JP2019152604A - Cell−based assay法に基づいたハイスループット抗体検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[態様A1]被検者に由来する試料中における第1から第12の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様A2]第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はバイシストロニック(IRES)発現ベクター(IRES:Internal Ribosome Entry Site)を用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様A1記載の方法。
[態様A3]第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様A1またはA2記載の方法。
[態様A4]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様A1〜A3のいずれか記載の方法。
[態様A5]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様A1〜A4のいずれか記載の方法。
[態様A6]第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様A1〜A5のいずれか記載の方法。
[態様A7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様A1〜A6のいずれか記載の方法。
[態様A8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様A1〜A7のいずれか記載の方法。
[態様A9]第1から第12の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様A1〜A8のいずれか記載の方法。
[態様A10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様A2〜A9のいずれか記載の方法。
[態様A11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様A4〜A10のいずれか記載の方法。
[態様A12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様A7〜A11のいずれか記載の方法。
[態様A13]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様A1〜A12のいずれか記載の方法。
[態様A14]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様A15]第1から第12の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様A14記載の方法。
[態様A16]第1から第12の抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様A14記載の方法。
[態様A17]第1から第12の抗原タンパク質が、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様A14〜A16のいずれか記載の方法。
[態様A18]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様A14〜A17のいずれか記載の方法。
[態様B1]被検者に由来する試料中における第1の抗体、第2の抗体、第3の抗体、および第4の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様B2]第1から第4の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第1から第4の抗原タンパク質のぞれそれがIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様B1記載の方法。
[態様B3]第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第3および第4の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第3および第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様B1またはB2記載の方法。
[態様B4]第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様B1〜B3のいずれか記載の方法。
[態様B5]第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様B1〜B4のいずれか記載の方法。
[態様B6]第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能であり、第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様B1またはB2記載の方法。
[態様B7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様B1〜B6のいずれか記載の方法。
[態様B8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様B1〜B7のいずれか記載の方法。
[態様B9]第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様B1〜B8のいずれか記載の方法。
[態様B10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様B2〜B9のいずれか記載の方法。
[態様B11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様B4〜B10のいずれか記載の方法。
[態様B12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様B7〜B11のいずれか記載の方法。
[態様B13]前記第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜3種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様B1〜B12のいずれか記載の方法。
[態様C1]被検者に由来する試料中における第1の抗体および第2の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1および第2の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様C2]第1および第2の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第1および第2の抗原タンパク質のぞれそれがIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様C1記載の方法。
[態様C3]第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とが同一の蛍光タンパク質である、態様C1またはC2記載の方法。
[態様C4]第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様C1またはC2記載の方法。
[態様C5]第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様C1〜C4のいずれか記載の方法。
[態様C6]第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様C1〜C5のいずれか記載の方法。
[態様C7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様C1〜C6のいずれか記載の方法。
[態様C8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様C1〜C7のいずれか記載の方法。
[態様C9]第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様C1〜C8のいずれか記載の方法。
[態様C10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様C2〜C9のいずれか記載の方法。
[態様C11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様C5〜C10のいずれか記載の方法。
[態様C12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様C7〜C11のいずれか記載の方法。
[態様D1]被検者に由来する試料中における抗AQP4抗体および抗MOG抗体を同時に検出または測定する方法であって、
AQP4タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
MOGタンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該AQP4タンパク質を発現する細胞と該MOGタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様D2]AQP4タンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様D1記載の方法。
[態様D3]MOGタンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様D1またはD2記載の方法。
[態様D4]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質とMOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが同一である、態様D3記載の方法。
[態様D5]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質で標識されている、態様D4記載の方法。
[態様D6]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様D4またはD5記載の方法。
[態様D7]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質とMOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが異なるものである、態様D3記載の方法。
[態様D8]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様D1〜D7のいずれか記載の方法。
[態様D9]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、および脳脊髄液から成る群より選択される、態様D1〜D8のいずれか記載の方法。
[態様D10]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質がEGFPである、態様D2〜D9のいずれか記載の方法。
[態様D11]MOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質がEGFPである、態様D3〜D9のいずれか記載の方法。
[態様D12]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方がHoechst 33342で標識されている、態様D5〜D11のいずれか記載の方法。
[態様D13]前記二次抗体がAlexa Fluor 647で標識されている、態様D8〜D12のいずれか記載の方法。
[態様E1]被検者に由来する試料中における4n種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
nは1以上の整数であり、
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
[態様E2]第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様E1記載の方法。
[態様E3]第1から第2nの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様E1またはE2記載の方法。
[態様E4]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様E1〜E3のいずれか記載の方法。
[態様E5]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様E1〜E4のいずれか記載の方法。
[態様E6]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様E1〜E5のいずれか記載の方法。
[態様E7]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様E1〜E6のいずれか記載の方法。
[態様E8]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様E1〜E7のいずれか記載の方法。
[態様E9]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞であって、nは1以上の整数であり、第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第2nの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様E10]第1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様E9記載の方法。
[態様E11]第1から第4nの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様E9記載の方法。
[態様E12]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様E9〜E11のいずれか記載の方法。
[態様E13]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様E9〜E12のいずれか記載の方法。
[態様F1]1以上の被検者に由来する12種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第12の試料を、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様F2]第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様F1記載の方法。
[態様F3]第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様F1またはF2記載の方法。
[態様F4]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様F1〜F3のいずれか記載の方法。
[態様F5]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様F1〜F4のいずれか記載の方法。
[態様F6]第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様F1〜F5のいずれか記載の方法。
[態様F7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様F1〜F6のいずれか記載の方法。
[態様F8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様F1〜F7のいずれか記載の方法。
[態様F9]第1から第12の抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様F1〜F8のいずれか記載の方法。
[態様F10]第1から第12の抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様F1〜F8のいずれか記載の方法。
[態様F11]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様F2〜F10のいずれか記載の方法。
[態様F12]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様F4〜F11のいずれか記載の方法。
[態様F13]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様F7〜F12のいずれか記載の方法。
[態様F14]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用し、2〜11種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様F1〜F13のいずれか記載の方法。
[態様F15]第1から第12の抗原タンパク質が、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様F1〜F14のいずれか記載の方法。
[態様F16]第1から第12の試料が全て異なる試料である、態様F1〜F15のいずれか記載の方法。
[態様F17]第1から第12の試料が同一の試料を含む、態様F1〜F15のいずれか記載の方法。
[態様G1]1以上の被検者に由来する4n個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
nは1以上の整数であり、
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第4nの試料を、第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
[態様G2]第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様G1記載の方法。
[態様G3]第1から第2nの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様G1またはG2記載の方法。
[態様G4]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様G1〜G3のいずれか記載の方法。
[態様G5]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様G1〜G4のいずれか記載の方法。
[態様G6]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様G1〜G5のいずれか記載の方法。
[態様G7]第1から第4nの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様G1〜G6のいずれか記載の方法。
[態様G8]第1から第4nの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様G1〜G6のいずれか記載の方法。
[態様G9]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用し、2〜4n−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様G1〜G8のいずれか記載の方法。
[態様G10]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様G1〜G9のいずれか記載の方法。
[態様G11]第1から第4nの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様G1〜G10のいずれか記載の方法。
[態様G12]第1から第4nの試料が全て異なる試料である、態様G1〜G11のいずれか記載の方法。
[態様G13]第1から第4nの試料が同一の試料を含む、態様G1〜G11のいずれか記載の方法。
[態様H1]被検者に由来する試料中における2mn種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様H2]第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様H1記載の方法。
[態様H3]第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様H1またはH2記載の方法。
[態様H4]第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様H1〜H3のいずれか記載の方法。
[態様H5]第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様H4記載の方法。
[態様H6]第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様H4またはH5記載の方法。
[態様H7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様H1〜H6のいずれか記載の方法。
[態様H8]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様H1〜H7のいずれか記載の方法。
[態様H9]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H4〜H8のいずれか記載の方法。
[態様H10]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H6〜H9のいずれか記載の方法。
[態様H11]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様H1〜H10のいずれか記載の方法。
[態様H12]第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様H1〜H11のいずれか記載の方法。
[態様H13]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様H2〜H12のいずれか記載の方法。
[態様H14]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様H4〜H13のいずれか記載の方法。
[態様H15]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様H7〜H14のいずれか記載の方法。
[態様H16]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様H17]第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様H16記載の方法。
[態様H18]第1から第2mnの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様H16記載の方法。
[態様H19]第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様H16〜H18のいずれか記載の方法。
[態様H20]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様H16〜H19のいずれか記載の方法。
[態様H21]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H16〜H20のいずれか記載の方法。
[態様H22]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H16〜H21のいずれか記載の方法。
[態様I1]1以上の被検者に由来する2mn個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第2mnの試料を、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様I2]第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様I1記載の方法。
[態様I3]第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様I1またはI2記載の方法。
[態様I4]第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様I1〜I3のいずれか記載の方法。
[態様I5]第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様I4記載の方法。
[態様I6]第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様I4またはI5記載の方法。
[態様I7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様I1〜I6のいずれか記載の方法。
[態様I8]第1から第2mnの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様I1〜I7のいずれか記載の方法。
[態様I9]第1から第2mnの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様I1〜I7のいずれか記載の方法。
[態様I10]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用し、2〜2mn−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様I1〜I9のいずれか記載の方法。
[態様I11]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様I4〜I10のいずれか記載の方法。
[態様I12]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様I6〜I11のいずれか記載の方法。
[態様I13]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様I1〜I12のいずれか記載の方法。
[態様I14]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様I2〜I13のいずれか記載の方法。
[態様I15]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様I4〜I14のいずれか記載の方法。
[態様I16]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様I7〜I15のいずれか記載の方法。
[態様I17]第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様I1〜I16のいずれか記載の方法。
[態様I18]第1から第2mnの試料が全て異なる試料である、態様I1〜I17のいずれか記載の方法。
[態様I19]第1から第2mnの試料が同一の試料を含む、態様I1〜I17のいずれか記載の方法。
多発性硬化症(multiple sclerosis:MS)は、上述のとおり、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄・視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症性脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発するのが特徴である。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学的診察により時間的・空間的な病変の多発性を証明し、他の疾患を十分に除外することで診断を確定させる必要がある。このため、厚生労働省によるMSの指定難病診断基準と、その基盤となるMcDonald診断基準(2010年版)では、鑑別診断を行うことの重要性が説かれている。MSとの鑑別診断が必要な疾患は、視神経脊髄炎(neuromyelitis optica:NMO)、急性散在性脳脊髄炎、頸椎症性脊髄症、脊髄空洞症、脊髄小脳変性症、神経ベーチェット病、神経サルコイドーシス、ミトコンドリア脳筋症、進行性多巣性白質脳症などが挙げられる。視神経脊髄炎を鑑別するためには、視神経脊髄炎に特異的なIgG(抗AQP4抗体[NMO−IgGとしても知られる])を測定する血液検査が必須である。
視神経脊髄炎(neuromyelitis optica:NMO)は、重度の視神経炎と横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。最近までNMOは多発性硬化症(MS)との関連が議論されてきたが、2004年にNMOに特異なIgG(NMO−IgG)が発見され、さらにアストロサイトの足突起に高密度に発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−4(AQP4)がその標的抗原であることが報告された。
(1)視神経炎
(2)急性脊髄炎、および
(3)以下の3項目のうち2項目以上を満たすこと
− 3椎体以上の連続性の脊髄病変
− Patyの脳MRI基準を満たさない
− NMO−IgG(抗AQP4抗体)陽性
上述のとおり、抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、MSならびに抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDと異なる疾患群であることが報告されている。MOG(ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質)はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗MOG抗体はこのMOGを認識する自己抗体である。
MSの鑑別診断を行う上では、上記の抗AQP4抗体と抗MOG抗体に加えて、抗核抗体、リウマチ因子、甲状腺関連自己抗体(抗TSH受容体抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ぺルオキシダーゼ抗体)、抗SS−A抗体、抗SS−B抗体、抗アセチルコリン受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、自己免疫性脳炎の診断を行う上で、抗NMDA抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体、抗AMPA受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗GABAB受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、重症筋無力症の診断を行う上で、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗LDL受容体関連タンパク質4抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体、抗kv1.4抗体などを検出することも有用となりうる。
生物学的試料中における抗体の検出には、様々な免疫学的検査法が用いられうる。代表的な例としては、免疫組織化学、抗原タンパク質を発現させたヒト胎児腎(HEK)293細胞あるいはその他の細胞を基質とした免疫細胞化学あるいはフローサイトメトリー、単離した抗原タンパク質あるいは細胞・組織抽出液を基質とした放射性免疫沈降法あるいは蛍光免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法(ELISA)などが挙げられる。
CBA法による試料に含まれる抗体の検出方法とは、任意の細胞に目的の抗原タンパク質の遺伝子を導入後、試料と反応させ、目的の抗体を認識する標識二次抗体を用いて標識シグナルを検出する方法を指す。
フローサイトメトリー解析は、CBA法によって被検者由来試料および二次抗体と反応させた細胞に対して、例えば、ベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて行うことができる。本発明の方法によれば、例えば3種類の波長のレーザー(例えば、488nm青レーザー、640nm赤レーザー、355nmUVレーザー)を用いて2種類以上の抗体を分析することができ、また、4種類の波長のレーザー(例えば、青、赤、黄、およびUV)を用いて4種類以上(例えば、12種類、18種類、24種類)の抗体を分析することができる。例えば、EGFPとPE-Cy7は青レーザーにより、Alexa Fluor 647は赤レーザーにより、mCherryは黄レーザーにより、Hoechest 33342はUVレーザーにより、それぞれ励起される。使用するレーザーは、例えば、UVレーザーの代わりに紫レーザーを、黄レーザーの代わりに黄緑レーザーを選択してもよい。また、使用するレーザーの組み合わせは任意でよい。測定したフローサイトメトリーデータの解析には、例えば、FlowJoを使用することができる。フローサイトメトリーデータの解析により、被検者由来試料中の抗体を検出および/または測定することができる。
本発明の方法によれば、被検者に由来する試料中における複数の抗体、例えば、2種類、4種類、6種類、8種類、12種類、16種類、18種類、24種類、またはそれ以上の種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。また、本発明の方法によれば、1以上の被検者に由来する複数の試料中、例えば、2種類、4種類、6種類、8種類、12種類、16種類、18種類、24種類、またはそれ以上の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、複数種の抗体の検出および/または測定、あるいは複数の試料中における抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。
本発明の一つの態様としては、被検者に由来する試料中における12種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、12種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。
第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、
該2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば2〜11種の抗体の検査を同時に行うことができる。
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1の抗体、第2の抗体、第3の抗体、および第4の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、4種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1の抗体および第2の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。フローサイトメーターを用いることで、2種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1および第2の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1から第4nの抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、4n種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている細胞のうち、2以上を調製する工程、
該2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば、2〜4n−1種の抗体の検査を同時に行うことができる。
上述した4n種類の抗体の同時検出において、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質による標識をm段階に分けることにより、2mn種類の抗体の同時検出を行うことができる。よって、本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における2mn種類の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでmおよびnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、2mn種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。2mnは例えば、2、4、6、8、12、16、18、24、32などの値を取り得る。被検者に由来する試料としては、例えば、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、尿などを使用することができる。検出対象の抗体が結合する抗原タンパク質としては、例えば、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、kv1.4などを使用することができる。
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
ここで、第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、方法に関する。
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、
を含む、方法に関する。なお、mおよびnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。また、本方法は、2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、および細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含むものでありうる。
本発明の一つの態様としては、1以上の被検者に由来する12種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、12種類の試料中における目的の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を個別の容器中において調製する工程、1以上の被検者に由来する第1から第12の試料を、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。ここで、試料を細胞に加えてインキュベートする際には、あらかじめ複数の細胞(例えば第1の抗原タンパク質を発現する細胞と第2の抗原タンパク質を発現する細胞)を混合しておき、それに複数の試料(例えば第1の試料と第2の試料。ここで、第1の試料と第2の試料は同じものであってもよい)を加えてインキュベートしてもよい。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。
本発明の別の態様としては、1以上の被検者に由来する4n個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、4n個の試料中における抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。
上述した4n種類の試料の同時分析において、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質による標識をm段階に分けることにより、2mn種類の試料の同時分析を行うことができる。よって、本発明の別の態様としては、1以上の被検者に由来する2mn個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでmおよびnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、2mn個の試料中に含まれる抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。2mnは例えば、2、4、6、8、12、16、18、24、32などの値を取り得る。被検者に由来する試料としては、例えば、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、尿などを使用することができる。検出対象の抗体が結合する抗原タンパク質としては、例えば、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、kv1.4などを使用することができる。
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第2mnの試料を、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
ここで、第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、方法に関する。
本発明の方法によれば、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定することにより、疾患の診断に有用な指標を得ることができる。
CHO−K1細胞の培養は、10%ウシ胎児血清、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むHam’s F−12K培地を用いて、37℃、5%CO2濃度の環境下で行った。hAQP4M23 cDNA(配列番号:1)ならびにhMOG isoform alpha1 precursor cDNA(配列番号:2)を、発現ベクターpEGFP−N3のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製した。細胞を播種した翌日、Lipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行い、48時間後にフローサイトメトリー測定を行った(図1参照)。
ヒトMOGを発現させたCHO−K1細胞に最終濃度5μg/mLとなるようにHoechst 33342を加え、37℃で20分間のインキュベートを行った。ヒトAQP4M23を発現させたCHO−K1細胞ならびにHoechst 33342染色を行ったヒトMOGを発現させたCHO−K1細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が1.0×106cells/mLとなるように調整した。その後、2種類の細胞懸濁液を等量混ぜ、4℃で2時間のインキュベートを行った。細胞懸濁液として、3%ウシ胎児血清、2mM EDTAを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いた。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図3−1から3−8に示す。図3−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図3−2は、図3−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図3−3は、図3−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図3−4は、図3−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図3−3と図3−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図3−5は、図3−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図3−6は、図3−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図3−7は、図3−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図3−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの30.4%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗AQP4抗体陽性であると判断した。図3−8は、図3−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図3−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.35%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図4−1から図4−8に示す。図4−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図4−2は、図4−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図4−3は、図4−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図4−4は、図4−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図4−3と図4−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図4−5は、図4−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図4−6は、図4−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図4−7は、図4−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図4−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの28.3%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗AQP4抗体陽性であると判断した。図4−8は、図4−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図4−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの14.0%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図5−1から図5−8に示す。図5−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図5−2は、図5−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図5−3は、図5−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図5−4は、図5−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図5−3と図5−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図5−5は、図5−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図5−6は、図5−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図5−7は、図5−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図5−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.12%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図5−8は、図5−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図5−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの3.50%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体弱陽性であると判断した。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図6−1から図6−8に示す。図6−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図6−2は、図6−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図6−3は、図6−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図6−4は、図6−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図6−3と図6−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図6−5は、図6−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図6−6は、図6−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図6−7は、図6−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図6−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.26%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図6−8は、図6−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図6−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの20.1%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図7−1から図7−8に示す。図7−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図7−2は、図7−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図7−3は、図7−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図7−4は、図7−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図7−3と図7−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図7−5は、図7−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図7−6は、図7−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図7−7は、図7−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図7−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.44%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図7−8は、図7−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図7−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.24%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図8−1から図8−8に示す。図8−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図8−2は、図8−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図8−3は、図8−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図8−4は、図8−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図8−3と図8−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図8−5は、図8−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図8−6は、図8−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図8−7は、図8−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図8−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.26%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図8−8は、図8−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図8−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの21.4%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図9−1から図9−8に示す。図9−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図9−2は、図9−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図9−3は、図9−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図9−4は、図9−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図9−3と図9−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図9−5は、図9−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図9−6は、図9−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図9−7は、図9−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図9−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.40%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図9−8は、図9−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図9−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの6.40%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図を図10−1から図10−8に示す。
図10−1は、横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。図10−2は、図10−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。図10−3は、図10−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。図10−4は、図10−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図10−3と図10−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図10−5は、図10−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。図10−6は、図10−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。図10−7は、図10−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図10−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.076%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。図10−8は、図10−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図10−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.061%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
複数個の試料(例えば、6種類、12種類、24種類)を同時にアッセイするのに使用可能な細胞の調製を行った。例えば、6種類の試料を同時に分析するためには、以下の6種類の細胞を調製することができる:
1.第1の抗原タンパク質と第1の蛍光タンパク質(例えばEGFP)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)陰性である第1の細胞;
2.第1の抗原タンパク質と第1の蛍光タンパク質(例えばEGFP)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)弱陽性である第2の細胞;
3.第1の抗原タンパク質と第1の蛍光タンパク質(例えばEGFP)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)強陽性である第3の細胞;
4.第1の抗原タンパク質と第2の蛍光タンパク質(例えばmCherry)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)陰性である第4の細胞;
5.第1の抗原タンパク質と第2の蛍光タンパク質(例えばmCherry)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)弱陽性である第5の細胞;
6.第1の抗原タンパク質と第2の蛍光タンパク質(例えばmCherry)の融合タンパク質を発現し、第1の蛍光色素(例えばHoechst 33342)強陽性である第6の細胞。
培養ディッシュA:Hoechst 33342による染色を行わない;
培養ディッシュB:Hoechst 33342によって弱く染色を行う;
培養ディッシュC:Hoechst 33342によって強く染色を行う。
1.細胞培養と一過性発現の方法
CHO−K1細胞を10%ウシ胎児血清、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むHam’s F−12K培地を用いて、37℃、5%CO2濃度の環境下で、12枚の培養ディッシュを用いて培養する。第1の抗原タンパク質をコードする遺伝子1、第2の抗原タンパク質をコードする遺伝子2、第3の抗原タンパク質をコードする遺伝子3、第4の抗原タンパク質をコードする遺伝子4、第5の抗原タンパク質をコードする遺伝子5、第6の抗原タンパク質をコードする遺伝子6をそれぞれ発現ベクターpEGFP−N3のマルチクローニングサイトに挿入した6種類のプラスミドを作製する。第7の抗原タンパク質をコードする遺伝子7、第8の抗原タンパク質をコードする遺伝子8、第9の抗原タンパク質をコードする遺伝子9、第10の抗原タンパク質をコードする遺伝子10、第11の抗原タンパク質をコードする遺伝子11、第12の抗原タンパク質をコードする遺伝子12をそれぞれ発現ベクターpMSCV-IRES-mCherry FPのマルチクローニングサイトに挿入した6種類のプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、12枚の培養ディッシュに対して12種類のプラスミドを1種類ずつ、Lipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行い、48時間後にフローサイトメトリー測定を行う。
第2の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第5の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第8の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第11の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞にそれぞれ最終濃度0.1μg/mLとなるようにHoechst 33342を加える。第3の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第6の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第9の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第12の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞に最終濃度5μg/mLとなるようにHoechst 33342を加える。37℃で20分間のインキュベートを行う。第1の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第2の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第3の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第4の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第5の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第6の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第7の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第8の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第9の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第10の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第11の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞、第12の抗原タンパク質を発現させたCHO−K1細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が1.0×106cells/mLとなるように調整後、4℃で1時間30分のインキュベートを行う。
1.細胞培養と一過性発現の方法
CHO−K1細胞を10%ウシ胎児血清、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むHam’s F−12K培地を用いて、37℃、5%CO2濃度の環境下で、12枚の培養ディッシュ(培養ディッシュ1、培養ディッシュ2、培養ディッシュ3、培養ディッシュ4、培養ディッシュ5、培養ディッシュ6、培養ディッシュ7、培養ディッシュ8、培養ディッシュ9、培養ディッシュ10、培養ディッシュ11、培養ディッシュ12とする)を用いて培養する。hAQP4M23 cDNA(配列番号:1)を、発現ベクターpEGFP−N3のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、培養ディッシュ1、培養ディッシュ2、培養ディッシュ3、培養ディッシュ4、培養ディッシュ5、培養ディッシュ6に対してLipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行う。また、hAQP4M23 cDNA(配列番号:1)を、発現ベクターpMSCV-IRES-mCherry FPのマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、培養ディッシュ7、培養ディッシュ8、培養ディッシュ9、培養ディッシュ10、培養ディッシュ11、培養ディッシュ12に対してLipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行う。トランスフェクションから48時間後にフローサイトメトリー測定を行う。
培養ディッシュ2、培養ディッシュ5、培養ディッシュ8、培養ディッシュ11に最終濃度0.1μg/mLとなるようにHoechst 33342を加え、培養ディッシュ3、培養ディッシュ6、培養ディッシュ9、培養ディッシュ12に最終濃度5μg/mLとなるようにHoechst 33342を加え、37℃で20分間のインキュベートを行う。培養ディッシュ1のCHO−K1細胞、培養ディッシュ2のCHO−K1細胞、培養ディッシュ3のCHO−K1細胞、培養ディッシュ4のCHO−K1細胞、培養ディッシュ5のCHO−K1細胞、培養ディッシュ6のCHO−K1細胞、培養ディッシュ7のCHO−K1細胞、培養ディッシュ8のCHO−K1細胞、培養ディッシュ9のCHO−K1細胞、培養ディッシュ10のCHO−K1細胞、培養ディッシュ11のCHO−K1細胞、培養ディッシュ12のCHO−K1細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が1.0×106cells/mLとなるように調整後、4℃で1時間30分のインキュベートを行う。
Claims (37)
- 被検者に由来する試料中における2mn種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。 - 第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、請求項1記載の方法。
- 第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項1または2記載の方法。
- 第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。 - 第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項4記載の方法。
- 第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項4または5記載の方法。
- 前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、
該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、
該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、
該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。 - 第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、請求項12記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、請求項12記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
- 前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
- 前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。
- 1以上の被検者に由来する2mn個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第2mnの試料を、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。 - 第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、請求項19記載の方法。
- 第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項19または20記載の方法。
- 第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。 - 第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項22記載の方法。
- 第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項22または23記載の方法。
- 前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項19〜24のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質が同じタンパク質である、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。
- 前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用し、2〜2mn−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、請求項19〜27のいずれか一項記載の方法。
- 前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項22〜28のいずれか一項記載の方法。
- 前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項24〜29のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項19〜30のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの試料が全て異なる試料である、請求項19〜31のいずれか一項記載の方法。
- 第1から第2mnの試料が同一の試料を含む、請求項19〜31のいずれか一項記載の方法。
- 被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、請求項2〜18、20〜34のいずれか一項記載の方法。
- 前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、請求項4〜18、22〜35のいずれか一項記載の方法。
- 前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、請求項7〜18、25〜36のいずれか一項記載の方法。
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