是，直接在显微镜下用纳米电离细管扎进天竺葵的叶子和茎的一个细胞里，捕捉其成分的结果。画面239是叶子的部位的显微镜画面，放大后不仅是绿色的细胞，白色的叶绿素少的细胞也混在其中。将电离细管扎进白色的细胞里，用与上述同样的手法分析细胞内成分得到质谱240。另一方面，天竺葵的茎(画面241)更加容易，得到像242那样的质谱。对于像这样得到的质谱的各个谱峰，t检验的结果是表243，叶子里特殊的分子谱峰(左列)和茎里特殊的谱峰(右列)有很多。其中，像图19的244所表示的那样，m/z 178.70的谱峰所指的分子是茎里特殊存在的成分，图19的245所表示的那样，m/z 311.17的谱峰所指的分子是叶子里特殊存在的成分。像这样，本发明验证了对于植物也能够在细胞内分子鉴定和探索中直接使用本手法。

生命现象是经时的在发生有生气的变化。追踪其分子变化，并且通过将各种各样的分子标记法和本手法合并，更加扩大其解析能力。

图20提示了用本发明追踪细胞内外的物质移动和物质代谢的手法。例如在细胞外液里添加标记分子或能够追踪的同位素分子(以下总称为示踪分子)85，在本手法中用质谱分析法将其质量的质量位移(mass shift)等的特殊性为指标能够进行追踪。标记分子85以下述方式存在：被吞进细胞内、在细胞里移动存在于细胞内液中88，或被细胞内细胞器吞入的标记分子86或其自身作为追踪用同位素分子；用本手法检测它的局部存在、被侵吞到细胞膜里、或作为与细胞膜结合的标记分子或追踪用同位素分子87在捕获膜的成分时被检测出来，在细胞里移动时检测出作为代谢或被修饰的标记分子或追踪用同位素分子88，检测出被细胞内细胞器吞入的标记分子或追踪用同位素分子89或其代谢物89’，或检测出移动到核里乃至被侵吞的标记分子或追踪用同位素分子90，检测出分泌到细胞外液里或再放出的经过代谢或被修饰的标记分子或追踪用同位素分子91。根据这些用一个细胞能够阐明细胞内外的物质代谢和分子移动等的情况。

图21是像这样从肥大细胞的模型RBL-2H3细胞的外部有选择性的吞入到细胞内颗粒里的奎纳克林(荧光物质)的追踪例子。从细胞外被导入的奎纳克林分子，细胞质质谱92里的93的放大谱图也没有被检测出来，检测出颗粒的质谱94里的比较弱的谱峰95，不仅限于细胞质，还能到达颗粒。从其MS/MS质谱96中，证实了肯定是奎纳克林分子。本手法的空间分辨能力决定于细管1的前端口径。现在的前端口径是1微米，所以空间分辨能力也就是1微米。用本手法能够阐明现在多种成分的分子同时协调地带来药效的中草药类医药品的药效机构。首先，测定中草药成分的质谱，将中草药成分按照混合物的样子注入到目标的细胞或组织的培养液及回流液中，通过在观察细胞的形态的同时分析移动到细胞内的成分的谱峰，能够检测出移动到细胞内、将会现出药效的被吞入到细胞里的成分分子。其经时变化会告诉我们其药效成分的分子在细胞内的动态信息。从目前的一个药效一个分子的医药品的观点看来，为了开发更加综合的、多种成分协调型医药品，本发明将提供至今不可想象的可能性。

图22是，用稳定性同位素标记的氨基酸组氨酸246，追踪组氨酸是以什么样的速度被吞入到细胞内颗粒中的，是怎样被代谢出去的例子。一个细胞的细胞内一个颗粒成分的质谱247中，检测出比组胺的谱峰的质量数大1个的又一个稳定性同位素的组氨酸被运送到颗粒里面。1分钟后(248)、10分钟后(249)、60分钟后(250)同位素的组氨酸增加，包括组氨酸从细胞膜经由细胞质被运送到颗粒里的速度也被检测出来。并且，伴随着这个，其积蓄的代谢分子的组胺在1分钟后(251)、10分钟后(252)、60分钟后(253)稍微晚一些的积蓄在颗粒里，到最后会积蓄相当的多。将采取的成分捕捉到电离细管后，从该细管的后端添加高效率电离氨基示踪分子等使它在电离辅助溶媒中混合与试样成分发生反应，为了能够以更高的谱峰检测出分子，用其MS/MS分析，有可能将进行包括高分子的结构解析得以实现。

此外，测定细胞内成分或血液等体液中的酶活性时，使底物混入电离细管后端添加的电离辅助溶媒中，或是用纳升注入机添加一定量的含有底物的水溶液，不久后与试样中的酶发生反应，一定时间后通过测定该底物和反应物，能够知道试样的酶活性。

更进一步，与细胞内成分或血液等体液中的特定成分相结合而消失的成分用和上述同样的方法，将仅有一点的被结合分子添加到试样溶液里，能够评价其结合成分的浓度和结合成分的分布及结合率。利用标记化合物，将会对扩大本手法的可能性给予更高的期待。

确保本手法的定量性也是重要的课题。因为对象物是1皮升以下极小量的，内部标准添加相当困难。但是，引起纳米喷雾，使用溶出溶媒和电离溶液的混合液72时，在其中添加一定量的同位素或者不是天然存在的内部标准物质，能够校正一个细胞的质谱的各个谱峰强度。进而，我们查明添加的溶媒的谱峰98可用作质谱强度基准。图17里表示的是其中的一个例子。这是溶出的溶媒和电离溶液的混合液72里所含有的邻苯二甲酸二辛基酯由来的谱峰。因此，能够简便的校正谱峰的强度或将其标准化。

像上述那样，在适用于以各种各样的细胞为中心的分析中发现能够验证本发明的广泛适用和迅速的高效率的分析。在实行验证中，无论作为装置、还是作为手法，从各种各样的需求进行了各种各样的发明，将在后半部分记载这些。

图24表示在高效率的实施本发明的过程中，用质谱分析法检测一个细胞里的分子时所使用的一系列的手法及必要的系统。在使用的导电性细管中形成的纳米喷雾电离细管(以下简称为电离细管)1，在这里是将外径最大是4mm以下的绝缘体(多数是玻璃或塑料)细管用加热等手段将其延长，使其越向前端变得越细，前端的内部口径最好是与捕获对象的细胞或细胞内的细胞器的大小相同或更小，在这个细管的外侧用溅射法或蒸镀法涂布6金属(多数是金或镍)而带有导电性。

在本发明中所说的导电性细管是，里侧、外侧、两侧或材料自身具有导电性表面，导电性表面就是，电离细管材料自身有导电性也可以，涂布或涂抹导电性物质或做化学处理也可以。不是细管全部都具有导电性领域也可以，只要前端部分被广泛覆盖，其他部分因为加上电压，从接触电的地方到前端部为止只要电连通也可以。作为导电性材料，有导电性金属、导电性有机材料，并不只限于这些，并且作为导电性涂布的方法有蒸镀、溅射、涂抹等，也不只限于这些。

导电性细管与细胞或微小领域的液体相接处的前端，内部的液体试样能够容易纳米电气喷雾电离，前端口径尽量细小，为100微米以下为最理想，口径大了纳米喷雾的液滴也大仅有一点的试样就会迅速消失、并且灵敏度很不好，电离效率也会低下。理想的口径为50微米以下，更令人满意的是10微米以下尽量小的口径，其喷雾的液滴也小，电离效率也好，与采取的细胞或细胞内细胞器的大小及微小领域的采取大小相同或者比它们还小是最为理想的。作为最小的口径，能有吸取细胞内液体或微小领域液体的大小就足够了。最小口径与采取的试样的粘度及细管前端的里侧的亲和性相关，粘度越大时，不将最小口径扩大的话，试样液也不会吸进细管里。与细管前端里侧的亲和性越高，即使不利用毛细管现象吸取，在不再进行加压时一定程度上试样液也会自动的进入细管里。

这个细管里从一个细胞或几微米以下的细胞内细胞器吸取试样溶液3，从电离细管的后端部用具有像胡须那样的细管的艾本德公司制造的微量移液管尖端等从前端试样液面的附近添加电离辅助液(正电荷模式(positive mode)的时候，通常使用甲酸和乙腈或醇等)，利用振动等除去气泡后，根据需要，向细管1的前端用离心力和压力使试样调整溶液充满细管的前端。

在此操作后，在几乎与质谱仪2的试样导入口的同轴上，离此导入口几毫米到几厘米地方设置细管1的前端，1的导电性涂布部6和质谱仪2的试样导入口之间，加上令人满意的几百V到几kV的高压电场4就会发生带电的非常微小的雾状液滴。这叫作纳米喷雾5。并且这样的纳米喷雾电离细管(简称电离细管)1是导电性细管，为了确保导电性，不仅是其外侧，里侧导电涂布也行，里侧和外侧两方导电涂布也行，或全体具有导电性例如是用金属形成的也行，均能发挥作用。

像这样，形成的纳米喷雾电离细管尖端1能从一个细胞吸取几皮升以下程度的溶液，同时，通过添加上述电离辅助液，能稳定的进行纳米喷雾，显微镜载物台9上的培养皿15里的在培养液中活着的全部细胞8或细胞8的内液或像颗粒那样的细胞8里的细胞器(或者必要时当然细胞外液也可以)，在吸取它们时直接使用这个细管1，照原样的将捕捉到的细胞液10，或将上述电离辅助液像上述那样添加到捕捉到的细胞液10里，例如电离辅助液主要以有机溶媒为主的话，蛋白质等会沉淀并结合到细管1的内壁上不动，用电离辅助液的有机溶媒成分里低分子能够溶出的状态，使用简单的操作将细胞里的低分子群导入电离试样以照原样的进行质谱分析已被我们所发现(参照后述图32)。由此，采取几乎一个细胞的内部液体的操作变得非常简便并且测定分子变得很直接很迅速，用质谱法能阐明像细胞内液那样包含只有极其微量的体积的成分分子。

图24是边用录像显微镜11、12监视器17观察插入到细胞8里的电离细管1的插入，边用将细管1结合到前端的电动操作器的x-y-z轴驱动体35、角度和轴向驱动驱动体36、驱动控制装置38、操作器的操作手柄39操作37细管前端刺入细胞，此时通过吸取细胞成分驱动用管40不将吸取时的振动传到细管1的前端，用吸取细胞成分用的活塞41能够吸取捕捉细胞内成分的活塞驱动体41做驱动13的样子。像这样捕获到细胞内液3之后，从操作器取下这个细管1，添加电离辅助剂移动到质谱仪2的纳米喷雾位置，通过高压电源加上高压4，发生纳米喷雾5，作为质谱分析谱图，发现了内部所包含的分子谱峰的出现。以下带有相同附图标记者将省略说明。

图25是为了解决刺入细胞时的课题而设计的。将上述的纳米喷雾电离细管(电离细管)1刺入在显微镜载物台9上的培养皿15等里面培养的细胞8时，因为在显微镜下找电离细管1的前端是极其困难的事，经常弄断电离细管的前端，这个过程是采取细胞内成分阶段中的一个难关。因此用显微镜上的物镜11和与其相连接的录像机12在监视器17上引导电离细管1的前端到达能观察到的细胞8的指定位置，在此表示为了克服这个困难的装置和手法。每当安装电离细管1到操作器36的前端时，在微米领域里就会被安装到很不一样的地方。其显微下的前端位置如下检测：使用固定在两个以上的位置而进行认识的录像显微装置43-44、45-46，在监视器47上检测细管1的前端三维位置48，用电动操作器的移动步数等在驱动控制装置49下检测其前端位置，随后用驱动装置49也能推断出来在三维的x-y-z及轴方向用几阶段能引导到显微镜观察中的细胞附近。细胞8的位置要是在显微镜的视野中心的话，在显微镜载物台9或物镜11的上下位置作为焦点面能检测出来，因为以往z轴显微镜载物台驱动装置上安装有编码器等装置，将它和上述电离细管前端引导装置相连接。像这样，能自动或半自动的(刺入细胞多数是手动为好)引导最困难的电离细管1的前端位置，由此引导到将要把电离细管1刺入的在监视器17上看到的细胞附近或细胞里，能够使操作变得迅速化、高精度化。此外的附图标记与以前的图相同。像这样，能够克服引导用于吸取试样的电离细管1到微小领域的特定位置的困难。当然最后刺入细胞时等的微妙的感觉是必要的，有时还存在一些问题，也可以将一部分用手动，这样能成功的时候还很多。

图26表示的是进一步从电离细管1吸取细胞内成分到用纳米喷雾电离将试样电离导入到质谱仪里为止的操作的自动化的实施例子。在这种情况下表示的例子是，加上上述，通过注入泵50设置细胞等的微小领域试样吸取管51和电离辅助剂添加管52，必要时吸取和添加溶液，进行自动化。

图27和图26几乎相同，对象是悬浮细胞等不粘着培养皿表面的细胞时，通过前端结合有轻微吸取后的细胞固定用的细管尖端38′的电动操作器的x-y-z轴驱动体35′、角度和轴向驱动体36′、驱动控制装置38′，固定目标细胞，操作37细胞内液捕获细管1的前端，将用于刺入细胞的电离细管1刺入细胞。当然，可以安装里侧被修饰的电离细管，此外也可安装同时外侧也被疏水涂敷或亲水涂敷被加工的能够顺利插入到细胞里的电离细管，另一方面，这些电离细管到接近细胞为止，将电离细管的内部加压，使中途不让细胞培养基的成分混入到前端里，并且从含有液体的组织里形成的穴中漏出细胞内或组织内成分，从上述前端部采取成为质谱分析对象的细胞成分时，图24到图27所表示的系统能够对应并能控制驱动。

图28表示的是纳米喷雾电离细管(记载为电离细管)的表面导电涂布6的变化，基本上前端尖的部分要是被充分的导电涂布或溅射的话，前端空间周围朝着质谱仪试样导入口会形成漏斗状的等电场面，能引起纳米喷雾。因此电离细管全体没有必要被导电性涂布，从与外部电源接线头相接触的部位到前端被涂敷或贴上导电性材料53也可以，只要保持着导电性就可以。这使能容易看到电离细管的里侧，并且给抑制生产成本带来制造上的好处。

图29是将电离细管1里被捕获的液体及表面与电离辅助溶媒有亲和性的试样溶媒亲和性细心材56(以下表示为溶媒路径细线)安装在电离细管里的方案，这个溶媒路径细线可以从前端到后端在线上结合电离细管里侧的一部分的面，也可以不动地在管内部分结合后浮起来。理想的是，特别是在前端附近与电离细管里侧相结合，在很细的前端上，溶媒路径细线也变细，口径不被堵上是重要的。根据溶媒路径细线，像图30所表示的那样，作为一般的纳米喷雾电离细管使用，甚至比其粘度高的一个细胞试样，基本上不中断，能够实现TIC稳定的纳米喷雾254。为了进行比较，没有溶媒路径细线的电离细管中，TIC像255的图那样不稳定，得知在很大程度上一旦不出来后会很难恢复。像这样，辅助溶液里的成分的抽取和溶液的顺利移动对于一个细胞纳米喷雾电离是重要的，像这样改良方法是本手法的又一个关键之处。这个设想，没有表面的涂敷等的一般的被叫作纳米喷雾尖端者当然也能作为有效的技术来使用。同时，安装图29导电性细心材57在细管1的里侧内，通过对其加上电极能更积极的通电和引起纳米喷雾电离。

图31是，将电离细管1的外侧表面进行疏水性涂敷54，将尖端刺入到细胞里的图。根据这个，成为接近细胞膜构造即2层脂质的物性的外侧材料表面，动物细胞的时候，用细管1刺入细胞膜时，发现能非常容易的插入。由此通过插入电离细管1带来细胞8的形态变化给细胞带来的多余反应能被控制在最小限度，并且从插入或刺入的部位55漏出的内部成分也能被控制在最小限。进而在细胞培养液中将电离细管1移动到细胞为止的过程中通过毛细管现象引起培养液混入电离细管1的前端能被控制在最小限，这是来自于尖端的疏水性表面与水发生排斥，到此为止，在电离细管1里注入加压空气防止细胞培养液的混入的操作几乎不需要，能简化操作。在植物细胞里，细胞壁有以纤维素为成分的部分，电离细管1的表面的亲水性化反而是有效的。

这里所说的亲水性表面是，可以将亲水性物质物理性的涂抹到细管材料上，或将亲水性化合物直接或通过间隔物化合结合也可以。作为亲水性化合物来说，包含生物体内的分子表面是亲水性的蛋白质分子、核酸分子、糖分子等以及它们的复合体，作为分子表面是亲水性的蛋白质分子来说，各种酶、细胞因子、肽类激素、抗体、受体蛋白、受体激动剂、受体拮抗剂、受体抑制剂、离子通道蛋白质、通道抑制剂、酶抑制剂等被列举，并不只限于这些。分子表面为亲水性的核酸分子，是单链DNA也可以、RNA也可以、它们的组合也可以。核酸的序列数为几个到几千碱基的范围也可以。这些分子表面是亲水性蛋白质、分子表面是亲水性的核酸以及/或分子表面是亲水性的糖分子，这些成分化学性的结合在细管材料上能够利用。并且作为亲水性物质来说包括羟基、硫醇基、酯、硫醚、阴离子以及/或阳离子等的高极性官能基。作为阴离子官能基来说，羧基、磺酸基、硫酸基、磷酸基等被列举，但并不只限定于这些。作为阳离子官能基来说，氨基、氨基乙基、二甲基氨基、三甲基氨基、胍基、咪唑基、氨基苄基等被列举，但并不只限于这些。并且，磁力珠子的表面与亲和性基相结合，在试样中捕捉特殊成分，在这个电离细管的前端用磁铁诱导捕捉分子的磁力珠子，通过电离辅助溶媒和溶出溶媒的混合液进行纳米喷雾电离也能够测定。

这里所说的疏水性表面是，在细管材料上涂抹疏水性物质也可以，将具有化学的疏水性官能基的化合物直接或通过间隔物结合也可以。作为疏水性物质来说，脂肪族烃化合物、芳香族烃化合物、脂肪酸酯等等被列举，但不只限于这些。作为疏水性官能基来说，十八烷基、十二烷基、己基、有取代基的苯基及萘基等被列举，但不只限于这些。

图32是尽管像这样采取超微量的细胞成分，为什么还能通过纳米喷雾电离细管(电离细管)1的采取使一个细胞的成分的检测能够得到实现。假定一个细胞的体积大约是1皮升，纳米喷雾尖端前端的仅有一点点的部位里吸取·捕捉细胞成分。在其中添加电离辅助溶媒236的1微升，如果就这样充分的混合，细胞的成分会被稀释大约100万倍，其浓度变得比现在哪个质谱仪能够检测的灵敏度都低的远，不能检测。我们也是，至今恐怕大多数的研究者都尝试过，但没能实现直接分析一个细胞，其理由应该在这里。细胞成分本身就是微量的，为了能高浓度并将其保持在前端并以该状态溶出其细胞试样液里的成分，利用电离辅助溶媒和纳米喷雾引起的流动，像这样超微量试样里的分子的检测能够实现。

因此，在电离细管1或1‘的前端部为了留下细胞成分所设定的各种各样的条件是本发明的又一个重要之处。本发明中，将细胞成分捕捉到前端后，在低分子的分析里，利用有机溶媒含量高的电离辅助溶媒236。这时，细胞成分里的高分子成分，特别是蛋白质成分等沉淀，附着在细管的里侧，其中，辅助溶媒使低分子成分从高分子基质中溶出，低分子成分在纳米喷雾中被溶出的是256。因此，用分子亲和性基选择性修饰前端的里侧，在此，在细胞内成分中用亲和性基257特殊的捕捉，用电离辅助溶媒236使其溶出，这些是将一个细胞的分析变为可能的又一个手法。在前端里侧设置有亲和性(亲和、离子交换、疏水性、两离子亲和性等)的分子捕捉树脂和网眼258等，用电离辅助溶媒236溶出、用上述的梯度溶出都是一个手法。

根据上述的设想，像图33那样，采取细胞8的成分液10，对于在电离细管1的前端里被采取的试剂液，从电离细管1的后端轻轻的添加溶出的溶媒或电离辅助溶媒或它们的混合液，之后采用纳米喷雾电离过程。当然，之后添加不同组成的溶媒，通过与前面的溶媒相混合，可以进行梯度溶出。

图34是电离细管1的前端里侧的各种各样的修饰法的图示。疏水性物质表面结合体或涂布61、或者阳离子性物质表面结合体或涂布62、或者阴离子性物质表面结合体或涂布63、或者抗体等受体结合表面64、或者抗原或基质等的结合表面65和里侧均匀涂布58，造成酶等的结合表面66，或者形成核酸类的结合表面67，或者在里侧用纤维状或链状填充物质59或整体结构体充填，用刷子状的与表面相结合的物质60覆盖，上面还能与上述的修饰分子相结合。或者将最近报告的温度敏感性聚合体涂布或结合也能行。

这时，从电离细管1的前端吸取细胞成分后，使这个有分子亲和性的纤维状或链状的填充物质59捕捉成分，之后通过从电离细管1的前端部吸取或从上述细管的后端部注入为了洗出分析对象以外的成分的溶液进行洗出，除去防止电离的盐，之后从电离细管1的后端导入溶出捕捉成分的电离辅助溶媒，能够实现有选择性的高灵敏度的检测分子群。图35是在电离细管1里填充或环状的在前端里侧设置表面具有分子亲和基的树脂68的例子。与上述进行相同的洗净、溶出，能有选择性的对分子群进行浓缩和除盐。

像这样修饰细管1的里侧可以更有效的进行分子浓缩。这个进行里侧修饰的区域可以是尖端里侧全部，不过只有前端才捕捉细胞成分液，理想的是因为上述理由，只有前端附近的限定范围进行修饰，按照目的·状况灵活运用最好。当然，这样里侧被修饰的电离细管的外侧进行疏水涂敷或亲水涂敷等，被加工的能够顺利的插入细胞，并且应当考虑到在接近细胞为止，将电离细管的内部加压，在途中不让细胞培养基的成分混入到前端。通过从含有液体的组织中形成的穴里漏出细胞内或组织内成分，从上述前端部采取成为质谱分析对象的细胞成分时，在纳米喷雾电离细管的前端里侧使分子亲和基相结合，用电离细管的前端捕获特殊的成分是很方便的。

图35是作为修饰里侧的一个例子，在里侧填充色谱分析用的树脂的例子，其树脂的表面像图34的下方所表示的那样用分子修饰也可以。在本手法中，吸取细胞内或微小领域里的成分捕获到电离细管1里，因此仅仅沿着内壁设置该树脂，与吸取液体同时，在喷雾时带来的被浓缩的成分的溶出电离排出会变得很容易。作为将这些疏水性官能基或亲水性官能基直接的或通过间隔物与细管材料相结合的方法及运用它的色谱分析的应用例子来说，例如，升岛努等人编著，“パ一トナ一分析化学II”(伙伴分析化学I I)172-191(2007)(南江堂)中有所记载。还有作为运用填充材料的色谱分析的应用例子来说，例如，升岛努等人编著，“パ一トナ一分析化学II”(伙伴分析化学II)145-172(2007)(南江堂)中有所记载。

吸上细胞的内液，为了促进它吸附在树脂表面，像图36那样不固定树脂68而是安放在烧结材料69上，吸取细胞液10之后，还要吸取分子捕捉溶液70，这时使树脂表面与细胞内或微小领域里的成分相结合进行浓缩。之后从微型移液管71添加溶出溶媒和电离溶液的混合液72，用纳米喷雾5进行电离的方法。这个方法是将一些细胞内液稀释，因此用串联四极杆等高灵敏度质谱仪追踪已知分子时能够使用。

图37是用在市面上出售的填充树脂的纳米喷雾尖端进行细胞内外分析方法的一个例子。从细胞中捕获细胞内的成分时，可以不用导电性的东西，微型毛细管就可以，在填充树脂层68的上部添加用它捕获的试样，并且将电离辅助溶媒作为流动相使用，像纳米喷雾尖端那样，同时引起分离。然而，在这个手法中，细胞数为一个是不可能的，需要几千个细胞。成分分子向微小填充树脂的分散被认为是不能提高灵敏度的原因。

将图37的例子用孔型纳米喷雾73实施的例子表示在图38。这时在前端附近实施里侧涂布58，能在前端附近进行浓缩。像这样，在捕获的细胞内液10与分子捕捉溶液70的混合液中，分子在前端被浓缩一次，之后更进一步使用适当的溶出溶液和电离辅助剂的混合液通过纳米喷雾进行电离的状况。

图39表示扩增细胞内液里的RNA等核酸成分进行检测时的过程。电离细管1里被捕获的细胞内液10，在其中添加处理用的添加试液76、用燃烧器74等封上前端、将其泡在热水浴(PCR时为热循环仪)75里、PCR扩增、热变性等处理77，随后将经PCR扩增、热变性等处理后的试样液78，用放电79等方法折断尖端前端后通过纳米喷雾导入质谱仪的状况。

图40记载着上述的各种各样的细管1里进行的试样调整过程中有关前端被堵塞时的处理。在细胞等的捕捉试样液里添加溶出·电离溶媒80作为试样的细管1，如果前端被堵塞时通过放电79或用镊子81等进行物理性的折断，或用激光82等切断将前端的口径扩大，能够继续进行纳米喷雾电离。

图41里，改善从细胞等微小领域吸取成分溶液时的电离细管1，使吸取操作变得容易。以往，电离细管1被安装在特殊的座上使用。但是，在本手法中，为电离细管1的后端经过注射加工等形成能插入在注射针的后端附带的注射筒的前端的套筒的105。如果形成这样的构造，以往的医疗用注射器里使用的周围小零件就能照原样使用。例如，106的配管借助不传播振动地结合延伸管与本纳米喷雾尖端105和吸取活塞注射筒(41)或与吸取泵相结合，微小领域里没有前端针头的振动能够达到吸取细胞内成分的操作，并且，它的座也像107那样用简便的夹座通过105的套筒的位置来决定而能够有一定的位置精确度的安装。夹座还实现了与本纳米喷雾尖端进行电气接触，还能够容易的做到加上高压电场。

图42表示根据本发明将一个细胞成分进行纳米喷雾电离时的加上电压的变化。以往在电离细管和质谱仪的试样导入口之间加上直流高电压259，为了更加提高效率，加上高压脉冲电压260，或加上与高压直流偏压重叠在一起的正弦波电压261。或者加上与高压直流偏压重叠在一起的矩形波电压262，也可以加上与高压直流偏压重叠在一起的锯形波电压263。

本手法的更进一步的确保定量性的课题是，捕获的细胞液是极小量的，它的体积太小不能测量重量，有必要解决这个问题。图43中所表示的是其中的一个例子，将在细管1的前端里被吸取的细胞内液3的体积作为录像显微镜放大进行捕捉，用通过转动其二维画面形成的三维积分评价它的体积。在此之后，能够求得添加102、或吸取103其它的溶液时的稀释比率。

图44是归纳开展本手法时的数据解析的理想的过程124。并不存在在这样的一个细胞的状态间因子分析里使用以往的统计手法的例子，还没有对于一个细胞的质谱使用差解析、t检验、主成分解析法、回归分析这些方法的前例。根据这个，对应每一个细胞的个性的分子谱峰的抽取、属性解析、成分解析、函数依赖性等的阐明得以实现。

作为以往的质谱仪的控制或数据解析系统中不包括的功能，像这个图，超微量试样的时候纳米喷雾时间最长为5-10分的短时间，为了能够在这个时间里尽可能更多的用MS/MS分析进行分子鉴定，最初的1分钟里边取得全体的质谱，同时，已经有了应当作比较的质谱的情况下用计算机同时进行其数据的比较统计解析(t检验等)，在剩余的宝贵的喷雾时间里，下次自动的或者用表示出来等待判断的形式，用于几乎实时的进行分子鉴定的MS/MS分析，或者能够迅速的带入分子鉴定能力高的高分辨率质谱分析的仪器控制及数据解析的软件已经被我们所设计了。该软件为，同时通过因特网能够迅速访问公开检索的MS数据库，作为将其质谱自动的、变换成其数据库的数据形式进行检索，得到结果。

图45是捕获细胞内成分后，从其电离细管1(在这种情况下没有导电性也没关系)直接注入到纳米液相色谱仪(LC)的喷射器128，用纳米LC色谱柱129分离后用UV等检出130后，用纳米喷雾电离131法进行电离检测。这个方法提高了网罗性，但是纳米LC色谱柱很贵，容易损耗，是成本很高的分析法。而且还不是实时的分析，超微量的成分在广阔空间里容易散失，有必要将质谱仪设定为高灵敏度后再作。

图46表示像这样得到结果的一个例子。淋巴球系细胞在用甾类化合物处理前108和处理后109的细胞中得到的分子进行简单的分离得到的三维质谱。谱峰数大约是1200个意味着至少有数百个分子被检测出来。

某个状态里特殊的谱峰是不能从图46中立刻看出来，对于两者的全部质谱进行t检验，像图47那样，作为处理细胞之后减少的谱峰来说t值95％以上的谱峰有31个(110)。并且处理后增加的谱峰中t值-95％以上的谱峰有20个(111)。因此，在细胞的两个状态间分子量增减的谱峰，也就是能抽取在状态间有变动的分子，能够提高今后的细胞内分子动态解析的网罗性。

图48里，这些谱峰中，捕捉m/z  302.3的谱峰，将未处理的细胞与处理后的细胞的谱峰强度进行比较。图表112和115是用全离子色谱里m/z 302.3的谱峰的出现的保持时间比较了质谱。于是质谱113里看不见的谱峰在116的处理后看见了。将这个强度按照每一个试样来作图成为像117图那样，哪个试样都确实在处理后增加，并且通过113图和116图的比较也能知道其谱峰也在处理后能看见。114图是放大m/z 302.3的谱峰。

MS/MS分析上述谱峰就得到图49的质谱118，与质谱数据库里的数据119相比较就知道了这个分子是二氢神经鞘氨醇。像这样能迅速的鉴定分子，如果有与数据库等一致的数据的话，从捕获细胞的内部成分，到抽取重要的分子谱峰为止需要2-3个小时，并且通过MS/MS分析决定分子结构为止需要2个小时，成为具有绝对快的速度就能进行决定并且能够鉴定分子的高精确度的分析方法。还有能够与细胞的形态变化进行联动也是一大特点。

图50是将此时的m/z 302.3的谱峰强度的时间经过与其消失函数相合并的回归分析，其函数非常好的表示了这个谱峰的强度的时间变化。像这样，通过回归分析能够仿真一个细胞的分子动态。

这回的质谱分析法能确保网罗性，并且使用正在电离中能简单的进行MS/MS分析的纳米喷雾电离法，也能采用对于高分子成分有力的MALDI电离法。以往取出完整的一个细胞，添加基质溶液，与基质的微晶化同时认识细胞的去向，尽管如此试样板也会进入真空，依靠录像画面，直到碰上一个细胞的微小尺寸为止接连不断的打激光寻找，是花费功夫的分析法，并且因为是完整的一个细胞，被细胞膜的成分等强度大的分子盖上的其它的分子是不能电离的，是只能检测出数量少的谱峰的手法。根据本发明，像图51那样，不含有细胞膜的成分，或能够捕捉只有细胞膜等部位特殊的成分，将其试样点在试样板264上的明确的位置，添加基质溶液265，用MALDI电离能够检测纳米喷雾不擅长的高分子的成分。

图52表示的是质谱分析法以外的分析方法。在这个分析法中，在将两个液流合在一根管道里的鞘流里注入捕获的细胞内成分，设法做到在管道里不发生细胞成分的接触和吸附，导入到原子吸收及ICP或ICP-MS等，能够检测细胞里的金属离子等的无机物。

图53是在微芯片133化的分离体系里添加用本手法捕捉的一个细胞的试样3，在浓缩区域136等浓缩其成分进行毛细管电泳134、分离、在尖端化的前端138加上高压、诱导纳米喷雾5。

图54是只用毛细管本体完成同样的分离的例子。将微量的试样溶液添加到毛细管的后端的非填充区域通过毛细管电泳来分离。这时，毛细管里有高分子凝胶等也没关系。

用这样的方法，像图55那样，在细胞进行药物处理前后比较TIC，比较某一个时间里的质谱，能明显的看到不同分子谱峰。

在图56里，表示以高流通量为目标的、不是一个细胞体系而是多个细胞体系中迅速的细胞内分子动态追踪法。在这个图里，多个细胞被放在试样板的孔142里，用细胞培养液143进行一定的增殖，然后作处理，将处理过的和未处理的细胞群用捕捉细胞用的过滤器144冲洗，之后用溶出细胞内成分的电离溶液147溶解细胞，从设置在孔下方的导电性的纳米喷雾中心突起部145进行纳米喷雾电离，将试样导入到质谱分析仪。

图57也是同样的，最后溶解了细胞之后，从孔的下方扎入纳米喷雾针149、对其加上高压电场引起纳米喷雾是不同之处。破碎细胞时使用超声波也可以。

图58，在试样板150里配置这样的孔，从它的下部145或149接连不断地按照惯例引起纳米喷雾，进行质谱分析。

图59是更加高速的实现一个细胞的质谱分析的例子，从细胞分类器出来的带电的含有细胞的163与落下来的含有细胞的带电液滴同时被脉冲纳米喷雾167或脉冲电极168或脉冲激光169加上正的高电压脉冲166或负的高电压脉冲166，将含有细胞的带电液滴吹成微小的液滴，导入到质谱仪。由此，与非常高速的检测细胞的形态的手法相协作能够被开展起来。

图60是图59的扩展，使用专用的脉冲电极168(正)和175(负)分别吹带有正电荷与负电荷的含有细胞的液滴163，导入到阳离子专用质谱仪172及阴离子专用仪174。由此能够更进一步的实现一个细胞的分子解析的高速化。

图61是将图59里所表示的细胞分类器和质谱仪合为一体的系统的一个例子。由此，同时得到反映在细胞分类器里得到的细胞的形态和表面标记的散布图和密度图及同时通过质谱分析得到的表示各个细胞的属性的主成分解析的结果以及MS质谱。

图62表示上述的血球细胞的散布图182和只选择淋巴球的荧光标记的密度图。

图63是，通过被选择的淋巴球的正离子模式的MS质谱中推算出的主要成分解析结果184，得知有三个种类的细胞群，得到了它们的平均MS质谱185。

这些分子不仅是与同时被观察到的细胞举动有关系，通过与其它被检测出的分子群相关联，不仅能知道生命现象的分子机构，作为新的医药品的候补，或者，如果这些是癌细胞的话能够关系到发现病因分子和阐明机构，进而还可以开展诊断方法。至今在世界上，具有这样的分析过程，而且边观察这个细胞的举动，边检测来自一个细胞的分子，从众多的分子谱峰中，包括归属细胞的举动或所处的细胞的状态的归属程度评价某一个分子谱峰，进而到决定其分子的结构的例子还没有。最重要的是，用飞跃般的速度阐明至今为止不被人所知道的生命现象的机构，它的各种各样的应用会以飞跃般的速度进展是毫无疑义的。

产业上的可利用性

像上述那样，本发明带来了将生命现象和其分子机构的两方面，用一个细胞的微小尺寸，迅速并直接的阐明的手段，它的用途是庞大的。最重要的是，通过疾病细胞和正常细胞的动态和分子比较加速了疾病的分子机构的阐明。并且，如果知道了细胞内的分子机构，利用那个分子或机构制药和开发诊断法、治疗法，如果发现了新分子对于新医药品的应用或开发生命科学用的试药等，能想出有非常丰富多彩的应用。最好是，用飞跃般的速度阐明至今为止不被人所知道的生命现象的机构会是毫无疑义的。

应答合乎目的地变化着的外部因子的细胞，其举动与细胞内分子动态相联动的情况很多，通过实时地在显微镜下观察细胞和检测分子，能够迅速的阐明生命现象的合乎目的的分子机构。本发明带来了将生命现象和其分子机构的两方面，用一个细胞的微小尺寸，迅速并直接的阐明的手段，它的用途是庞大的。最重要的是，通过疾病细胞和正常细胞的动态和分子比较加速了疾病的分子机构的阐明。并且，如果知道了细胞内的分子机构，利用那个分子或机构制药和开发诊断法、治疗法，如果发现了新分子对于新医药品的应用或开发生命科学用的试药等，能想出有非常丰富多彩的应用。

还有，高速地阐明细胞内或生体组织中的细胞内的各种各样的分子机构，带来了包括成为医药品的候补分子的新分子的发现、新生命现象的发现的高速化，能够加速更大的开展医疗及诊断或生物应用。例如，再生医疗等的万能细胞的细胞分化因子的高速探索、细胞分化的控制、细胞增殖因子的发现及控制法、癌细胞等细胞种类的分子诊断及分子探索、细胞种类的鉴定等，各种各样的分析能够被高速地开展起来。

现在，将被进行网罗性的解析的关于各种疾病的多数遗传因子以及其发现产物的蛋白质等相关联，能够使细胞内的低分子动态变得明了，能够综合的阐明生命现象，生命现象的综合的理解给人类的生命、健康的增进做出很大的贡献，能够创造出各种各样的附加的事业。

同样，在食品领域里，能够提供研究风味、香味等微妙的品质的细胞内的低分子动态的解析手段。

进一步在一般的化学品制造产业等，例如，纳米技术的微小领域的分子机构的阐明，像有机半导体、有机导电体、有机光学材料那样要求有高纯度的制品的制造管理，或食品添加物等在健康方面的品质保证为很重要的制品的制造过程中，在微量的副生物会给物理化学的性能或安全性等的品质要求带来不良影响的制造工序中，像这样的副生物的监视、制造管理、品质管理等，在微小领域中检测和解析分子会变为可能。

Claims (22)

1.在观察细胞的动态的同时采取构成前记细胞或者从前记细胞里分泌出的细胞成分并进行实时质谱分析的方法，其具有以下阶段：

用显微镜对细胞的动态进行观察的同时，对前记细胞的特定领域，插入前端部口径在前记特定领域以下的纳米喷雾电离细管的阶段；

用前记纳米喷雾电离细管前端部采取前记特定领域内的细胞成分并留在细管的前端部的采取阶段；

从前记的纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒的阶段；

在质谱仪的试样导入口与前记纳米喷雾电离细管之间加上电场，使前记细胞成分被纳米喷雾电离后作为试样导入前记质谱仪的阶段；

对作为试样被导入前记质谱仪内的前记细胞成分进行质谱分析的阶段。

2.根据权利要求1所述的方法，前记纳米喷雾电离细管的前端部的口径是0.1～100μm。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，前记纳米喷雾电离细管的里侧或外侧至少有一方具有导电性，或者具有从前记纳米喷雾电离细管后端侧向其前端部延伸的细导线。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，以具有内部是脂溶性的细胞膜作为隔壁的细胞为分析对象时，前记纳米喷雾电离细管的外侧为疏水性；

以具有由亲水性材料形成的细胞膜、细胞壁作为隔壁的细胞为分析对象时，前记纳米喷雾电离细管的外侧为亲水性。

5.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，前记纳米喷雾电离细管的前记前端部的里侧为结合分子亲和基的结构，从而能特异性捕捉分子。

6.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，前记纳米喷雾电离细管的前端部在接近观察中的细胞为止，一直由外侧向其内部加压，以免包括细胞培养液在内的周边成分混入到其前端部；当前记纳米喷雾电离细管的前端部到达观察中的细胞后，解除前记加压，由前记的前端部通过吸取而采取作为质谱分析对象的细胞成分。

7.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，从含有液体的组织内形成的穴中使细胞内或组织内成分流出，从而由前记的前端部采取作为质谱分析对象的细胞成分。

8.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，前记纳米喷雾电离细管的前端部是由操作器控制其三维位置，在作为观察对象的细胞和前记质谱仪之间设置了操作器，并与前记纳米喷雾电离细管的后端侧连接，

前记操作器在采取前记细胞成分时，引导前记的前端部到达正在观察中的细胞内的作为质谱分析对象的细胞成分的采取位置；在向前记质谱仪导入前记细胞成分时引导前记前端部到达该质谱仪的试样导入口。

9.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，其包括下述的采取阶段和质谱分析阶段，

前记采取阶段是经前记纳米喷雾电离细管的前端部采取下述细胞成分：在空间位置不同的多个细胞成分、细胞的每个经时变化的细胞成分、或对细胞进行多个不同处理时细胞的处理前和处理后的细胞成分；

前记质谱分析的阶段是导出空间的、经时的或在处理前后不同的多个细胞成分的各个质谱，抽取导出的各个质谱间的差异，由此评价或确定在显微镜下观察的细胞中的与空间及时间差异有关的分子。

10.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，其具有质谱分析的阶段，前记质谱分析的阶段是，事先在计算机内存入已知的质谱，在纳米喷雾电离中导出作为试样被导入的细胞成分的质谱，并抽取前记细胞成分的前记质谱和前记已知的质谱的差异，解析前记细胞成分；

对通过滤质器所抽取的前记细胞成分内的特定分子，进行高维的质谱分析，从而鉴定分子。

11.在观察细胞的动态的同时采取构成前记细胞或从前记细胞中分泌出的细胞成分并进行实时质谱分析的系统，该系统具有：

用于观察包含作为质谱分析对象的细胞成分的细胞动态的显微镜；

纳米喷雾电离细管，其具有为采取前记细胞的特定领域的细胞成分所用的口径在前记特定领域以下的前端部和用于导入电离辅助溶媒的后端部，能对作为质谱分析对象的前记细胞成分进行电离；

具有试样导入口的、对作为试样被导入的电离后的细胞成分进行质谱分析的质谱仪；

在前记质谱仪的试样导入口和前记纳米喷雾电离细管之间加上电场的施加电场装置；

在该系统中，侵入用显微镜观察的细胞内由前记纳米喷雾电离细管的前端部采取特定领域的细胞成分的同时，从前记纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒后，在前记质谱仪的试样导入口和前记纳米喷雾电离细管之间加上电场，对前记细胞成分进行电离并作为试样导入到前记质谱仪中进行质谱分析。

12.根据权利要求11所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的前端部的口径是0.1到100μm。

13.根据权利要求11或12所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的里侧或外侧至少有一方具有导电性，或者在前记施加电场装置具有从前记纳米喷雾电离细管的后端部向其前端部延伸的细导线。

14.根据权利要求11～13的任一项所述的系统，以具有内部为脂溶性的细胞膜作为隔壁的细胞为分析对象时，前记纳米喷雾电离细管的外侧为疏水性；以具有由亲水性材料形成的细胞膜、细胞壁作为隔壁的细胞为分析对象时，前记纳米喷雾电离细管的外侧为亲水性。

15.根据权利要求11～14的任一项所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的前记前端部的里侧为结合分子亲和基的构造，从而能特异性捕捉分子。

16.根据权利要求11～14的任一项所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的前端部在接近观察中的细胞为止，一直由外侧向其内部加压，以免包括细胞培养液在内的周边成分混入到其前端部；当前记纳米喷雾电离细管的前端部到达观察中的细胞后，解除前记加压，由前记的前端部通过吸取而采取作为质谱分析对象的细胞成分。

17.根据权利要求11～14的任一项所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的前端部是由操作器控制其三维位置，在作为观察对象的细胞和前记质谱仪之间设置了操作器，并与前记纳米喷雾电离细管的后端侧连接，

前记操作器在采取前记细胞成分时，引导前记的前端部到达正在观察中的细胞内的作为质谱分析对象的细胞成分的位置；在向前记质谱仪导入前记细胞成分时引导前记前端部到达该质谱仪的试样导入口。

18.根据权利要求11～14的任一项所述的系统，前记纳米喷雾电离细管的前端部是对在空间位置不同的多个细胞成分、细胞的每个经时变化的细胞成分、或对细胞进行多个不同处理时细胞的处理前和处理后的细胞成分进行采取；

前记质谱仪导出空间、经时的、或在处理前后不同的多个细胞成分的各个质谱，抽取导出的各个质谱间的差异，由此评价或确定在显微镜下观察的细胞中的与空间及时间差异有关的分子。

19.根据权利要求11～14的任一项所述的系统，其具有质谱仪，前记质谱仪事先在计算机内存入已知的质谱，在纳米喷雾电离化中导出作为试样被导入的细胞成分的质谱，并抽取前记细胞成分的前记质谱和前记已知的质谱的差异，解析前记细胞成分；

对用滤质器所抽取的前记细胞成分内的特定分子，进行高维的质谱分析，从而鉴定分子。

20.纳米喷雾电离细管，其为采取构成细胞的细胞成分的同时为了进行质谱分析而对前记细胞成分进行纳米喷雾电离的纳米喷雾电离细管，其具有：

口径的大小在前记细胞内的特定领域以下的前端部、用于导入电离辅助溶媒的后端部、和在前记纳米喷雾电离细管内部延伸至前端的具有溶媒亲和性表面的溶媒路径细线；

前记纳米喷雾电离细管的外侧为疏水性；

前记前端部的外侧或者里侧至少有一方具有导电性，或者能插入在内部从后端侧延伸至导入的电离溶媒的细导线，使得能在其与质谱仪之间加上电场。

21.采取构成活体组织的细胞成分进行质谱分析的方法，其具有下述阶段：

将前端部的口径在前记细胞大小以下的纳米喷雾电离细管的前端部扎进前记细胞；

由前记纳米喷雾电离细管的前端部采取前记细胞的细胞成分作为试样；

前记细胞成分在前记纳米喷雾电离细管的前端部停留的状态下，从前记纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒；

在质谱仪的试样导入口和前记纳米喷雾电离细管之间加上电场，对前记细胞成分进行电离并作为试样导入到前记质谱仪中；

对作为试样被导入前记质谱仪的前记细胞成分进行质谱分析。

22.采取构成活体组织的细胞成分进行质谱分析的系统，其具有：

纳米喷雾电离细管，其具有为采取前记细胞内的细胞成分所用的口径在前记细胞大小以下的前端部和用于导入电离辅助溶媒的后端部，能对成为质谱分析对象的前记细胞成分进行电离；

具有试样导入口的、对作为试样被导入的电离后的细胞成分进行质谱分析的质谱仪；

在前记质谱仪的试样导入口和前记纳米喷雾电离细管之间加上电场的施加电场装置；

在该系统中，由前记纳米喷雾电离细管的前端部采取细胞成分的同时，从前记纳米喷雾电离细管的后端侧导入电离辅助溶媒，然后在前记质谱仪的试样导入口和前记纳米喷雾电离细管之间加上电场，对前记细胞成分进行电离并作为试样导入到前记质谱仪中进行质谱分析。

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