CN113281397B

CN113281397B - 追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法

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Publication number: CN113281397B
Application number: CN202110548132.8A
Authority: CN
Inventors: 熊伟; 朱洪影; 仓春蕾
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2041-05-19
Also published as: CN113281397A

Abstract

本发明公开一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，构建单溶酶体质谱检测模型；然后用亲溶酶体物质对细胞进行孵育，并通过所述单溶酶体质谱检测模型对细胞中单溶酶体的内容物进行检测。本发明通过构建单溶酶体质谱检测模型，来追踪亲溶酶体内容物在单溶酶体中的贮积情况，检测单溶酶体内容物的变化，实现了跟踪检测单溶酶体内的代谢情况，并为减少临床亲脂性弱碱药物的副作用或耐药性提供理论依据。

Description

追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法

技术领域

本发明涉及溶酶体内容物追踪技术领域，具体为一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法。

背景技术

现有技术可以通过膜片钳技术记录的电信号的差异来区别不同的溶酶体，却无法对单溶酶体内的成分进行分析。对溶酶体内的成分分析目前还是依赖于匀浆处理，而匀浆处理的方法将溶酶体长时间暴露于非细胞环境，易造成样品损失及代谢副产物的产生。Kelly,B.M.等人报道的文章《人成纤维细胞溶酶体的异质性》，发现溶酶体是异质性细胞器，它的形态、大小、活性及功能各不相同，因此，上述匀浆处理的方法无法对单溶酶体内容物进行定性定量分析。Zhitomirsky,B.通过研究发现疏水性弱碱类药物容易被溶酶体捕获，而疏水性弱碱类药物被溶酶体捕获后，现有技术无法跟踪检测其在单溶酶体内的代谢情况。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，来解决现有技术无法跟踪检测单溶酶体内的代谢情况的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，构建单溶酶体质谱检测模型；然后用亲溶酶体物质对细胞进行孵育，并通过所述单溶酶体质谱检测模型对细胞中单溶酶体的内容物进行检测。

本发明中，通过构建单溶酶体质谱检测模型，来追踪亲溶酶体内容物在单溶酶体中的贮积情况，检测单溶酶体内容物的变化，实现了跟踪检测单溶酶体内的代谢情况，并为减少临床亲脂性弱碱药物的副作用或耐药性提供理论依据。

优选地，所述构建单溶酶体质谱检测模型包括膜片钳、质谱仪，所述膜片钳用于提取单溶酶体中的内容物，所述质谱仪用于对获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测。

优选地，所述方法包括以下步骤：

步骤一、用亲溶酶体物质对细胞进行孵育；

步骤二、将步骤一孵育后的细胞采用单溶酶体膜片钳技术获取单溶酶体中的内容物；

步骤三、对步骤二获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测。

优选地，所述亲溶酶体物质包括疏水性弱碱类药物。

优选地，所述疏水性弱碱类药物包括利多卡因、吉西他滨中的至少一种。

优选地，所述细胞为HEK-293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肺成纤维细胞、膀胱癌细胞、人膀胱上皮永生化细胞、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞的至少一种。

优选地，所述步骤一采用吉西他滨药物分别孵育HEK-293T细胞、BxPC-3细胞0.5h、12h和36h。

优选地，本发明采用NH₄Cl电极内液，与传统电极内液相比，提高了质谱检测的信噪比，可以同时获得电生理和质谱信号。

优选地，所述吉西他滨(Gemcitabine)的浓度为10μM。

优选地，所述单溶酶体膜片钳技术采用的电极其电极尖端长度为5-10mm、尖端开口直径为0.1-2μm。以防止样品被电极外液稀释；质谱取样的电极外液是模拟溶酶体所处的胞质离子环境。

如此，可以获得pL/min的喷雾速度并对物质的检测具有较高的重现性和灵敏度，对于赖氨酸(LYS)，组氨酸(HIS)以及精氨酸(ARG)的检测限分别是0.045μM，0.042μM和0.038μM。

优选地，所述步骤二还通过单溶酶体膜片钳技术获取单溶酶体的电生理信息。

优选地，本发明的单溶酶体质谱分析方法也同样适用于细胞中内体的质谱分析。

本发明的优点在于：本发明通过将单溶酶体膜片钳取样技术与质谱检测技术进行有机结合，建立了单溶酶体质谱检测模型，实现了对单个溶酶体内容物进行质谱检测，从而对溶酶体内容物成分及含量进行分析，相对于传统的溶酶体匀浆的分析方法，单溶酶体质谱分析方法更能如实地反映溶酶体的代谢状态，也是本发明能够实现跟踪检测单溶酶体内的代谢情况的关键。本发明通过构建单溶酶体质谱检测模型，来追踪亲溶酶体内容物在单溶酶体中的贮积情况，检测单溶酶体内容物的变化，实现了跟踪检测单溶酶体内的代谢情况，并为减少临床亲脂性弱碱药物的副作用或耐药性提供理论依据。

进一步，本发明分析了吉西他滨Gemcitabine在细胞内的分布，发现它在HEK-239T细胞的溶酶体中的含量远高于胞质，提示它会通过内吞途径进行转运。但在胰腺癌细胞系BxPC-3中，吉西他滨在溶酶体和内体的聚积则远低于HEK-293T，提示两种细胞中药物的转运机制不同，而这种差异也是两种细胞对药物敏感性差异的重要原因。

附图说明

图1为本发明中孵育过Gemcitabine之后，HEK293T细胞和BxPC-3细胞溶酶体内Gemcitabine的归一化强度检测图。

图2为本发明中Gemcitabine在溶酶体中相对含量的统计图。

图3为本发明中Gemcitabine孵育HEK293T细胞和BxPC-3细胞72h后，细胞凋亡率检测的典型图。

图4为本发明中细胞凋亡比例的统计图。

图5为本发明中各个玻璃电极其尖端形状的示意图。

图6为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的赖氨酸相对含量柱状图。

图7为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的组氨酸相对含量柱状图。

图8为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的精氨酸相对含量柱状图。

图9为本发明中抽取的ALF的TIC与SIC的质谱峰图。其中，喷雾流速为3.2pL/min。SIC表示选择离子流；TIC表示总离子流。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例以离体HEK-293T细胞为例进行介绍，当然本发明也可以用于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、膀胱癌细胞(T24)、人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元和神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠皮肤成纤维细胞(MEF)等细胞。

本实施例公开一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，包括以下步骤：

步骤一、细胞的培养

HEK-293T细胞的培养

将用于传代的HEK-293T细胞培养在T25培养瓶中。将培养瓶中的培养基吸除，加1mL预热的胰蛋白酶润洗一遍，再加1mL胰蛋白酶，放于37℃二氧化碳培养箱消化2min；向培养瓶中加入4mL预热的培养基，终止消化，用1mL的移液枪吹打10下，将细胞吹散，形成细胞悬液；取一个新的T25培养瓶，加入5mL预热的培养基，再取250μL细胞悬液加入培养瓶中，倾斜摇晃培养瓶，将细胞混匀。细胞密度为5％的细胞一般三天可以长满，再传代。

其中，培养HEK-293T细胞的细胞培养基优选为是含10％胎牛血清(即胎牛血清与细胞培养基的体积比是1:10，来源于Biological Industries)和1％青霉素-链霉素(即青霉素-链霉素双抗与细胞培养基的体积比是1:100，来源于Biosharp)的DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，来源于Gibco)培养基。细胞培养在37℃条件下，通入含5％二氧化碳(即CO₂的体积为5％)培养箱中。

进一步，当细胞密度长至90％-98％时，可以在生物安全柜中进行传代。

步骤二、质粒的转染

对HEK-293T细胞的瞬时转染时，采用脂质体Lipofectamine2000进行转染的。质谱取样实验、电生理实验和成像实验中使用到的质粒有PQLC2-EGFP、LAMP1-mCherry、LAMP2-EGFP、mCherry2-LC3及EGFP-Rab5A等。当涉及共转染的，质粒质量比为1:1。

本实施例的细胞培养在35mm的培养皿中，当HEK-293T细胞长至密度70％时，使用Lipofectamine2000转染目的质粒。2μg质粒(共转染的话，两种质粒各取1μg)和7μLLipofectamine2000分别加入到150μL Opti-MEM Medium中稀释。

将稀释后的质粒和Lipofectamine2000混合至同一个EP管中，吹打混匀。室温条件下静置5min。逐滴加入到培养HEK-293T细胞的细胞培养基中，孵育12h，得到含有溶酶体被标记的细胞。

再用胰蛋白酶消化，以50％-70％细胞密度铺在成像的chamber中，用于共聚焦显微镜成像实验。或者铺在多聚赖氨酸处理过的12mm直径的圆形盖玻片上。用于电生理实验和质谱取样实验。

进一步，在本实施例中，用带mCherry标签的Lamp1(即LAMP1-mCherry)或Rab5A(即EGFP-Rab5A)质粒瞬时转染HEK-293T细胞，标记溶酶体。仅选择被荧光标记的溶酶体进行记录和采样。原代细胞是通过LysoTracker(Invitrogen)孵育以标记溶酶体。

步骤三、单溶酶体膜片钳技术，包括以下步骤：

1.盖玻片处理

12mm直径的圆形盖玻片(ISO9001)的处理方式：

1)在200mL烧杯中加150mL的自来水和两滴洗洁精，将500片玻片拨开放入水中，晃动5-10min。

2)用自来水流水冲洗玻片5-10min，再用超纯水冲洗30遍。

3)用100mL的盐酸(5.3mL体积百分比为36％-38％的浓盐酸定容到100mL)浸泡玻片2天，烧杯口用保鲜膜和锡箔纸封住。

4)再用超纯水冲洗玻片30遍。用分析纯无水乙醇浸没玻片洗3遍。然后再用100mL无水乙醇浸没玻片，并将烧杯口用保鲜膜和锡箔纸封住，室温条件下过夜放置。

5)将烧杯中浸泡玻片的无水乙醇倒掉，用锡箔纸盖住烧杯口，留一个小孔用于无水乙醇挥发，放置在60℃烘箱将玻片烘干。

6)显微镜下检查玻片是否处理干净，再用高压灭菌锅对玻片进行灭菌处理。

7)在细胞间生物安全柜中将灭菌后的玻片倒入10cm的玻璃皿中，室温条件下用0.1mg/mL的多聚赖氨酸(PLL)孵育12h。

8)回收PLL，用灭菌的超纯水洗涤玻片4遍，然后将玻片浸没在超纯水中置于生物安全柜内备用。

2.0.1％多聚赖氨酸溶液的配制

硼酸盐缓冲液的配制(100mL)：0.48g硼酸和0.25g硼酸钠溶于灭菌的超纯水中，定容至100mL。100mg多聚赖氨酸粉末溶于100mL硼酸盐缓冲液中，配制成0.1％多聚赖氨酸溶液。用0.22μm的滤器过滤后，存放在4℃冰箱。

进一步，使用前，用硼酸盐缓冲液将0.1％多聚赖氨酸溶液稀释10倍再使用。

3.溶酶体增大处理

将步骤二转染目的质粒后的含有溶酶体被标记的细胞铺在多聚赖氨酸处理过的12mm直径的玻片上培养12h。

待细胞充分贴壁后，使用1μM vacuolin-1过夜处理，使溶酶体增大。

vacuolin-1是脂溶性多环三嗪，能通过同型膜融合选择性地增加内体和溶酶体的大小。

4.采集电生理数据

使用硼硅酸盐电极进行单溶酶体的内容物取样。质谱取样的玻璃电极拉制比较严格，要求拉制出的电极尖端有5-10mm长、尖端开口直径为0.1-2μm，本实施例优选采用的电极尖端8mm长、尖端开口直径为0.5μm。细长的电极尖端可以减少样品被电极外液稀释的可能。玻璃电极采用两步拉制的方式获得。拉制过程中涉及的参数如表1所示。

表1质谱取样玻璃电极拉制得参数(Ramp＝532)

采集电生理数据具体包括以下步骤：

4.1)将vacuolin-1处理后的细胞转移至装有含140mM K-gluconate、4mM NaCl、2mM MgCl₂、0.39mM CaCl₂和10mM HEPES(用KOH调节的pH 7.2)的电极外液的槽中。

4.2)使用玻璃电极尖端切开细胞膜，手动从细胞中分离出涨大的细胞器(即溶酶体)。

电极内液成分包括：185mM NH₄HCO₃和80mM NH₄Cl。填充电极内液的电极电阻为5-16MΩ。

4.3)形成千兆封接之后，通过ZAP脉冲(1V，0.5-2ms)使膜破裂。

4.4)进行单溶酶体电压钳记录。电压刺激是-70mV，2s；+70mV，2s。每个sweep 10s，电压holding在0mV。

进一步，本发明仅收集具有紧密封接(>1GΩ)的溶酶体进行分析，以确保管腔样品不会被电极外液污染。

5.获得单溶酶体的内容物

采集电生理数据后，通过施加负压来获得单溶酶体的内容物成分。通过观察单溶酶体的体积变化来确认采样是否成功。一旦将腔内成分吸入电极，单溶酶体的体积就会明显减少。

步骤四、质谱分析

将含有单溶酶体内容物的玻璃电极快速从浴液中移出，然后经质谱仪(MS质谱仪)检测对单溶酶体的内容物成分进行定性定量分析。

步骤五、追踪亲溶酶体药物的代谢

1.细胞孵育

采用步骤一的方式对培养后的HEK-293T细胞达到细胞密度为50％-70％时，用Gemcitabine+DMSO(其中，Gemcitabine在细胞培养基中的摩尔浓度为10μM、DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰)孵育HEK-293T细胞0.5h、12h和36h。

2.追踪Gemcitabine的含量

采用步骤二至步骤四建立的单溶酶体质谱检测方法分别追踪HEK-293T细胞中溶酶体中的Gemcitabine的含量。

进一步，本发明还采用步骤一的方式对HEK-293T细胞培养后，细胞密度为50％-70％时，用0.5‰DMSO(DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰)孵育HEK-293T细胞0.5h、12h和36h。

进一步，本发明还公开了追踪BxPC-3细胞中溶酶体药物的代谢情况。

采用步骤一的方式对BxPC-3细胞培养至细胞密度为50％-70％时，分别用Gemcitabine+DMSO(其中，Gemcitabine在细胞培养基中的摩尔浓度为10μM、DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰)、0.5‰DMSO(DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰)孵育BxPC-3细胞0.5h、12h和36h。采用步骤二至步骤四建立的单溶酶体质谱检测方法分别追踪BxPC-3细胞中溶酶体中的Gemcitabine的含量。

如图1、2所示，随着孵育时间的延长，发现HEK-293T细胞的溶酶体内Gemcitabine的含量显著性增加，而在BxPC-3细胞的溶酶体中并没有检测到Gemcitabine。

如图3、4所示，相对于DMSO处理组，HEK-293T细胞在Gemcitabine处理下的凋亡率是9.4％，而BxPC-3细胞的凋亡率是27.7％，两者间具有显著性差异。结果表明，HEK-293T细胞可能是通过溶酶体贮积Gemcitabine而降低了Gemcitabine对细胞的毒性。

图中的n＝4，实验重复4次。数据表示为平均值±标准误，其中*P<0.05。

本实施例中，优选采用通过流式细胞术检测细胞凋亡比率来检验Gemcitabine对细胞的毒性。具体操作步骤如下所示：

1)将HEK-293T细胞和BXPC3细胞采用步骤一的方式在35mm培养皿中培养；

2)当HEK-293T细胞和BXPC3细胞的细胞密度达到50％-70％时，分别用μMGemcitabine+DMSO(其中，Gemcitabine在细胞培养基中的摩尔浓度为10μM、DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰DMSO)孵育HEK-293T细胞72h以及分别用Gemcitabine+DMSO(其中，Gemcitabine在细胞培养基中的摩尔浓度为10μM、DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰DMSO)孵育BXPC3细胞72h。

3)细胞凋亡检测前，37℃条件下用胰蛋白酶消化贴壁细胞2-5min，收集细胞(优选地，培养细胞的液体培养基一同收集)。

4)4℃条件下500g离心5min，弃上清。

5)1mL预冷的1×PBS重悬细胞。4℃条件下500g离心5min。

6)弃上清，1mL预冷的1×PBS重悬细胞。吸取20μL细胞悬液用于计数。

7)4℃条件下500g离心5min，弃上清。用1×annexin binding buffer重悬细胞，使细胞密度调整为5×10⁵个/mL。

8)1mg/mL PI用1×annexin binding buffer稀释10倍。

9)3μL annexin V和1μL PI加入100μL细胞悬液中，吹打混匀，室温避光孵育15min。

10)每个样品中在加100μL 1×annexin binding buffer，吹打混匀，然后用300目滤网(Suoqiao Bio)过滤细胞悬液，样品避光置于冰上待检测。

11)样品使用流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman Coulter)快速检测。annexin VFITC和PI信号分别在525/40BP和585/42BP通道上进行分析。用空白对照调电压，峰值调到1×10²-1×10³即可。用单染调补偿，散点图中的点群调的横平竖直即可。

12)Flowjo软件设门统计细胞凋亡率及作图。

实施例2

Tip尖端(电极尖端)和形状举例

如图5-8所示，其中，图5的Tip1-Tip5中各个玻璃电极的尖端开口直径分别为272nm、340nm、298nm、288nm、310nm，玻璃电极的尖端长度选用8mm。

使用具有相似尖端尺寸和形状的玻璃电极进行SLMS的重现性。图5为SLMS玻璃电极的几何特性，5个选定的玻璃移液管尖端的扫描电子显微镜下的图像。比例尺：200μm。图6SLMS测量赖氨酸(LYS，相对标准偏差＝7.3％)，图7组氨酸(HIS，相对标准偏差＝8.1％)和图8精氨酸(ARG，相对标准偏差＝7.5％)的重现性。

在人工模拟溶酶体内液(ALF)中加入LYS为5ppm(34μM)，HIS为5ppm(32μM)，ARG为5ppm(28μM)的水平上进行了重复测量。ALF包含145mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、2mMCaCl₂、10mM HEPES、10mM MES和10mM葡萄糖(用NaOH调节pH至4.6，用蔗糖调节渗透压至296mOsm/kg)。所有数据归一化到Tip1组。

采用本发明的电极尖端结构，可以获得pL/min的喷雾速度并对物质的检测具有较高的重现性和灵敏度，对于赖氨酸(LYS)、组氨酸(HIS)以及精氨酸(ARG)的检测限分别是0.045μM、0.042μM和0.038μM。

实施例3

本实施例公开了一种细胞的冻存和复苏方式。

HEK-293T细胞可以传代培养的细胞系一般会在液氮中冻存，使用时再进行细胞复苏。培养的原代细胞一般不冻存。

细胞冻存和复苏

其中，HEK-293T细胞冻存包括以下步骤：

1)培养在T75培养瓶中的HEK-293T细胞，密度长至80％-90％时，可以冻存。

2)准备一个50mL离心管，加入900μL DMSO(Sigma)，再加入11.1mL的培养基(体积分数10％FBS，体积分数1％青霉素-链霉素和体积分数89％DMEM)，混匀备用。

3)将待冻存的HEK-293T细胞用胰蛋白酶消化下来。首先将T75培养瓶中的培养基吸除，用3mL预热的胰蛋白酶润洗一遍。然后，再加3mL胰蛋白酶，放在37℃二氧化碳培养箱中消化2min。最后，加3mL培养基终止消化，并吹打10下，将细胞吹散，形成细胞悬液。

4)用电动移液枪将6mL细胞悬液吸取，加入到上述准备的50mL离心管中。颠倒混匀。

5)分装到冻存管中，细胞悬液500μL/管，共分36管。然后将冻存管放入程序降温盒中，存放在-80℃冰箱中。第二天再转移到液氮中保存。

其中，HEK-293T细胞的复苏包括以下步骤：

1)准备一个T25培养瓶，加入5mL培养基(体积分数10％FBS，体积分数1％青霉素-链霉素和体积分数89％DMEM)，放入37℃二氧化碳培养箱中预热。

2)从液氮罐中取出1管HEK-293T细胞，放在37℃的水浴锅中快速融化。

3)将细胞悬液吸出，加入到前面准备的T25培养瓶中，倾斜摇晃培养瓶，将细胞混匀。放入37℃二氧化碳培养箱中培养。

4)12h后，更换新的培养基继续培养即可。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，其特征在于，构建单溶酶体质谱检测模型；然后用亲溶酶体物质对细胞进行孵育，并通过所述单溶酶体质谱检测模型对细胞中单溶酶体的内容物进行检测；

所述构建单溶酶体质谱检测模型包括膜片钳、质谱仪，所述膜片钳用于提取单溶酶体中的内容物，所述质谱仪用于对获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测；

所述方法包括以下步骤：

步骤一、用亲溶酶体物质对细胞进行孵育；

步骤三、对步骤二获取的单溶酶体中的内容物进行质谱检测；

所述步骤一中的细胞为HEK-293T细胞；

采用步骤一的方式对培养后的HEK-293T细胞达到细胞密度为50％-70％时，用吉西他滨+DMSO孵育HEK-293T细胞0.5h、12h和36h；

采用单溶酶体质谱检测方法追踪HEK-293T细胞中溶酶体中的吉西他滨的含量；

所述单溶酶体膜片钳技术采用的电极其电极尖端长度为5-10mm、尖端开口直径为0.1-2μm；

采用所述电极，赖氨酸、组氨酸、精氨酸的检测限分别是0.045μM，0.042μM和0.038μM；

所述电极采用两步拉制的方式获得；

所述第一步的拉制参数为：Heat＝545，Pull＝0，Vel＝37，Time＝200；

所述第二步的拉制参数为：Heat＝545，Pull＝0，Vel＝35，Time＝185；

所述培养HEK-293T细胞的细胞培养基包括含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基；

所述培养HEK-293T细胞培养完成后，采用脂质体Lipofectamine2000和质粒对HEK-293T细胞进行转染，标记HEK-293T细胞的溶酶体；

所述质粒包括PQLC2-EGFP、LAMP1-mCherry、LAMP2-EGFP、mCherry2-LC3、EGFP-Rab5A中的任一种；

当所述转染为共转染时，质粒包括PQLC2-EGFP、LAMP1-mCherry、LAMP2-EGFP、mCherry2-LC3、EGFP-Rab5A中的任两种，两种质粒间的质量比为1:1；

所述采用单溶酶体膜片钳技术获取单溶酶体中的内容物，包括以下步骤：

将所述溶酶体被标记的HEK-293T细胞使用1μM vacuolin-1过夜处理，使溶酶体增大；

溶酶体被标记的HEK-293T细胞被vacuolin-1处理后，被转移至装有含140mM K-gluconate、4mM NaCl、2mM MgCl2、0.39mM CaCl₂和10mM HEPES的电极外液中；

使用玻璃电极尖端切开细胞膜，手动从细胞中分离出涨大的溶酶体；

其中，电极的内液成分包括：185mM NH₄HCO₃和80mM NH₄Cl；填充电极内液的电极电阻为5-16MΩ；

形成千兆封接之后，通过1V，0.5-2ms的ZAP脉冲使溶酶体的膜破裂；

进行单溶酶体电压钳记录；

其中，电压刺激是-70mV，2s；+70mV，2s，每个sweep 10s，电压holding在0mV；

采用检测细胞凋亡比率来检验吉西他滨对细胞的毒性，具体操作步骤如下：

采用步骤一的方式对培养后的HEK-293T细胞达到细胞密度为50％-70％时，用吉西他滨+DMSO孵育HEK-293T细胞72h；

其中，吉西他滨在细胞培养基中的摩尔浓度为10μM、DMSO在细胞培养基中的体积分数为0.5‰；

37℃条件下用胰蛋白酶消化贴壁细胞2-5min，收集细胞；

细胞经处理后，使用流式细胞仪进行检测，根据检测结果统计细胞凋亡率。

2.根据权利要求1所述的追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法，其特征在于，所述步骤二还通过单溶酶体膜片钳技术获取单溶酶体的电生理信息。