CN110672572B - 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 - Google Patents
一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110672572B CN110672572B CN201910987600.4A CN201910987600A CN110672572B CN 110672572 B CN110672572 B CN 110672572B CN 201910987600 A CN201910987600 A CN 201910987600A CN 110672572 B CN110672572 B CN 110672572B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sybr green
- mitochondrial dna
- green derivative
- derivative
- fluorescence imaging
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，涉及细胞生物学领域，所述SYBR Green衍生物是通过对SYBR Green原料烷基化修饰得到的季铵盐产物；所述SYBR Green衍生物的修饰剂包括亲电试剂或连接有亲电取代基的功能分子。所述SYBR Green衍生物作为荧光探针在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，该类探针能够准确定位于活细胞的线粒体DNA中进行实时成像并反映线粒体的电势。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用。
背景技术
线粒体是哺乳动物中普遍存在的细胞器，对从ATP的产生到细胞死亡等各种细胞活动都发挥着至关重要的作用。线粒体是从古老的变形杆菌进化而来的内共生体，含有与细菌DNA相似的环状DNA结构。线粒体DNA能够编码与氧化、磷酸化相关的蛋白，是一种非常重要的危险相关分子模式，参与炎症、自身免疫和衰老过程。因此，发展线粒体DNA活细胞成像技术在细胞生物学和生物医药研究中具有重要意义。
DNA嵌入剂已经被广泛用于工业以及细胞生物学领域，如SYBR Green-I用于荧光PCR、Hoechst用于细胞核染色。由于上述探针对细胞核有很强的亲和力，会在细胞核中大量富集，因而很难直接用于活细胞线粒体DNA成像。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中传统DNA染料趋向于在细胞核中富集，很难直接用于活细胞线粒体DNA成像的问题，提供一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，采用一种SYBR Green衍生物作为探针能实现活细胞线粒体DNA成像，可特异性标记线粒体DNA，并反映线粒体的电势。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种SYBR Green衍生物，所述SYBR Green衍生物是通过对SYBR Green原料烷基化修饰得到的季铵盐产物。
所述SYBR Green衍生物的修饰剂包括亲电试剂或连接有亲电取代基的功能分子。
所述亲电试剂包括卤代烷烃、卤代烯烃、卤代炔烃、含对甲苯磺酰基烷烃中的至少一种；所述功能分子包括荧光分子。
所述SYBR Green原料包括SYBR Green-I和SYBR Green-I的结构类似物中的至少一种。
所述SYBR Green-I的结构类似物为与SYBR Green-I的结构类似的化合物，此处举例如下：
其中，R1可为正丙基、正丁基、3-(二甲基氨基)丙基等。
所述SYBR Green衍生物为SYBR Green-I烷基化修饰得到季铵盐产物，其化学结构式如下：
其中，R为烷基化后修饰的基团。
所述SYBR Green衍生物作为荧光探针在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用：所述SYBR Green衍生物在线粒体中选择性富集并对线粒体DNA进行荧光成像，所述细胞为活细胞。
所述SYBR Green衍生物在不超过2μM的浓度范围内，大量富集在线粒体中，并与线粒体DNA结合，发出绿色荧光。
所述SYBR Green衍生物能够反映活细胞线粒体电势，当线粒体电势丧失时，SYBRGreen衍生物探针会从线粒体DNA中转移到细胞核DNA中，当电势恢复时，又从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
所述细胞线粒体DNA的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、和超高分辨率荧光显微成像法。
所述探针获得的荧光信号可以通过共聚焦荧光显微镜、激光共聚焦荧光显微镜、转盘共聚焦荧光显微镜、随机重构荧光显微镜。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
1)所述SYBR Green衍生物的合成工艺简单，易于推广；2)所述SYBR Green衍生物作为荧光探针能够准确定位于活细胞的线粒体DNA中，信噪比高；3)所述SYBR Green衍生物能对活细胞线粒体DNA进行实时成像并反映线粒体的电势；4)所述SYBR Green衍生物可连接不同功能基团，实现不同应用，如连接开环罗丹明B来靶向和指示线粒体、连接pH响应染料来测试pH、连接NO响应染料来检测NO等；5)所述SYBR Green衍生物在细胞内保留时间长，细胞毒性小。
附图说明
图1为荧光探针SG-RB的作用原理图；
图2为荧光探针SG-Alk在细胞内的定位图；
图3为荧光探针SG-RB对DNA响应的发射光谱图；
图4为荧光探针SG-RB在细胞内的定位图；
图5为荧光探针SG-RB在细胞线粒体完全丧失电势之后又逐渐恢复电势期间的变化过程；
图6为荧光探针SG-RB通过MTT比色法测细胞毒性实验数据图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明实施例以通过罗丹明B修饰SYBR Green-I的荧光探针SG-RB和丙炔修饰SYBR Green-I的荧光探针SG-Alk为例进行说明，其结构式如下：
本发明以罗丹明B修饰的SYBR Green-I(SG-RB)为例，阐述SG-RB作为荧光探针的原理如下：
1、根据文献报道(S.Wu,Y.Song,Z.Li,Z.Wu,J.Han and S.Han,AnalyticalMethods,2012,4,1699-1703.)由罗丹明B通过三步反应，得到化合物RB-CAP，再利用化合物RB-CAP与SYBR Green-I发生亲电取代反应，从而制备得到荧光探针SG-RB，化合物RB-CAP与SYBR Green-I的合成路线如下；
2、如图1所示，SG-RB利用线粒体跨膜电势在线粒体中富集，SYBR Green-I部分进而与线粒体DNA结合，发出绿色荧光，同时罗丹明B的红色被淬灭；当线粒体DNA受到破坏时，如线粒体自噬过程，SYBR Green-I部分失去与线粒体DNA的相互作用，绿色荧光消失，红色荧光恢复。因此，该荧光探针除了可以实现对活细胞线粒体DNA的实时荧光成像，并反映线粒体电势以外，还可以通过颜色变换成像线粒体自噬伴随线粒体DNA动态变化过程。
同SG-RB合成方法类似，SG-Alk由3-溴丙炔与SYBR Green-I发生取代反应，一步得到。SG-Alk能利用线粒体本身具有负的跨膜电势，实现在线粒体中的富集。SYBR Green-I部分进而与线粒体DNA结合，发出绿色荧光，用于线粒体DNA标记。
实施例1：配制浓度为1mM荧光探针SG-Alk的标准溶液。
称取5.5mg的SG-Alk溶于10mL二甲亚砜，即得1mmol/L(1mM)的荧光探针SG-Alk的标准溶液。
实施例2：荧光探针SG-Alk在HeLa细胞中的细胞器定位实验。
将实施例1制备的荧光探针SG-Alk的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例孵育HeLa细胞，同时加入终浓度1μM Mitotracker Deep Red(商业化的线粒体探针)和终浓度1μM Lysotracker Blue(商业化的溶酶体探针)进行共孵育，在5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min，然后用新鲜的细胞培养液洗三遍，最后用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。如图2所示，说明荧光探针SG-Alk定位在线粒体DNA中，其中，重合表示以上三种探针的信号重合在一张图上。
实施例3：配制浓度为1mM荧光探针SG-RB的标准溶液。
称取10.6mg的SG-RB溶于10mL二甲亚砜。即得1mmol/L(1mM)的荧光探针SG-RB的标准溶液。
实施例4：收集荧光探针SG-RB对DNA响应的荧光发射光谱。
取实施例3制备的荧光探针SG-RB的标准溶液50μL稀释至250μL，得200μM的荧光探针SG-RB的二甲亚砜溶液。取2μL上述溶液，溶于200μLPBS缓冲溶液(10.0mM,pH 7.5)，加入质粒，孵育30min，检测荧光探针SG-RB(2μM)在不同DNA浓度下(0.00、0.18、0.90、1.80mg/mL的质粒)，激发波长为490nm的荧光发射光谱。实验结果如图3，荧光探针SG-RB对DNA有响应。
实施例5：荧光探针SG-RB在HeLa细胞中的细胞器定位实验。
将荧光探针SG-RB的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例孵育HeLa细胞，同时加入终浓度0.3μM Mito-deep red(商业化的线粒体探针)和终浓度1μM Lysotracker Blue(商业化的溶酶体探针)进行共孵育，在5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min，然后用新鲜的细胞培养液洗三遍，最后用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。实验结果见图4，说明荧光探针SG-RB定位在线粒体DNA中，其中，重合表示将以上三种探针的信号重合在一张图上，而SG-RB具有红绿两种荧光信号，红光信号来自SG-RB中的罗丹明B部分，绿光信号来自SG-RB的SYBR Green-I部分。
实施例6：荧光探针SG-RB反映细胞的线粒体电势。
将荧光探针SG-RB的标准溶液与细胞培养液按1:1000的比例加入到HeLa细胞中，在5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养30min后，用新鲜的细胞培养液洗三遍，加入50μMCCCP(一种破坏线粒体电势的药物)，孵育15min后，将含CCCP的细胞培养基换成新鲜的细胞培养基，然后在分别0、1、2、4、6、8、10、12、14、16min进行共聚焦荧光信号采集。实验结果如图5，细胞线粒体电势丧失后，荧光探针SG-RB进入细胞核DNA，线粒体电势恢复后，荧光探针SG-RB又逐渐从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
实施例7：荧光探针SG-RB通过MTT比色法测细胞毒性实验。
将荧光探针SG-RB分别以0、1、2、4、8μM的浓度与细胞培养混合用于孵育HeLa细胞(其中0μM组加入等体积的二甲亚砜)。在5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养60min后，用新鲜的细胞培养液洗三遍，分别在0h、24h、48h后，通过MTT法(一种用于测量细胞数量的实验分析方法)测量细胞相对数。实验结果如图6表明，即使在孵育时间延长，孵育浓度增加的情况下，荧光探针SG-RB对HeLa细胞并不具有明显的毒性。
Claims (4)
1.一种SYBR Green衍生物，其特征在于：所述SYBR Green衍生物是通过对SYBR Green-I烷基化修饰得到的季铵盐产物，其化学结构式如下：
其中，R为烷基化后修饰的基团；
所述SYBR Green衍生物的修饰剂包括卤代炔烃或开环的罗丹明B荧光分子RB-CAP。
2.权利要求1所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，其特征在于：所述SYBR Green衍生物在线粒体中选择性富集并对线粒体DNA进行荧光成像；所述SYBR Green衍生物在不超过2μM的浓度范围内，大量富集在线粒体中，并与线粒体DNA结合，发出绿色荧光。
3.如权利要求2所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，其特征在于：所述SYBR Green衍生物能够反映活细胞线粒体电势，当线粒体电势丧失时，SYBRGreen衍生物探针从线粒体DNA中转移到细胞核DNA中，当电势恢复时，又从细胞核DNA转移到线粒体DNA中。
4.如权利要求2所述的一种SYBR Green衍生物在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用，其特征在于：所述细胞线粒体DNA的荧光成像方法包括荧光显微镜法、激光共聚焦荧光显微镜法、和超高分辨率荧光显微成像法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910987600.4A CN110672572B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910987600.4A CN110672572B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110672572A CN110672572A (zh) | 2020-01-10 |
| CN110672572B true CN110672572B (zh) | 2020-07-31 |
Family
ID=69082900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910987600.4A Expired - Fee Related CN110672572B (zh) | 2019-10-17 | 2019-10-17 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110672572B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
| CN104774147A (zh) * | 2014-01-10 | 2015-07-15 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种荧光分子开关及其荧光探针和荧光探针的应用 |
| CN108299438A (zh) * | 2017-01-13 | 2018-07-20 | 国家纳米科学中心 | pH响应性近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 |
| JP2019152604A (ja) * | 2018-03-06 | 2019-09-12 | 株式会社ＣｅＳＰＩＡ | Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ法に基づいたハイスループット抗体検出方法 |
-
2019
- 2019-10-17 CN CN201910987600.4A patent/CN110672572B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
| CN104774147A (zh) * | 2014-01-10 | 2015-07-15 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种荧光分子开关及其荧光探针和荧光探针的应用 |
| CN108299438A (zh) * | 2017-01-13 | 2018-07-20 | 国家纳米科学中心 | pH响应性近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 |
| JP2019152604A (ja) * | 2018-03-06 | 2019-09-12 | 株式会社ＣｅＳＰＩＡ | Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ法に基づいたハイスループット抗体検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110672572A (zh) | 2020-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | A BODIPY-based fluorescent dye for mitochondria in living cells, with low cytotoxicity and high photostability | |
| Harvey | An unidentified virus which causes the rapid production of tumours in mice | |
| CN112225711B (zh) | 一种能双色同时成像细胞核和线粒体的pH敏感型荧光探针 | |
| Resa et al. | New dual fluorescent probe for simultaneous biothiol and phosphate bioimaging | |
| CN111334291B (zh) | 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用 | |
| Burdock et al. | Effect of assay conditions on the measurement of dehydrogenase activity of Streptomyces venezuelae using triphenyl tetrazolium chloride | |
| CN110672572B (zh) | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 | |
| CN111004246A (zh) | 监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用 | |
| CN111778014A (zh) | β-半乳糖苷酶近红外荧光探针及其制备方法和用途 | |
| Zhang et al. | Based on theoretical calculations designed a novel dual-channel chemo-sensor for Mg2+ and Zn2+ detection and bioimaging applications | |
| CN111100119B (zh) | 一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其合成方法和应用 | |
| CN111349101B (zh) | 一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用 | |
| CN102742581A (zh) | 纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法 | |
| CN110606862B (zh) | 特异性检测rna g-四链体的铂络合物荧光探针、制备方法和应用 | |
| CN110194900B (zh) | 一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法 | |
| CN115650897A (zh) | 一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| US20030157518A1 (en) | Fluorescent compounds | |
| CN114716430A (zh) | 一种磺胺甲恶唑荧光探针、制备方法及其应用 | |
| CN114276356A (zh) | 一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用 | |
| CN112557354B (zh) | 一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途 | |
| CN110687087A (zh) | 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 | |
| CN109650387A (zh) | 一种具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的制备方法及其用途 | |
| Xiong et al. | A pH-responsive supramolecular antibacterial agent based on host–guest chemistry | |
| CN111117284B (zh) | RedNucleusⅡ染料及其制备方法与基于该染料的细胞凋亡检测试剂盒 | |
| CN113004266B (zh) | 一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200731 Termination date: 20211017 |