CN110174387A - 一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,所述荧光碳点在追踪不同细胞系下的活细胞、固定细胞、凋亡的细胞中溶酶体的实时成像和长时间成像中的应用,荧光碳点的制备方法为:将无水柠檬酸加入到水中溶解,溶解后加入N,N‑二甲基苯胺,混合液移入微波管中,微波加热反应,反应液经超滤,柱层析分离,得到荧光碳点。本发明碳点合成十分简单,便于操作;能实现碳点在溶酶体的实时成像和长时间成像,实现碳点在活细胞、固定的细胞和凋亡的细胞内的溶酶体成像,本发明可实现碳点在不同细胞系下的活细胞内的溶酶体成像,本发明可实现碳点在氯喹刺激下活细胞内的溶酶体成像。

Description

一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用
技术领域
本发明涉及有机小分子荧光碳点和生物传感技术领域,具体涉及一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用。
背景技术
溶酶体作为真核细胞中的一种细胞器,具有单层膜包被的囊状结构,它内含多种水解酶,专为分解各种外源和内源的大分子物质。如果缺失任一水解酶,那么相应的底物就不能在溶酶体中降解,造成该底物在溶酶体内的积累,从而导致细胞代谢障碍,形成溶酶体贮存病。除此之外,溶酶体在细胞内吞、自噬和凋亡中发挥重要作用。因此,实现对溶酶体的位置及状态的实时追踪和长时间追踪具有重要意义。
碳点作为碳家族一种新型的纳米材料,因其原材料资源丰富、廉价易得,本身毒性低、抗光漂白能力强、水溶性好、且具有良好的生物相容性等优点,引起了人们的广泛关注。目前,已有许多碳点应用于生物标记、药物靶向、细胞成像等众多领域。截至目前,仅有少量的荧光碳点用于溶酶体的成像,并且他们都需要较长的孵育时间,通常为2小时以上。因此,开发出一种新型荧光碳点快速聚集在溶酶体内,实现对溶酶体的实时追踪和长时间追踪是非常有意义的。
发明内容
本发明提出了一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,当细胞内加入荧光碳点时,由于碳点表面所含的二甲氨基具有弱碱性,荧光碳点能迅速的聚集在溶酶体内,并长期的滞留在溶酶体内。
实现本发明的技术方案是:
一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,所述荧光碳点在追踪不同细胞系下的活细胞、固定细胞、凋亡的细胞中溶酶体的实时成像和长时间成像中的应用,荧光碳点的制备方法为:将无水柠檬酸加入到水中溶解,溶解后加入N,N-二甲基苯胺,混合液移入微波管中,微波加热反应,反应液经超滤,柱层析分离,得到荧光碳点。
用碳点母液孵育不同细胞系下的细胞,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
用碳点母液孵育固定的细胞、凋亡下的细胞,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
用碳点母液孵育细胞,再加入氯喹刺激溶酶体的移动,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,包括以下步骤:
(1)称取荧光碳点,用超纯水溶解,准确配制10 mg/mL的碳点储存液;
(2)向比色皿中加入1990 µL的PBS缓冲溶液后,加入6 µL 10 mg/mL的碳点储存液,以405 nm进行激发,探针具有很强的荧光发射;
(3)通过共聚焦显微镜对孵育好荧光碳点的活细胞、固定的细胞和凋亡下的细胞进行荧光成像;
(4)通过共聚焦显微镜对孵育好荧光碳点的不同细胞系下的活细胞进行荧光成像。
(5)通过共聚焦显微镜对孵育不同时间的荧光碳点的活细胞进行荧光成像。
(6)通过共聚焦显微镜对氯喹刺激下碳点孵育的活细胞进行荧光成像。
利用N,N-二甲基苯胺和无水柠檬酸制备荧光碳点的合成路线如下:
所述N,N-二甲基苯胺和无水柠檬酸的物质的量之比为1:(1-3);N,N-二甲基苯胺和水的体积比为1:(10-30)。
所述微波加热的温度为160 ℃,反应时间为6-14 h;所述超滤分子量为3000 Da。
本发明的有益效果是:(1)碳点合成十分简单,便于操作;(2)本发明能实现碳点在溶酶体的实时成像和长时间成像,(3)本发明可实现碳点在活细胞、固定的细胞和凋亡的细胞内的溶酶体成像,(4)本发明可实现碳点在不同细胞系下的活细胞内的溶酶体成像,(5)本发明可实现碳点在氯喹刺激下活细胞内的溶酶体成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1碳点的吸收、激发、发射图谱。
图2是碳点特异性靶向溶酶体实验研究图,以405 nm激发波长,收集450-650 nm的波长。
图3是碳点在活细胞和固定的细胞下的荧光成像图。
图4是碳点在不同细胞系下活细胞的荧光成像图。
图5是碳点在不同孵育时间下的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
碳点合成,步骤如下:
将2.4 g无水柠檬酸溶解在16 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应10 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例2
碳点合成,步骤如下:
将0.6 g无水柠檬酸溶解在16 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应10 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例3
碳点合成,步骤如下:
将4.8 g无水柠檬酸溶解在16 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应10 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例4
碳点合成,步骤如下:
将2.4 g无水柠檬酸溶解在8 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应10 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例5
碳点合成,步骤如下:
将2.4 g无水柠檬酸溶解在32 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应10 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例6
碳点合成,步骤如下:
将2.4 g无水柠檬酸溶解在16 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应4 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
实施例7
碳点合成,步骤如下:
将2.4 g无水柠檬酸溶解在16 mL超纯水中,再加入800 µL N,N-二甲基苯胺液体,将混合液用微波反应仪加热至160 ℃,持续反应16 h,反应液经超滤,柱层析分离,得到该碳点。
应用
1. 碳点在细胞成像中的应用
在37 ℃,95 %空气,5 %二氧化碳培养箱中,将HeLa细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。如图2所示,碳点在溶酶体内聚集,A图为碳点在HeLa细胞内的荧光图像,B图为商业化溶酶体染料在HeLa细胞内的荧光图像,C图为A图和B图的叠加图,D图是A图和B图内划线区域的荧光强度变化趋势图。C图、D图充分说明碳点聚集在溶酶体内。
2. 碳点在活细胞和固定细胞成像中的应用
在37 ℃,95 %空气,5 %二氧化碳培养箱中,将HeLa细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。用4 %的多聚甲醛孵育10分钟使其固定,如图3所示,无论是在活细胞还是固定细胞中,碳点皆在溶酶体内聚集。
4. 碳点在不同细胞系下的活细胞成像中的应用
在37 ℃,95 %空气,5 %二氧化碳培养箱中,将HeLa细胞、HL-7702细胞、3T3细胞分别接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。如图4所示,碳点皆在溶酶体内聚集。
5. 碳点在不同孵育时间下的活细胞成像中的应用
在37 ℃,95 %空气,5 %二氧化碳培养箱中,将HeLa细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养,加入碳点孵育不同的时间。如图5所示,碳点依然滞留在溶酶体内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,所述荧光碳点在追踪不同细胞系下的活细胞、固定细胞、凋亡的细胞中溶酶体的实时成像和长时间成像中的应用,荧光碳点的制备方法为:将无水柠檬酸加入到水中溶解,溶解后加入N,N-二甲基苯胺,混合液移入微波管中,微波加热反应,反应液经超滤,柱层析分离,得到荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,用碳点母液孵育不同细胞系下的细胞,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
3.根据权利要求1所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,用碳点母液孵育固定的细胞、凋亡下的细胞,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
4.根据权利要求1所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,用碳点母液孵育细胞,再加入氯喹刺激溶酶体的移动,并用共聚焦显微镜,以激发波长为405 nm光源激发,观察细胞成像图。
5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取荧光碳点,用超纯水溶解,准确配制10 mg/mL的碳点储存液;
(2)向比色皿中加入1990 µL的PBS缓冲溶液后,加入6 µL 10 mg/mL的碳点储存液,以405 nm进行激发,探针具有很强的荧光发射;
(3)通过共聚焦显微镜对孵育好荧光碳点的活细胞、固定的细胞和凋亡下的细胞进行荧光成像;
(4)通过共聚焦显微镜对孵育好荧光碳点的不同细胞系下的活细胞进行荧光成像;
(5)通过共聚焦显微镜对孵育不同时间的荧光碳点的活细胞进行荧光成像;
(6)通过共聚焦显微镜对氯喹刺激下碳点孵育的活细胞进行荧光成像。
6.根据权利要求1所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,所述N,N-二甲基苯胺和无水柠檬酸的物质的量之比为1:(1-3);N,N-二甲基苯胺和水的体积比为1:(10-30)。
7.根据权利要求1所述的荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用,其特征在于,所述微波加热的温度为160 ℃,反应时间为6-14 h;所述超滤分子量为3000 Da。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190827

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