CN113281512B - Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途。Ptrh2蛋白对太赫兹波辐射具有敏感性，在太赫兹波作用下Ptrh2蛋白表达上调，神经元细胞线粒体功能增强。因此，通过检测在太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白的表达量变化，可有效地确定太赫兹波作用下可否造成神经元线粒体功能发生变化。

Description

Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的 用途

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途。更具体地，本发明提出了Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途、检测Ptrh2蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途、检测在太赫兹波作用下神经元线粒体功能的方法和调控神经元中Ptrh2蛋白表达的方法。

背景技术

太赫兹波是指频率在0.1太赫兹到10太赫兹范围的电磁波，波长在0.03毫米到3毫米范围，介于微波与红外之间。由于太赫兹波在电磁波谱中所处的特殊位置以及太赫兹波一系列独特的优良特性，国际科技界认为，太赫兹波可能引发科学技术的革命性突破。神经元是电磁辐射的敏感靶细胞，神经元因其功能特殊性，对能量变化极为敏感。线粒体是与能量代谢密切相关的细胞器，也是电磁辐射敏感靶点之一。

但是，目前太赫兹波辐射影响神经元线粒体功能的敏感蛋白缺乏。因此，迫切需要开发出一种敏感蛋白以提示太赫兹波辐射对神经元线粒体功能影响。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

在本发明的一个方面，本发明提出了Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途。

蛋白肽酰tRNA水解酶2(Peptidyl-tRNA hydrolase 2，Ptrh2)主要定位于线粒体，发挥氨酰-转运核糖核酸水解酶活性等功能，通过参与三磷酸腺苷结合、三磷酸腺苷依赖性3’-5’脱氧核糖核酸解旋酶活性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合、线粒体电子传递及泛醇-细胞色素c、神经系统发育等的生物学过程，引起神经细胞氧化磷酸化、坏死性凋亡等线粒体功能等改变。

发明人发现，Ptrh2蛋白对太赫兹波辐射具有敏感性，在太赫兹波作用下会导致Ptrh2蛋白表达上调，神经元细胞线粒体功能旺盛。因此，通过检测在太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白的表达量变化，可以有效地确定太赫兹波辐射可否造成神经元线粒体功能发生变化。

根据本发明的实施例，上述Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述Ptrh2蛋白表达上调时，所述神经元线粒体功能增强。发明人发现，在太赫兹波作用下，神经元中Ptrh2蛋白表达上调，线粒体功能增强。由此，通过检测太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白表达量变化，以便于确定神经元线粒体功能是否发生变化，例如线粒体功能是否增强。

根据本发明的实施例，所述Ptrh2蛋白表达上调时，所述神经元中三磷酸腺苷含量升高。发明人发现，在太赫兹波作用下，神经元中Ptrh2蛋白表达上调，神经元中三磷酸腺苷含量升高。由此，通过检测太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白表达量变化，以便于确定神经元线粒体功能是否发生变化，例如三磷酸腺苷含量是否升高。

根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率为20～40毫瓦，时间为20～40分钟。由此，在此条件下太赫兹波辐射神经元，使得Ptrh2蛋白表达上调，线粒体功能增强。

在本发明的另一方面，本发明提出了检测Ptrh2蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于确定在太赫兹波作用下的神经元线粒体功能。如前所述，发明人发现，在太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白表达上调，线粒体功能增强。由此，通过采用检测Ptrh2蛋白的试剂确定在太赫兹波作用下的神经元线粒体功能，当Ptrh2蛋白表达上调，则表明神经元线粒体功能增强。

需要说明的是，本发明对于“检测Ptrh2蛋白的试剂”的组成不作严格限定，主要能够定量或定性检测Ptrh2蛋白表达量即可，可以采用本领域常规试剂，例如进行免疫印迹电泳的试剂。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测在太赫兹波作用下神经元线粒体功能的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对神经元施加太赫兹波辐射，测定辐射后神经元中Ptrh2蛋白的表达量，其中，Ptrh2蛋白的表达上调，是所述神经元线粒体功能改变的指示。

如前所述，发明人发现，在太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白表达上调，线粒体功能增强。由此，通过测定太赫兹波作用下的神经元中Ptrh2蛋白的表达量，可以准确确定神经元线粒体功能。

根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率为20～40毫瓦，时间为20～40分钟。由此，在此条件下太赫兹波辐射神经元，可以使Ptrh2蛋白表达上调，线粒体功能增强。

根据本发明的实施例，Ptrh2蛋白的表达上调，是所述神经元中线粒体功能增强的指示。由此，利用通过检测太赫兹波作用下神经元中Ptrh2蛋白表达量变化，以便于确定神经元中线粒体功能是否增强。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种调控神经元中Ptrh2蛋白表达的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使太赫兹波辐射所述神经元。发明人发现，在太赫兹波作用下，神经元中Ptrh2蛋白表达上调。由此，可以通过使太赫兹波辐射神经元，以调控神经元中Ptrh2蛋白表达。

根据本发明的实施例，所述Ptrh2蛋白表达上调。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的大鼠原代海马神经元经过30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻的细胞超微结构，其中，

1A为假辐射组大鼠原代海马神经元超微结构(透射电镜，标尺＝500纳米)，

1B为30毫瓦太赫兹波辐射组辐射后大鼠原代海马神经元超微结构(透射电镜，标尺＝2微米)；

图2显示了根据本发明实施例的大鼠原代海马神经元经过30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻大鼠原代海马神经元的三磷酸腺苷含量；

图3显示了根据本发明实施例的30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻大鼠原代海马神经元差异表达的蛋白质聚类分析图；

图4显示了根据本发明实施例的30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻大鼠原代海马神经元Ptrh2免疫印迹检测和定量分析结果，其中，

4A为30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后大鼠原代海马神经元Ptrh2的免疫印迹结果，

4B为30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后大鼠原代海马神经元Ptrh2的免疫印迹定量分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1大鼠原代海马神经元分离培养

将新生24小时以内Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，用75％酒精浸泡大鼠消毒后，剥离脑组织并分离海马，消化与分散组织块，吹打制备成细胞悬液并接种在多聚赖氨酸包被的35毫米塑料培养皿中。隔天半量更换饲养液，培养7天。

实施例2对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射

将上述实施例1培养的大鼠原代海马神经元随机分为假辐射组和太赫兹波辐射组。采用军事医学研究院太赫兹波生物暴露系统对上述神经元进行均匀辐射，太赫兹波辐射源的功率密度为30毫瓦，时间为30分钟。假辐射组进行同等条件下的伪辐射。

实施例3大鼠原代海马神经元线粒体超微结构观察

于辐射后即刻离心收集神经元(1×10⁶/毫升)，迅速放入2.5％戊二醛固定2小时，1％锇酸后固定2小时，梯度乙醇和丙酮脱水，树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片(厚70纳米)，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄像。结果见图1。

由图1中结果可见，假辐射组神经元线粒体完整，结构基本正常，偶见线粒体嵴断裂；太赫兹波辐射组神经元线粒体数目增多、稍肿胀、基质结构完整、嵴断裂偶见。提示太赫兹波辐射后原代神经元细胞线粒体功能旺盛。

实施例4大鼠原代海马神经元三磷酸腺苷含量检测

用三磷酸腺苷检测裂解液稀释三磷酸腺苷标准溶液至适当的浓度梯度用于测定标准曲线。于辐射后即刻收集各组大鼠原代海马神经元，吸除培养液，按照每孔加入200微升裂解液的比例加入裂解液，裂解后4摄氏度，12000转每分钟离心5分钟，取上清。加100微升三磷酸腺苷检测工作液到检测孔或检测管内，室温放置5分钟，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。每组每时间点重复三次检测。在检测孔或检测管内加10～100微升样品或标准品，迅速混匀，至少间隔2秒后，立即用液闪仪测定相对光单位值。根据标准曲线计算出样品中三磷酸腺苷的浓度。结果见图2。

由图2中结果可见，与假辐射组相比，太赫兹波辐射组三磷酸腺苷含量显著升高(P<0.05)。表明太赫兹波辐射后神经元线粒体功能增强。

实施例5大鼠原代海马原代神经元蛋白质表达谱检测

5.1大鼠原代海马神经元总蛋白提取和定量

于辐射后即刻收集各组神经元至2毫升的离心管中，离心去上清，加入适量裂解缓冲液(7摩尔每升尿素，1.4摩尔每升硫脲，4％CHAPS)，涡旋混匀。14,000转每分钟4摄氏度离心20分钟，小心取出上清。采用Bradford法测定蛋白浓度，结果见表1。每管50微克蛋白分装后冻存于-80摄氏度。

表1蛋白样品浓度

组别	蛋白浓度(微克每微升)
		假辐射组	0.77
太赫兹波辐射组	0.87

5.2太赫兹波辐射后大鼠海马原代神经元蛋白组学检测

通过蛋白酶解、iTRAQ标记、高pH条件下的反相色谱分离、纳升级反相色谱-QExactive的蛋白质分析，进一步采用Uniprot中下载的大鼠蛋白质组全库，由Thermo Q-Exactive型质谱完成iTRAQ的质谱分析，产生的质谱原始文件采用Thermo公司的配套商用软件Proteome Discoverer2.2处理，最终获得大鼠原代海马神经元蛋白质表达谱。

直接提取Proteome Discoverer 2.1搜索后的结果中的不同label的定量值，去除有0(无定量值)的结果后，得到聚类分析的结果，结果见图3。由图3可见假辐射组(3个平行样)和太赫兹波辐射组(3个平行样)组内差别小，表明所制备样品的一致性较好；组间有一定差异，提示为差异蛋白质。

定量值在进行中值归一化后得到的结果，进一步进行perseuse归一化。由于样品的重复次数大于等于3次，因此直接采用t检验进行差异分析，卡方检测P值0.05，变化倍数1.2倍，得到差异蛋白的分析结果。结果发现，太赫兹波辐射后，显著上调的蛋白有38个，显著下调的蛋白有38个。

蛋白质组结果中Ptrh2表达差异及显著性见表2，其显示Ptrh2显著上调。

表2蛋白质表达谱中Ptrh2表达变化

实施例6蛋白质表达谱Ptrh2表达验证

提取各组辐射后即刻大鼠原代海马神经元总蛋白，二羧基二喹啉法检测样品中蛋白浓度。沸水煮沸15分钟进行蛋白变性，调整蛋白浓度后上样进行免疫印迹电泳，转膜2小时，10％脱脂奶粉封闭，一抗4摄氏度孵育过夜，二抗室温轻摇1小时，显影并摄像。

图4显示了免疫印迹方法检测大鼠原代海马神经元Ptrh2的表达情况。与假辐射组相比，太赫兹波辐射后大鼠原代海马神经元Ptrh2的表达显著升高(P<0.05)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.Ptrh2蛋白在检测太赫兹波作用下神经元线粒体功能中的用途，

其特征在于 ，所述Ptrh2蛋白的表达上调，是所述神经元中线粒体功能增强的指示；

所述太赫兹波的辐射功率为20～40毫瓦，辐射时间为20～40分钟。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Ptrh2蛋白表达上调时，所述神经元中的三磷酸腺苷含量升高。

3.一种检测在太赫兹波作用下神经元线粒体功能的方法，其特征在于，包括：

对神经元施加太赫兹波辐射，测定辐射后神经元中Ptrh2蛋白的表达量，

其中，所述Ptrh2蛋白的表达上调，是所述神经元线粒体功能增强的指示；

所述太赫兹波的辐射功率为20～40毫瓦，辐射时间为20～40分钟。

4.一种调控神经元中Ptrh2蛋白表达的方法，其特征在于，包括：使太赫兹波辐射所述神经元，所述Ptrh2蛋白的表达上调；

所述太赫兹波的辐射功率为20～40毫瓦，辐射时间为20～40分钟。

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