CN108872172A - 一种基于bsa的超分辨成像探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用，该超分辨成像探针为包裹了Alexa Fluor 594染料的BSA纳米球，并且其表面偶联了HER2抗体；该探针具有荧光闪烁特性，可用于超分辨单分子定位成像；另外，该探针能靶向高表达HER2的肿瘤细胞，并能通过受体介导的内吞作用进入细胞；通过SMLM成像技术即可对摄入了该探针的肿瘤细胞进行超分辨光学成像；本发明实现了超分辨成像探针在细胞内进行超分辨成像的应用，利用SMLM显微镜，能够对探针在细胞内的分布进行精确定位。

Description

一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及超分辨成像探针领域，特别涉及一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用。

背景技术

近几年出现的超分辨率显微技术具有对超出光学衍射极限的亚细胞结构的成像能力，使得我们对细胞的研究发生了革命性的变化，因为超分辨率显微镜可以通过图形化的照明，如受激发射损耗（STED），或者通过图像重建的光激活的定位显微镜（PALM）和光学重建显微镜（STORM）。同时，由于当前可用的荧光探针的不断开发，通过单分子定位的PALM/ STORM的最终空间分辨率几乎可以实现在细胞内的分子追踪。从概念上讲，PALM / STORM通过调节激活和激发激光器的状态，实现荧光团在荧光（“开”）和暗（“关”）态之间的随机切换，然后将包含所有荧光团发光位置的荧光图像结构重建形成超分辨图像。而目前已报道的适用于单分子定位成像的光学探针包括有机染料，量子点（QDs），碳点（CDs）和荧光蛋白（例如：绿色荧光蛋白，GFP）等等。通常，观察这些探针的荧光“开”和“关”（闪烁）行为须在一些严格的条件下才能实现，例如多个照明激光器，高功率激光照射或毒性成像缓冲溶液等等。这些要求使得PALM / STORM成像过程相对复杂和麻烦，更加限制了超分辨成像在活细胞成像的应用。因此，开发在温和条件下具有光学闪烁行为的新型纳米探针对于超分辨成像技术的发展将尤为重要。

受体介导的内吞（receptor mediated endocytosis)是一种特殊类型的内吞作用,主要是用于摄取特殊的生物大分子.被吞入的物质首先同细胞质膜的受体蛋白结合,同受体结合的物质称为配体(ligand)。受体介导的内吞作用有两个主要特点:①配体与受体的结合是特异的,具有选择性; ②要形成特殊包被的内吞泡。内吞过程大致分为四个基本过程∶①配体与膜受体结合形成一个小窝(pit); ② 小窝逐渐向内凹陷.然后同质膜脱离形成一个被膜小泡;③ 被膜小泡的外被很快解聚,形成无被小泡,即初级内体;④ 初级内体与溶酶体融合,吞噬的物质被溶酶体的酶水解。

利用单分子定位显微技术的超高分辨率，有望细致地观察到纳米粒子通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞后，在细胞内的分布及定位。这有利于研究纳米粒子与细胞之间的相互作用。

发明内容

本发明为了克服传统光学显微镜存在的光学衍射极限，提供了一种荧光闪烁良好、制备过程简单超分辨成像探针，可用于探究通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞的纳米材料的光学超分辨定位及分布研究。本发明还提供了该超分辨成像探针的制备方法及其应用。

一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，具体步骤如下：以BSA为基质合成BSA纳米球，向BSA纳米球中掺入Alexa Fluor 594染料后，加入HER2抗体溶液以及偶联剂，并在掺了染料的BSA纳米球表面偶联HER2抗体，即可得到超分辨成像探针。掺入的Alexa Fluor 594染料具有荧光闪烁特性，可用于单分子定位成像。

作为本发明的一种改进，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将BSA溶解于PBS溶液中，用碳酸氢钠调节PH，向溶液中加入Alexa Fluor 594 NHSester，并放于摇床摇晃反应，得到偶联了染料的BSA溶液；

（2）向BSA溶液中加入经过步骤（1）所得的偶联了染料的BSA溶液，得到混合的BSA溶液；向混合的BSA溶液中加入无水乙醇以及偶联剂溶液并搅拌，得到掺入了染料的BSA纳米球溶液；待反应结束后，用超滤管离心提纯即得到掺入了染料的BSA纳米球；

（3）在步骤（2）所得的掺染料的BSA纳米球中依次加入偶联剂溶液以及HER2抗体溶液，并放于摇床摇晃反应，用超滤管离心提纯，即可得超分辨成像探针

作为本发明的一种改进，所述步骤（2）以及步骤（3）中的偶联剂均为戊二醛；所述步骤（2）中戊二醛的终浓度为0.1-0.5%，所述步骤（3）中戊二醛的终浓度为0.1-1%。

作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中，BSA和Alexa Fluor 594 NHS ester的质量比为1000:2-0.5。

作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中摇床摇晃反应时间为1小时；所述步骤（1）中，碳酸氢钠调节后溶液的PH为8.3-8.5。

作为本发明的一种改进，所述步骤（2）得到的混合的BSA溶液中，BSA的总浓度为5-20 mg/mL；混合的BSA溶液与无水乙醇的体积比为1:0.5-2。

作为本发明的一种改进，所述步骤（2）的搅拌反应时间为12-18小时；所述步骤（2）中超滤管为50KD超滤管，超滤管离心时转速为6500 round/min，离心时间为20 min。

作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中BSA纳米球与HER2抗体的体积比为100:0.5-5，所述HER2抗体的浓度是1 mg/mL；所述步骤（3）床摇晃反应时间为4-16小时。

作为本发明的一种改进，所述的制备方法制得的超分辨成像探针在肿瘤细胞超分辨成像中的应用。

作为本发明的一种改进，所述应用的具体步骤如下：

1）将制得的超分辨成像探针加入培养液后与肿瘤细胞共孵育；

2）将经过步骤1）处理后的肿瘤细胞中的培养液取出，并用PBS洗去多余杂质；

3）将经过步骤2）处理后的肿瘤细胞用多聚甲醛固定；

4）在经过步骤3）处理后的肿瘤细胞中加入成像缓冲液；所述成像缓冲液的成分包含巯基乙醇、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及葡萄糖；

5）将加入了成像缓冲液的样品放于单分子定位显微镜下进行成像，激发光波长为561nm或543nm，收集570-620 nm之间的荧光信号进行超分辨光学成像。

本发明的探针可用于基于单分子定位（SMLM）的超分辨光学成像，BSA纳米球中掺入的Alexa Fluor 594染料作为荧光团，其荧光闪烁现象对基于SMLM的超分辨成像至关重要。将HER2抗体通过戊二醛偶联到掺入了Alexa Fluor 594的BSA纳米球上，获得了可用于通过受体介导的内吞作用靶向肿瘤细胞的超分辨成像探针。利用SMLM技术对进入了细胞的该超分辨成像探针进行超分辨定位与成像，空间分辨率可达50 nm，突破了光学衍射极限（200-300 nm）限制的分辨率。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明采用具有良好荧光闪烁效应的掺染料的BSA纳米球作为超分辨成像探针的荧光基团，符合SMLM技术的应用需求。所制备的超分辨成像探针闪烁时间久、光稳定性好，能够用于长时间超分辨光学成像。结合SMLM成像技术，该探针能够用于深入探究受体介导的内吞纳米粒子在肿瘤细胞内的超分辨空间定位及分布。

附图说明

图1为超分辨成像探针的荧光闪烁图；

图2 为实施例4中超分辨成像探针通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞后的普通宽场荧光成像图；

图3 为实施例4中超分辨成像探针通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞后的单分子定位超分辨成像图；

图4为一种基于BSA的超分辨成像探针的制备方法的反应机理结构示意图。

具体实施方式

一、原料来源

1、PBS缓冲液为pH=7.4，浓度为10 mM的PBS缓冲液；

2、Alexa Fluor 594 NHS ester购自Invitrogen公司；

3、HER2抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；

4、其余材料均为市售所得。

二、超分辨成像探针的制备

实施例1：

取2mg BSA溶解于200 μL PBS溶液中，用0.5 M碳酸氢钠调节PH至8.3，然后在溶液中加入2 μL 1 mg/mL Alexa Fluor 594 NHS ester并于室温摇床遮光反应1小时，所得溶液即为偶联有Alexa Fluor 594的BSA溶液。

取20 mg BSA溶解于2 mL PBS溶液中，再加入200 μL 上述制备的偶联有AlexaFluor 594的BSA溶液，得到混合的BSA溶液（BSA总浓度10 mg/mL）。搅拌并继续加入2 mL 无水乙醇，再加入50 μL，8%（v/v）的戊二醛溶液，搅拌反应12 h后（戊二醛的终浓度为0.18%），得到掺入了染料的BSA纳米球溶液，最后将样品用50 KD超滤管6500 round/min，20 min提纯5次，即可得掺入了Alexa Fluor 594的BSA纳米球。随后，取500 μL 掺入了Alexa Fluor594的BSA纳米球溶液，加入50 μL 10%（v/v）的戊二醛溶液，再加入5 μL 1 mg/mL的HER2抗体溶液，室温下摇床摇晃反应6 h（戊二醛的终浓度为0.9%），再用100 KD超滤管8000round/min，15 min提纯3次，即可得超分辨成像探针。

图1为该超分辨成像探针的单粒子荧光闪烁特性测量曲线，从局放大图可以看出所制备的超分辨成像探针的荧光强度随时间呈显著起伏（即荧光闪烁现象），说明所制备的超分辨成像探针适用于SMLM成像。同时，数据采集时间持续到600秒时，该超分辨成像探针的荧光闪烁并没有消失或减弱，说明该探针具有优异的长时间荧光闪烁能力，为超分辨成像应用提供了良好的支撑。

实施例2：

取5mg BSA溶解于200 μLPBS溶液中，用0.5M碳酸氢钠调节PH至8.3，然后在溶液中加入5μL 1mg/mL Alexa Fluor 594-NHS easter并于室温摇床遮光反应1小时，所得溶液即为偶联有Alexa Fluor 594的BSA溶液。

取20 mg BSA溶解于2 mL PBS溶液中，再加入200 μL上述制备的偶联有AlexaFluor 594的BSA溶液，得到混合的BSA溶液（BSA总浓度11.4 mg/mL）。搅拌并继续加入2 mL无水乙醇，再加入50 μL，8%（v/v）的戊二醛溶液，搅拌反应18h后（戊二醛的终浓度为0.18%），得到掺入了染料的BSA纳米球溶液，最后将样品用50KD超滤管6500round/min，20min提纯5次，即可得掺入了Alexa Fluor 594的BSA纳米球。随后，取500 μL 掺入了AlexaFluor 594的BSA纳米球溶液，加入50 μL 10%（v/v）的戊二醛溶液，再加入10 μL 1mg/mL 的HER2抗体溶液，室温下摇床摇晃反应4h（戊二醛的终浓度为0.89%），再用100KD超滤管8000round，15 min提纯3次，即可得超分辨成像探针。该探针的单粒子荧光闪烁特性测量曲线与图1类似。

实施例3：

取2 mg BSA溶解于200μL PBS溶液中，用0.5M碳酸氢钠调节PH至8.5，然后在溶液中加入2μL 1mg/mL Alexa Fluor 594-NHS easter并于室温摇床遮光反应1小时，所得溶液即为偶联有Alexa Fluor 594的BSA溶液。

取20 mg BSA溶解于2 mL PBS溶液中，再加入200 μL 上述制备的偶联有AlexaFluor 594的BSA溶液，得到混合的BSA溶液（BSA总浓度10 mg/mL）。搅拌并继续加入4mL 无水乙醇，再加入50μL，8%（v/v）的戊二醛溶液，搅拌反应16h后（戊二醛的终浓度为0.18%），得到掺入了染料的BSA纳米球溶液，最后将样品用50KD超滤管6500 round/min，20min提纯5次，即可得掺入了Alexa Fluor 594的BSA纳米球。随后，取500 μL 掺入了Alexa Fluor 594的BSA纳米球溶液，加入10 μL 10%（v/v）的戊二醛溶液，再加入10 μL 1mg/mL 的HER2抗体溶液，室温下摇床摇晃反应16 h（戊二醛的终浓度为0.19%），再用100KD超滤管8000 round，15 min提纯3次，即可得超分辨成像探针。该探针的单粒子荧光闪烁特性测量曲线与图1类似。

实施例4：

上述超分辨成像探针在肿瘤细胞超分辨成像中的应用，具体方法为：细胞接种于八孔板内并孵育24 h，加入上述制备的超分辨成像探针50-200 μL，轻微摇晃以混合均匀，置于37℃恒温箱反应1-12小时，反应结束后将培养液取出并用PBS洗去剩余杂质。最后，加入多聚甲醛固定10分钟，后加入成像缓冲液以用于基于单分子定位的超分辨成像。成像缓冲液的配方为巯基乙醇（10μL/mL）、葡萄糖氧化酶（50μg/mL）、过氧化氢酶（50μg/mL）、葡萄糖（100mg/mL）。

图2为实施例4中所得的超分辨成像探针通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞的探针的普通宽场荧光图像，图3是实施例4中所得的超分辨成像探针通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞后的单分子定位超分辨成像图；从图中可以看出，相比较普通宽场荧光图像，SMLM超分辨成像图空间分辨率高，能更加清晰和详细地展示探针在细胞内的定位以及分布。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：以BSA为基质合成BSA纳米球，向BSA纳米球中掺入Alexa Fluor 594染料后，加入HER2抗体溶液以及偶联剂，并在掺了染料的BSA纳米球表面偶联HER2抗体，即可得到超分辨成像探针。

2.根据权利要求1所述一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将BSA溶解于PBS溶液中，用碳酸氢钠调节PH，向溶液中加入Alexa Fluor 594 NHSester，并放于摇床摇晃反应，得到偶联了染料的BSA溶液；

（2）向BSA溶液中加入经过步骤（1）所得的偶联了染料的BSA溶液，得到混合的BSA溶液；向混合的BSA溶液中加入无水乙醇以及偶联剂溶液并搅拌，得到掺入了染料的BSA纳米球溶液；待反应结束后，用超滤管离心提纯即得到掺入了染料的BSA纳米球；

（3）在步骤（2）所得的掺染料的BSA纳米球中依次加入偶联剂溶液以及HER2抗体溶液，并放于摇床摇晃反应，用超滤管离心提纯，即可得超分辨成像探针。

3.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）以及步骤（3）中的偶联剂均为戊二醛；所述步骤（2）中戊二醛的终浓度为0.1-0.5%，所述步骤（3）中戊二醛的终浓度为0.1-1%。

4.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，BSA和Alexa Fluor 594 NHS ester的质量比为1000:2-0.5。

5.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中摇床摇晃反应时间为1小时；所述步骤（1）中，碳酸氢钠调节后溶液的PH为8.3-8.5。

6.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）得到的混合的BSA溶液中，BSA的总浓度为5-20 mg/mL；混合的BSA溶液与无水乙醇的体积比为1:0.5-2。

7.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的搅拌反应时间为12-18小时；所述步骤（2）中超滤管为50KD超滤管，超滤管离心时转速为6500 round/min，离心时间为20 min。

8.根据权利要求2所述的一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中BSA纳米球与HER2抗体的体积比为100:0.5-5，所述HER2抗体的浓度是1 mg/mL；所述步骤（3）床摇晃反应时间为4-16小时。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得的超分辨成像探针在肿瘤细胞超分辨成像中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，具体步骤如下：

1）将制得的超分辨成像探针加入培养液后与肿瘤细胞共孵育；

2）将经过步骤1）处理后的肿瘤细胞中的培养液取出，并用PBS洗去多余杂质；

3）将经过步骤2）处理后的肿瘤细胞用多聚甲醛固定；

4）在经过步骤3）处理后的肿瘤细胞中加入成像缓冲液；所述成像缓冲液的成分包含巯基乙醇、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及葡萄糖；

5）将加入了成像缓冲液的样品放于单分子定位显微镜下进行成像，激发光波长为561nm或543nm，收集570-620 nm之间的荧光信号进行超分辨光学成像。