CN113281511B - CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途。CaMKIIδ蛋白对太赫兹波辐射具有敏感性,在太赫兹波作用下CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强。因此,通过检测在太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白的表达量变化,可有效地确定太赫兹波作用可否造成神经元突触可塑性发生变化。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途。更具体地,本发明提出了CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途、检测CaMKIIδ蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途、检测在太赫兹波作用下神经元突触可塑性的方法和调控神经元中CaMKIIδ蛋白表达的方法。
背景技术
作为电磁波谱中具有巨大潜力和价值的重要成员,太赫兹波及其技术飞速发展,在生物医学领域的基础和应用研究也日益广泛。基于太赫兹波和生物体之间存在的强相互作用,可望实现太赫兹波对生物大分子的精细调控,并由此引发生物领域的变革。神经元是电磁辐射的敏感靶细胞。突触可塑性是神经元功能发挥的神经生物学基础。然迄今,太赫兹波辐射引起神经元突触可塑性改变的敏感蛋白缺乏。因此,迫切需要开发出一种敏感蛋白以提示太赫兹波辐射引起神经元突触可塑性变化。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面,本发明提出了CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途。
钙/钙调蛋白依赖II型蛋白激酶亚基δ(Calcium/calmodulin-dependent proteinkinase type II subunit delta,CaMKIIδ)是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase II,CaMK II)的一个亚基,主要存在于神经细胞核、树突和突触前终末,CaMKIIδ可通过神经递质传递等增强突触可塑性,从而使神经元保持持久记忆,通过其基因的持续表达在记忆持久性和维持中起关键作用。因此,CaMKIIδ在突触可塑性增强及神经认知提升中具有重要作用和研究前景。
发明人发现,CaMKIIδ蛋白对太赫兹波辐射具有敏感性,太赫兹波辐射可导致CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强。因此,通过检测在太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白的表达量变化,可有效地确定太赫兹波作用下可否造成神经元突触可塑性发生变化。
根据本发明的实施例,上述CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途还可以具有下列附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述CaMKIIδ蛋白表达上调时,所述神经元的突触可塑性增强。发明人发现,在太赫兹波作用下,神经元中CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强。由此,通过检测太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白表达量变化,以便于确定神经元状态是否发生变化,例如神经元的突触可塑性是否增强。
根据本发明的实施例,所述CaMKIIδ蛋白表达上调时,所述神经元中的丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。发明人发现,在太赫兹波作用下,神经元中CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元中上述氨基酸含量升高。由此,通过检测太赫兹波辐射作用下神经元中CaMKIIδ蛋白表达量变化,以便于确定神经元突触可塑性是否发生变化,例如上述氨基酸含量是否升高。
根据本发明的实施例,所述太赫兹波辐射的功率为20~40毫瓦,时间为20~40分钟。由此,在此条件下太赫兹波辐射神经元,使得CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强,包括突触长度增加、细胞代谢旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。
在本发明的另一方面,本发明提出了检测CaMKIIδ蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例,所述试剂盒用于确定在太赫兹波作用下的神经元突触可塑性。如前所述,发明人发现,在太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强,包括突触长度增加、细胞代谢旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。由此,通过采用检测CaMKIIδ蛋白的试剂确定在太赫兹波作用下的神经元突触可塑性,当CaMKIIδ蛋白表达上调,则表明神经元的突触可塑性增强,包括突触长度增加、细胞代谢旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。
需要说明的是,本发明对于“检测CaMKIIδ蛋白的试剂”的组成不作严格限定,主要能够定量或定性检测CaMKIIδ蛋白表达量即可,可以采用本领域常规试剂,例如进行免疫印迹电泳的试剂。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种检测在太赫兹波作用下神经元突触可塑性的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:对神经元施加太赫兹波辐射,检测辐射后神经元中CaMKIIδ蛋白的表达量,其中,CaMKIIδ蛋白的表达上调,是所述神经元突触可塑性改变的指示。
如前所述,发明人发现,在太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强,包括突触长度增加、细胞代谢旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。由此,通过测定太赫兹波作用下的神经元中CaMKIIδ蛋白的表达量,可准确确定神经元突触可塑性变化。
根据本发明的实施例,所述太赫兹波辐射的功率为20~40毫瓦,时间为20~40分钟。由此,在此条件下太赫兹波辐射神经元,可以使CaMKIIδ蛋白表达上调,神经元的突触可塑性增强,包括突触长度增加、细胞代谢旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。
根据本发明的实施例,CaMKIIδ蛋白的表达上调,是所述神经元突触可塑性增强的指示。由此,利用通过检测太赫兹波作用下神经元中CaMKIIδ蛋白表达量变化,以便于确定神经元的突触可塑性是否增强,包括突触长度是否增加、细胞代谢是否旺盛,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量是否升高。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种调控神经元中CaMKIIδ蛋白表达的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:使太赫兹波辐射所述神经元。发明人发现,在太赫兹波作用下,神经元中CaMKIIδ蛋白表达上调。由此,可以通过使太赫兹波辐射神经元,以调控神经元中CaMKIIδ蛋白表达。
根据本发明的实施例,所述CaMKIIδ蛋白表达上调。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明实施例的大鼠原代海马神经元经过30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻的细胞突起形态变化,其中:
1A为假辐射组大鼠原代海马神经元突起形态(倒置相差显微镜,放大倍数为40×),
1B为30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元突起形态(倒置相差显微镜,放大倍数为40×),
1C为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元突起长度分析结果;
图2显示了根据本发明实施例的大鼠原代海马神经元经过30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻的细胞超微结构,其中,
2A为假辐射组大鼠原代海马神经元超微结构(透射电镜,标尺=500纳米),
2B为30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元超微结构(透射电镜,标尺=2微米);
图3显示了根据本发明实施例的大鼠原代海马神经元经过30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻的神经递质含量,其中,
3A为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元丙氨酸含量分析结果,
3B为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元谷氨酸含量分析结果,
3C为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元甘氨酸含量分析结果,
3D为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元蛋氨酸含量分析结果,
3E为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元酪氨酸含量分析结果,
3F为假辐射组和30毫瓦太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元缬氨酸含量分析结果,
图4显示了根据本发明实施例的30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻大鼠原代海马神经元差异表达的蛋白质聚类分析图;
图5显示了30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后即刻大鼠原代海马神经元CaMKIIδ免疫印迹检测和定量分析结果,其中,
5A显示了30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后大鼠原代海马神经元CaMKIIδ的免疫印迹结果,
5B显示了30毫瓦太赫兹波辐射30分钟后大鼠原代海马神经元CaMKIIδ的免疫印迹定量分析结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1大鼠原代海马神经元分离培养
将新生24小时以内Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司),用75%酒精浸泡大鼠消毒后,剥离脑组织并分离海马,消化与分散组织块,吹打制备成细胞悬液并接种在多聚赖氨酸包被的35毫米塑料培养皿中。隔天半量更换饲养液,培养7天。
实施例2对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射
将上述实施例1培养的大鼠原代海马神经元随机分为假辐射组和太赫兹波辐射组。采用军事医学研究院太赫兹波生物暴露系统对上述神经元进行均匀辐射,太赫兹波辐射源的功率密度为30毫瓦,辐射时间为30分钟。假辐射组进行同等条件下的伪辐射。
实施例3大鼠原代海马神经元突起长度和分支数量检测
采用倒置光学显微镜观察辐射后即刻各组神经元突起生长情况,并在每组随机选取10个视野拍照。采用Neuron J软件对细胞突起进行跟踪描绘,并统计分析其长度和分支数量。结果见图1。
由图1中结果可见,原代海马神经元胞体呈椭圆形,向四周长出突起,随着培养时间的延长,突起不断生长延长并产生次级分支及相互交织连接。与假辐射组相比,太赫兹波辐射组原代海马神经元突起长度明显增加(P<0.05)。表明太赫兹波辐射后神经元突触结构可塑性增加。
实施例4大鼠原代海马神经元超微结构观察
于辐射后即刻离心收集各组神经元(1×106/毫升),迅速放入2.5%戊二醛固定2小时,1%锇酸后固定2小时,梯度乙醇和丙酮脱水,树脂包埋,半薄切片定位后,制作超薄切片(厚70纳米),醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,透射电镜观察并摄像。结果见图2。
由图2中结果可见,假辐射组神经元胞核染色质均匀,细胞器完整,突触结构正常;太赫兹波辐射组胞核染色质均匀,突触结构基本正常、间隙清晰。提示太赫兹波辐射后神经元突触超微结构无明显影响。
实施例5大鼠原代海马神经元氨基酸类神经递质含量检测
于辐射后即刻,将各组神经元培养液吸出500微升加入到1.5毫升管中,3000转/分钟4摄氏度离心10分钟;取250微升上清到新的管中,置于-20摄氏度冰箱中保存,以上操作过程均在4摄氏度条件下完成。高效液相色谱检测神经递质,根据标准品峰面积和浓度计算神经递质含量。结果见图3。
由图3中结果可见,与假辐射组相比,太赫兹波辐射组丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、缬氨酸含量于辐射后即刻明显增加(P<0.01或P<0.001)。表明太赫兹波辐射可通过提升神经元兴奋性以增加突触可塑性,并可能引起学习记忆以及工作性记忆能力的提升。
实施例6大鼠原代海马原代神经元蛋白质表达谱检测
6.1大鼠原代海马神经元总蛋白提取和定量
于辐射后即刻,收集各组神经元至2毫升的离心管中,离心去上清,加入适量裂解缓冲液(7摩尔每升尿素,1.4摩尔每升硫脲,4%CHAPS),涡旋混匀。14000转每分钟4摄氏度离心20分钟,小心取出上清。采用Bradford法测定蛋白浓度,结果见表1。每管50微克蛋白分装后冻存于-80摄氏度。
表1蛋白样品浓度
组别 | 蛋白浓度(微克每微升) |
假辐射组 | 0.77 |
太赫兹波辐射组 | 0.87 |
6.2太赫兹波辐射后大鼠海马原代神经元蛋白组学检测
通过蛋白酶解、iTRAQ标记、高pH条件下的反相色谱分离、纳升级反相色谱-QExactive的蛋白质分析,进一步采用Uniprot中下载的大鼠蛋白质组全库,由Thermo Q-Exactive型质谱完成iTRAQ的质谱分析,产生的质谱原始文件采用Thermo公司的配套商用软件Proteome Discoverer2.2处理,最终获得大鼠原代海马神经元蛋白质表达谱。
直接提取Proteome Discoverer 2.1搜索后的结果中的不同label的定量值,去除有0(无定量值)的结果后,得到聚类分析的结果,结果见图4。
由图4可见假辐射组(3个平行样)和太赫兹波辐射组(3个平行样)组内差别小,表明所制备样品的一致性较好;组间有一定差异,提示为差异蛋白质。定量值在进行中值归一化后得到的结果,进一步进行perseuse归一化。由于样品的重复次数大于等于3次,因此直接采用t检验进行差异分析,卡方检测P值0.05,变化倍数1.2倍,得到差异蛋白的分析结果。结果发现,太赫兹波辐射后,显著上调的蛋白有38个,显著下调的蛋白有38个。
蛋白质组结果中CaMKIIδ表达差异及显著性见表2,其显示CaMKIIδ显著上调。
表2蛋白质表达谱中CaMKIIδ表达变化
实施例7蛋白质表达谱CaMKIIδ表达验证
提取各组辐射后即刻大鼠原代海马神经元总蛋白,二羧基二喹啉法检测样品中蛋白浓度。沸水煮沸15分钟进行蛋白变性,调整蛋白浓度后上样进行免疫印迹电泳,转膜2小时,10%脱脂奶粉封闭,一抗4摄氏度孵育过夜,二抗室温轻摇1小时,显影并摄像。CaMKIIδ免疫印迹表达结果见图5。
图5显示了免疫印迹方法检测大鼠原代海马神经元CaMKIIδ的表达情况。与假辐射组相比,太赫兹波辐射后大鼠原代海马神经元CaMKIIδ的表达显著升高(P<0.05)。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (4)
1.CaMKIIδ蛋白在检测太赫兹波作用下神经元突触可塑性中的用途,
其特征在于 ,所述CaMKIIδ蛋白表达上调时,所述神经元的突触可塑性增强;
所述太赫兹波的辐射功率为20~40毫瓦,辐射时间为20~40分钟。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述CaMKIIδ蛋白表达上调时,所述神经元中的丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量升高。
3.一种检测在太赫兹波作用下神经元突触可塑性的方法,其特征在于,包括:
对神经元施加太赫兹波辐射,检测辐射后神经元中CaMKIIδ蛋白的表达量;
其中,CaMKIIδ蛋白的表达上调,是所述神经元突触可塑性增强的指示;
所述太赫兹波的辐射功率为20~40毫瓦,辐射时间为20~40分钟。
4.一种调控神经元中CaMKIIδ蛋白表达的方法,其特征在于,包括:使太赫兹波辐射所述神经元,所述CaMKIIδ蛋白表达上调;
所述太赫兹波的辐射功率为20~40毫瓦,辐射时间为20~40分钟。
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