CN103154736A - 用于检测和诊断神经变性疾病的诊断性自身抗体谱 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测神经变性疾病特异性自身抗体，用于诊断神经变性疾病和处于发生神经变性疾病风险，以及用于生成患者特异性神经变性疾病的诊断性自身抗体谱的方法、组合物以及试剂盒。

Description

用于检测和诊断神经变性疾病的诊断性自身抗体谱
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月13日提交的美国临时申请第61/334,466号和2011年2月21日提交的美国临时申请第61/444,932号的优先权，其公开的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
自身抗体是由个体免疫系统产生的针对个体自身蛋白抗原的抗体。正常情况下，响应体内的外源性蛋白或物质而产生抗体，所述外源性蛋白或物质通常为作为感染性生物的病原体。正常情况下，免疫系统能够识别和忽略机体的自身细胞，并且不对环境中的非威胁性物质(例如食物)进行过度反应。然而，有时，免疫系统停止将一种或多种机体的正常组分识别为“本体”，导致产生自身抗体。这些自身抗体攻击机体的自身细胞、组织和/或器官，导致炎症和损伤。
血清自身抗体参与多种神经性疾病和综合症。已经从源自表现出强迫症、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染相关性儿童自身免疫神经精神障碍(“PANDAS”)以及桥本氏脑病的个体的血清中检测到了结合神经元的自身抗体。精神分裂症也与自身抗体的出现有关，包括数种针对神经表面受体的自身抗体。已知由抗核抗体导致的系统性红斑狼疮(“SLE”)具有与一组抗DNA抗体的出现相吻合的认知和记忆丧失组分，所述抗DNA抗体与N-甲基-D-天冬氨酸受体(“NMDAR”)交叉反应。另外，在将自闭症儿童母亲的脑反应性抗体施用于怀孕哺乳动物时引发了行为异常。
另外，在神经变性疾病中，发现自身抗体已见于帕金森氏病、自闭症谱系障碍、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆以及阿尔茨海默病(“AD”)。在阿尔茨海默病的情况下，有许多文献报道了患者具有高滴度的针对非脑和脑相关靶的自身抗体，包括结合神经元的自身抗体。另外，已经鉴定了数种特异性自身抗体靶，包括醛缩酶、神经丝重亚基、组蛋白、微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白以及S-100。
阿尔茨海默病(AD)是一种老年人的进行性和破坏性神经变性疾病，其体现为显著的记忆和认知减退，与神经元和突触的损失有关(Selkoe(2002)Science298,789-91)。其他的关键病理特征包括神经元中沉积的淀粉样蛋白(Aβ)，尤其是42氨基酸肽(Aβ42)，和脑血管壁中的淀粉样蛋白斑块，以及出现神经原纤维缠结、神经胶质激活以及广泛的炎症(Schwab et al.(2008)JAlzheimers Dis13,359-69；Thal et al.(2008)Acta Neuropathol 115,599-609；Weisman et al.(2006)Vitam Horm74,505-30)。神经元中的Aβ42沉积始于疾病过程早期，之后是淀粉样蛋白斑块和缠结形成，在时间和空间上与人阿尔茨海默病和转基因小鼠脑中的突触损失相符合(D’Andrea et al.(2001)Histopathology38,120-134；Nagele et al.(2002)J Neurosci110,199-211；Gouras et al.(2000)Am J Patho.156,15-20)。这导致提出Aβ沉积物的逐渐生长可进行性破坏神经元支持其广泛的树突棘的能力，由此促成早期突触损失，最终表现出先兆性症状(telltale symptoms)。
有研究报道，在死者的阿尔茨海默病脑组织切片中存在免疫球蛋白(Ig)免疫阳性神经元，这极少见于在年龄匹配的非痴呆对照的相当脑区中(Stein etal.(2002)J Neuropathol Exp Neurol61,1100-8；Bouras et al.(2005)Brain ResBrain Res Rev48,477-87；D’Andrea(2003)Brain Res Brain Res Rev982,19-30)。还有报道在阿尔茨海默病患者血清中存在特异性脑反应性自身抗体(Bouras et al.(2005)Brain Res Brain Res Rev48,477-87；Kulmala et al.(1987)Exp Aging Res13,67-72；Mecocci et al.(1993)Biol Psychiatry34,380-5；Mecocci et al.(1995)J Neuroimmunol57,165-70；Weksler et al.(2002)ExpGerontol37,971-979)。
自闭症谱系障碍(“ASD”)是一组脑发育障碍的疾病，包括自闭症、阿斯伯格综合征、雷特病以及儿童期崩解症(childhood disintegrative disorder)。自闭症谱系障碍的特征为社会行为和沟通损害，通常表现于儿童期的最初36个月内(American Psychiatric Association:Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders,Fourth Edition(2000))。显著比例(20-30%)的自闭症患者经历自闭性退化期，在此过程中，其经历了先前在语言和行为技能上所获取的能力的丧失(Fombonne(2003)JAMA289,87-89)。令人费解的是，自闭症谱系障碍的流行显著增加，此发现并非是由于诊断改进，而是表明与某些环境因素有关。目前，自闭症系障碍影响1:150的儿童，其病因很大程度上未知，但可能是多因素的(Fombonne,2003)。
自闭症患者的神经病理学和神经影像研究报道了脑尺寸和重量增加(Bailey et al.(1998)Psychol Med25,63-77；Kemper and Bauman(1998)Neurol Clinic1,175-87；Palmen et al.(2004)Brain127,2572-2583)。许多自闭症脑研究报道神经元尺寸总体减少和神经元存储密度增加，尤其是在海马、脑下脚以及杏仁核中(Kemper and Bauman,1993)。
自闭症谱系障碍与特定的脑异常相关。神经学观察和神经影像研究提供证据证明在自闭症中可累及许多脑区，包括小脑、大脑皮质、杏仁核、海马、基底神经节以及脑干(Akshoomoff et al.,2002；Acosta and Pearl(2004)SeminPediatr Neurol 11,205-213)。小脑异常也常见于ASD患者中，其标志为浦肯野细胞(Purkinje cell)和粒细胞的缺少(Courchesne et al.,2001)。
自身免疫和自身抗体参与自闭症谱系障碍的发病机制(Ashwood et al.(2006)J Leukocyte Biol80,1-11；Wills et al.(2007)AnnN.Y.Acad Sci 1107,79-91；Zimmerman et al.(2007)Brain Behav Immun21,351-357)。自身抗体与神经元结合可破坏关键时期神经发育的正常模式。据报道，在自闭症儿童中有脑反应性自身抗体，并且有数种自身免疫因素，包括脑特异性自身抗体，淋巴功能受损、细胞因子调节异常以及病毒联合(viral association)与其有关(Singh and Rivas(2004)Neurosci Lett355,53-56)。例如，Singh和Rivas(2004)揭示了自闭症儿童血清含有脑特异性自身抗体。在68名4-12岁的自闭症儿童的研究中，分别在49%、18%以及9%的自闭症儿童中检测到抗尾状核、大脑皮质以及小脑的抗体，但在正常儿童中检测不到。另一研究显示患有妥瑞氏综合征(tourette syndrome)的儿童具有抗纹状体抗体，将这些抗体输注到大鼠纹状体中导致了与妥瑞氏综合征相似的神经元功能障碍(Hallet et al.(2000)J Neuroimmunol 111,195-202)。在自闭症患者中还发现其他抗脑抗体，包括针对5-羟色胺受体、髓磷脂碱性蛋白、轴突丝蛋白、小脑神经丝、神经生长因子、脑内皮蛋白的抗体以及针对其他未鉴定脑蛋白的抗体。
在儿童链球菌感染后病例中显示了在抗神经元自身抗体和神经性疾病之间具有强关联性，例如，强迫症(OCD)、西德纳姆舞蹈病、妥瑞氏综合征、PANDAS、伴肿瘤效应(paraneoplasia)，并且在系统性红斑狼疮老年患者中显示了认知和记忆的丧失(Swedo et al.(1989)Am J Psychiatry154,110-2；Kalume et al.(2004)J Neurosci Res77,82-89；Tanaka et al.(2004)JNeurological Sci217,25-30)。DeGeorgio等人(DeGeorgio et al.(2001)NatureMed 11,1189-1193)和Kowal等人(Kowal et al.(2004)Immunity21,179-188)报道了通过分子模拟，系统性红斑狼疮患者的一组抗DNA抗体与NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)亚型谷氨酸受体交叉反应，并且在体外和体内诱导神经元损伤和死亡。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供了一种检测受试者神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括：从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于诊断受试者神经变性疾病的方法，所述方法包括：从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为所述神经变性疾病。
在一种实施方式中，本发明提供了一种鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括：从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在所述一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种生成受试者特异性神经变性疾病诊断性自身抗体谱的方法，所述方法包括：从受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，并生成存在于所述样品中的受试者特异性神经变性疾病诊断性自身抗体谱。
本发明的另一种实施方式提供了一种基材，所述基材上固定有对于一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体具有特异性的一种或多种自身抗原。
本发明的另一种实施方式提供了一种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有对于一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体具有特异性的一种或多种自身抗原。
本发明的另一种实施方式提供了一种用于检测神经变性疾病诊断性自身抗体的试剂盒。
附图说明
图1是实施例8中例示的诊断逻辑的图示。
具体实施方式
根据本发明，发现在人血清中存在丰富和普遍的自身抗体，也称为自身反应性抗体，与年龄或是否存在疾病无关。某些自身抗体为脑反应性，其他的自身抗体对于全身其他器官中的靶具有反应性。尽管某些自身抗体可为过往疾病和免疫活性的残余物，但根据本发明发现，由于现有或发展中的疾病，血液和脑脊液(CSF)中还存在许多自身抗体。该后一组可用于现有疾病的早期检测和诊断。
本发明发现因活动性神经变性疾病的存在，包括长期和短期疾病，导致由于与进行中的病变相关的细胞损伤而产生和释放出细胞产物，其中某些具有细胞类型和器官特异性。这些释放的细胞产物(其中许多为蛋白质)，其裂解片段以及疾病相关翻译后修饰物进入血液和淋巴循环，充当抗原，引发免疫应答。该免疫应答导致血液中产生和出现较大量的自身反应性自身抗体。遍布机体的细胞共有大量蛋白质，但仅一组较小量的自身抗体对涉及特定疾病的细胞、组织以及器官具有特异性反应性。根据本发明发现该应答导致所涉及的各疾病和特定细胞类型所特有的疾病特异性自身抗体谱。另外，本发明发现，在患有并发症的个体中，特定的自身抗体谱反映了这些并发症中的每一种的疾病过程。
另外，本发明发现，能够结合脑特异性靶(包括神经元及其支持性胶质细胞)的自身抗体常见于血液中，实际上它们显示为遍在的。这些自身抗体与脑中的神经元和/或胶质细胞的结合对于这些细胞及其所参与的功能是有害的。这不仅破坏正常细胞功能，而且还最终导致神经元和胶质细胞死亡和从脑中永久性丧失。
一旦自身抗体位于脑组织中，则其自由选择性结合脑中于其表面具有并呈现合适靶抗原的任何细胞。如果细胞表面上的自身抗体靶特别丰富，许多自身抗体分子的结合可交联和固定该蛋白。如果所述靶是重要的受体，可使得靶和细胞不具功能性，导致更广泛的脑功能损害。当靶细胞为神经元时，自身抗体结合可导致神经元功能障碍，所述神经元障碍可最终表现为行为、认知、记忆以及活动损害。当所述靶为支持神经元的胶质细胞时，该支持的丧失可间接破坏神经元功能。由此，人血清中的特异性脑反应性自身抗体可将人置于特定神经变性疾病的风险中。本发明提供了一种用于检测人生物样品中这些自身抗体的方法。
由此，在一种实施方式中，本发明提供了一种鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括：从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险中。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种检测受试者的神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括：从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，并进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。
在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染相关性儿童自身免疫神经精神障碍(“PANDAS”)、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎(Rasmussen encephalitis)、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合征、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。
在本发明的优选实施方式中，通过如下方法进行用于检测所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体的测定：在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下，使所述生物样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测所述免疫复合物的存在。
可通过将存在于来自患有神经变性疾病的受试者的含有免疫球蛋白的样品中的自身抗体与存在于来自年龄匹配的无病对照受试者的含有免疫球蛋白的样品中的自身抗体进行比较来鉴定神经变性疾病诊断性自身抗体特异性的自身抗体。存在于来自患有所述疾病的受试者的样品中而不存在于来自对照受试者的样品中的自身抗体的靶自身抗原提供了所述疾病诊断性自身抗体的鉴定。所述样品优选为血清。
例如，点在单样品载玻片上的含有数千个完整或近完整人蛋白的蛋白微阵列可用于鉴定患者样品中与微阵列中抗原靶具有反应性的自身抗体。对照样品中的自身抗体可通过相似的方式鉴定。可将患者自身抗体谱与对照自身抗体谱进行比较以检测所述疾病特异性自身抗体和相应的自身抗原。
可用于鉴定神经变性疾病诊断性自身抗体和自身抗原的蛋白微阵列可通过本领域已知方法制备，还可商购获得。可商购获得的蛋白微阵列包括，例如，Invitrogen的
Figure BDA00002732721600071
人蛋白微阵列v5.0，该微阵列优选根据Invitrogen
Figure BDA00002732721600072
方案和免疫应答生物标志物谱(Immune Response BiomarkerProfiling)应用来使用。
用于探测和扫描此类蛋白微阵列和用于检测所得数据的诊断性意义的方法为本领域技术人员已知，并公开在例如，Tibshirani et al.(2002)Proc NatlAcad Sci USA99,6567-6572。一旦通过前述方法鉴定了神经变性疾病诊断性自身抗体，则鉴定和筛选相应的自身抗原以用于检测和诊断方法。
自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病诊断性自身抗体识别的一种或多种表位，或由所述疾病诊断性自身抗体识别的表位拟肽(peptidomimetic)。自身抗原可由天然来源纯化而来，或通过本领域已知的方法重组或合成性制备，可为融合蛋白形式。可使用无细胞翻译系统体外制备自身抗原。在优选的实施方式中，在哺乳动物或昆虫表达系统中制备自身抗原以确保正确的折叠和功能。所有这些方法可为自动化的以用于高通量制备。
用于检测免疫复合物的测定和条件为本领域技术人员已知。这样的测定包括，例如，竞争性测定、直接反应测定以及夹层型测定。所述测定可为定量或定性的。在优选的实施方式中，测定利用与自身抗原直接或间接连接的固相或基材，例如微量滴定板或微量测定板、载玻片、磁珠、非磁珠、柱、基质、膜、试纸片、过滤器、膜、针或片，可由合成性材料(例如，聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其他合成性聚合物)、天然聚合物(例如纤维素)、衍生性天然聚合物(例如醋酸纤维素或硝酸纤维素)以及玻璃(例如玻璃纤维)构成。所述基材优选包括固定于表面上的可分别定位的多种自身抗原。可分别定位的自身抗原优选固定于表面上以形成阵列。所述基材可以以合适的形状使用，例如薄膜、片或板，或可包被、粘合或层压至合适的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物。在优选的实施方式中，所述基材为载玻片或微珠。
将自身抗原连接到支持物或基材上的方法为本领域已知，包括共价和非共价相互作用。例如，所应用的蛋白扩散至例如水凝胶的多孔表面允许在水凝胶结构中未修饰蛋白的非共价结合。共价偶联方法提供了稳定的连接，可应用于许多蛋白。使用蛋白上的标签(例如，六组氨酸/Ni-NTA或生物素/亲和素)和固定于基材表面上的配偶体(partner)试剂的生物捕获方法提供了稳定的连接，以可再现取向(reproducible orientation)特异性结合蛋白。在优选的实施方式中，将自身抗原涂覆或点至支持物或基材(例如化学衍生玻璃)上。在更优选的实施方式中，使用硝酸纤维素包被的载玻片。
在一种优选的实施方式中，以阵列、优选微阵列的形式提供自身抗原。蛋白微阵列为本领域已知，并且综述在例如Hall et al.(2007)Mech Ageing Dev128:161-167和Stoevesandt et al(2009)Expert Rev Proteomics6:145-157中，该文献公开的整体内容通过引用并入本文。可通过使用接触点样器或非接触微阵列仪将纯化的自身抗原固定于基材(如处理过的显微镜载玻片)上来制备微阵列。还可通过由相应DNA阵列直接原位无细胞合成来制备微阵列。
外源制备和纯化待点样至阵列上的自身抗原的合适方法包括在细菌中表达(如Venkataram et al.(2008)Biochemistry47:6590-6601所揭示的)、在酵母中表达(如Li et al.(2007)ApplBiochem Biotechnol.142:105-124所揭示的)、在昆虫细胞中表达(如Altman et al.(1999)Glycoconj J 16:109-123所揭示的)以及在哺乳动物细胞中表达(如Spampinato et al.(2007)Curr Drug Targets8:137-146所揭示的)。
合适的原位(“芯片上”)蛋白制备方法公开在例如，Ramachandran et al.(2006)Methods Mol.Biol2328:1-14and He et al.(2008)Curr.Opin Biotechnol19:4-9。
同时平行在阵列表面上表达和固定蛋白的其他方法也是本领域已知的，可用于本发明。例如，在蛋白原位阵列(PISA)方法(He et al.(2001)NucleicAcids Res29:e73)中，直接由DNA制备溶液或固定形式的蛋白，当通过识别标签序列而制备时连接到阵列表面。利用无细胞系统(通常为兔网织红细胞或大肠杆菌S30)体外平行表达蛋白，以进行偶联的转录和翻译。在该方法中，在其上预包被有能够结合标签的固定剂的表面上进行蛋白表达。由此，在各蛋白翻译后，其同时特异性固定于邻近的表面上，而其他物质可随后被洗除。可通过将DNA与无细胞裂解物系统混合之后点样，或通过首先点样随后与表达系统混合的多次点样技术(MIST)直接将微阵列制备至载玻片上。
在已知为核酸程序化蛋白阵列(NAPPA)(Ramachandran et al.(2004)Science305:86-90)的系统中，由固定(与溶液相对)的DNA模板进行转录和翻译允许将DNA阵列转化为蛋白阵列。在该方法中，将编码作为GST融合物的蛋白的生物素化cDNA质粒与用作捕获实体的抗GST抗体一起印至亲和素包被的载玻片上。然后使用兔网织红细胞裂解物覆盖cDNA阵列以表达蛋白，所述蛋白由邻近各DNA点的抗体捕获，由此所述蛋白以与cDNA相同的布局固定。该技术产生了其中固定的蛋白与DNA和捕获剂一起存在的蛋白阵列。
另一种产生蛋白阵列的合适方法是DNA阵列至蛋白阵列(DAPA)方法。该原位蛋白阵列的方法使用固定的DNA阵列作为模板以在分离的表面上由DNA产生“纯”蛋白阵列，还可由相同DNA模板产生多拷贝蛋白阵列(He et al.(2008)Nature Methods,5:175-7)。在置于两个表面(例如载玻片)之间的膜中进行无细胞蛋白合成，其中一个表面布有DNA分子阵列，而另一个表面带有特定试剂以捕获所翻译的蛋白。由所布阵列的DNA平行合成各标记的蛋白，所述蛋白经间隙扩散，之后通过其与位于相对面的标签捕获试剂相互作用而固定，以形成蛋白阵列。产生了在位置和量上准确反映DNA的离散点。可通过再利用DNA获得蛋白阵列的复制拷贝。
阵列构建方法包括机器人接触印刷、喷墨、压电点样以及照相平板印刷。例如，可使用柔性蛋白微阵列喷墨印刷系统(例如，ArrayJet,Roslin,Scotland,UK)将外源制备和纯化的本发明的纯化自身抗原点样至微阵列基材上，以提供高质量蛋白微阵列生产。可将精确的自身抗原的行和列转化为标示出已结合诊断性自身抗体的存在和量的可检测点。
优选使用经设计以维持自身抗原三维形状的可商购印刷缓冲液进行微阵列的制备。在一种优选实施方式中，用于微阵列的基材是硝酸纤维素包被的载玻片。
可通过本领域已知的方法进行测定，在所述方法中在允许形成自身抗原与抗体的免疫复合物的条件下，使一种或多种自身抗原与生物样品接触，并检测所述免疫复合物。可通过本领域已知的方法检测免疫复合物的存在和量，所述方法包括基于标签和无标签的检测。例如，基于标签的检测方法包括添加第二抗体，所述第二抗体与包含产生信号的化合物的指示剂偶联。所述第二抗体可为抗人IgG抗体。所述指示剂包括生色剂、诸如酶偶联物的催化剂、诸如荧光素和若丹明的荧光化合物、诸如二氧杂环丁烷、吖啶类、菲啶类(phenanthridiniums)、钌以及鲁米诺(luminol)的化学发光化合物、放射性元素、直接可视标签以及辅因子、抑制剂和磁性颗粒。所述酶偶联物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶以及β-半乳糖苷酶。无标签检测方法包括表面等离振子共振、碳纳米管以及纳米线以及干扰量度法。基于标签和无标签检测方法为本领域已知，并公开于例如Hall et al.(2007)and by Ray et al.(2010)Proteomics10:731-748。可通过本领域已知且适于所使用标签的扫描方法，以及相关的分析软件来实现检测。
在本发明的一种优选实施方式中，使用荧光标记和检测方法来检测免疫复合物。可使用可商购的载玻片扫描仪(例如，Genepix4000B载玻片扫描仪(Molecular Devices,Inc.))和相关的分析软件。在一种优选实施方式中，使用荧光标记(例如，Alexa-Fluor(Invitrogen))的抗人抗体探测免疫复合物，使用微阵列扫描仪检测各蛋白点的荧光强度。可使用可商购的软件(例如，GenePixPro5.0软件(Axon instruments))从扫描仪产生的数字图像提取各特征的净中值像素强度。可通过比较相同阵列的不同区域中的多个相同对照点的中值来对数据进行标准化。
检测到免疫复合物是生物样品中存在神经变性疾病诊断性自身抗体的标志，由此表明是神经变性疾病的阳性诊断。
本发明的另一种实施方式提供了一种诊断受试者神经变性疾病的方法，所述方法包括：由所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，和如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为患有所述疾病。
在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。
在优选的实施方式中，通过如下所述进行用于诊断受试者神经变性疾病的测定：在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下，使所述样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测所述免疫复合物的存在(上文有详细描述)。可以以阵列或优选微阵列的形式提供自身抗原。
本发明另一种实施方式包括一种生成受试者特异性的神经变性疾病特异性自身抗体谱的方法，所述方法包括：由所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，和生成存在于样品中的所述神经变性疾病诊断性自身抗体的受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体谱。
在更优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。
在优选的实施方式中，通过如下所述进行用于诊断受试者神经变性疾病的测定：在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下使所述样品与神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，和检测所述免疫复合物的存在(上文有详细描述)。可以以阵列或优选微阵列的形式提供自身抗原。
本发明的另一种实施方式提供了一种基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。在另一种实施方式中，本发明还提供了一种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。所述基材和微阵列可如上文所述制备，可用于制备神经变性疾病诊断性自身抗体谱和诊断神经变性疾病。自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病诊断性自身抗体识别的一种或多种表位，或由所述疾病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。对于每种神经变性疾病，所述基材和微阵列含有至少一种特异性自身抗原，优选对每种神经变性疾病含有约两种至约三十种特异性自身抗原。
所述基材和微阵列可含有多组(panels)自身抗原，其中各组含有对于特定神经变性疾病的诊断性自身抗原。这样的多基材和多阵列允许在相同测定中诊断多于一种的神经变性疾病，还允许区分神经变性疾病。
在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于检测样品中神经变性疾病特异性自身抗体的试剂盒。所述试剂盒包含神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原和用于检测所述自身抗原与所述样品中自身抗体结合的工具。所述试剂盒还包含包装材料(packaging material)，所述包装材料包括指示所述试剂盒的所述一种或多种自身抗原可用于鉴定神经变性疾病的标签。所述试剂盒中可包含本领域技术人员已知可包含在此类试剂盒中其他组分，诸如缓冲液、对照、检测试剂等。所述试剂盒可用于检测神经变性疾病特异性自身抗体和诊断神经变性疾病。
阿尔茨海默病
本文中阿尔茨海默病(AD)诊断性自身抗体被定义为特异性结合蛋白或肽抗原和作为可用于区分阿尔茨海默病与没有患有阿尔茨海默病的对照受试者的诊断指示剂的抗体。已经鉴定为可潜在用于诊断性指示剂的蛋白抗原列于下表1中。表1中的蛋白抗原通过本领域接受的名称及数据库识别号而确定。数据库识别号是指可公开获得的美国国家生物技术信息中心(NCBI)蛋白数据库，该数据库为本领域公知并为本领域普通技术人员可获得。
表1
Figure BDA00002732721600141
Figure BDA00002732721600151
表1(续)
Figure BDA00002732721600152
Figure BDA00002732721600161
表1(续)
数据库ID 说明
PHR5001 重组人CTLA-4/Fc
BC030983.1 免疫球蛋白λ基因座(IGL)
BC030984.1 cDNA克隆MGC:32654IMAGE:4701898，完整编码序列
NM_133494.1 NIMA(从不位于有丝分裂基因a)相关激酶7(NEK7)
BC010467.1 cDNA克隆MGC:17410IMAGE:4156035，完整编码序列
NM_014060.1 恶性T细胞扩增序列1(MCTS1)
NM_016167.3 核仁蛋白7，27kDa(NOL7)
BC015833.1 cDNA克隆MGC:27152IMAGE:4691630，完整编码序列
NM_145063.1 染色体6开放阅读框130(C6orf130)
BC040106.1 假定蛋白HSPC111(HSPC111)
BC010947.1 信号识别颗粒19kDa(SRP19)
NM_014065.2 蛋白小行星同源物1
BC012760.2 糖原合成酶激酶-3β
NM_004088.1 脱氧核苷酸转移酶，末端(DNTT)，转录变体1
BC019337.1 免疫球蛋白重链恒定区γ1(G1m标志物)(IGHG1)
NM_002938.2 环指蛋白4(RNF4)
NM_006620.2 HBS1样(啤酒酵母菌)(HBS1L)
NM_000992.2 60S核糖体蛋白L29
NM_024668.2 含锚蛋白重复和KH结构域的1(ANKHD1)，转录变体3
NM_031445.1 AMME染色体区基因1样(AMMECR1L)
NM_003517.2 组蛋白簇2，H2ac(HIST2H2AC)
BC072419.1 Igγ-1链C区
NM_145174.1 DnaJ(Hsp40)同源物，亚家族B，成员7(DNAJB7)
BC022361.1 rRNA加工蛋白FCF1同源物
BC006376.1 N-肉豆蔻酰转移酶2(NMT2)
NM_001895.1 酪蛋白激酶2，α1多肽(CSNK2A1)，转录变体2
NM_003524.2 1-H型组蛋白H2B
BC027951.1 Cas支架蛋白家族成员4
NM_134427.1 G蛋白信号传导调节因子3(RGS3)，转录变体4
NM_052969.1 核糖体蛋白质L39样(RPL39L)
NM_023080.1 染色体8开放阅读框33(C8orf33)
NM_138779.1 染色体13开放阅读框27(C13orf27)
BC026030.1 锌指蛋白239(ZNF239)
BC029760.1 含OTU结构域的6B(OTUD6B)
PHC1475 C-C基序趋化因子21
NM_133336.1 Wolf-Hirschhorn综合征候选物1(WHSC1)，转录变体9
BC034142.1 免疫球蛋白κ可变区1-5(IGKV1-5)
NM_020235.2 短袜(bobby sox)同源物(果蝇)(BBX)
表1(续)
Figure BDA00002732721600171
Figure BDA00002732721600181
表1(续)
Figure BDA00002732721600182
Figure BDA00002732721600191
表1(续)
Figure BDA00002732721600192
Figure BDA00002732721600201
表1(续)
Figure BDA00002732721600212
表1(续)
Figure BDA00002732721600222
Figure BDA00002732721600231
表1(续)
Figure BDA00002732721600232
Figure BDA00002732721600241
表1(续)
数据库ID 说明
PHC0205 白细胞介素20(IL20)
NM_016093.2 核糖体蛋白质L26样1(RPL26L1)
NM_005902.1 SMAD家族成员3(SMAD3)
XM_375456.2 Ataxin-7样蛋白3
NM_006275.2 剪接因子，富精氨酸/丝氨酸6(SFRS6)
BC011600.1 cDNA克隆IMAGE:3050953，****警告：嵌合克隆****
NM_014570.2 ADP-核糖基化因子GTP酶激活蛋白3(ARFGAP3)
NM_022551.2 核糖体蛋白质S18(RPS18)
BC063275.1 真核生物翻译起始因子2C，1(EIF2C1)
BC062423.1 染色体7开放阅读框41(C7orf41)
BC096708.1 维尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)相关蛋白
NM_199123.1 含SET结构域的3(SETD3)，转录变体2
BC010907.1 PAK1相互作用蛋白1(PAK1IP1)
NM_004217.1 极光激酶B(AURKB)
NM_005737.3 ADP-核糖基化因子样4C(ARL4C)
NM_020467.2 小跨膜和糖基化蛋白(LOC57228)，转录变体2
BC021180.2 高迁移率族框4(HMGB4)
NM_004728.2 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)框多肽21(DDX21)
BC030702.1 小头畸形，初级常染色体隐性遗传1(MCPH1)
NM_003724.1 jerky同源物(小鼠)(JRK)，转录变体1
NM_016077.1 肽酰tRNA水解酶2(PTRH2)，编码线粒体蛋白的核基因
NM_014955.2 KIAA0859(KIAA0859)，转录变体2
NM_003503.2 细胞分裂周期7相关蛋白激酶
BC017212.2 PHD指蛋白11(PHF11)
NM_019069.3 WD重复域5B(WDR5B)
BC094719.1 Rho GTP酶激活蛋白12
BC021187.1 DKFZP434K028蛋白(DKFZP434K028)
NM_003948.2 细胞周期蛋白依赖性激酶样2
BC040183.2 Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4(RAPGEF4)
NM_014061.3 黑色素瘤抗原家族H，1(MAGEH1)
BC032587.1 桶状蛋白3(TULP3)
BC005332.1 cDNA克隆MGC:12418IMAGE:3934658，完整编码序列
BC033710.2 RAD54同源物B(啤酒酵母菌)(RAD54B)
BC010425.1 酰基辅酶A氧化酶1，棕榈酰(ACOX1)
NM_021138.2 TNF受体相关因子2(TRAF2)
BC093990.1 Sin3组蛋白去乙酰化酶辅阻遏物复合物组分SDS3
NM_014288.2 着丝粒蛋白R
NM_024826.1 微管相关蛋白9
表1(续)
Figure BDA00002732721600261
表1(续)
Figure BDA00002732721600272
Figure BDA00002732721600281
表1(续)
Figure BDA00002732721600282
Figure BDA00002732721600291
表1(续)
Figure BDA00002732721600292
Figure BDA00002732721600301
表1(续)
数据库ID 说明
NM_006755.1 转醛醇酶1(TALDO1)
NM_004853.1 突触融合蛋白8(STX8)
BC036910.1 假定蛋白LOC388882(LOC388882)
BC094687.1 延伸因子1-α1
NM_144608.1 环己二乙酰胺诱导蛋白2(HEXIM2)
NM_003831.1 RIO激酶3(酵母)(RIOK3)
BC009250.1 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白样2(核仁)(GNL2)
BC032598.1 含NHL重复序列的2(NHLRC2)
NM_018697.3 LanC抗生合成酶组分C样2(细菌)(LANCL2)
NM_024104.1 染色体19开放阅读框42(C19orf42)
BC030665.1 磺基转移酶4A1
BC004955.1 APT酶抑制因子1(ATPIF1)
BC009010.1 未表征的蛋白C6orf142同源物
BC012887.1 核仁和纺锤体相关蛋白1
BC015066.1 核心结合因子，runt结构域，α亚基2；有易位，2(CBFA2T2)
BC052303.1 Rho GTP酶激活蛋白4(ARHGAP4)
NM_080414.1 空泡蛋白分选16同源物(啤酒酵母菌)(VPS16)，转录变体2
NM_001790.2 细胞分裂周期25同源物C(粟酒裂殖酵母菌)(CDC25C)，转录变体1
PHC0045 白细胞介素4(IL4)，转录变体1
NM_145041.1 跨膜蛋白106A(TMEM106A)
NM_021639.2 富含GC启动子结合蛋白1样1(GPBP1L1)
BC028295.1 肽酶D(PEPD)
PV3612 极光激酶A(AURKA)，转录变体2
NM_032321.1 假定蛋白MGC13057(MGC13057)，转录变体4
BC010033.1 喹啉酸磷酸核糖酰转移酶(烟酸核苷酸焦磷酸化酶(羧化))(QPRT)
NM_001064.1 转酮醇酶
NM_017572.2 MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶2
NM_022650.1 RAS p21蛋白激活因子(GTP酶激活蛋白)1(RASA1)，转录变体2
NM_020781.2 锌指蛋白398(ZNF398)，转录变体2
NM_002391.1 中期因子midkine(轴突生长促进因子2)(MDK)，转录变体3
NM_006298.2 锌指蛋白192(ZNF192)
BC047536.1 sciellin(SCEL)
NM_139062.1 酪蛋白激酶1，δ(CSNK1D)，转录变体2
NM_005639.1 突触结合蛋白I(SYT1)
BC006811.1 过氧化物酶体增殖因子激活受体γ(PPARG)
表1(续)
Figure BDA00002732721600321
表1(续)
Figure BDA00002732721600331
表1(续)
Figure BDA00002732721600341
Figure BDA00002732721600351
表1(续)
Figure BDA00002732721600352
Figure BDA00002732721600361
表1(续)
Figure BDA00002732721600362
Figure BDA00002732721600371
表1(续)
Figure BDA00002732721600372
Figure BDA00002732721600381
表1(续)
Figure BDA00002732721600391
表1(续)
Figure BDA00002732721600392
Figure BDA00002732721600401
表1(续)
Figure BDA00002732721600402
Figure BDA00002732721600411
表1(续)
数据库ID 说明
NM_006590.2 泛素特异性肽酶39(USP39)
NM_199054.1 MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2(MKNK2)，转录变体2
BC050696.1 染色体12开放阅读框48(C12orf48)
NM_024563.1 染色体5开放阅读框23(C5orf23)
NM_004832.1 谷胱甘肽S-转移酶ω1(GSTO1)
NM_003242.2 转化生长因子，β受体II(70/80kDa)(TGFBR2)，转录变体2
BC050444.1 高尔基体自身抗原，高尔基蛋白亚家族a，4(GOLGA4)
NM_201259.1 线粒体输入内膜转位酶亚基TIM14
NM_032124.3 含卤酸脱卤素酶样水解酶结构域的2(HDHD2)
NM_002870.1 RAB13，成员RAS癌基因家族(RAB13)
BC000337.2 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)
BC060785.1 含三重基序的40(TRIM40)
BC030597.1 ATR相互作用蛋白(TREX1)
BC050551.1 BCL2相关永生基因5(BAG5)
NM_004697.3 PRP4前mRNA加工因子4同源物(酵母)(PRPF4)
NM_020990.2 肌酸激酶，线粒体1B(CKMT1B)，编码线粒体蛋白的核基因
BC039742.1 聚(rC)结合蛋白1(PCBP1)
BC021573.1 GTP结合蛋白10
NM_015068.1 父系表达10(PEG10)，转录变体1
NM_001827.1 CDC28蛋白激酶调控亚基2(CKS2)
NM_152876.1 肿瘤坏死因子受体超家族成员6
BC015548.1 RAB3A相互作用蛋白(rabin3)(RAB3IP)
BC062359.1 染色体8开放阅读框47(C8orf47)
BC029424.1 可能的谷胱甘肽过氧化酶8
NM_001786.2 细胞分裂周期2，G1至S和G2至M(CDC2)，转录变体1
BC000870.1 TIMELESS相互作用蛋白(TIPIN)
NM_004103.2 蛋白酪氨酸激酶2β
BC022454.2 瞬时受体潜能阳离子通道亚家族M成员3
NM_024046.1 CaM激酶样囊泡相关(CAMKV)
BC040521.1 睾丸表达2(TEX2)
BC003164.1 白细胞受体簇(LRC)成员4(LENG4)
NM_000402.2 6-磷酸葡萄糖1-脱氢酶
BC069328.1 Bcl2修饰因子(BMF)
BC063463.1 辅酶Q3同源物，甲基转移酶(啤酒酵母菌)(COQ3)
表1(续)
Figure BDA00002732721600431
Figure BDA00002732721600441
在另一种实施方式中，所述基材和微阵列含有作为自身抗原的表2中的至少一种蛋白抗原，或其多肽或肽片段，所述多肽或肽片段含有由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位或由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。表2-5中，通过本领域接受的名称及数据库识别号来确定蛋白抗原。数据库识别号是指可公开获得的美国国家生物技术信息中心(NCBI)蛋白数据库，该数据库为本领域公知并可为本领域普通技术人员可获得。
表2
数据库ID 说明
BC030984.1 cDNA克隆MGC:32654IMAGE:4701898，完整编码序列
PHR5001 重组人CTLA-4/Fc
BC016380.1 cDNA克隆MGC:27376IMAGE:4688477，完整编码序列
BC015833.1 cDNA克隆MGC:27152IMAGE:4691630，完整编码序列
BC099907.1 通用转录因子II-I
BC051695.1 包含FERM结构域的8(FRMD8)
BC040106.1 假定蛋白HSPC111(HSPC111)
NM_003141.2 含三重基序的21(TRIM21)
NM_003384.1 牛痘相关激酶1(VRK1)
BC004236.2 泛素结合酶E2S(UBE2S)
BC001662.1 MAP激酶激活蛋白激酶3
NM_017588.1 WD重复域5(WDR5)，转录变体1
NM_032377.2 延伸因子1同源物(啤酒酵母菌)(ELOF1)
NM_021032.2 成纤维细胞生长因子12(FGF12)，转录变体1
NM_000984.2 核糖体蛋白质L23a(RPL23A)
BC064984.1 其他的性梳样1(果蝇)(ASXL1)
NM_012387.1 肽基精氨酸脱亚氨酶，IV型(PADI4)
NM_001641.2 APEX核酸酶(多功能DNA修复酶)1(APEX1)，转录变体1
NM_001896.2 酪蛋白激酶2，α引物多肽(CSNK2A2)
NM_014481.2 APEX核酸酶(无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶)2(APEX2)，
编码线粒体蛋白的核基因
NM_014280.1 DnaJ同源物亚家族C成员8
BC007228.1 CSAG家族，成员3A(CSAG3A)
BC021174.1 富含EDRK的小因子1
BC033758.1 蓟苦素，α2(CENTA2)
BC005248.1 真核生物翻译起始因子1A，Y染色体连锁(EIF1AY)
BC022098.1 cDNA克隆MGC:31944IMAGE:4878869，完整编码序列
NM_024754.2 三角形五肽重复域2(PTCD2)
NM_024316.1 白细胞受体簇(LRC)成员1(LENG1)
NM_015920.3 40S核糖体蛋白S27样蛋白
BC048970.1 微管蛋白酪氨酸连接酶样家族，成员7(TTLL7)
NM_003668.2 有丝分裂原激活蛋白激酶激活的蛋白激酶5(MAPKAPK5)，转录变体1
NM_007278.1 GABA(A)受体相关蛋白(GABARAP)
NM_006838.1 甲硫氨酰基氨基肽酶2(METAP2)
NM_018439.1 冲击同源物(小鼠)(IMPACT)
表2(续)
数据库ID 说明
NM_002013.2 FK506结合蛋白3，25kDa(FKBP3)
NM_018956.2 染色体9开放阅读框9(C9orf9)
NM_004987.3 含LIM和衰老细胞抗原样结构域的蛋白1
BC004292.1 PHD指蛋白15(PHF15)
NM_133494.1 NIMA(从不存在于有丝分裂基因a中)相关激酶7(NEK7)
NM_145063.1 染色体6开放阅读框130(C6orf130)
NM_021104.1 核糖体蛋白质L41(RPL41)，转录变体1
NM_006223.1 蛋白(肽基脯氨酸顺/反异构酶)NIMA相互作用，4(小细胞蛋白)(PIN4)
NM_003135.1 信号识别颗粒19kDa蛋白
NM_015933.1 含卷曲螺旋结构域的72(CCDC72)
NM_001031.4 40S核糖体蛋白S28
BC022524.1 成纤维细胞生长因子12(FGF12)
NM_001028.2 核糖体蛋白质S25(RPS25)
NM_001997.2 芬克尔-布里斯基斯-赖利小鼠肉瘤病毒(FBR-MuSV)遍在表达的(FAU)
NM-080659.1 染色体11开放阅读框52(C11orf52)
在另一种实施方式中，所述基材和微阵列含有作为自身抗原的表3中的至少一种蛋白抗原，或其多肽或肽片段，所述多肽或肽片段含有由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位或由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。
表3
数据库ID 说明
BC051695.1 含FERM结构域的蛋白8(FRMD8)
NM_024754.2 含三角形五肽重复序列的蛋白2(PTCD2)
NM_021104.1 60S核糖体蛋白L41(RPL41)
NM_032855.1 含造血性SH2结构域的蛋白HSH2D
在本发明一个方面的另一种实施方式中，所述微阵列包含由含有FERM结构域的蛋白8(FRMD8)、60S核糖体蛋白L41(RPL41)、含三角形五肽重复序列的蛋白2(PTCD2)以及含造血性SH2结构域的蛋白(HSH2D)构成的自身抗原或其片段，所述片段含有由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位或由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。在另一种实施方式中，所述微阵列包含由含有FERM结构域的蛋白8(FRMD8)和含造血性SH2结构域的蛋白(HSH2D)构成的自身抗原或其片段，所述片段含有由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位。
在本发明一种优选实施方式中，所述基材和微阵列含有作为自身抗原的表4中的至少一种蛋白抗原或其片段，所述片段含有由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位或由阿尔茨海默病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。在本发明的另一种优选实施方式中，所述基材和微阵列包含表4的所有蛋白抗原。
表4
Figure BDA00002732721600461
帕金森氏病
在本发明的另一种实施方式中，所述微阵列还包含与帕金森氏病(PD)具有反应性而与阿尔茨海默病无反应性由此允许区分阿尔茨海默病与帕金森氏病的自身抗原。对帕金森氏病具有诊断性而对阿尔茨海默病无诊断性的自身抗体包括，例如表5的蛋白及其片段，所述片段含有由帕金森氏病诊断性自身抗体识别的一个或多个表位和由帕金森氏病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。
表5
数据库ID 说明
NM_003177.3 脾酪氨酸激酶(SYK)
BC_019015.2 RNA聚合酶II转录亚基的介体29(MED29)
BC003551 蛋白谷氨酰胺γ谷氨酰基转移酶2(TGM2)
PV3851 MAP/微管亲和性调节激酶-4(MAPrk4)
BC001755.1 平滑肌蛋白-1
下列实施例用于进一步说明本发明。
实施例
材料与方法
动物
Swiss-Webster小鼠获自Taconic Farms(Hudson,NY)，以3-6月龄用于实验。Sprague-Dawley大鼠也获自Taconic Farms，以7-9月龄使用。在AALAC(国际实验动物评估和认可管理委员会)认可的动物饲养所中，在12小时光/暗循环下饲养所述小鼠和大鼠，食物和水任取。动物使用由美国新泽西医科与牙科大学动物实验管理委员会(UMDNJ IACUC)评审和批准。
人脑组织
患有散发性阿尔茨海默病患者(n=23，年龄范围=71-88)和年龄匹配的神经学正常个体(n=14，年龄范围=69-83)的脑组织获自哈佛脑组织资源中心(Harvard Brain Tissue Resource Center,Belmont,MA)、人类组织合作网(Cooperative Human Tissue Network,Philadelphia,PA)、UCLA组织资源中心(UCLA Tissue Resource Center Los Angeles,CA)以及Slidomics(Cherry Hill,NJ)。死后间隔为<24h，根据美国国家衰老研究所和里根研究所阿尔茨海默病神经病理评估诊断标准工作组制定的标准(Hyman and Trojanowski(1997)JNeuropathol Exp Neurol56,1095-7)评价阿尔茨海默病的病理确认。根据标准方案处理福尔马林固定组织用于常规的石蜡包埋和切片。对照组织表现了最小的局部显微阿尔茨海默病样神经病理。
抗体
Aβ42抗体获自Millipore International(Temecula,CA)(多克隆，批号AB5078P，稀释度=1:50)和Pharmingen(San Diego,CA)(多克隆，批号4767，稀释度=1:50)。用于免疫组织化学的生物素化抗人IgG抗体获自VectorLaboratories(Burlingame,CA)(宿主：山羊，批号PK-6103，稀释度=1:100)。用于蛋白质印迹的过氧化物酶偶联的抗人IgG抗体获自Thermo Scientific(Rockford,IL)(宿主：山羊，批号31410，稀释度=1:200,000)。下列抗体用于处理小鼠器官特征脑切片培养物：抗α7烟碱乙酰胆碱受体(C-20,Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)，抗GluR2抗体(多克隆N19,Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)，抗β微管蛋白抗体(D-10,Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)。这些抗体的特异性通过蛋白质印迹确认。
人血清
人血清样品[阿尔茨海默病(n=52，年龄范围=61-97岁)；年龄匹配的对照(n=28，年龄范围=51-86)；和较年轻的健康对照(n=28，年龄范围=19-30岁)]获自Analytical Biological Services Inc(Wilmington,DE)。对样品进行数字编号，包括下列信息：患者年龄和性别，是否存在可检测的神经疾病，以及如果所述疾病存在，疾病严重性的指征和所估计的死后间隔。这些样品的使用得到了美国新泽西医科与牙科大学机构评审委员会(UMDNJ IRB)的批准。
免疫组织化学
如先前文献所述，使用石蜡包埋脑组织进行免疫组织化学测试(D'Andreaet al.(2001)Histopathology38,120-34；Nagele et al.(2002)Neuroscience110,199-211)。简言之，使用二甲苯对组织进行脱石蜡化，并通过浓度递减的分级系列乙醇进行再水化。通过在柠檬酸盐缓冲剂中对切片进行微波处理增强抗原性。通过使用0.3%H2O2处理切片而淬灭内源性过氧化物酶。在封闭血清中温育切片，然后使用合适稀释度的初级抗体在室温下处理1小时。在PBS中彻底清洗之后，应用生物素化二级抗体30分钟。使用抗生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain ABC Elite,Vector Laboratories,Inc.,Foster City,CA)处理切片，并使用3-3-二氨基联苯胺-4-HCL(DAB)/H2O2(Imm-Pact-DAB)(Vector)显像。然后，使用苏木精轻柔复染切片，通过递增浓度的乙醇脱水，在二甲苯中透明化，并于Permount中封片。对照由使用非免疫血清处理或省略初级抗体处理的脑切片组成。使用Nikon FXA显微镜检查样品并照相，使用NikonDXM1200F数码相机记录数字图像，使用Image Pro Plus(Phase3Imaging,Glen Mills,PA)和Cell Profiler图像分析软件处理和分析。
成年大鼠脑蛋白的制备
为制备大鼠脑蛋白级分，取出在-80°C下储存的新鲜大鼠脑组织，置于1mM苯甲磺酰基氟化物、50.0mM Tris-HCL缓冲液(pH7.4，10.0ml/g)连同.5ml/g的蛋白酶抑制因子混合物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中。使用预冷却的Dounce匀浆器(Arrow Engineering Co.,Inc.,Hillside,NJ；设为4档)将脑样品匀浆。随后，使用配备悬臂转子的Beckman CS-6R离心机(BeckmanCoulter Inc,Brea,CA)在4℃下于3,000rpm离心脑样品10分钟，以去除完整细胞和大碎片。将上清作为全脑蛋白级分保留。使用Bradford测试法测定蛋白浓度。
通过蛋白质印迹检测自身抗体靶
进行蛋白质印迹分析以测定血清自身抗体的脑膜靶。首先，使用MiniPROTEAN3System(165-3302,BioRad,Hercules,CA)配制12.5%SDS-聚丙烯酰胺分离胶，使用浓缩胶覆盖(4.0%)。将100.0μg的蛋白样品添加至样品缓冲液中，并沿PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus(SM1811,Fermentas,Glen Burnie,MD)上样至凝胶上。然后，在130V分离蛋白7分钟，随后，在剩余的解析时间中以100V进行分离。然后，在180mA作用75分钟，从而将蛋白转移至Hybond-ECL硝酸纤维素膜(RPN3032D,Amersham,Piscataway,NJ)。在溶于PBS-Tween(PBS-T)中的5.0%脱脂干乳粉中封闭印迹，然后转移至人血清样品(初级抗体)，1:500稀释于封闭缓冲液中，在4℃过夜温育。次日早晨，在PBS-T中彻底清洗印迹，然后置于适当稀释的过氧化物酶偶联的二级抗体中并在4℃温育1小时。然后，在PBS-T中彻底清洗印迹，之后在dH2O中快速清洗，以去除磷酸盐缓冲液。然后，使用Pierce增强化学发光(ECL)底物(32106,Pierce,Rockford,IL)和放射自显影膜(XAR ALF1824,LabScientific,Livingston,NJ)对印迹进行显影。给定血清样品的每份蛋白质印迹以一式三份进行。
小鼠器官特征型脑切片培养和处理
使用Stoppini等的技术(Stoppini et al.(1991)J Neurosci Methods.37,173-82)制备成年小鼠器官特征型脑切片培养物(MBOC)。这些培养物中的神经元显示积累外源性Aβ42(可在接触100nM Aβ42的4小时内检测到)(Bahret al.,(1998)J Comp Neurol.397,139-47；Harris-White et al.,(1998)J Neurosci.18,10366-74；Malouf，(1992)Neurobiol Aging.13,543-51；Stoppini et al.(1991))。在无菌条件下，分离Swiss-Webster小鼠(3-6月龄)的脑，使用McIlwain组织切块机制备通过所需脑区的横向冠状切片(0.5-0.75mm厚)，置于30mmMillicell-CM培养插件(Millicell-CM,Millipore,Bedford,MA,USA)，使得在无血清培养基(DMEM)中短暂(1小时)稳定，或在25%灭活马血清、25%汉克斯缓冲盐溶液、50%DMEM、25mg/l青霉素-链霉素中过夜稳定，之后处理。稳定之后，将培养物暴露于含Aβ42肽(100nM)、抗GluR2抗体(1:250稀释)、人血清样品(1:50稀释)、抗α7nAChR抗体(1:1000稀释)、抗体β微管蛋白抗体(1:200稀释)的无血清培养基(仅DMEM)或完全培养基(25%灭活马血清、25%汉克斯缓冲盐溶液、50%DMEM、25mg/l青霉素-链霉素)。对照切片仅接受培养基。在37℃于富5%CO2的气氛中处理MBOC达72小时。使用Zagorski等的方法(Zagorski et al.(1999)Methods Enzymol.309,189-204)将Aβ42溶解为单体形式。
图像分析
使用定量免疫组织化学来测定在有或无人血清或针对α7nAChR或GluR2的抗体的条件下，使用100nM Aβ42处理的MBOC中的Aβ42聚集程度。首先，在相同条件下，使用抗Aβ42抗体对上述处理的MBOC进行免疫染色。然后使用配备有Nikon CCD照相机和图像分析软件的(Image Pro Plusand Cell Profiler)的Nikon FXA显微镜在相同的照明和照相设置下记录图像。测定各Aβ42阳性细胞的胞内Aβ42阳性沉积物的相对量，并对于不同处理组进行比较。通过学生t检验检测细胞内的胞内Aβ42量的显著性差异。免疫组织化学对照包括非免疫血清或仅检测抗体。
实施例2：人血清中的脑反应性自身抗体
检测来自阿尔茨海默病患者(n=52，年龄范围=61-97岁)、年龄匹配的非痴呆对照受试者(n=28，年龄范围=51-86)和较年轻的健康对照个体(n=28，年龄范围=19-30岁)的血清是否存在脑反应性自身抗体。对于蛋白质印迹分析，通过探测获自衍生自成年大鼠脑的全细胞匀浆的蛋白检测各血清是否存在脑反应性自身抗体。结果证实所检测的三组的所有血清中均存在脑反应性自身抗体。各血清样品生成的免疫反应性蛋白条带数量与所有三个受试者组相似：阿尔茨海默病血清的平均值=5.1+/-3.1(n=52)；年龄匹配的对照血清为7.4+/-4.0(n=28)；较年轻的健康对照血清为6.0+/-3.8(n=28)。在使用人血清探测小鼠和人脑蛋白时，获得了相当的结果。基于蛋白质印迹中的表观分子量，发现了在三各受试者组内和组间几个潜在的通用蛋白条带。
实施例3：表现阿尔茨海默病状的脑区中的IgG阳性神经元
死后的阿尔茨海默病脑中的Ig阳性神经元已有报道(Bouras et al.(2005)Brain Res Brain Res Rev.48,477-87；Clifford et al.(2007)Brain Res.1142,223-36；Deane and Zlokovic(2007)Curr Alzheimer Res.4,191-7；Franceschi etal.(1989)J Gerontol.44,M128-30；Kalaria(1999)Ann NY Acad Sci.893,113-125；Kulmala et al.(1987)Exp Aging Res13:67-72；Loeffler et al.(1997)Neurochem Res.22,209-14；Mooradian(1988)Neurobiol Aging.9,31-9；Nandyet al.(1975)J Gerontol.30,269-74；Stein et al.(2002)J Neuropathol Exp Neurol.61,1100-8)。在该实施例中，使用抗人IgG抗体的免疫组织化学用于检测23个阿尔茨海默病脑和14个年龄匹配的对照脑中是否存在IgG免疫阳性脑组分。在所有检查的脑中都发现了具有免疫标记的细胞体和树突干的IgG阳性神经元。阿尔茨海默病中的IgG阳性神经元远比相应的年龄匹配的对照脑中要丰富、广泛以及免疫染色强。在后者中，IgG阳性神经元常常为由较大范围完全无IgG阳性细胞的脑组织分离的散在个体细胞和小细胞簇。在阿尔茨海默病患的脑中，IgG阳性神经元在已知易受阿尔茨海默病相关病理改变影响的脑区(例如颞皮质、内嗅皮质以及海马)中特别丰富。在阿尔茨海默病和对照脑中，IgG免疫反应性一贯且优选地与锥体神经元相关，这些细胞在IgG免疫标记强度方面常显示显著的个体差异，有时在其临近区域存在的IgG阳性和阴性神经元。在海马神经元中注意到IgG免疫染色强度的相似差异。在锥体神经元中，在细胞体和主树突干的近区段中IgG免疫反应性最显著。散在于锥体细胞中的大多数较小神经元、星形细胞以及小胶质细胞为IgG阴性。在所检测的23个阿尔茨海默病脑的3个脑中，星形细胞和锥体神经元均为IgG阳性，但在年龄匹配的对照脑中未观察到这点。
实施例4：IgG免疫反应性和Aβ42沉积之间的关系
使用人IgG和Aβ42的特异性抗体探测死后阿尔茨海默病脑组织的切片。在显示轻度阿尔茨海默病病理的大脑皮质和海马的区域(即，具有隐蔽的神经元内Aβ42沉积物但几乎没有淀粉斑块的区域)中，Aβ42免疫阳性神经元也表现了强烈的IgG免疫染色。对两组连续切片进行免疫染色以揭示阿尔茨海默病大脑皮质中的Aβ42和IgG相对分布。在表现轻度阿尔茨海默病病理的区域中，IgG和Aβ42共定位于两种切片中出现的相同神经元。同样，在显示更进展的病理(通过神经元内的Aβ42沉积物和淀粉斑块增加来判断)的皮质区中，间质和神经元内的IgG量显著增加。除了锥体神经元内的富Aβ42物质的典型大核旁沉积物之外，这些细胞的主要树突干常常含有丰富的大小均一的Aβ42阳性小颗粒。这些结果证明了椎体神经元内的神经元内Aβ42沉积和IgG免疫标记之间的时空一致性。
实施例5：人血清抗体与活神经元的反应性
为了检测人血清抗体与活神经元表面的反应性(即，结合)，在有或无稀释的人血清的培养基中培养成年小鼠脑器官特征型(脑切片)培养物(MBOC)达72小时。在合适的条件下，MBOC保留成年脑组织结构达数周，显示含有内化和积累外源性可溶性Aβ42肽的神经元(Bahr et al.(1998)；Harris-White et al.(1998)；Malouf(1992)；Stoppini et al.(1991))。通过免疫组织化学，使用抗人IgG抗体检测人IgG与MBOC中的神经元的结合。人血清添加至培养基导致活成年小鼠神经元的强烈选择性IgG免疫标记，而未使用血清处理的对照显示没有固有的IgG免疫反应性。人血清处理的MBOC中的背景IgG免疫染色图表明树突和/或突触连接也可为IgG阳性。如上文所述的死后人阿尔茨海默病脑中所示，MBOC大脑皮质的锥体神经元一致地为免疫阳性最强的细胞。
实施例6：自身抗体对外源性Aβ42内化的影响
该实施例利用了如上文在蛋白质印迹中所证实的，人血清中的抗体与上文在免疫组织化学制备物中所示的脑组织中的啮齿动物蛋白的交叉反应特性。在存在或不存在以1:50稀释于无血清培养基中的个体人血清样品的情况下，使用100nM Aβ42处理MBOC细胞1、3、24、48以及72h，通过使用对于处理24小时的MBOC的图像分析确定神经元内Aβ42的相对量。仅使用100nM Aβ42处理24h的MBOC未显示人IgG免疫染色，仅显示最小的Aβ42免疫反应性。另一方面，当MBOC暴露于人血清自身抗体和Aβ42肽24h时，相对于仅使用Aβ42肽处理或仅使用血清处理相同时间的对照，锥体神经元选择性显示了胞内Aβ42积累的显著增加。在这些神经元内，Aβ42阳性物质定位于浓集于神经元核周体和近端树突干中的密集细胞质颗粒。在24h处理之后使用图像分析对MBOC中的神经元内Aβ42相对量的测量值揭示，将人血清添加至含有100nM Aβ42的培养基中导致Aβ42免疫反应性相对于仅使用Aβ42处理的细胞神经元增加许多倍。未观察到MBOC中显著细胞死亡和负担Aβ42的神经元丧失的形态学证据。
实施例7：纯化的靶向神经表面蛋白对外源性Aβ42内化的作用
使用可商购获得针对已知在神经元细胞表面丰富表达的两种神经元受体α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)和谷氨酸盐R2(GluR2)受体的抗体处理MBOC细胞24h。发现两种抗体有效增加神经元内Aβ42聚集，同样选择性地增加锥体神经元中的神经内Aβ42聚集，并且水平远高于仅使用Aβ42处理的培养物中所观察到的水平。为了探测IgG的神经元细胞表面反应性是否为提高外源性Aβ42内化所需，还使用针对常见的胞内蛋白β-微管蛋白的抗体连同100nM Aβ42处理MBOC。使用β-微管蛋白抗体处理导致神经元Aβ42聚集与仅使用100nM Aβ42处理相当。
实施例8：阿尔茨海默病诊断性自身抗体的鉴定
蛋白质印迹分析
如上文所述，使用蛋白质印迹分析对各人血清中脑反应性自身抗体的存在进行生物化学确认。另外，对上文所示人自身抗体具有免疫反应性的总大鼠脑蛋白用于与对来自患有阿尔茨海默病的患者、年龄匹配的神经学正常对照以及较年轻的健康个体的血清进行比较。基于单独估计的分子量，使用称为A.I.Solver(Silversoft Solutions)的模式识别计算机程序分析所产生的个体靶蛋白的分子量分布。
基于对自身抗体靶蛋白分子量分布特异性模式的识别，A.I.Solver能够在98%的测试次数中，区分源自阿尔茨海默病患者血清的蛋白质印迹与年龄匹配的对照和较年轻的健康受试者。该实施例证明了血液中存在结合脑蛋白靶抗原的阿尔茨海默病特异性蛋白抗体。接下来，蛋白微阵列平台用于鉴定可用于有效诊断阿尔茨海默病的特异性亚组自身抗体及其靶蛋白。
微阵列程序
用于鉴定诊断性抗体和证实蛋白微阵列诊断性功效的蛋白微阵列平台为Invitrogen’s
Figure BDA00002732721600551
Human Protein Microarray v5.0。该平台为含有用于蛋白相互作用筛选的数千纯化人蛋白的高密度蛋白微阵列。使用杆状病毒表达系统将每个人开放阅读框(ORF)表达为N-末端GST融合蛋白，从昆虫细胞纯化，并一式两份印于硝酸纤维素包被的载玻片上。使用Immune ResponseBiomarker Profiling应用程序，原因是其最适于诊断性需要。所有试剂和材料均直接购自Invitrogen。在所有时间均严格遵照所推荐的Invitrogen
Figure BDA00002732721600552
方案，其通过引用将全文并入本文。使用稀释(1:500)的人血清或血浆探测阵列。
微阵列扫描
使用推荐的Axon Genepix4000b显像仪对蛋白微阵列进行扫描。将各载玻片插入显像仪中，然后使用100%激光功率、635nm激发光波、PMT600以及5um像素尺寸进行扫描。通过将数据与获自Invitrogen的Genepix ArrayList(*.GAL)文件同步而从图像中提取数据。GAL文件描述了蛋白微阵列上所有点的位置和身份，通过Genepix Pro软件(Molecular Devices)用于生成含有阵列上所有特征的像素强度信息的文件。然后，Genepix Pro生成以仅文本电子表格格式列出微阵列上各蛋白点的所有像素强度数据的*.GPR(GenepixPixel Results)文件。将该GPR文件输入至Prospector中用于数据分析。
标准化
在通过使用Axon Genepix4000b显像仪扫描微阵列和使用Genepix Pro软件进行起始定量而获取各微阵列数据之后，对所产生的数据进行标准化以允许微阵列间的对比。为此，使用Invitrogen的专有软件Prospector，更特别地，Immune Response Biomarker Profiling Toolbox应用程序。将各微阵列的GPR文件输入至程序中，分析，并标准化为线性模型。
通过稳健回归(robust regression)，借助于迭代重加权最小二乘方程序，使用类似中值的M估计值进行数据与线性模型的拟合。线性模型使用对数转化信号来估计和校正差异。对于载玻片i(=1，…,ns,)上亚阵列j(=1，…,48)中蛋白特征k(=1，…,nf)的各点复制r(=1,2)，拟合下列模型：
yijkr=αi+βj+τk+εijkr
其中，yijkr是log2数值范围内所观察到的信号，α载玻片效应，βj是亚微阵列/封闭效应(包括印刷针效应)，τk是“实际”的蛋白特征信号(以不同浓度印刷的不同蛋白含量)，εijkr是误差，假定εijkr~N(0,σ2)。在使用对照蛋白估计这些效应的系数之后，各点原始数值范围中的标准化信号如下计算：
Sijkr=2^(yijkr-αi-βj)
在标准化之后，充分调整微阵列数据的误差和各差异，开始形式分析。诊断意义正是由该调整后的数据确定的。
数据分析
有多种可接受的测定微阵列荧光数据诊断意义的方法。为了确保本发明结果的再现性和准确性，使用三种独立的不同方法分三次分析数据。所选择的方法为可获得的最具可靠性和一致性的，并通常用于相似的研究中的方法。所述方法为：M-Statistical Prevalence、Nearest Shrunken Centroid Analysis以及Random Forest Decision-Making Trees。为了管理这些无偏统计定量方案中的各方案，分别使用Prospector,PAM和R’sRandom Forest。这些程序中的各程序评价蛋白微阵列数据以确定哪种蛋白对于诊断阿尔茨海默病最有意义。列表几乎精确地彼此反映，由此证明了蛋白微阵列可用作成功的诊断。统计方法、所涉及的程序以及所产生的结果在下文描述。
M统计分析
除了解释和标准化由Genepix Pro生成的原始荧光数据之外，还利用Prospector生成M-Statistics，而M-Statistics又用于评价各蛋白的诊断意义。简言之，M-statistics用于确定一组(例如，阿尔茨海默病或对照)中信号值大于该探针在比较组中观察到的最高蛋白信号值的测定的数量。通过下式给出与nx尺寸的组x相比尺寸ny的组y的M次序统计：
My i,above，between=Σ1{yk>x(i)+between}1{yk>above}
其中，x(i)是组x的第i大数值，above和between为计算参数。P值被计算为具有等于或大于Mi的M值的概率。Prospector选择具有最低P值的M统计量，并报告该Mmax值和次序，以及相应的P值和蛋白普遍性估计值。将数值呈现为Microsoft Excel工作手册格式的电子表格，并进行过滤以提供最有效的组差异指标，即，作为最佳诊断性标志物的蛋白。
PAM(微阵列预测分析)
另一种解释蛋白微阵列结果和生成蛋白意义的方法为PAM(微阵列预测分析)。PAM为用于使用最近收缩重心(nearest shrunken centroids)的类别预测的统计技术。其运行为Microsoft Excel宏，广泛用于表征微阵列结果(Tibshirani et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA99:6567-6572)。该程序用于鉴定最佳表征各类别和由此用作有意义的诊断指标的特定亚组荧光数据。简言之，该方法计算各类别的标准化重心。这是各类别的蛋白的平均荧光除以该蛋白的类别内标准差。通过阈值减少“收缩”重心，以减少误差和离群值影响。然后，将各新样品的微阵列荧光与各收缩的类别重心进行比较，其重心在平方距离上最接近的类别为该新样品的预测类别。使用该信息，PAM生成了按诊断意义次序呈现的一系列蛋白。
PAM用于生成一系列用于区分阿尔茨海默病血清与对照血清的前五十种最重要的蛋白，如表6所示。
表6
Figure BDA00002732721600571
Figure BDA00002732721600581
表6(续)
Figure BDA00002732721600582
Figure BDA00002732721600591
随机森林算法(Random Forest)
用于确证结果的第三种定量方法为随机森林算法：Random Forest。这是开放源分类算法，通过R运行，使用决策树集。使用数据的自展样品(bootstrapsample)构建这些分类树中的每一棵树，在各分割处，变量的候选物组为随机亚组。随机森林算法直接回复变量重要性的数个测量值，所述测量值与类别中变量的关联性相关。因此，在该情况下，其提供了每种蛋白对于合适的诊断的相对重要性的评估。
最可靠的测量值基于当树节点中的变量值随机置换时类别准确性的减少，这是变量重要性的测量值。变量重要性的另一种估计基于Gini杂质。每次在对于变量m进行节点分割时，两个下行节点的Gini杂质标准小于母节点。各森林中所有树的各单个变量的合计Gini减少给出了快变量重要性，这常与置换重要性测量非常一致。
将Genepix Pro和Prospector计算的微阵列上的各蛋白点的相对荧光单位值输入随机森林算法中。如对于最佳微阵列分析结果所描述的，使用R包和所有缺省设置进行实施预测模型。计算仅6.67%的平均袋外(Out-Of-Bag)误差，该算法能够基于上文所述评价方法快速评价蛋白重要性。
结果
使用三种不同的无偏倚的统计方法评价了微阵列数据中的各自身抗体个体的诊断重要性，它们几乎完美地相互反映。所产生的三个列表考虑相同自身抗体诊断的重要性，并赋予它们相似的重要性。所有三者所共有的结论赋予了结果很大的置信度。这些方法所测定具有可用作阿尔茨海默病指标的自身抗体的所有蛋白抗原列表示于下表7中。其中包括蛋白数据库识别号，开放阅读框号，各蛋白的常用名称，其疾病状态适应症，以及通过M-statistic计算的相关P值。
表7
Figure BDA00002732721600611
表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
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表7(续)
Figure BDA00002732721601022
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表7(续)
Figure BDA00002732721601032
表7(续)
Figure BDA00002732721601042
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表7(续)
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表7(续)
Figure BDA00002732721601062
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表7(续)
Figure BDA00002732721601072
表7(续)
Figure BDA00002732721601081
表7(续)
表7(续)
使用小亚组的鉴定的指示剂，可以高效诊断阿尔茨海默病。使用表4中描述的20个蛋白微阵列荧光数值将盲选样品分类为阿尔茨海默病或对照。使用下列方程式计算各诊断指标的阈值：
诊断阈值＝[(平均阿尔茨海默病荧光值)-(平均对照荧光值)/2]+(平均对照荧光值）
将任何给定诊断指标的荧光值超出该指标的阈值计为阳性结果。使用表4的抗原，在20种可能的诊断性指标中，等于或大于4个阳性结果高准确性地预测出样品是来自阿尔茨海默病患者。表4中20种可能的诊断性指标中，少于4种阳性结果高准确性地预测出样品来自健康对照(见图1)。具有该诊断逻辑的起始结果如下：
阿尔茨海默病(AD)与所有对照(使用表4的20个生物标记)
(见图1)
N=90(50个AD，40个对照)
总体误差率：4.44%
预测/实际 AD 对照
AD 50 4
对照 0 36
误差率 0.000 0.010
实施例9
阿尔茨海默病的诊断
选择由多元统计分析程序(Prospector，PAM，随机森林算法)鉴定为高重要性的20种抗体及其各自的抗原，该选择在单个平台良好进行。抗体列于表8中。
表8
Figure BDA00002732721601111
Figure BDA00002732721601121
使用这20种生物标志(列于表4和表8)和上文解释的简单诊断逻辑，可以以超过95%的效率区分阿尔茨海默病血清样品与对照血清样品。
还可使用表3的仅4种生物标志准确诊断。评价了这些诊断标志对于阿尔茨海默病、低简易智能状态测验(MMSE)阿尔茨海默病和高MMSE阿尔茨海默病的诊断效率。结果如下所示。
阿尔茨海默病(AD)与所有对照
随机森林算法：
N=90(50个AD，40个对照)
总体误差率：7.78%
预测/实际 AD 对照
AD 48 5
对照 2 35
误差率 0.040 0.125
微阵列的预测分析(PAM):
N=90(50个AD，40个对照)
总体误差率：7.8%
预测/实际 AD 对照
AD 50 7
对照 0 33
误差率 0.000 0.175
低MMSE阿尔茨海默病与所有对照
(低MMSE阿尔茨海默病样品具有<15的MMSE得分)
随机森林算法：
N=55(15个微心理状态检查阿尔茨海默病，40个对照)总体误差率：7.26%
预测/实际 AD 对照
AD 13 2
对照 2 38
误差率 0.133 0.050
微阵列的预测分析(PAM):
N=30(15个低MMSE阿尔茨海默病，15个对照)
总体误差率：9.9%
预测/实际 AD 对照
AD 13 1
对照 2 14
误差率 0.133 0.067
高MMSE阿尔茨海默病与所有对照
(高MMSE阿尔茨海默病样品具有≥15的MMSE)
随机森林算法：
N=75(35个高MMSE阿尔茨海默病，40个对照)
总体误差率：10.67%
预测/实际 AD 对照
AD 32 5
对照 3 35
误差率 0.086 0.125
微阵列的预测分析(PAM):
N=70(35个高MMSE阿尔茨海默病，35个对照)
总体误差率：12.8%
预测/实际 AD 对照
AD 28 2
对照 7 33
误差率 0.200 0.057
还使用表3和5所列的生物标志的组合(总共9个诊断性标志)评价了区分阿尔茨海默病和帕金森氏病的效率。结果如下所示。
阿尔茨海默病与帕金森氏病(PK)
随机森林算法：
N=79(29AD，29PK)
总体误差率：12.07%
预测/实际 AD PK
AD 25 3
PK 4 26
误差率 0.138 0.103
微阵列的预测分析(PAM):
N=58(29AD，29PK)
总体误差率：12.0%
预测/实际 AD PK
AD 24 2
PK 5 27
误差率 0.172 0.069
确定可使用表4的20种抗原以超过95%的准确性和使用表3的4种抗原以超过90%的准确性区分阿尔茨海默病和对照，然而，仅使用这4种指示剂不允许准确区分阿尔茨海默病与其他神经变性疾病(例如帕金森氏病)。准确区分需要包含表5的抗原。然而，实际上，这种区分通常是不必要的，原因是表现疑有阿尔茨海默病的患者具有记忆和认知缺陷，而患有早期帕金森氏病的患者最常显示震颤，并没有认知和/或记忆缺陷的主诉。
本文所引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。

Claims (20)

1.用于检测受试者的神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品；和
(b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。
2.用于诊断受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品；
(b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及
(c)如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为所述神经变性疾病。
3.用于鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品；
(b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及
(c)如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险。
4.用于生成受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体谱的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品；
(b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及
(c)生成存在于所述样品中的疾病诊断性自身抗体的受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体谱。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述神经变性疾病选自：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、孤独症、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述受试者是人。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述生物样品选自全血、血清、脑脊液、唾液和痰液。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中通过如下进行所述测定：在允许形成自身抗原与自身抗体免疫复合物的条件下，使所述样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测是否存在所述免疫复合物，其中存在所述免疫复合物则表明存在神经变性疾病特异性自身抗体，其中不存在所述免疫复合物则表明不存在神经变性疾病特异性自身抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述一种或多种自身抗原连接到基材。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种自身抗原为阵列形式。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述阵列为微阵列。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述基材为硝酸纤维素包被的载玻片。
13.一种基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。
14.根据权利要求13所述的基材，其上固定有可分别定位的多种自身抗原，所述自身抗原对神经变性疾病针对性自身抗体具有特异性。
15.根据权利要求13所述的基材，其包含多组自身抗原，其中每一组含有用于一种神经变性疾病的诊断性自身抗原。
16.根据权利要求13所述的基材，其中所述基材为载玻片或微珠。
17.一种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。
18.根据权利要求17所述的微阵列，其包含多组自身抗原，其中每一组含有用于一种神经变性疾病的诊断性自身抗原。
19.一种试剂盒，其包含神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原和用于检测所述自身抗原与含免疫球蛋白的生物样品中的自身抗体结合的工具。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述一种或多种自身抗原固定于基材上。
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