CN110672572B - 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,涉及细胞生物学领域,所述SYBR Green衍生物是通过对SYBR Green原料烷基化修饰得到的季铵盐产物;所述SYBR Green衍生物的修饰剂包括亲电试剂或连接有亲电取代基的功能分子。所述SYBR Green衍生物作为荧光探针在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,该类探针能够准确定位于活细胞的线粒体DNA中进行实时成像并反映线粒体的电势。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域,尤其涉及一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用。
背景技术
线粒体是哺乳动物中普遍存在的细胞器,对从ATP的产生到细胞死亡等各种细胞活动都发挥着至关重要的作用。线粒体是从古老的变形杆菌进化而来的内共生体,含有与细菌DNA相似的环状DNA结构。线粒体DNA能够编码与氧化、磷酸化相关的蛋白,是一种非常重要的危险相关分子模式,参与炎症、自身免疫和衰老过程。因此,发展线粒体DNA活细胞成像技术在细胞生物学和生物医药研究中具有重要意义。
DNA嵌入剂已经被广泛用于工业以及细胞生物学领域,如SYBR Green-I用于荧光PCR、Hoechst用于细胞核染色。由于上述探针对细胞核有很强的亲和力,会在细胞核中大量富集,因而很难直接用于活细胞线粒体DNA成像。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中传统DNA染料趋向于在细胞核中富集,很难直接用于活细胞线粒体DNA成像的问题,提供一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,采用一种SYBR Green衍生物作为探针能实现活细胞线粒体DNA成像,可特异性标记线粒体DNA,并反映线粒体的电势。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种SYBR Green衍生物,所述SYBR Green衍生物是通过对SYBR Green原料烷基化修饰得到的季铵盐产物。
所述SYBR Green衍生物的修饰剂包括亲电试剂或连接有亲电取代基的功能分子。
所述亲电试剂包括卤代烷烃、卤代烯烃、卤代炔烃、含对甲苯磺酰基烷烃中的至少一种;所述功能分子包括荧光分子。
所述SYBR Green原料包括SYBR Green-I和SYBR Green-I的结构类似物中的至少一种。
所述SYBR Green-I的结构类似物为与SYBR Green-I的结构类似的化合物,此处举例如下:
其中,R1可为正丙基、正丁基、3-(二甲基氨基)丙基等。
所述SYBR Green衍生物为SYBR Green-I烷基化修饰得到季铵盐产物,其化学结构式如下:
其中,R为烷基化后修饰的基团。
所述SYBR Green衍生物作为荧光探针在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用:所述SYBR Green衍生物在线粒体中选择性富集并对线粒体DNA进行荧光成像,所述细胞为活细胞。
所述SYBR Green衍生物在不超过2μM的浓度范围内,大量富集在线粒体中,并与线粒体DNA结合,发出绿色荧光。
所述SYBR Green衍生物能够反映活细胞线粒体电势,当线粒体电势丧失时,SYBRGreen衍生物探针会从线粒体DNA中转移到细胞核DNA中,当电势恢复时,又从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
所述细胞线粒体DNA的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、和超高分辨率荧光显微成像法。
所述探针获得的荧光信号可以通过共聚焦荧光显微镜、激光共聚焦荧光显微镜、转盘共聚焦荧光显微镜、随机重构荧光显微镜。
相对于现有技术,本发明技术方案取得的有益效果是:
1)所述SYBR Green衍生物的合成工艺简单,易于推广;2)所述SYBR Green衍生物作为荧光探针能够准确定位于活细胞的线粒体DNA中,信噪比高;3)所述SYBR Green衍生物能对活细胞线粒体DNA进行实时成像并反映线粒体的电势;4)所述SYBR Green衍生物可连接不同功能基团,实现不同应用,如连接开环罗丹明B来靶向和指示线粒体、连接pH响应染料来测试pH、连接NO响应染料来检测NO等;5)所述SYBR Green衍生物在细胞内保留时间长,细胞毒性小。
附图说明
图1为荧光探针SG-RB的作用原理图;
图2为荧光探针SG-Alk在细胞内的定位图;
图3为荧光探针SG-RB对DNA响应的发射光谱图;
图4为荧光探针SG-RB在细胞内的定位图;
图5为荧光探针SG-RB在细胞线粒体完全丧失电势之后又逐渐恢复电势期间的变化过程;
图6为荧光探针SG-RB通过MTT比色法测细胞毒性实验数据图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白,以下结合附图和实施例,对本发明做进一步详细说明。
本发明实施例以通过罗丹明B修饰SYBR Green-I的荧光探针SG-RB和丙炔修饰SYBR Green-I的荧光探针SG-Alk为例进行说明,其结构式如下:
本发明以罗丹明B修饰的SYBR Green-I(SG-RB)为例,阐述SG-RB作为荧光探针的原理如下:
1、根据文献报道(S.Wu,Y.Song,Z.Li,Z.Wu,J.Han and S.Han,AnalyticalMethods,2012,4,1699-1703.)由罗丹明B通过三步反应,得到化合物RB-CAP,再利用化合物RB-CAP与SYBR Green-I发生亲电取代反应,从而制备得到荧光探针SG-RB,化合物RB-CAP与SYBR Green-I的合成路线如下;
2、如图1所示,SG-RB利用线粒体跨膜电势在线粒体中富集,SYBR Green-I部分进而与线粒体DNA结合,发出绿色荧光,同时罗丹明B的红色被淬灭;当线粒体DNA受到破坏时,如线粒体自噬过程,SYBR Green-I部分失去与线粒体DNA的相互作用,绿色荧光消失,红色荧光恢复。因此,该荧光探针除了可以实现对活细胞线粒体DNA的实时荧光成像,并反映线粒体电势以外,还可以通过颜色变换成像线粒体自噬伴随线粒体DNA动态变化过程。
同SG-RB合成方法类似,SG-Alk由3-溴丙炔与SYBR Green-I发生取代反应,一步得到。SG-Alk能利用线粒体本身具有负的跨膜电势,实现在线粒体中的富集。SYBR Green-I部分进而与线粒体DNA结合,发出绿色荧光,用于线粒体DNA标记。
实施例1:配制浓度为1mM荧光探针SG-Alk的标准溶液。
称取5.5mg的SG-Alk溶于10mL二甲亚砜,即得1mmol/L(1mM)的荧光探针SG-Alk的标准溶液。
实施例2:荧光探针SG-Alk在HeLa细胞中的细胞器定位实验。
将实施例1制备的荧光探针SG-Alk的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例孵育HeLa细胞,同时加入终浓度1μM Mitotracker Deep Red(商业化的线粒体探针)和终浓度1μM Lysotracker Blue(商业化的溶酶体探针)进行共孵育,在5%CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min,然后用新鲜的细胞培养液洗三遍,最后用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。如图2所示,说明荧光探针SG-Alk定位在线粒体DNA中,其中,重合表示以上三种探针的信号重合在一张图上。
实施例3:配制浓度为1mM荧光探针SG-RB的标准溶液。
称取10.6mg的SG-RB溶于10mL二甲亚砜。即得1mmol/L(1mM)的荧光探针SG-RB的标准溶液。
实施例4:收集荧光探针SG-RB对DNA响应的荧光发射光谱。
取实施例3制备的荧光探针SG-RB的标准溶液50μL稀释至250μL,得200μM的荧光探针SG-RB的二甲亚砜溶液。取2μL上述溶液,溶于200μLPBS缓冲溶液(10.0mM,pH 7.5),加入质粒,孵育30min,检测荧光探针SG-RB(2μM)在不同DNA浓度下(0.00、0.18、0.90、1.80mg/mL的质粒),激发波长为490nm的荧光发射光谱。实验结果如图3,荧光探针SG-RB对DNA有响应。
实施例5:荧光探针SG-RB在HeLa细胞中的细胞器定位实验。
将荧光探针SG-RB的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例孵育HeLa细胞,同时加入终浓度0.3μM Mito-deep red(商业化的线粒体探针)和终浓度1μM Lysotracker Blue(商业化的溶酶体探针)进行共孵育,在5%CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min,然后用新鲜的细胞培养液洗三遍,最后用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。实验结果见图4,说明荧光探针SG-RB定位在线粒体DNA中,其中,重合表示将以上三种探针的信号重合在一张图上,而SG-RB具有红绿两种荧光信号,红光信号来自SG-RB中的罗丹明B部分,绿光信号来自SG-RB的SYBR Green-I部分。
实施例6:荧光探针SG-RB反映细胞的线粒体电势。
将荧光探针SG-RB的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例加入到HeLa细胞中,在5%CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min后,用新鲜的细胞培养液洗三遍,加入50μMCCCP(一种破坏线粒体电势的药物),孵育15min后,将含CCCP的细胞培养基换成新鲜的细胞培养基,然后在分别0、1、2、4、6、8、10、12、14、16min进行共聚焦荧光信号采集。实验结果如图5,细胞线粒体电势丧失后,荧光探针SG-RB进入细胞核DNA,线粒体电势恢复后,荧光探针SG-RB又逐渐从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
实施例7:荧光探针SG-RB通过MTT比色法测细胞毒性实验。
将荧光探针SG-RB分别以0、1、2、4、8μM的浓度与细胞培养混合用于孵育HeLa细胞(其中0μM组加入等体积的二甲亚砜)。在5%CO2和37℃的细胞培养箱中培养60min后,用新鲜的细胞培养液洗三遍,分别在0h、24h、48h后,通过MTT法(一种用于测量细胞数量的实验分析方法)测量细胞相对数。实验结果如图6表明,即使在孵育时间延长,孵育浓度增加的情况下,荧光探针SG-RB对HeLa细胞并不具有明显的毒性。
Claims (4)
2.权利要求1所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,其特征在于:所述SYBR Green衍生物在线粒体中选择性富集并对线粒体DNA进行荧光成像;所述SYBR Green衍生物在不超过2μM的浓度范围内,大量富集在线粒体中,并与线粒体DNA结合,发出绿色荧光。
3.如权利要求2所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,其特征在于:所述SYBR Green衍生物能够反映活细胞线粒体电势,当线粒体电势丧失时,SYBRGreen衍生物探针从线粒体DNA中转移到细胞核DNA中,当电势恢复时,又从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
4.如权利要求2所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用,其特征在于:所述细胞线粒体DNA的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、和超高分辨率荧光显微成像法。
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