CN117452001A - 基于单分子免疫检测技术的试剂盒 - Google Patents

基于单分子免疫检测技术的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于辅助诊断阿尔茨海默病（AD）的基于单分子免疫检测技术的试剂盒，具体公开了β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白及CD146蛋白的检测试剂在制备诊断阿尔茨海默病的试剂盒中的应用。本发明的试剂盒能够以血液（全血、血浆、血清等）、唾液、泪液等非脑脊液为样本，实现了AD的早期诊断筛查，适用于全自动单分子免疫分析仪，能够良好地应用于AD筛查中。

Description

基于单分子免疫检测技术的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于单分子免疫检测技术的用于阿尔茨海默病辅助诊断的试剂盒。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种原因不明的慢性神经退行性病变，其病理改变主要表现为β-淀粉样蛋白的沉积导致老年斑，Tau蛋白异常磷酸化导致神经纤维缠结，神经元和突触的丢失，临床表现为进行性认知功能减退和非认知性神经精神症状。目前AD的主要诊断手段是神经心理学量表、影像学检查、生物标志物检测等。神经心理学量表评估受试者的认知功能，现主要采用简易精神状态量表、特利尔认知评估量表、长谷川痴呆量表等量表，但由于受试者教育程度及个人理解能力不同，测试结果浮动大；神经影像学检测主要有磁共振成像（MRI）、正电子发射（PET）、计算机断层扫描（CT）等，都也是AD诊断的有力证据，CT可以直接显示AD患者脑萎缩现象，但由于软组织分辨力不佳，使其价值有限，MRI和PET价格昂贵，不适合人群筛查。
对AD的精确和早期诊断有利于患者接受早期医疗干预，从而为延缓AD的发作或疾病进展提供了可能性。脑脊液Aβ42/Aβ40（或脑脊Aβ2）和AβPET均与脑内Aβ病理相关，被认为是AD最早的生物标志物。然而，脑脊液分析在诊断期间通常不是一个必选项，因为需要进行侵入性腰椎穿刺。因此，在中国，迫切需要使用具有非侵入性，易得性且具有成本效益的方法来诊断AD。
目前，在我国境内上市的阿尔茨海默诊断试剂盒较少，其中国内有深圳安群生物（AD7C-NTP）、β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42)、磷酸化tau-181蛋白）3个基于传统的酶联免疫法的诊断试剂盒产品、南京诺尔曼基于化学发光方法的相关神经丝蛋白1个诊断产品、湖南乾康基于胶体金免疫层析法的尿液β淀粉样蛋白的1个检测试剂盒。
在文献报道方面，专利文献1报道了一种认知症诊断用生物标志物，其将脂肪酸结合蛋白（FABP）家族作为指标用于神经系统变性疾病的诊断。专利文献2报道了一种诊断阿尔茨海默病的联检试剂盒，其将磷酸化Tau蛋白、血液蛋白或DNA分子标志物中的至少两种用于阿尔茨海默病的检测，通过免疫检测和分子检测两个维度进行联合检测。专利文献3报道了用于阿尔茨海默症早期诊断的试剂盒，其基于化学发光法对血清和血浆中T-Tau、p-Tau-181、p-Tau-217、p-Tau-231进行检测。专利文献4涉及诊断阿尔茨海默病的生物标志物和装置，其中的体液生物标志物选自由脑脊液P-tau，脑脊液Aβ42/Aβ40和血浆P-tau组成的组中的一种或多种，所述装置包括：输入模块，用于输入受试者的临床检测指标，所述临床检测指标包括血浆生物标志物、关键生理指标和核磁共振成像测量；机器学习模块，用于筛选最佳模型，其中所述机器学习利用逐步向后回归和赤池信息准则来筛选最优模型指标；模型确定模块，用于量化ROC曲线下面积（AUC），并使用DeLong统计数据确定AUC的差异。
单分子免疫检测（SMD）是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性和较高的检测灵敏度。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中（参见专利文献5）。
具体而言，专利文献5为本申请发明人的在先申请，涉及利用具有特定粒径（180~400nm）的原位信号增强纳米粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其中，使用了原位信号增强纳米粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI蛋白、IL-6蛋白、DNA等进行了单分子免疫检测，获得了较低的检测下限。
现有技术文献
专利文献1：CN115667927A；
专利文献2：CN114324890A；
专利文献3：CN114034872A；
专利文献4：CN115201495A；
专利文献5：CN111771126B。
发明内容
发明所要解决的课题
如前文所述，现有技术中报道了一些诊断阿尔茨海默病的单检或联检试剂盒，但基本均是基于传统免疫检测技术、例如放射方法、酶联免疫方法、荧光免疫方法、流式荧光法、胶乳比浊法、生化法、免疫层析法、化学发光方法等来进行检测的试剂盒，这就导致了其灵敏度不够优异。考虑到针对阿尔茨海默症的有些生物标志物在血液（如血清、血浆）中的浓度较低，因而上述传统方法并不能满足要求，容易导致诊断准确性的下降。另外，上述专利文献1~4中虽然涉及了多种不同生物标志物的组合在阿尔茨海默病检测中的应用，但精准度仍有改进的空间。
鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种以较高的特异性和灵敏度实现对阿尔茨海默病的辅助诊断的联检试剂盒及相关应用。
用于解决课题的手段
申请人对能够良好地应用于阿尔茨海默病辅助诊断的联检试剂盒进行了深入研究，发现由β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和CD146蛋白构成的标志物组合能够以较高的准确度用于阿尔茨海默病的辅助诊断，并且还发现了基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对CD146蛋白的抗体的试剂盒能够以较高的灵敏度和特异性用于阿尔茨海默病的辅助诊断。需要说明的是，虽然现有技术中涉及了β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白单独作为生物标志物在阿尔茨海默病的辅助诊断试剂盒中的应用，但尚未报道过上述三种标志物的组合在AD的辅助诊断中的应用，更未提及过基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的包含针对上述三种标志物的检测试剂的试剂盒。
本申请的一个技术方案如下。
基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的试剂盒，其用于诊断阿尔茨海默病，特征在于，其包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对CD146蛋白的抗体。
众所周知，在试剂盒的注册申报时需要注明所依托的检测技术，这是因为试剂盒所基于的检测技术直接决定了其组成，例如若为基于ELISA的AD试剂盒，则其中必然包含酶等，若为基于化学发光技术的AD试剂盒，则其中必然包含化学发光剂。也即，试剂盒所基于的技术对其保护范围有限定作用，上述方案中的“基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术”这一特征意味着本发明的试剂盒中不会包含酶、化学发光剂等其他免疫检测方法所特有的试剂。
优选地，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42。
优选地，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau 217。
优选地，其还包含原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子含有荧光材料和载体，且粒径为180～350nm。
优选地，其中，所述载体为聚乙二醇、二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、量子点类发光材料、或半导体聚合物荧光材料。
优选地，其中包含的抗体由针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对CD146蛋白的抗体组成，试剂盒中还包含缓冲体系，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液中包含10mM～50mM的PBS、0.1g～2.0g的动物血清白蛋白、0.06mL～0.50mL的非离子表面活性剂、0.1g～1.0g的无机碱金属盐、0.01mL～0.10mL的生物防腐剂、和无菌蒸馏水。
本发明还涉及生物标志物的检测试剂在制备用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标志物是由β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和CD146蛋白构成的组合。
优选地，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau 217。
本发明还涉及用于诊断阿尔茨海默病的单分子免疫检测系统，其包含上述的试剂盒、和光学成像设备，所述光学成像设备包含光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
本申请中的粒径使用扫描电子显微镜（SEM），以在1个视野中可观察到约100个原位信号增强粒子的倍率来观察粒子，用卡尺测定随机选择的50个含荧光探针和载体的原位信号增强粒子的最长直径，求出该值的数均值，将其作为平均粒径。
本发明的有益效果在于，本发明的试剂盒采用β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和CD146蛋白这三种标志物联检的方式以提高阿尔茨海默病早期诊断和筛查的特异性及灵敏度；采用以计数为特征的单分子免疫检测技术，从而实现更高的检测灵敏度、和稳定性。进一步地，通过选择Aβ-40和Aβ-42作为β淀粉样蛋白、选择p-tau 181和p-tau 217作为磷酸化Tau蛋白、并选择CD146蛋白，以这五种特定标志物为指标，能够获得更好的检测准确性，而且，申请人意外地发现，这五种生物标志物能够使用基本相同的缓冲体系和信号放大体系，这样极大地降低了试剂盒的制备难度并减少了试剂种类，提高了试剂盒的易用性，这是专利文献1~4均不具备的优点。进一步地，通过在试剂盒中使用特定粒径的包含荧光材料和载体的原位信号增强粒子作为信号放大材料，能够特别合适地用于上述特定标志物组合的检测，同时实现这些标志物的单分子免疫检测。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
在本说明书中，受试者的“生物样本”并未特别限定为源于受试者的生物样本，宜为对受试者造成创伤较小的生物样本，可举出血液、血浆、血清、唾液、尿液、泪液、汗液等很容易从生物体上采集的生物样本，髓液、骨髓液、胸腔积液、腹腔积液、关节积液、眼房水、玻璃体液、淋巴液等比较容易采集的生物样本，以及组织活检等组织样本。在一些实施方式中，生物样本由体液所构成，该体液从由血液（全血）、血浆、血清、唾液、尿液、髓液、骨髓液、胸腔积液、腹腔积液、关节积液、泪液、汗液、眼房水、玻璃体液及淋巴液所构成的组中选择。使用血液、血清时，按照常用方法采集受试者血样，未经预处理即可直接或分离液体成分后进行分析，制备试样。本发明以蛋白质作为检测对象，必要时也能使用抗体柱、吸附剂柱或旋转柱等，预先分离去除高分子量的蛋白质组分等。需要说明，本发明的样品可以未经过囊泡（包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体、肿瘤小泡以及其他各种EV亚群）的富集或提取而直接使用。
本说明书中，β淀粉样蛋白（amyloid β-protein）是由淀粉样前体蛋白经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽，在神经细胞内、外聚积均可引起毒性反应，导致神经元变性和死亡。人体内Aβ最常见的亚型是Aβ1-40和Aβ1-42。
本说明书中，磷酸化Tau蛋白是具有至少一个被磷酸基团修饰的氨基酸残基的tau蛋白。一般认为Tau包括多达85个与磷酸化相容的氨基酸残基。通常，磷酸基是翻译后修饰，并且可以在氨基酸残基的侧链上结合。磷酸化氨基酸残基可以是例如丝氨酸（S）、苏氨酸（T）或酪氨酸（Y）残基、或者其组合。例如，p-tau 181是tau蛋白在第181位苏氨酸位点磷酸化后的蛋白，p-tau 231是tau蛋白在第231位苏氨酸位点磷酸化后的蛋白，p-tau 217是tau蛋白在第217位苏氨酸位点磷酸化后的蛋白，p-tau 199是tau蛋白在第199位苏氨酸位点磷酸化后的蛋白。本文的磷酸化tau蛋白可以是沉积的或可以是未沉积的，可以是可溶的。磷酸化tau蛋白可以是三重复tau、四重复tau或其组合。在一些实施方案中，磷酸化tau蛋白可包含三重复tau与四重复tau的混合物。磷酸化tau蛋白可以是纤丝的，例如作为神经纤维缠结（NFT）。NFT可发现于神经元的树突状室中。本发明的磷酸化tau蛋白可以位p-tau 181、p-tau 231、p-tau 217、p-tau 199、p-tau 202、p-tau 404或p-tau 205中的至少一种。
本说明书中，CD146又称黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM）或细胞表面糖蛋白MUC18，是一种单链的膜贯通性糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族（Igsf）成员，与许多细胞黏附分子有同源性。CD146可在血管壁组分细胞中高表达，包括血管内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞。MCAM作为黏附分子中的一员，通过与其配体相互作用，介导细胞间及细胞与基质间的作用是黏附分子的基本功能特征。最近的研究表明CD146在多种细胞生理过程中表现活跃，包括发育、信号转导、细胞迁移、间充质干细胞分化、血管生成和免疫应答。
本发明所述的抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体、羊驼源抗体中的一种或多种。
既可以为单克隆抗体，也可以是普通生殖细胞产生抗体之外的其他方法所产生的抗体）、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的抗体）、动物抗体（例如但不限于：鸟类（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类（例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等）、或者非人灵长类（例如，猴子、黑猩猩等）、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv（“scFv”）、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F（ab’）片段、F（ab’）2片段等，优选单/多克隆的鼠/兔抗。另外，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、任何类别（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或任何亚类的蛋白分子，优选IgG。
来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体的实例包括：产生在动物血液中的抗体、由杂交瘤产生的抗体、以及由转染有表达载体的宿主产生的抗体（所述表达载体包含由基因工程技术得到的抗体基因），利用最优抗体的基因在CHO细胞工厂大量生产的抗体，或者利用产生人抗体的抗基因小鼠直接产生的人抗体，等等。单克隆抗体和多克隆抗体可以利用本领域技术人员已知的方法来生产，也可以购买市售品。
本发明的原位信号增强粒子是在原位（in-situ）将荧光信号增强至能够被常规光学成像设备检测到的水平的材料，其含有荧光材料和载体这两部分。
所述原位信号增强粒子中，载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的荧光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性；为常规荧光显微镜实现单分子免疫检测提供可能性，如果没有载体则无法实现单分子免疫检测。所述载体按照材料分类，可以为聚乙二醇、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺中的一种或多种。所述载体按照结构分类，可以为中空结构、核壳结构、多孔结构、合金结构以及水凝胶结构中的一种或多种。其中，从使荧光材料均匀分布、使荧光材料的亮度高的观点考虑，载体优选为聚乙二醇。
所述原位信号增强粒子中的荧光材料也是实现单分子免疫检测所必须的。所述荧光材料可以为荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、聚集诱导发光材料、半导体聚合物荧光材料以及上转换纳米粒子中的一种或多种。荧光材料优选为荧光素类（如异硫氰酸荧光素）、罗丹明类（如罗丹明绿、罗丹明B等）、香豆素类、量子点类（如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe）、稀土元素（如Eu、Ce）及其配合物等。所述荧光材料通过共价修饰、螯合作用、空间包裹、疏水作用以及静电吸附作用中的一种或多种而吸附或包裹于载体表面或内部。需要说明，从有利于光学成像识别和提高灵敏度的观点考虑，优选的是，荧光材料被均匀地包裹于载体的内部。
本申请中，原位信号增强粒子优选为聚乙二醇包裹量子点而成的荧光粒子（有市售品）、二氧化硅包裹荧光染料分子（如荧光素）而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹荧光染料分子（如荧光素）而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹量子点而成的荧光粒子、及聚苯乙烯包裹稀土元素或稀土鳌合物而成的荧光粒子等。
本发明中，原位信号增强粒子的粒径需要控制在180~350nm范围内，例如为190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm。若原位信号增强粒子的粒径小于180nm，例如150nm，则在常规光学成像设备中检测不到任何信号，若粒径大于350nm，例如为360nm，则检测灵敏度无法满足要求，难以达到临床所要求的灵敏度。需要说明的是，所述粒径可以是一次粒径，也可以是二次粒径。所述二次粒径是指一级颗粒与二级颗粒团聚后形成的粒径。原位信号增强粒子的粒径可以通过调节荧光材料与载体的质量比、反应温度、反应时间、搅拌的转速以及溶剂的用量等参数来控制。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面可以修饰有一定长度的连接臂，所述连接臂包括多碳直链、多碳支链、聚合物链、肽链、蛋白质。所述连接臂的长度优选为180~350nm，进一步优选为2~20nm，最优选为5~10nm。
本说明书中所称的单分子计数，是指针对经原位信号增强粒子标记的待检蛋白，通过对单个分子进行计数的方式而非测定溶液整体的荧光强度的方式来测定蛋白的浓度。
本发明的试剂盒是基于双抗夹心法的试剂盒，其中的缓冲液可以是用于标记有原位信号增强粒子的检测抗体的缓冲液，也可以是用于与磁珠等固相载体结合后的捕获抗体的缓冲液，优选为用于标记有原位信号增强粒子的检测抗体的缓冲液。具体而言，吸取该缓冲液加入至装有经洗涤的标记工作液的离心管中而使标记工作液分散，之后保存待用。故该缓冲液又可以称为标记分散液。申请人分析，通过采用上述的特定组成和浓度的缓冲液对特定的标记工作液（也即，包含标记有特定原位信号增强粒子的检测抗体的液体）进行分散，能够使得本发明中使用的特定粒径的原位信号增强粒子能够稳定地存在而不至于过度聚集，避免荧光淬灭的产生，从而能够实现较高的灵敏度。另外，还推测上述特定组成和浓度的缓冲液与针对Aβ-40、Aβ-42、p-tau 181、p-tau 217、和CD146蛋白的抗体的相容性较好，保证了体系的稳定性，进而也有助于检测灵敏度和保存稳定性的提高。
如前文所述，本发明的另一个显著的优点在于缓冲体系的通用性，通过选择β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和CD146蛋白、特别是Aβ-40、Aβ-42、p-tau 181、p-tau 217、和CD146蛋白作为阿尔茨海默病的诊断标志物，从而能够共用一组缓冲体系，这样能够降低试剂盒的制备难度并减少了试剂种类，提高了试剂盒的易用性，这是专利文献1~4均不具备的优点。
本发明中的上述缓冲液中，非离子表面活性剂优选为吐温-20，浓度优选为0.08mL～0.20mL（每100mL缓冲液中）。无机碱金属盐优选为氯化钠，浓度优选为0.5g～0.8g。动物血清白蛋白优选为牛血清白蛋白，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为0.4g～0.6g。生物防腐剂优选为proclin-300，且在每100mL缓冲液中，其体积为0.03mL～0.06mL。本发明中的每100mL上述缓冲液优选还包含2g～10g的海藻糖，更优选包含4g～6g的海藻糖。还需说明，本发明中的上述缓冲液不包含现有的缓冲体系中经常包含的Tris碱、尿素、三羟甲基氨基甲烷、纤维素盐、纤维素衍生物、叠氮钠或甘油。另外，上述缓冲液也不包含酶稳定剂、明胶、氯化锌、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、酪朊酸钠和甘露醇等。更进一步优选地，本发明中的缓冲液由PBS、非离子表面活性剂、无机碱金属盐、动物血清白蛋白、生物防腐剂、和无菌蒸馏水组成、或者由PBS、非离子表面活性剂、无机碱金属盐、动物血清白蛋白、生物防腐剂、海藻糖和无菌蒸馏水组成。
本发明中，光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜（若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜）。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。
在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包CCD（Charge Coupled Device，电荷耦合装置）或CMOS（Complementary Metal-OxideSemiconductor，互补金属氧化物半导体）中的一种或两种。
本申请通过采用特定的检测体系，从而对光学成像设备的要求低，为常规的光学成像设备（即未突破光学衍射极限的光学成像设备）即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。
本申请中，各蛋白浓度的计算方式有单分子计数模式和荧光强度积分模式这两种。其中，就所述单分子计数模式而言，直接对生成的图像中的由原位信号增强纳米粒子形成的亮斑个数进行分析和统计，通过亮斑个数直接或间接换算为蛋白在样品中的浓度信息。所谓“直接换算为蛋白在样品中的浓度信息”，是指绝对定量，也即，无需标准曲线校正即可换算为浓度信息。所谓“间接换算为蛋白在样品中的浓度信息”，是指通过亮斑个数和标准曲线（或校正参数）换算为浓度信息。就所述荧光强度积分模式而言，对生成的图像中的由原位信号增强纳米粒子形成的亮斑面积进行统计和积分，通过将积分结果除以特定参数，例如平均每个原位信号纳米粒子所形成的平均亮斑面积或亮斑面积相关变量（例如幂方、开方以及多项式等），从而换算得到原位信号增强纳米粒子的近似个数，再将该数值换算为蛋白在样品中的浓度信息。其中，平均亮斑面积是通过在较低浓度下对单个分子的亮斑面积进行统计并取平均值而得到的。从获得更大的检测动态范围的方面考虑，重要的是，在低浓度区间使用单分子计数模式、并在高浓度区间使用荧光强度积分模式，然后将这两种模式下绘制的标准曲线合并，从而绘制完整的标准曲线。需要说明，上述低浓度与高浓度的分界线一般为一个磁珠表面上结合有超过一个的待测分子时的浓度，也可以根据标准曲线拟合结果优选为一个磁珠表面上平均结合有0.5个待测分子时的浓度或2个待测分子时的浓度。
本发明中，使用本申请人研发的AST-Dx90、AST-Sc-Ulti超灵敏单分子免疫检测仪、AST-Sc-Lite单分子免疫检测仪或AST-Sc-Semi超灵敏单分子免疫检测仪进行实验，优选使用AST-Sc-Ulti超灵敏单分子免疫检测仪进行。
实施例
以下，举出实施例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。
1、蛋白质的检测方法
（1）、原位信号增强纳米粒子的粒径和变异系数的测定
以聚乙二醇负载荧光材料、苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物负载荧光粒子、二氧化硅负载荧光粒子为例，将各原位信号增强粒子用水稀释1000倍，然后取100μL滴加在洁净硅片表面，晾干，使用小型溅射仪在其表面溅射沉积5nm的铂，使用SEM（日本日立高新技术公司制SU3900）进行成像分析，求出粒径。
粒径的变异系数通过下式来计算。
粒径的变异系数（CV值）=粒径的标准偏差/平均粒径
以聚丙烯酰胺负载荧光粒子为例，用纯水将得到的聚丙烯酰胺荧光纳米粒子稀释1000倍，使用马尔文粒度分析仪（Zetasizer Nano S90）测定粒子的粒径。
（2）、单分子成像
使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。
（3）、标准曲线绘制方法
本申请中，联合使用单分子计数模式与荧光强度积分模式，具体实施方法如下：
在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；
当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。
具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为“近似单分子数量”，从而进行标准曲线绘制。
最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。
（4）、原位信号增强粒子的制备
以聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下：将聚乙二醇和荧光材料以规定的比例置于有机溶剂中，搅拌并微热，将该液体滴入含表面活性剂如Pluronic F-127的水溶液中，超声而形成乳液，再次与含表面活性剂的水溶液混合，磁力搅拌后蒸发除去有机溶剂，离心后洗涤，得到包埋有荧光材料的以聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子。也可以使用市售品，如西安齐悦生物定制的特定粒径的PEG包裹量子点荧光材料。
当载体为二氧化硅、或聚丙烯酰胺时，原位信号增强粒子的制造方法可以参见专利文献1中实施例的记载。当载体为苯乙烯时，原位信号增强粒子可以参照本领域常见的方法来合成（例如可参见CN102676157A）。
2、数据集和统计方法。
2.1、研究的数据集
从北京招募受试者（n=36例，其中AD患者17例，健康对照组19例），用来分析蛋白质的差异。
AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会（NIA-AA）诊断标准。此外，根据脑脊液P-tau/Aβ42（临界值取0.14）的比值确定AD和正常对照，该值是根据北京宣武医院贾龙飞教授课题组发表的数据计算得出的，与其他研究报道一致（参见Jia Let al. Concordance between the assessment of Abeta42, T-tau, and P-T181-tauin peripheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinal fluid.Alzheimers Dement. 2019;15:1071-80）。根据ATN框架，低水平的脑脊液Aβ42是AD关键的病理改变。因此使用了已经报道的脑脊液Aβ42临界值500pg/ml作为另一个确定AD和正常对照的标准。所有受试者或其法定监护人均已取得充分知情并签署书面同意书。本研究获得医院机构审查委员会的批准。
2.2、参与者特征
参与者特征如下所示，下表1列出了研究对象的特征。
表1 参与者特征
特征 对照（n=19） AD（n=17）
年龄，平均（SD） 66.4（2.9） 68.3（3.5）
受教育年限，平均（SD） 9.6（2.4） 10.7（3）
男性，数量（%） 9（47%） 8（47%）
ApoE ε4阳性（%） 5（26%） 6（35%）
MMSE评分（SD） 26.8（0.4） 16.9（1.0）
Aβ42（pg/mL），平均（SD） 820.3（90.3） 325.1（106.2）
P-tau（pg/mL），平均（SD） 60.6（25.0） 124（27.3）
P-tau/Aβ，平均（SD） 0.074（0.03） 0.38（0.17）
注：年龄、受教育年限、和MMSE的值以平均值（标准差）表示。缩写：ApoE ε4，apolipoprotein ε4；MMSE，简易精神状态检查；SD，标准差；*P < 0.05与对照组相比。
如上表所示，在上述数据集中，AD组和对照组在年龄和性别方面没有观察到显著差异，而携带ApoE ε4人数比例、MMSE评分、脑脊液Aβ42和P-tau均有显著差异（P＜0.05）。
3、蛋白的提取与分析。
3.1脑脊液收集和检测。
依照国际指南收集脑脊液标本，简单地说，受试者在清晨空腹（禁食12小时）状态下取左侧卧位，选择L3-L5椎间隙作为穿刺部位。用防止损伤的20号穿刺针收集15ml脑脊液，于室温下2,000 × g离心10min，依据已经推出的标准来检验Aβ42和P-tau。需要说明，此处的脑脊液采集是为了通过前文所述的指标来确认是否为AD患者。
3.2血浆收集。
采集所有受试者的清晨空腹（禁食12小时）静脉血20ml，提取血浆，作为样品送下一步的蛋白水平检测。
3.3 蛋白水平检测。
Aβ40、Aβ42、p-tau 181、p-tau 217、和CD146的浓度采用本申请人研发的单分子免疫试剂盒测定，所有测定均在同一台AST-Sc-Ulti超灵敏单分子免疫检测仪上进行。所述试剂盒包含针对Aβ40、Aβ42、p-tau 181、p-tau 217、和CD146各自的捕获抗体和检测抗体、原位信号增强粒子（聚乙二醇包裹ZnO量子点，粒径250nm）、单一缓冲液（具体见本申请说明书内容部分）、配套说明书及标准品、质控品。
3.4 统计分析
按照文献CN114324890A的方法，把上述相关标志物的浓度进行自然对数转换，经Logistic回归分析（用Medcalc软件进行），得到回归方程，通过回归方程，同时分析得到相应的AUC值，特异性和灵敏度。结果如表2所示。
表2
标志物名称 阿尔茨海默和健康比对AUC 特异性（%） 灵敏度（%）
Aβ40 0.85 90 82
Aβ42 0.86 90 81
p-tau 181 0.78 90 68
p-tau 217 0.80 90 73
CD146 0.75 79 73
上述五种联检组合 0.93 92 90
如上表所示，上述五种蛋白的联检组合AUC＝0.93，特异性为92%，灵敏度为90%，均显著优于单个未联检的组合。
4、上述蛋白与MMSE评分的相关性
为了进一步探讨蛋白水平与AD认知损害的关系，对AD患者MMSE评分与5种蛋白水平进行线性相关分析。AD患者的五种蛋白组合的水平与MMSE评分显著正相关（校正R2=0.942，P<0.001），而单个蛋白与MMSE评分的相关性不如其组合（Aβ40、Aβ42、p-tau 181、p-tau 217、和CD146的R2分别为0.642、0.653、0.542、0.513、和0.366，均P<0.001），提示5种蛋白的组合具有预测认知功能损害的潜力。

Claims (9)

1.基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的试剂盒，其用于诊断阿尔茨海默病，特征在于，其包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对CD146蛋白的抗体。
2.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42。
3.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau217。
4.如权利要求1~3中任一项所述的联检试剂盒，其还包含原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子含有荧光材料和载体，且粒径为180～350nm。
5.如权利要求4所述的联检试剂盒，其中，所述载体为聚乙二醇、二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、量子点类发光材料、或半导体聚合物荧光材料。
6.如权利要求1所述的联检试剂盒，其包含的抗体由针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对CD146蛋白的抗体组成，试剂盒中还包含缓冲液，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液中包含10mM～40mM的PBS、0.2g～0.8g的动物血清白蛋白、0.05mL～0.30mL的非离子表面活性剂、0.4g～1.0g的无机碱金属盐、0.03mL～0.06mL的生物防腐剂、和无菌蒸馏水。
7.生物标志物的检测试剂在制备用于诊断阿尔茨海默病的联检试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标志物是由β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和CD146蛋白构成的组合。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau 217。
9.一种用于诊断阿尔茨海默病的单分子免疫检测系统，其包含权利要求1～6中任一项所述的联检试剂盒、和光学成像设备，所述光学成像设备包含光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
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