CN108299438A - pH响应性近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种pH响应性近红外荧光探针化合物、其探针，以及该化合物的制备方法和应用。本发明的化合物可以用于癌症检测的pH敏感性近红外荧光探针，该探针可以特异性定位于线粒体，并可以基于酸性敏感性特性有效区分肿瘤细胞与正常细胞。可以直接区分癌细胞与肿瘤细胞，具有普适性诊断意义，适用范围广。后期一旦修饰特异性靶向药物，则可以在成像的基础上进行肿瘤的治疗，具有很好的临床意义。
Description
技术领域
本发明属于癌症诊断领域，具体涉及一种pH响应性近红外荧光探针化合物、其探针，以及该化合物的制备方法和应用。
背景技术
目前，癌症已经成为威胁人类健康的首要难题，故而癌症检测对于人类健康发展具有重要指导意义。而探针因其具有快速灵敏且特异性好的特点广泛应用于各类疾病的检测。传统的应用于癌细胞诊断的探针大都针对于某种特异性的疾病的诊断，通过在其表面修饰靶标分子进入癌细胞，释放药物进而杀死癌细胞。而这种检测分子因其具有高选择性，并且受限于体内灵敏多变的环境，在广适性上受到了很大的局限。
线粒体作为细胞最重要的能量来源，成为生命体中必不可少的细胞器。细胞器的研究一直是认识细胞结构和功能的重要手段。线粒体是细胞的能量工厂，参与众多的新陈代谢过程，许多病理学过程均与它相关，定位于线粒体的荧光探针是一种重要的细胞器，一直以来都是研究的热点。近年来,许多基于有机小分子既能定位于线粒体又能够检测线粒体内各类活性小分子的双功能线粒体荧光探针被相继报道，成功地实现了线粒体内多种活性物种的检测和可视化成像，这些物种包括活性氧、还原性物种、金属离子、质子、阴离子等，进一步对线粒体内特定活性小分子进行组织及活体内无创检测与成像。
经过科学家指出，对于患有肿瘤的生命体，体内的肿瘤细胞相比于其他未生长肿瘤部位的pH值要低0.2-0.6，基于此，本发明设计了一个细胞毒性低、光稳定性高、对pH敏感的探针，实现了HeLa/MCF-7等癌细胞线粒体的定位检测。
据了解，现有技术中已有公开水溶性线粒体靶向成像探针及其制备方法，但该探针对癌细胞和非癌细胞都具有较高的线粒体靶向成像的特点，不能有效区分出癌细胞与非癌细胞，限制了其临床意义。
发明内容
为克服现有技术中的上述缺陷，本发明人设计合成了一种对于癌症检测成像具有普适性的线粒体荧光探针，可以广泛性的用于癌症筛选，对肿瘤的筛查具有重要指导意义。
概括而言，本发明的目的在于提供一种pH响应性近红外荧光探针化合物、其探针，以及该化合物的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种pH响应性近红外荧光探针化合物，所述化合物引入亲脂阳离子检测基团，并修饰季胺盐。
根据本发明第一方面的化合物，优选地，所述化合物由二酮吡咯并吡咯核和两个用季铵封端的烷基链组成。
更优选地，所述化合物为如下所示的DPP-噻吩-4：
该化合物包含π-共轭核(DPP)和用季铵盐封端的两个烷基链。
本发明的第二方面提供了第一方面所述化合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
以含有二酮吡咯并吡咯核的化合物为原料，通过三步反应连接季铵盐烷基链，经真空浓缩、有机溶剂洗涤、过硅胶柱纯化制得。
根据本发明第二方面的制备方法，进一步地，所述方法的反应路径为：
根据本发明第二方面的制备方法，进一步地，所述方法包括以下步骤：
(1)将DPP-噻吩-1、6-溴己基氨基甲酸叔丁酯和Cs2CO3的混合物溶解于二甲基甲酰胺在70℃下过夜；将混合物在70℃下真空浓缩；将残余物用石油醚和四氢呋喃(THF)的混合溶剂洗涤，得到粗产物，将其通过硅胶柱纯化，得到作为紫色固体的DPP-噻吩-2；
(2)在0℃下，将溶解在二氯甲烷DCM(30ml)中的DPP-噻吩-2滴加到三氟乙酸中；将反应混合物在室温下搅拌过夜，并在40℃真空浓缩；将甲醇和K2CO3依次加入到浓缩的产物中。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后真空浓缩并通过硅胶柱纯化，得到DPP-噻吩-3，为紫色固体；
(3)将DPP-噻吩-3，K2CO3和CH3I的混合物在60℃下搅拌过夜。反应混合物变为红色。将该混合物冷却至室温，过滤收集沉淀；通过C18柱纯化滤饼，得到作为紫色固体的DPP-噻吩-4。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的化合物在制备用于诊断恶性肿瘤和/或检测恶性肿瘤细胞的药物或医疗产品中的用途。
优选地：
所述恶性肿瘤包括但不限于：食道癌、乳腺癌、宫颈癌；和/或
所述恶性肿瘤细胞包括但不限于：Hela、MCF-7、A375。
本发明的第四方面提供了一种pH敏感性探针，所述探针包括如前所述的化合物，优选地，探针为线粒体荧光探针，进一步优选为水溶性线粒体靶向成像探针。
本发明的第五方面提供了所述的探针在制备用于定位检测恶性肿瘤细胞的药物或医疗产品中的用途；优选地，
所述恶性肿瘤细胞包括但不限于：Hela、MCF-7、A375；和/或
所述检测定位于所述恶性肿瘤细胞的线粒体。
现结合本发明的构思，对本发明具体技术方案进一步阐述如下：本发明涉及一种用于癌症检测的pH敏感性近红外荧光探针。此荧光检测探针通过设计引入亲脂阳离子检测基团，并修饰季胺盐，得到pH敏感性的探针。在pH6.8-7.0这个区间内，分子的荧光信号骤减。在体外的细胞实验中，Hela、MCF-7、A375的细胞成像的荧光强度通过共聚焦显微镜以及流式分析仪得到其信号强度远远大于正常的细胞如Huvec，3T3，MDCK。体内活体成像实验中，针对常见的几种具有临床诊断意义的肿瘤模型(食道癌、乳腺癌、宫颈癌等)小鼠进行实验，发现肿瘤部位的荧光强度远远高于正常组织。可以实现具有普适性的癌症诊断检测。
癌症诊断对于临床检测具有指导性意义。线粒体的定位对于细胞诊断具有很重要的意义。本研究利用线粒体定位特异性探针的机制，设计合成了pH敏感性的探针，得到在pH6.8-7.0区间范围内分子的荧光强度有明显的降低。这种优势可以在肿瘤细胞模型成像以及治疗上有重要的意义。
本发明的技术方案具有但不限于以下有益效果：
本发明的化合物可以用于癌症检测的pH敏感性近红外荧光探针。此荧光检测探针通过设计引入亲脂阳离子检测基团，并修饰季胺盐，得到pH敏感性的探针。在pH6.8-7.0这个区间内，分子的荧光信号骤减。在体外的细胞实验中，Hela、MCF-7、A375的细胞成像的荧光强度通过共聚焦显微镜以及流式分析仪得到其信号强度远远大于正常的细胞如Huvec，3T3，MDCK。体内活体成像实验中，针对常见的几种具有临床诊断意义的肿瘤模型(食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、咽喉癌等)小鼠进行实验，发现肿瘤部位的荧光强度远远高于正常组织。可以实现具有普适性的癌症诊断检测。
本发明建立了新型肿瘤成像方法，探针可以特异性定位于线粒体，并可以基于酸性敏感性特性有效区分肿瘤细胞与正常细胞。可以直接区分癌细胞与肿瘤细胞，具有普适性诊断意义，适用范围广。后期一旦修饰特异性靶向药物，则可以在成像的基础上进行肿瘤的治疗，具有很好的临床意义。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1设计的DPP-噻吩-4的合成制备方法；其中，图1A显示DPP-噻吩-4的合成反应路线；图1B显示在HPLC纯化和冻干后，紫色探针在pH6.8下容易以10μg/ml的浓度重新溶解于水中。
图2示出了实施例1设计、实施例2制备的DPP-噻吩-4探针对肿瘤的检测试验结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
BCECF-AM(双重激发比率pH指示剂)，购自东仁化学科技有限公司；DPP-噻吩-1、6-溴己基氨基甲酸叔丁酯、Cs2CO3、三氟乙酸、二甲基甲酰胺(DMF，60ml)、硅胶柱、C18柱、胎牛血清(GIBCO)的Dulbecco改良的Eagle培养基，购自sigma试剂公司(全称Sigma-AldrichLLC)；石油醚、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、K2CO3、CH3I，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
细胞：
MCF7细胞(人乳腺癌细胞)，HeLa细胞(宫颈癌细胞)，A375细胞(人黑素瘤细胞)，MDCK细胞(犬肾细胞)，3T3细胞(小鼠成纤维细胞)和HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)均购自普诺赛生物公司。
仪器：
共聚焦显微镜(Zeiss)，购自德国Zeiss公司，型号：Zeiss 710；
荧光光度计(Shimadzu RF-5301)，购自日本Shimadzu公司，型号：Shimadzu RF-5301。
实施例1：探针的结构设计
DPP-噻吩-4该探针包含π-共轭核(DPP)和用季铵盐封端的两个烷基链。制备后的性状检测试验显示，DPP作为发光团可以产生强烈的红色荧光。它不仅对热，湿度和光具有良好的稳定性，而且还具有许多优异的光学性能，例如高光稳定性和显着的斯托克斯位移。本发明人最近的研究表明，带负电荷的DPP探针将改善其水溶性，并且具有标记生物大分子的潜力。与带负电荷的DPP探针的发展相反，我们对基于DPP的探针施加正电荷——己基三甲基溴化铵臂。由于原始染料分子的对称性，两个六碳烷基链可以用作表面活性剂的类似物，例如十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。这样的改性不仅改善了这种探针的水溶性，也有利于本发明的探针分子结合和穿透细胞。此外，表面活性剂类似物的性质允许分子在外部刺激下以浓度依赖的方式自我组装。总的来说，本发明人发现本发明设计的探针可以很好地溶解在酸性条件下，增加pH可形成纳米级聚合物，这可以应用于恶性肿瘤的光谱成像。
实施例2：探针的制备方法
如图1所示，DPP-噻吩-4的合成非常简单。在HPLC纯化和冻干后，紫色探针在pH6.8下容易以10μg/ml的浓度重新溶解于水中。所制备的溶液给出中心在569nm的强荧光发射，激发波长为543nm。以下分步骤分别详细描述操作及检测结果：
化合物DPP-噻吩-2的合成
将DPP-噻吩-1(3.00g，10.0mmol)，6-溴己基氨基甲酸叔丁酯(8.88g，30.0mmol)和Cs2CO3(16.2g，50.0mmol)的混合物溶解于二甲基甲酰胺(DMF，60ml)在70℃下过夜。将混合物在70℃下真空浓缩。将残余物用石油醚和四氢呋喃(THF)(100ml，石油醚/THF＝1/1)的混合溶剂洗涤，得到粗产物，将其通过硅胶柱纯化(石油醚/二氯甲烷DCM＝10/1-0/1，然后DCM/甲醇＝200/1-50/1)，得到作为紫色固体的DPP-噻吩-2(4.00g，产率57％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ(ppm)：8.83(d，2H，J＝3.6Hz)，8.10(d，2H，J＝4.8Hz)，7.41(t，2H，J＝6.2Hz)，6.76(t，2H，J＝5.6Hz)，3.99(t，4H，J＝7.2Hz)，2.86-2.90(m，4H)，1.58-1.66(m，4H)，1.20-1.36(m，34H)。MS(ESI)m/z计算值[M-99]+：598.32，实测值：599.30。
化合物DPP-噻吩-3的合成
在0℃下，将溶解在DCM(30ml)中的DPP-噻吩-2(3.80g，5.44mmol)滴加到三氟乙酸(TFA，8ml)中。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并在40℃真空浓缩。将甲醇(50ml)和K2CO3(1.50g，10.9mmol)依次加入到浓缩的产物中。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后真空浓缩并通过硅胶柱(DCM/氨/甲醇＝100/0.25/1-15/0.25/1)纯化，得到DPP-噻吩-3(2.50g，产率92％)，为紫色固体。1H NMR(MeOD-d4，400MHz)：δ(ppm)：8.87(dd，2H，J1＝4.0Hz，J2＝0.8Hz)，7.94(dd，2H，J1＝4.8Hz，J2＝0.8Hz)，7.38(t，2H，J＝4.8Hz)，4.15(t，4H，J＝7.2Hz)，2.93(t，4H，J＝7.2Hz)，1.75-1.84(m，4H)，1.64-1.72(m，4H)，1.44-1.53(m，8H)。MS(ESI)m/z计算值：[M+H]+：498.21，实测值：499.20。
化合物DPP-噻吩-4的合成
将DPP-噻吩-3(2.50g，5.02mmol)，K2CO3(5.54g，40.2mmol)和CH3I(21.2g，151mmol)的混合物在60℃下搅拌过夜。反应混合物变为红色。将该混合物冷却至室温，过滤收集沉淀。通过C18柱纯化滤饼，得到作为紫色固体的DPP-噻吩-4(1.80g，产率48％)。1HNMR(MeOD-d4，400MHz)：δ(ppm)：8.75(dd，2H，J1＝4.0Hz，J2＝0.8Hz)，7.84(dd，2H，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz)，7.26(dd，2H，J1＝4.8Hz，J2＝4.0Hz)，4.00(t，4H，J＝7.6Hz)，3.21-3.29(m，4H)，3.20(s，18H)，1.65-1.74(s，8H)，1.35-1.42(m，8H)。MS(ESI)m/z计算值，1/2[M-2Br]+：292.16，实测值：292.30。
细胞培养和荧光强度的检测
DPP-噻吩-4以1mg/ml的浓度溶解于双蒸水中。在补充有10％胎牛血清(GIBCO)的Dulbecco改良的Eagle培养基(GIBCO)的6孔细胞培养板(Corning)上分别培养六种类型的细胞(MCF-7，HeLa，A375，MDCK，3T3，HUVEC)过夜。将DPP-噻吩-4(50μl，10μg/ml)在5％CO2培养箱中在37℃下加入细胞(5×105个细胞)中20分钟。通过共聚焦显微镜(Zeiss)在543nm激发下观察DPP-噻吩-4染色的细胞。通过荧光光度计(Shimadzu RF-5301)在543nm激发下检测细胞的荧光强度。
试验例1：实施例2制备的探针对肿瘤的检测试验
本试验例探究如前述实施例1、2所设计和制备得到的DPP-噻吩-4在体外区分恶性肿瘤细胞和正常细胞的能力。
具体地，本试验例在体外实验中选择三种类型的恶性肿瘤细胞和三种类型的非肿瘤细胞，分别为：MCF7细胞(人乳腺癌细胞)，HeLa细胞(宫颈癌细胞)，A375细胞(人黑素瘤细胞)，MDCK细胞(犬肾细胞)，3T3细胞(小鼠成纤维细胞)和HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)。使用BCECF-AM(2'，7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素，乙酰氧甲基酯)定量六种类型的细胞的细胞内pH。BCECF-AM是双重激发比率pH指示剂，pKa为约6.98并且可以在7.0附近测量pH变化。使用BCECF-AM的pH测量通过测定激发时发射强度(535nm)的pH依赖比来进行相对于其在440nm的等吸光点处激发时的发射强度。如图2所示，MCF7，HeLa和A375细胞的细胞内pH为6.52±0.11，6.64±0.17和6.71±0.09，均低于6.8。相反，MDCK，3T3和HUVEC细胞的细胞内pH为7.23±0.22，7.46±0.29和7.40±0.31，均高于6.8。加入10μg/ml DPP-噻吩-4到细胞培养基中孵育约20分钟。DPP-噻吩-4在MCF7，HeLa和A375细胞中产生明亮的荧光。相比之下，本发明人观察到MDCK，3T3和HUVEC细胞中没有/产生弱的荧光。
本试验例结果表明，DPP-噻吩-4根据肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的pH差异在体外产生显着不同的荧光强度。虽然几种商业可用的pH敏感染料可能定量pH值，但是双发射比率测量由于其荧光发射中较不优化的pH依赖性变化而不经常进行。相比之下，本发明的off-on发射模式更容易和更现实，以区分正常细胞中的癌细胞。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种pH响应性近红外荧光探针化合物，其特征在于，所述化合物引入亲脂阳离子检测基团，并修饰季胺盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物由二酮吡咯并吡咯核和两个用季铵封端的烷基链组成。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物为如下所示的DPP-噻吩-4：
其中，该化合物包含π-共轭核(DPP)和用季铵盐封端的两个烷基链。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
以含有二酮吡咯并吡咯核的化合物为原料，通过三步反应连接季铵盐烷基链，经真空浓缩、有机溶剂洗涤、过硅胶柱纯化制得。
5.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法的反应路径为：
6.权利要求1至3中任一项所述的化合物在制备用于诊断恶性肿瘤和/或检测恶性肿瘤细胞的药物或医疗产品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：
所述恶性肿瘤包括但不限于：食道癌、乳腺癌、宫颈癌；和/或
所述恶性肿瘤细胞包括但不限于：Hela、MCF-7、A375。
8.一种pH敏感性探针，其特征在于，所述探针包括权利要求1至3中任一项所述的化合物。
9.根据权利要求8所述的探针，其特征在于，探针为线粒体荧光探针，优选为水溶性线粒体靶向成像探针。
10.权利要求8或9所述的探针在制备用于定位检测恶性肿瘤细胞的药物或医疗产品中的用途；优选地，
所述恶性肿瘤细胞包括但不限于：Hela、MCF-7、A375；和/或
所述检测定位于所述恶性肿瘤细胞的线粒体。
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