JP7389049B2 - アミロイド関連疾患を診断する方法 - Google Patents

アミロイド関連疾患を診断する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7389049B2
JP7389049B2 JP2020554847A JP2020554847A JP7389049B2 JP 7389049 B2 JP7389049 B2 JP 7389049B2 JP 2020554847 A JP2020554847 A JP 2020554847A JP 2020554847 A JP2020554847 A JP 2020554847A JP 7389049 B2 JP7389049 B2 JP 7389049B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amyloid
sample
aggregates
individual
size
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020554847A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021519930A (ja
Inventor
ヴコイェヴィク、ヴラダナ
グラスルンド、アストリッド
ヤーヴェト、ユリ
ティイマン、アン
リグラー、ルドルフ
テレニウス、ラース
ワームランダー、セバスチャン
Original Assignee
アミロイディア スウェーデン アクチエボラグ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アミロイディア スウェーデン アクチエボラグ filed Critical アミロイディア スウェーデン アクチエボラグ
Publication of JP2021519930A publication Critical patent/JP2021519930A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7389049B2 publication Critical patent/JP7389049B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

本発明は、一般に、アミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断する方法、アミロイド関連疾患を治療する方法、並びにアミロイド関連疾患を治療するための剤を同定する方法に加えて、関連する使用及びキットに関する。
アミロイド関連疾患は、患者におけるアミロイドの原線維及び凝集体の存在及び蓄積を特徴とする。アミロイド関連疾患の周知の例は、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病である。これら疾患は、時に長期間にわたって患者の健康及び精神的な安定を悪化させることが多く、そして、多くの場合死に至る。アミロイド関連疾患の病態形成及び症状は、患者及びその家族にとって大きな精神的外傷を残すことが多い。アルツハイマー病は、世界中で認知症の最も一般的な原因である（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１６．Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ：２０１６ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２０１７）。
アミロイド関連疾患の症状の治療及び管理の鍵は、早期診断、並びに疾患進行の明晰な予後診断である。しかし、アミロイド関連疾患は、緩徐に発症することが多く、疾患の初期バイオマーカーも知られていないため、患者は、通常、何らかの診断及び／又は予後診断を受ける前に疾患が確立してしまっている。場合によっては、バイオマーカーを用いて疾患を同定する方法が死後にしか実施できないこともあり、患者は恩恵が受けられない。これにより、患者が適時に適切な治療を受けることができるのが大幅に遅れ、健康に害を及ぼす。
従って、アミロイド関連疾患を早期に診断及び予後診断する方法の開発が必要とされている。
米国特許第６，４９８，０１７号には、タンパク質の沈着に関連する疾患を検出する方法が開示されている。この方法の重要な特徴は、典型的には検出される標的と同じ種類の化合物であるプローブを使用することである。プローブは、好適には、病的タンパク質沈着物を物理的及び／又は化学的手段（例えば、超音波、界面活性剤）に供することによって得られる。プローブを、核として機能する疾患関連沈着物と併用することにより、測定されたシグナルを増幅させる重合プロセスが得られる。
国際公開第２０１６／０４０９０ Ａ１号は、サンプル中の誤って折り畳まれたＡβタンパク質の存在を決定するための方法論を提示している。この方法には、分析前にＡβタンパク質を増幅させる工程を組み込むことが不可欠である。
Ｔｉｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５，５４，７２０３－７２１１）は、Ａβ凝集体の動態、より具体的には、構造化されたＡβ凝集体の時間依存的成長に関する。動態研究は、組み換え凍結乾燥Ａβ４２を含むモデル溶液に対して行われる。
Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５，６，１５０３－１５０８）及び国際公開第２０１７／００４５６０号には、特にＡβのタンパク質凝集体に会合したときに有用な分光学的特徴を有する新規蛍光マーカー（ＡＲＣＡＭ－１）が開示されている。ＡＲＣＡＭ－１がＡβ凝集体に会合したとき、未結合のＡＲＣＡＭ
－１と比べて蛍光発光が著しく増加する。ＡＲＣＡＭ－１の分光学的特性は、合成Ａβ４２が組み込まれたモデル系を用いて評価される。
Ｗｅｎｎｍａｌｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５，８７，１１７００－１１７０５）は、ＦＲＥＴ及びＦＣＳ（蛍光相関分光法）を提供することによって、高感度でアミロイドビート（ｂｅａｔ）オリゴマーを検出するための系を提示している。合成の蛍光標識されたＡβ４０及びＡβ４２が、モデル物質として使用される。
この背景に対して、本発明者らは、アミロイド関連疾患を早期に診断及び予後診断することができる新規方法を開発した。
本発明者らによる開発は、患者における個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定することを含み、アミロイド関連疾患の患者に存在する個々のアミロイド凝集体が、血液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）等の患者の体液において同定され得るという驚くべき知見に基づいている。本発明者らは、疾患が確立され、他の公知の方法を使用して検出可能になる前にこれら個々のアミロイド凝集体をうまく同定することができること、そして、個々のアミロイド凝集体の検出によって、該疾患の高度に有効な診断及び／又は予後診断が得られることを見出した。本発明者らによる技術の更なる利点は、個々のアミロイド凝集体を低レベルで検出できることであるが、その理由は、アミロイド関連疾患の初期段階に低レベルのアミロイド関連疾患が存在することがあり、これが、早期の診断及び／又は予後診断の判定に役立つためである。
図１。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）のための機器の仕組みの概略図。Ａ．倒立共焦点顕微鏡における光学配置の概略図。入射レーザー光（濃灰色）は、主ダイクロイックビームスプリッタによって反射され、対物レンズによってサンプルに鋭く集光されて、二重円錐状照明体積が生じる。入射レーザー光を吸収することができる照明体積中の分子は励起されるが、未結合のＴｈＴ分子（薄灰色のドット）並びに小さなアミロイド形成性オリゴマー及びペプチド／タンパク質モノマー（濃灰色のドット）は蛍光を発せず、一方、ＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマーは蛍光を発する（星）。弾性散乱入射光（濃灰色）及びスペクトル的に異なる蛍光（薄灰色）は、対物レンズによって回収され、そして、弾性散乱光を反射し、入射／弾性散乱レーザー光よりも波長の長い蛍光はピンホールを通過させて検出器に入れる主ダイクロイックビームスプリッタによって分離される。Ｂ．顕微鏡の対物レンズで入射レーザー光を集光することによってサンプル中で生じる二重円錐状照明体積の拡大図（濃灰色）及びそれから蛍光が検出される長楕円の形態の理想化された観察体素（ＯＶＥ）（薄灰色）。Ｃ．ＯＶＥを通過する蛍光分子／粒子によって放出される光子は、各検出された光子に対して電気パルスで応答するアバランシェ発光ダイオード（ＡＰＤ）検出器によって検出される。特定の時間間隔、いわゆるビニング時間中に検出された光子から生じる電気パルスの数は、所与の時点において測定された光強度に対応する。上記と同じ光学設定を使用して血清中の量子ドットの希釈懸濁液中で記録された蛍光強度ゆらぎの時系列をここに例示する。Ｄ．電気シグナルをデジタルシグナル相関単位に変換し、対応する正規化自己相関関数Ｇ（τ）をオンラインで計算して、実験的に導出された時間的自己相関曲線（ｔＡＣＣ）を得る。ここに示されるｔＡＣＣは、Ｃ．に示した時間トレースから導出されたものである。挿入図：チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の化学式（上）。下：水中（黒色点線）及びインスリンの構造化アミロイド形成性オリゴマーを含有する水溶液中（灰色実線）におけるＴｈＴの蛍光発光スペクトル。水中（黒色点線）及びインスリンアミロイド原線維の水溶液中（灰色破線）におけるＴｈＴの正規化された基底状態吸収スペクトルを小さな挿入図中に示す。Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの許可を受けてＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．２０１５から画像を再現した。 図２。血清の自己蛍光及び血清のＴｈＴ蛍光のＦＣＳ分析。Ａ．ＴｈＴを含まない（黒色ドット）及びＴｈＴを含む（灰色丸）血清中で記録された実験的ＡＣＣ、並びに対応するベストフィット理論的ＡＦ（実線）。ＴｈＴを含まない血清中での測定については、実験データにフィッティングさせることができた最も単純な理論モデルは、トリプレットなしの自由３Ｄ拡散についてのＡＦであった。フィッティングによって導出されたパラメータ値は、Ｎ＝３００及びτＤ＝５５である。構造パラメータは、較正実験で求めた値で固定した、Ｓｐ＝５。ＴｈＴを含む血清中での測定については、実験データにフィッティングさせることができた最も単純な理論モデルは、トリプレットなしの２成分の自由３Ｄ拡散についてのＡＦであった。フィッティングによって導出されたパラメータ値は、Ｎ＝７５０、τＤ１＝４０μｓ、τＤ２＝１００ｍｓ、ｙ１＝０．９４、及びｙ２＝０．０６である。構造パラメータは、較正実験で求めた値で固定した、Ｓｐ＝５。Ｂ．同じ振幅に対して正規化されたＡ．に示した時間的自己相関曲線、τ＝１０μｓにおけるＧ（τ）＝１。 図３。経時的に記録された血清ＴｈＴにおける時間分解蛍光強度ゆらぎ。蛍光強度における明確に視認できるピークは、明るいＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー、すなわち、ナノプラークが稀に通過することを反映している。 図４。患者及び対照群におけるＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体の発生頻度。Ａ．患者群（縞模様の濃灰色）及び対照群（濃灰色）における単一事象発生の平均頻度。エラーバーは、標準偏差（±ＳＤ）を示す。Ｂ．様々な診断群における単一事象発生の平均頻度。 図５。血清中のＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性ナノプラークの濃度は、加齢と共に増加する。見かけ上健常対照（黒色円）及び患者（灰色のドット）における年齢の関数としての単一事象発生の頻度。ＡＤ患者から得られたデータは、薄灰色の線で囲まれている。濃灰色の線で囲まれた点は、胃バイパス手術を受けた患者由来である。線形回帰式の傾きは、（１．６±１．０）×１０－５ｓ－１年－１であり、切片は（９．４±０．６）×１０－４ｓ－１である。調整されたＲ二乗値Ｒ２ ａｄｊ＝０．０３２は、この相関が非常に弱いことを示す。 図６。患者及び対照群における並進拡散時間、すなわち、ＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体のサイズ。患者群では特徴的な減衰時間がより長いことを示す（これは、この群において観察される構造化凝集体がより大きいことを示す）、対照（黒色ドット）及び患者（灰色丸）群についての時間的自己相関曲線（ｔＡＣＣｓ）。 図７。臨床ＣＳＦパラメータと血清中の単一事象発生の頻度との間の相関。Ａ．ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としてのＣＳＦ中のＡβ４２レベルに対する全Ｔａｕレベルの比。縁部が濃灰色である薄灰色のドットは、ＡＤと診断された個体から得られたデータを示す。全てのグラフにおいて、点線はＣＳＦ中のＡβ４２レベルに基づくＡＤ診断について一般的に許容されている限度を示す、［Ａβ４２］＜５５０ｎｇｌ－１。Ｂ．ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としての血清中の単一事象発生の頻度。大きなドットは、ＡＤと診断された個体から得られたデータを示し、一方、小さなドットは、ＡＤと診断されなかった患者コホートにおける個体から得られたデータを示す。Ｃ．ＣＳＦ測定値と血清測定値との間の比較。薄灰色の軸及び記号はＣＳＦ中の測定値に関し、ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としてのＣＳＦ中のＡβ４２レベルに対する全Ｔａｕレベルの比を示す。濃灰色の縦軸及び記号は、血清中の測定値に関する。濃灰色の記号は、ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としての血清中の単一事象発生の頻度を表す。多面的臨床評価に基づいてＡＤと診断された個体から得られたデータを大きなドットで表す。薄灰色の線で囲まれた点は、胃バイパス手術を受けた患者から得られた値を示す。 図Ｓ１（図８）。機器の較正。ＴｈＴアッセイと同じ光学設定を使用して、Ｒｈ６Ｇの２５ｎＭ水溶液中で記録された時間的自己相関曲線（黒丸）。ＯＶＥにおける平均分子数、Ｎ＝２．５；並進拡散時間、τ＝２４μｓ；及び構造パラメータＳｐ＝７をフィッティングさせることによって得られた、自由三次元（３Ｄ）拡散についての自己相関関数（薄灰色）。これら条件下では、Ｒｈ６Ｇについての１分子あたり１秒あたりの平均カウント数は、ＣＰＳＭ＝（５．１±０．６）ｋＨｚであった。 図Ｓ２（図９）。単一事象発生頻度の分析から求められたフルオスフィアの拡散時間は、時間的自己相関分析によって得られた値と実験誤差の範囲内で一致する。Ａ．フルオスフィアの５０ｎＭ水懸濁液中で記録された蛍光強度ゆらぎ。Ｂ．フルオスフィアの５０ｐＭ水懸濁液中で記録された蛍光強度ゆらぎ。Ｃ．１００ｎｍのフルオスフィアの５０ｎＭ又は５０ｐＭ水懸濁液中で記録された蛍光強度ゆらぎを分析することによって得られた、同じ振幅に対して正規化されたｔＡＣＣ、τ＝１０μｓにおけるＧｎ（τ）＝１。実線：１００ｎｍのフルオスフィアの５０ｎＭ水懸濁液中で記録された、一連の１０個の連続して取得された蛍光強度ゆらぎの測定値（各個々の測定は１０ｓ持続）から得られた、正規化された平均ｔＡＣＣ。一点鎖線：１００ｎｍのフルオスフィアの５０ｐＭ水懸濁液中で３０００ｓにわたって記録された蛍光強度ゆらぎの時間的自己相関分析によって得られた、正規化されたｔＡＣＣ。点線：１００ｎｍのフルオスフィアの５０ｐＭ水懸濁液中で記録された、３００個の連続して取得された蛍光強度ゆらぎの測定値（各個々の測定は１０ｓ持続）から得られた、正規化された平均ｔＡＣＣ。破線：データ解析に記載の通り単一事象発生を同定した場合の、１００ｎｍのフルオスフィアの５０ｐＭ水懸濁液中で記録された蛍光強度ゆらぎ（各個々の測定は１０ｓ持続）を分析することによって得られた、正規化された平均ｔＡＣＣ。一点長鎖線、点線、及び破線のｔＡＣＣは、異なるデータ解析手順を使用したことを除いて、同じサンプル中で実施した測定から得られた。正規化されたｔＡＣＣが重複していることは、試験した全ての手順から実験誤差の範囲内で同じ結果が得られたことを示す。 図Ｓ３（図１０）。単一事象発生ｆＳＥＯの頻度は、ｃ≦１０ｆＭの希釈水懸濁液中の１００ｎｍのフルオスフィアの実際の濃度に正比例する。回帰直線の傾きは（２．３±０．３）であり、決定係数Ｒ２＝０．９２である。 図Ｓ４（図１１）。対照（黒色）及び患者（濃灰色）群についてのＴｈＴを含む血清中の単一事象発生の平均頻度を、対照（薄灰色）及び患者（縞模様の薄灰色）群についてのＴｈＴを含まない血清中の測定値と比較する対照実験。 図Ｓ５（図１２）。見かけ上健常対照被験体のＣＳＦにおけるＴｈＴアッセイ。Ａ．ＴｈＴ添加前（黒色）及びＴｈＴ添加後（灰色）のＣＳＦにおいて記録された経時的な蛍光強度ゆらぎ。Ｂ．対応する時間的自己相関曲線。 図Ｓ６（図１３）。見かけ上健常対照被験体の唾液におけるＴｈＴアッセイ。Ａ．ＴｈＴ添加前（黒色）及びＴｈＴ添加後（灰色）の唾液において記録された経時的な蛍光強度ゆらぎ。Ｂ．対応する時間的自己相関曲線。 図Ｓ７（図１４）。見かけ上健常対照被験体の尿におけるＴｈＴアッセイ。Ａ．ＴｈＴ添加前（黒色）及びＴｈＴ添加後（灰色）の尿において記録された経時的な蛍光強度ゆらぎ。Ｂ．対応する時間的自己相関曲線。 図１５。金属フィルムを使用して透明融解石英基材上に構築されたゼプトリットル観察導波管を備える単一分子蛍光イメージングシステムの概略図。金属フィルムにおける１つのウェルを拡大する。（Ｍ Ｊ Ｌｅｖｅｎｅ，Ｊ Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｓ Ｗ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ Ｆｏｑｕｅｔ，Ｈ Ｇ Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ａｎｄ Ｗ Ｗ Ｗｅｂｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２９９，Ｎｏ．５６０７（Ｊａｎ．３１，２００３）ｐｐ．６８２－６８６）。 図１６。ゼプトリットル観察導波管の直径。Ａ．直径５０ｎｍ及び深さ１００ｎｍのゼプトリットル導波管についての、強度ゆらぎ（対数スケール）の三次元有限要素時間領域シミュレーション。金属材料は、Ａｌ（アルミニウム）である。Ｂ．ウェル直径の様々な直径についてのＳ（ｚ）曲線。Ｃ．有効観察体素サイズ（Ｖｅｆｆ）及び平均して体積中に一分子が存在する対応する濃度（＜Ｎ＞＝１）（Ｍ Ｊ Ｌｅｖｅｎｅ，Ｊ Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｓ Ｗ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ Ｆｏｑｕｅｔ，Ｈ Ｇ Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ａｎｄ Ｗ Ｗ Ｗｅｂｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２９９，Ｎｏ．５６０７（Ｊａｎ．３１，２００３）ｐｐ．６８２－６８６）。 図１７。ゼプトリットル導波管アレイを備える融解石英カバーガラス。Ａ．個々の実験についてアレイを単離するためのガスケットで覆われているカバーガラス。Ｂ及びＣ．導波管のスケールの連続増加。Ｄ．個々のウェルの走査型電子顕微鏡画像。（Ｍ Ｊ Ｌｅｖｅｎｅ，Ｊ Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｓ Ｗ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ Ｆｏｑｕｅｔ，Ｈ Ｇ Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ａｎｄ Ｗ Ｗ Ｗｅｂｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２９９，Ｎｏ．５６０７（Ｊａｎ．３１，２００３）ｐｐ．６８２－６８６）。 図１８。超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）のための機器における光学配置の概略図。フィルタホイール（ＮＤＦＷ）に実装された様々な透過力を有する中性密度フィルタを使用して強度が制御される単一レーザービームは、拡大され（Ｌ１及びＬ２）、ペリスコープアセンブリ（ＰＡ）を通して導かれ、単一レーザービームを３２×３２（１０２４）本のビームの矩形アレイに分割するように設計された回折光学素子（ＤＯＥ）において焦点レンズ（Ｌ３）によって集光される。３２×３２個のレーザービームスポットの照明マトリックスが、顕微鏡の背面端子の画面に形成され、顕微鏡のリレーオプティクス（ＲＯ）によってロングパスダイクロイックミラー（ＬＰＤＭ）に、そして、対物レンズ（ＯＢＪ）を通してサンプルに導かれる。対物レンズによって収集された蛍光は、ＬＰＭＤを通過し、単一光子アバランシェ発光ダイオード（ＳＰＡＤカメラ）の場合一致する２Ｄアレイに導かれる。上：ローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）の薄層及び１８．０メガピクセルのデジタル一眼レフ（ＤＳＬＲ）カメラ（ナビゲーションカメラ）を使用して可視化された、顕微鏡の対物レンズの焦点面において生成された照明マトリックスの画像。中心にゼロ次回折ピークが見える（Ｖｉｔａｌ Ｍ，Ｂｒｏｎｚｉ Ｄ，Ｋｒｍｐｏｔ ＡＪ，Ｎｉｋｏｌｉｃ ＳＮ，Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｆ－Ｊ，Ｊｕｎｇｈａｎｓ Ｃ，Ｔｉｓａ Ｓ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｔ，Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ Ｖ，Ｔｅｒｅｎｉｕｓ Ｌ，Ｚａｐｐａ Ｆ，Ｒｉｇｌｅｒ Ｒ，Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｐｈｏｔｏｎ ａｖａｌａｎｃｈｅ ｃａｍｅｒａ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｔｙ．ＩＥＥＥ Ｊ．Ｓｅｌ．Ｔｏｐ．Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４ ２０：３４４－３５３）。 図１９。超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）を使用した溶液中及び血清中のアミロイド形成性凝集体のサイズ分布の決定。Ａ．１０２４個の観察体素における拡散時間マップ。Ｂ．１０２４個の観察体素全てにわたる拡散ヒストグラム。Ｃ．反応開始の３時間後のアミロイドβ１－４２（Ａβ４２）ペプチドの水溶液（２０μＭ Ａβ４２、１０μＭ ＴｈＴ、室温（
Figure 0007389049000001
℃））中の１つの観察体積に記録された時系列。Ｄ．血清サンプル中の１つの観察体素に記録された時系列。バックグラウンドよりも明確に視認できる蛍光強度バーストは、ＴｈＴ反応性ナノプラークの通過を反映している。
図２０。単一事象発生（ｆＳＥＯ）の測定された頻度によって反映されたときの、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された個体、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）と診断された個体、及び見かけ上健常個体（対照）の血清中の構造化Ｔｈ－Ｔ反応性アミロイド形成性凝集体の量の差。箱髭図において、箱はデータの平均（中央の実線）を標準偏差１個分上回る及び下回るものを示し、横破線は中央値を示し、髭の末端は５～９５％の区間を与える。 図２１。臨床ＣＳＦパラメータと血清中の単一事象発生の頻度（ｆＳＥＯ）との間の相関。Ａ．ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としてのＣＳＦ中のＡβ４２レベルに対する全Ｔａｕレベルの比。縁部が濃灰色である薄灰色のドットは、ＡＤと診断された個体から得られたデータを示す。薄灰色のドットは、ＭＣＩと診断された個体から得られたデータを示す。全てのグラフにおいて、縦点線は、ＣＳＦ中のＡβ４２レベルに基づくＡＤ診断について一般的に許容されている限度を示す、［Ａβ４２］≦５５０ｎｇｌ－１。Ｂ．ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としての血清中の単一事象発生の頻度。縁部が黒色である大きな濃灰色のドットは、ＡＤと診断された個体から得られたデータを示す。小さな濃灰色のドットは、ＭＣＩと診断された患者コホートにおける個体から得られたデータを示す。横破線は、血清中のｆＳＥＯのカットオフ値、ｆＳＥＯ≧１．５×１０－３ｓ－１（５．４ｈ－１）を示す。Ｃ．ＣＳＦ測定値と血清測定値との間の比較。薄灰色の軸及び記号は、ＣＳＦ中の測定値に関し、ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としてのＣＳＦ中のＡβ４２レベルに対する全Ｔａｕレベルの比を示す。濃灰色の縦軸及び記号は、血清中の測定値に関する。濃灰色の記号は、ＣＳＦ中のＡβ４２レベルの関数としての血清中の単一事象発生の頻度を表す。多面的臨床評価に基づいてＡＤと診断された個体から得られたデータを大きなドットで表す。Ｂ．及びＣ．において薄灰色の円で囲まれた点は、ＭＣＩと診断された胃バイパス手術を受けた患者から得られた値を示す。 図２２。ＭＣＩ及びＡＤの個体におけるアミロイド形成性負荷に対する神経変性の寄与。ＣＳＦ及び血液の分析データを組み合わせることによって、以下の通り神経変性及びアミロイド形成性負荷の程度に従って患者を４群に層別化することができた：Ｉ－低神経変性（ｌＮＤＧ）かつ低アミロイド形成性負荷（ｌＡＬ）；ＩＩ－低神経変性（ｌＮＤＧ）かつ高アミロイド形成性負荷（ｈＡＬ）；ＩＩＩ－高神経変性（ｈＮＤＧ）かつ高アミロイド形成性負荷（ｈＡＬ）；ＩＶ－高神経変性（ｈＮＤＧ）かつ低アミロイド形成性負荷（ｌＡＬ）。この分類によれば、低神経変性かつ高アミロイド形成性負荷を呈するＭＣＩの個体は、ＡＤを発症するリスクがある可能性がある。これら個体では、アミロイドベータの生理は崩壊するが、神経変性は依然として低い。
従って、本発明の第１の態様は、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断する方法であって、
－ 該被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と；
－ 該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
を含む方法を提供する。
好ましくは、該方法は、該決定に基づいて該アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する工程を更に含む。最も好ましくは、該決定に基づいて該アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する工程は、該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程の後に行われる。
従って、本発明は、生存患者におけるアミロイド関連疾患を診断及び予後診断するための高度に有効な早期かつ非侵襲的な方法を提供し、これは、アミロイド関連疾患の治療効果の追跡にも適用可能である。該方法は、更に、アミロイド関連疾患の治療、並びにアミロイド関連疾患を治療するための剤の同定及び開発にも有用である。これら用途に特に有用なのは、本明細書に記載の方法を使用して、経時的に繰り返し同じ患者においてアミロイド凝集体のレベルを定期的に同定及び特性評価することができる点である。また、本発明は、本明細書に記載の方法に対応するキットを提供する。
本発明の方法の追加の利点は、体液に対して実施されるので非侵襲的又は低侵襲的であり、従って、患者にとってそれほど不快ではない点である。更に、該方法は疾患の初期徴候を検出することができるので、死後だけではなく、生存患者に対しても実施することができる。このことから、生存患者における疾患進行をモニタリングするために、該方法を複数回繰り返すことも可能になる。
用語「アミロイド関連疾患」は、医学分野の当業者に公知である。アミロイド関連疾患は、時にアミロイドーシスとも称され、被験体にアミロイドが蓄積する疾患を包含する。アミロイドは、互いに密着して凝集体を形成し、次に、合わさって原線維を形成する特定のペプチド又は特定のタンパク質の多数のコピーの蓄積である。従って、原線維は、凝集体よりも大きな構造体であり得る。凝集体及び／又は原線維の形態では、ペプチド又はタ
ンパク質は、もはやその生理学的機能を有しない。アミロイドの凝集体及び原線維が被験体の組織に蓄積した場合、多くの場合、その組織の機能が崩壊し、アミロイド関連疾患の病状を引き起こし得る。
「個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」には、個々の凝集体を決定することが含まれる。決定は、凝集体の量又は濃度の合計を決定するのではなく、存在する全ての中で個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定することを含む。従って、請求される方法は、利用可能な場合、アミロイド原線維の総量及び／又は大きな群のみが検出される現行の方法とは異なる。本明細書で論じるとき、「個々のアミロイド凝集体」は、アミロイド関連疾患の初期バイオマーカーであり、これによって、早期の診断及び／又は予後診断が可能になる。
「個々のアミロイド凝集体」には、アミロイド関連疾患に関連する構造体であるか又は該構造体を形成するペプチド又はタンパク質の蓄積が含まれる。用語「個々のアミロイド凝集体」は、構造化されたアミロイド凝集体と称される場合もあり、これには、β－プリーツシートを含むアミロイド凝集体等の規定の二次構造を有するアミロイド凝集体が含まれる。用語「アミロイド凝集体」は、アミロイド関連疾患に関連する構造体を形成することができる任意のペプチド又はタンパク質を指すために使用される。この用語は、時にアミロイドβペプチド（アルツハイマー病に関連する構造体を形成する）を指すために当技術分野において使用されるが、本願の目的では、そのペプチドに限定されるものではない。
「ペプチド」は、一般に、２以上のアミノ酸であるが、約５０以下のアミノ酸；例えば：約３～約５０アミノ酸；約４～約５０アミノ酸；約５～約５０アミノ酸；約６～約５０アミノ酸；約７～約５０アミノ酸；約８～約５０アミノ酸；約９～約５０アミノ酸；約１０～約５０アミノ酸；約２０～約５０アミノ酸；約３０～約５０アミノ酸；又は約４０～約５０アミノ酸を含む分子であると考えられる。
「タンパク質」は、一般に、約５０以上のアミノ酸；例えば：約６０以上；約７０以上；約８０以上；約９０以上；約１００以上；約１５０以上；約２００以上；約２５０以上；約３００以上；約３５０以上；約４００以上；約４５０以上；又は約５００以上のアミノ酸を含む分子であると考えられる。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、非晶質アミロイド凝集体を含まない。「非晶質アミロイド凝集体」には、β－プリーツシート構造を有しないアミロイド凝集体等の、明確な二次構造を有しないアミロイド凝集体が含まれる。
本発明は、一般に、個々のアミロイド凝集体の検出、及び個々のアミロイド凝集体の特性評価に関する。その検出及び特性評価は、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」と記載され、それには、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを「同定及び／又は計算及び／又は検出する」ことが含まれる。
「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在を決定する」には、サンプル中に個々のアミロイド凝集体が存在するか否かを判定することが含まれる。以下で更に論じる通り、サンプルが患者由来の体液である場合かつ個々のアミロイド凝集体が患者の体液中に存在する場合、患者はアミロイド関連疾患と診断される。
「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の量を決定する」には、サンプル中の個々のア
ミロイド凝集体の総数を求めることが含まれる。以下で更に論じる通り、サンプルが患者由来の体液である場合、患者の体液中の個々のアミロイド凝集体の量が多いほど、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断は悪くなる。
「サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズを決定する」には、個々のアミロイド凝集体中のペプチド数を求める、及び／又はサンプル中の個々のアミロイド凝集体の寸法を求める、及び／又はサンプル中の個々のアミロイド凝集体の測定値を求める、及び／又はサンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量を求めることが含まれる。以下で更に論じる通り、サンプルが患者由来の体液である場合、患者の体液中の個々のアミロイド凝集体のサイズが大きいほど、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断は悪くなる。
「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の濃度を決定する」には、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の相対量を特定することが含まれる。以下で更に論じる通り、サンプルが患者由来の体液である場合、患者の体液中の個々のアミロイド凝集体の濃度が高いほど、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断は悪くなる。
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、該方法は、以下の順に、
－ 被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と；
－ 該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該決定に基づいて、該アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する工程と；
を含む。
追加の実施形態は、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断する方法であって、
－ 該被験体由来の血漿及び／又は血清からなる群から選択されるサンプルを提供する工程と；
－ 蛍光分光法、好適には蛍光相関分光法に基づく分析によって、該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
を含む方法に関する。
用語「診断」及び「予後診断」は、医学分野の当業者に公知である。
「診断」には、該方法を使用して、被験体がアミロイド関連疾患を有するか否かを特定できることが含まれる。「予後診断」には、該方法を使用して、被験体においてアミロイド関連疾患がどれくらい早く進行する可能性があるか、並びに／又は被験体においてアミロイド関連疾患の症状及び／若しくは徴候がどれくらい重篤になる可能性があるか、並びに／又はアミロイド関連疾患に起因して被験体が死亡する可能性があるかどうか、並びに／又はアミロイド関連疾患に起因して被験体がいつ頃死亡する可能性があるか、並びに／又は被験体に以前投与された若しくは施されたアミロイド関連疾患の治療の有効性の評価、並びに／又は将来的に被験体に投与される若しくは施される可能性のあるアミロイド関連疾患の治療の有効性の可能性を特定できることが含まれる。言い換えれば、予後診断には、被験体に以前投与された若しくは施されたアミロイド関連疾患の治療の有効性を追跡することが含まれる。
アミロイド関連疾患の治療は、利用可能な場合、医学分野の当業者に公知である。
「治療」には、アミロイド関連疾患の治癒を意図する治療、並びに／又はアミロイド関
連疾患の症状及び／若しくは徴候の数及び／若しくは重篤度の低減を意図する治療、並びに／又は対症療法的治療、並びに／又は実験的治療、及び／又は理学療法が含まれる。アミロイド関連疾患の具体的な治療については、本明細書で論じられる。
一実施形態では、体液は、血液、及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／又は唾液、及び／又は尿、及び／又は滑液、及び／又は糞便を含む又はからなる群のうちの１つ以上である。好ましい実施形態では、体液は、血液を含む。別の好ましい実施形態では、体液は、唾液を含む。更に別の好ましい実施形態では、体液は、尿を含む。更なる実施形態では、体液は、血漿及び／又は血清から選択される。より更なる実施形態では、体液は、血清から選択される。別の実施形態では、体液は、血液細胞、具体的には、赤血球、白血球、及び血小板を含む。更なる実施形態によれば、血液細胞は、溶解していてもよい。
本発明の特に驚くべき進歩は、血液、尿、滑液、糞便、及び／又は唾液の体液サンプルを使用してアミロイド関連疾患を診断する又は予後診断に達することができる点である。既に、公知の方法を使用しても、特に本明細書に記載のように、血液サンプルを使用してアミロイド関連疾患であるアルツハイマー病を診断することはできなかったことが研究によって示されている（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；１０（３）：１９５－２０７及びＴｏｌｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；５（２）：８）。しかし、個々のアミロイド凝集体を検出することによって、以前の方法で判明した問題が本発明では克服されるが、それは、個々のアミロイド凝集体がアミロイド関連疾患の有効な初期バイオマーカーであることが現在は示されているためである。尿、唾液、滑液、糞便、及びＣＳＦのサンプルについては、これら体液中の個々のアミロイド凝集体の検出を、アルツハイマー病等のアミロイド関連疾患の診断又は予後診断において使用できることはこれまで示唆されていない。
尿、唾液、糞便、及び血液の体液の具体的な利点は、尿、糞便、及び唾液のサンプルの提供に医療従事者の補助を必要とせず、低侵襲的方法を使用して被験体から提供され得る点である。
本発明の目的のために体液サンプルをどのように提供することができるかは、医学分野の当業者に公知である。例えば、血液体液サンプルは、針を用いて静脈から血液を採取することによって、医療従事者により入手することができる。
一実施形態では、血液サンプルは、全血；血清；血漿；血液細胞：赤血球、白血球、及び／又は血小板；血液細胞溶解物を含むか又はからなる群のうちの１つ以上である。
被験体から採取された血液は、特に、血漿に懸濁している血液細胞を含む。血液細胞の主な種類は、赤血球、白血球、及び血小板である。実施形態によれば、血液から血液細胞を分離し、それによって血漿を得ることが好都合であり得る。更に、血漿から凝固因子を除去し、それによって血清を入手することができる。全血は、遠心分離によって分画することができる。遠心分離によって、全血は血漿及び赤血球に分画され、これら２つの画分の間に白血球及び血小板の薄層が生じる。分析されるサンプルとして全血をそのまま使用してもよいが、特定の場合、血液細胞を除去し、分析のためのサンプルとして血漿を使用することが好ましい場合がある。更に、血漿から任意の凝固因子を除去し、分析のために（サンプルとして）血清を使用することが望ましい場合もある。
「細胞溶解物」には、赤血球、白血球、及び／又は血小板の細胞溶解物が含まれる。
血液の特定の成分（例えば、赤血球、白血球、及び／又は血小板）は、例えば、全血サ
ンプルを遠心分離することを含む血液分画等、当技術分野において公知の方法を使用して単離することができる。
幾つかの状況では、ＦＡＤ酵素及び脂肪色素、並びにＮＡＤＨ酵素及び脂肪色素は、自己蛍光するとき、方法の感度を低下させる場合がある。従って、方法を使用する前に体液サンプルからこれら分子を除去することには幾つかの利点があり得る。
一実施形態では、体液サンプルは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）酵素及び／若しくはＦＡＤ脂肪色素；並びに／又はピリジン性（ＮＡＤＨ）酵素及び／若しくはＮＡＤＨ脂肪色素を含むか又はからなる群のうちの１つ以上を含まない。
特定の実施形態では、血液サンプルは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）酵素及び／若しくはＦＡＤ脂肪色素；並びに／又はピリジン性（ＮＡＤＨ）酵素及び／若しくはＮＡＤＨ脂肪色素を含むか又はからなる群のうちの１つ以上を含まない。
特定の実施形態では、ＣＳＦサンプルは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）酵素及び／若しくはＦＡＤ脂肪色素；並びに／又はピリジン性（ＮＡＤＨ）酵素及び／若しくはＮＡＤＨ脂肪色素を含む又はからなる群のうちの１つ以上を含まない。
サンプルからフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）酵素、ＦＡＤ脂肪色素、ピリジン性（ＮＡＤＨ）酵素、及び／又はＮＡＤＨ脂肪色素を除去する方法は、化学分野の当業者に公知である。例えば、ＦＡＤは、Ｂｕｒｃｈ ＨＢ，Ｂｅｓｓｅｙ ＯＡ，Ｌｏｗｒｙ ＯＨ．Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｓｍａｌｌ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９４８ １７５（１）：４５７－４７０に記載の通り、３７”Ｃで２０時間以内に５％トリクロロ酢酸中でＦＭＮに完全に加水分解される。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、アミロイドオリゴマー；アミロイドナノ凝集体；及び／又はアミロイド老人性凝集体；及び／又はアミロイド原線維；及び／又はアミロイド前原線維を含む群から選択される。好ましくは、個々のアミロイド凝集体は、アミロイドナノ凝集体である。これらアミロイド凝集体は、被験体においてアミロイド凝集体を形成しやすいペプチド及び／又はタンパク質の交差反応によって形成される。
アミロイドナノ凝集体は、アミロイドナノプラーク又は構造化アミロイドナノプラークと称される場合もあり、例えば、β－プリーツシートの二次構造を含むもの等である。用語「アミロイドナノ凝集体」は、二量体及び三量体よりも多数のペプチドを含む（そして、構造化超分子集合体と記載される場合もある）が、アミロイド原線維又は老人性アミロイド凝集体（老人性プラークとして知られている場合もある）をまだ形成していないことを示す。これらの区別は、生物学又は化学分野の当業者には理解されるであろう。
アミロイドオリゴマー及びアミロイド前原線維は、アミロイド原線維の成長中に観察される可溶性ペプチド集合体である。これらは、かなりの量のβ－シート構造を含有するので、ＴｈＴに結合することができ、従って、ＴｈＴ蛍光を生じさせることができる。アミロイドオリゴマー及びアミロイド前原線維は構造的に不均一な超分子集合体を含むが、典型的には、オリゴマーがより小さく、前原線維の形成に先行するとされている。更に、オリゴマーは、前原線維に特徴的な細長い輪状形状ではなく球状であることがより多いと考えられるとされている。前原線維における構造秩序の程度は、オリゴマーにみられるものと原線維にみられるものとの間の中間である。オリゴマー及び前原線維の分子量は、４０～３０００ｋＤａの範囲である（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ．２０１５ ５４（１３）：２１９３－２２０４；Ｂｙｒｏｎ ＆ Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１５ ３５：７６－８６．）。
アミロイド前原線維は、成長してアミロイド原線維になる、細長い又は輪状形状の細長い一本鎖状超分子集合体である。前原線維は、２～１０ｎｍの範囲の直径を有し、長さは約１００～２００ｎｍである。アミロイド原線維は、長さ対直径比が高く、直径が１０～１００ｎｍの範囲である分子の細長い複数鎖状集合体である。原線維は、老人性プラークを生じさせ、これは、複雑に織り合わさった成熟した原線維からなる均一な構造体である（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＭＲ，Ｃｏｌｖｉｎ ＢＡ，Ｈｏｏｄ ＥＡ，Ｐａｒａｎｊａｐｅ ＧＳ，Ｏｓｂｏｒｎ ＤＣ，Ｔｅｒｒｉｌｌ－Ｕｓｅｒｙ ＳＥ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｍｙｌｏｉｄ－β（１－４２）ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ，ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１５ ５４（１３）：２１９３－２２０４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ５００９５７ｇ；Ｂｙｒｏｎ Ｏ，Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｂ．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ ｓｕｐｒａ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｄｅｍａｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓ－ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１５ ３５：７６－８６；Ｒｅｌｉｎｉ Ａ．Ａｍｙｌｏｉｄ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｉｏ－ｎａｎｏｉｍａｇｉｎｇ：Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｕｖｅｒｓｋｙ ａｎｄ Ｙｕｒｉ Ｌｙｕｂｃｈｅｎｋｏ Ｅｄ．２０１３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．）。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、１枚以上のベータ（β）シート（例えば、β－プリーツシート）を含む。生物学又は化学分野の当業者には公知であるように、ベータ（β）シートはタンパク質の二次構造であり、一般に、アミノ酸がねじれて引き伸ばされたものである。２枚以上のベータ（β）シートの会合は、例えば、アミロイド関連疾患に関連する個々のアミロイド凝集体を形成するためのペプチド蓄積のメディエーターであることが多い。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、２－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－３，６－ジメチルベンゾ［ｄ］チアゾール－３－イウムクロリド（チオフラビンＴ（ＴｈＴ））によって結合され得る（Ｇｒｏｅｎｎｉｎｇ，Ｍ．（２０１０）Ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ－ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，１－１８）。ＴｈＴは、ベータ（β）－シート構造に結合する分子であり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、約２０以上のペプチド又はタンパク質；例えば：約３０以上；約４０以上；約５０以上；約６０以上；約７０以上；約８０以上；約９０以上；約１００以上；約２００以上；約３００以上；約４００以上；約５００以上；約６００以上；約７００以上；約８００以上；約９００以上；約１，０００以上；約２，０００以上；約３，０００以上；約４，０００以上；約５，０００以上；約６，０００以上；約７，０００以上；約８，０００以上；約９，０００以上；約１０，０００以上；約２０，０００以上；約３０，０００以上；約４０，０００以上；約５０，０００以上；約６０，０００以上；約７０，０００以上；約８０，０００以上；約９０，０００以上；約１００，０００以上；約２００，０００以上；約３００，０００以上；約４００，００
０以上；約５００，０００以上；又は約１，０００，０００以上のペプチド又はタンパク質、好ましくは、約４０以上のペプチド又はタンパク質を含む。
理解される通り、アミロイドナノ凝集体は、約２０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド、例えば：約３０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約４０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約５０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約６０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約７０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約８０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約９０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約１００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約２００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約３００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約４００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約５００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約６００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約７００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約８００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約９００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約２，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約３，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約４，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約５，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約６，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約７，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約８，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約９，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約１０，０００のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチド；約４０のタンパク質又はペプチド～約１，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約２，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約３，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約４，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約５，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約６，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約７，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約８，０００のタンパク質又はペプチド；約１，０００のタンパク質又はペプチド～約８，０００のタンパク質又はペプチド；又は約１，０００のタンパク質又はペプチド～約１０，０００のタンパク質又はペプチドを含み得る。
理解される通り、アミロイド原線維は、１００，０００超のペプチド又はタンパク質～１，０００，０００のペプチド又はタンパク質、例えば：約２００，０００のペプチド又はタンパク質～１，０００，０００のペプチド又はタンパク質；約３００，０００のペプチド又はタンパク質～１，０００，０００のペプチド又はタンパク質；約４００，０００のペプチド又はタンパク質～１，０００，０００のペプチド又はタンパク質；又は約５００，０００のペプチド又はタンパク質～１，０００，０００のペプチド又はタンパク質を含み得る。
理解される通り、老人性アミロイド凝集体は、１，０００，０００超のペプチド又はタンパク質を含み得る。
一実施形態では、該方法は、サンプルに検出剤を添加する工程を更に含む。
好ましくは、「サンプルに検出剤を添加する」工程は、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程の前に行われる。
より好ましくは、「サンプルに検出剤を添加する」工程は、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程の前に、そして、「被験体由来の体液のサンプルを提供する」工程の後に行われる。
一実施形態では、検出剤は、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応する。好ましくは、検出剤は、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又と反応し；それによって、該検出剤が検出可能になる及び／若しくは測定可能になる、又はより容易に検出可能になる及び／若しくはより容易に測定可能になる、並びに／又はより多くの測定可能なアウトプットを生じさせる。
「検出剤が個々のアミロイド凝集体と結合する」には、検出剤が個々のアミロイド凝集体と分子結合（例えば、共有結合）を形成することが含まれる。
「検出剤が個々のアミロイド凝集体と会合する」には、検出剤が個々のアミロイド凝集体と非共有結合性相互作用（例えば、静電相互作用、及び／又はパイ（π）－相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用、及び／又は疎水性相互作用）を形成することが含まれる。
「検出剤が個々のアミロイド凝集体と反応する」には、検出剤が、機能を発揮するために、必ずしも個々のアミロイド凝集体と結合若しくは会合する、及び／又は個々のアミロイド凝集体と近接している必要はないことが含まれる。
「検出剤が検出可能になる」には、個々のアミロイド凝集体の存在下で検出剤が結合及び／又は会合及び／又は反応したとき、検出剤の存在を同定又は検出できることが含まれる。言い換えれば、サンプルが個々のアミロイド凝集体を含まない場合、本明細書に記載の方法を使用して、検出剤の存在を同定することも検出することもできない。
「検出剤が測定可能になる」には、個々のアミロイド凝集体の存在下で検出剤が結合及び／又は会合及び／又は反応したとき、検出剤の量を定量できる及び／又は検出剤の相対量若しくは相対レベルを評価できることが含まれる。検出剤の量又はレベルを使用して、個々のアミロイド凝集体の量及び／又は濃度及び／又はサイズを定量することができる。
一実施形態では、決定は、検出剤の検出及び／又は測定を含む。誤解を避けるために、この決定は、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程の一部として行ってもよい。
「検出剤の検出」には、検出剤の存在が検出又は同定されることが含まれる。「検出剤の測定」には、検出剤の量の定量及び／又は検出剤の相対量若しくは相対レベルの評価が含まれる。検出剤の量又はレベルを使用して、個々のアミロイド凝集体の量及び／又は濃度及び／又はサイズを定量することができる。
一実施形態では、検出剤は、１枚以上のβ－シートを含む個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応する。
一実施形態では、検出剤は、蛍光部分及び／又は生物発光部分を含む。生物学及び／又は化学分野の当業者は、用語「蛍光部分」及び「生物発光部分」に包含されるものを理解するであろう。
一実施形態では、検出剤は、蛍光部分を含み、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応したときに蛍光を発生させる又は放出する。
好ましい実施形態では、蛍光剤を含む検出剤を添加し、検出剤からの蛍光の測定及び／又は検出を使用して、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する。
更に別の実施形態では、検出剤は、生物発光部分を含み、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応したときに生物発光を発生させる又は放出する。
一実施形態では、検出剤は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、及び／又はＡＲＣＡＭ１、及び／又は五量体ホルミルチオフェン酢酸（ｐＦＴＡＡ）、及び／又は４－（ジシアノビニル）－ジュロリジン（ＤＣＶＪ）、及び／又は１－アミノ－８－ナフタレンスルホナート（ＡＮＳ）、及び／又はビス－ＡＮＳ、及び／又は２－［Ｎ－ビス－（３－ジメチルアミノプロピル）－アミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を含むか又はからなる群のうちの１つ以上である。好ましくは、検出剤は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）及び／又はＡＲＣＡＭ１を含む。より好ましくは、検出剤は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を含む。
ＡＲＣＡＭ１は、アリールシアノアミドであり、これは、ベータ（β）－シートに結合する（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，６：１５０３－１５０８）．
一実施形態では、検出剤は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、及び／又はＡＲＣＡＭ１、及び／又は五量体ホルミルチオフェン酢酸（ｐＦＴＡＡ）、及び／又は４－（ジシアノビニル）－ジュロリジン（ＤＣＶＪ）、及び／又は１－アミノ－８－ナフタレンスルホナート（ＡＮＳ）、及び／又はビス－ＡＮＳ、及び／又は２－［Ｎ－ビス－（３－ジメチルアミノプロピル）－アミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）の変異体又は誘導体又は修飾体を含むか又はからなる群のうちの１つ以上である。
一実施形態では、アミロイド関連疾患は、個々のアミロイド凝集体、好ましくは、１枚以上のベータ（β）シートを含む個々のアミロイド凝集体と関連する。
「アミロイド関連疾患が個々のアミロイド凝集体と関連する」には、アミロイド関連疾患が、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は蓄積によって引き起こされるか又は悪化することが含まれる。
一実施形態では、アミロイド関連疾患は、アルツハイマー病；及び／又はパーキンソン病；及び／又はハンチントン病；及び／又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；及び／又は２型糖尿病；及び／又は全身性アミロイドーシス；及び／又はプリオン病（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ））；及び／又はアミロイド軽鎖アミロイドーシス；及び／又は多発性骨髄腫；及び／又は炎症；及び／又は腎不全；及び／又は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）アミロイドーシス；及び／又は多発ニューロパシーを伴うトランスサ
イレチン関連遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）又はＳｋｅｌｌｅｆｔｅｓｊｕｋａｎとしても知られている）；及び／又は血液透析関連アミロイドーシス；及び／又は脳アミロイドアンギオパシー；及び／又は家族性内蔵アミロイドーシス；及び／又は原発性皮膚アミロイドーシス；及び／又は脳アミロイドアンギオパシー；及び／又はプロラクチノーマ；及び／又は家族性角膜アミロイドーシス；及び／又は心房の老人性アミロイド；及び／又は甲状腺髄様がん；及び／又は医薬品インスリン誘発性アミロイドーシスを含む群から選択される１つ以上である。前述の疾患は、医学分野の当業者に公知である。
好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患は、アルツハイマー病である。
別の好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患は、パーキンソン病である。
更に別の実施形態では、アミロイド関連疾患は、ハンチントン病である。
更に別の実施形態では、アミロイド関連疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
アルツハイマー病は、経時的に緩徐に発症し、通常平均余命が診断後３～９年間である、慢性神経変性疾患である。しかし、アルツハイマー病の診断は、疾患の信頼できる初期マーカーが存在していないので、非常に遅くなる場合が多い。現在、診断は、短期記憶消失等、多くの場合かなり軽微で観察することが困難な行動症状を呈する患者に依る。現行の方法に基づくと、患者がどれくらい早く増悪する可能性があるかについての予後診断を提供することもかなり困難である。従って、アルツハイマー病を早期に診断し、信頼できる予後診断を提供することができる有効な方法が特に必要とされている。本発明は、本発明者らが有効な診断マーカー及び予後診断を評価するための信頼できるマーカーを提供することを証明した、個々のアミロイド凝集体を検出することによってこの問題を解決する。
同様に、パーキンソン病、ハンチントン病、及びＡＬＳは、行動症状を使用して診断され、有効な初期診断及び予後診断マーカーのない慢性疾患である。本明細書に記載の全てのアミロイド関連疾患と同様に、パーキンソン病、ハンチントン病、及びＡＬＳを早期に診断し、信頼できる予後診断を提供することができる有効な方法が特に必要とされている。本発明は、本発明者らが有効な診断マーカー及び予後診断を評価するための信頼できるマーカーを提供することを証明した、個々のアミロイド凝集体を検出することによってこの問題を解決する。
一実施形態では、アルツハイマー病は、主観的認知障害；軽度認知障害；アルツハイマー病；及び血管性認知症を伴うアルツハイマー病を含む群から選択される。これらの種類のアルツハイマー病は、医学分野の当業者に公知である。
主観的記憶障害としても知られている主観的認知障害（ＳＣＩ）は、記憶障害を含む認知能力の悪化を有するが、標準的な試験によってその悪化を検証することができない被験体に関する。客観的認知機能不全又は鬱病の非存在下では、ＳＣＩは、正常老化における一般的な遷移段階であるとみなされることがある。
初発認知症又は単独記憶障害としても知られている軽度認知機能障害（ＭＣＩ）は、被験体の年齢に基づいて予測されるものを超えた認知障害の発病及び発展を含むが、日常の活動を妨げるほど重篤ではない脳機能症状である。ＭＣＩは、正常老化と認知症との間の遷移段階として生じる場合もある。ＭＣＩの原因は不明であるので、予防法も治療法も存
在しない。米国では、ＭＣＩは、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＩＣＤ－１０－ＣＭ医療診断コードにおいてＧ３１．８４に指定されている。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の大脳皮質における神経細胞及び神経連絡の不可逆的な破壊、並びに脳量の著しい喪失を特徴とする進行性神経変性疾患である。その結果、経時的に悪化する認知症症状が生じる。最終的に、この疾患は、被験体が日常の作業を行うことができず、常にケアを受けなければ生きることができなくなるほど重篤になる。根底にある生化学的変化について多くのことが知られているが、ＡＤの原因は未だ不明であり、現在ＡＤの治療法は存在していない。本明細書で論じる通り、早期にＡＤを診断するための信頼できるバイオマーカーも、信頼できる疾患進行のバイオマーカーも存在していない。ＡＤの治療に一般的に使用される治療剤は、疾患の進行を減速させ、幾つかの症状及び／又は徴候を緩和するが、患者を治癒させはしない。
混合型認知症としても知られている血管性認知症を伴うアルツハイマー病は、ＡＤ及び血管性認知症、すなわち、脳への血液供給の低減によって引き起こされる認知崩壊の両方を含む、遭遇することの多い併存疾患である。血管性認知症症状を伴うアルツハイマー病では、記憶及び言語の障害、集中力及び注意力の喪失、論理的思考及び判断の障害、視覚認知の問題等の認知症の症状は、二重の原因によって増強される。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体は、アミロイドベータ（β）ペプチド（βペプチド）（例えば、ベータ（β）４０及び／又はベータ（β）４２及び／又はベータ（β）４３）；及び／又はアミロイド軽鎖；及び／又は血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）；及び／又は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）；及び／又はトランスサイレチン；及び／又はベータ（β）２ミクログロブリン；及び／又はアミリン；及び／又はプリオンタンパク質；及び／又はシスタチンＣ（ＣＳＴ３）；及び／又はアポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）；及び／又はフィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）；及び／又はリゾチーム（ＬＹＺ）；及び／又はオンコスタチン－Ｍ特異的受容体サブユニットベータ（ＯＳＭＲ）；及び／又は内在性膜タンパク質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）；及び／又はプロラクチン；及び／又はケラトエピテリン；及び／又は心房性ナトリウム利尿因子；及び／又はカルシトニン；及び／又はハンチンチン；及び／又はアルファ（α）－シヌクレイン；及び／又はインスリンを含むリストから選択される１つ以上のペプチド又はタンパク質を含む。
一実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、個々のアミロイド凝集体はアミロイドベータ（β）ペプチド、例えば、β４０及び／又はβ４２及び／又はβ４３を含む。好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、個々のアミロイド凝集体はβ４０及びβ４２を含む。別の好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、個々のアミロイド凝集体はβ４０を含む。更に別の好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、個々のアミロイド凝集体はβ４２を含む。追加の別の実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、個々のアミロイド凝集体はβ４０及び／若しくはβ４２のみを含むか、又は他のペプチド及び／若しくはタンパク質との共凝集体である。
本発明の様々な実施形態では、
－ アミロイド関連疾患はアミロイド軽鎖アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はアミロイド軽鎖を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は多発性骨髄腫であり、個々のアミロイド凝集体はアミロイド軽鎖を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は炎症であり、個々のアミロイド凝集体は血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）アミロイドーシスであり
、個々のアミロイド凝集体は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は腎不全であり、個々のアミロイド凝集体は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は多発ニューロパシーを伴うトランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）又はＳｋｅｌｌｅｆｔｅｓｊｕｋａｎとしても知られている）であり、個々のアミロイド凝集体はトランスサイレチンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）であり、個々のアミロイド凝集体はトランスサイレチンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は血液透析関連アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はベータ（β）２ミクログロブリンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は２型糖尿病であり、個々のアミロイド凝集体はアミリンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患はプリオン病であり、個々のアミロイド凝集体はプリオンタンパク質を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は脳アミロイドアンギオパシーであり、個々のアミロイド凝集体はシスタチンＣ（ＣＳＴ３）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は家族性内蔵アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はアポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、及び／若しくはフィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、及び／若しくはリゾチーム（ＬＹＺ）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は原発性皮膚アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はオンコスタチン－Ｍ特異的受容体サブユニットベータ（ＯＳＭＲ）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は脳アミロイドアンギオパシーであり、個々のアミロイド凝集体は内在性膜タンパク質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患はプロラクチノーマであり、個々のアミロイド凝集体はプロラクチンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は家族性角膜アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はケラトエピテリンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は心房の老人性アミロイドであり、個々のアミロイド凝集体は心房性ナトリウム利尿因子を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は甲状腺髄様がんであり、個々のアミロイド凝集体はカルシトニンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患はハンチントン病であり、個々のアミロイド凝集体はハンチンチンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患はパーキンソン病であり、個々のアミロイド凝集体はアルファ（α）－シヌクレインを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は医薬品インスリン誘発性アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はインスリンを含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、個々のアミロイド凝集体は銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含む；並びに／又は
－ アミロイド関連疾患は全身性アミロイドーシスであり、個々のアミロイド凝集体はモノクローナル免疫グロブリン（Ｉｇ）軽（Ｌ）鎖若しくはＬ鎖断片を含む。
アミロイド凝集体は主に一種類のペプチド又はタンパク質を含み得る（例えば、アミロイド関連疾患がアミロイド軽鎖アミロイドーシスであるとき、個々のアミロイド凝集体は主にアミロイド軽鎖を含み得る）が、幾つかの状況では、アミロイド凝集体は、追加の種類のペプチド及び／又はタンパク質を含んでいてもよいことが理解される。
一実施形態では、（特に、アミロイド関連疾患がアルツハイマー病である場合）該方法
は、更に、
－ サンプル中のＴａｕタンパク質の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該決定に基づいて、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する工程と；
を含む。
Ｔａｕは、神経変性のマーカーであり、アルツハイマー病の診断及び予後診断において使用することができ、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、唾液、及び尿等の体液中で検出することができる（Ｈｅｉ－Ｎｇａ Ｃｈａｎ，Ｄｉ Ｘｕ，Ｓｅｅ－Ｌｏｋ Ｈｏ，Ｍａｎ Ｓｈｉｎｇ Ｗｏｎｇ ＯＲＣＩＤ ｌｏｇｏ＊ ａｎｄ Ｈｕｎｇ－Ｗｉｎｇ Ｌｉ，Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７，８，４０１２－４０１８）。個々のアミロイド凝集体に関する本明細書に記載の方法をＴａｕに関する本明細書に記載の方法と組み合わせる場合のように、一般に、バイオマーカーの同定を組み合わせると診断及び予後診断の方法を改善することができる。
一実施形態では、Ｔａｕタンパク質は、リン酸化Ｔａｕタンパク質である。
Ｔａｕタンパク質の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する一実施形態では、該方法は、五量体ホルミルチオフェン酢酸（ｐＦＴＡＡ）等のＴａｕの存在下で結合及び／又は会合及び／又は反応する更なる検出剤を添加する工程を更に含む。
ｐＦＴＡＡを使用してＴａｕを検出する方法は、Ｂｒｅｌｓｔａｆｆ及び共同研究者によって記載されている（Ｂｒｅｌｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５ Ｍａｙ ２９；９：１８４）。Ｔａｕタンパク質の検出に関する追加の指針は、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｈｅｉ－Ｎｇａ Ｃｈａｎ，Ｄｉ Ｘｕ，Ｓｅｅ－Ｌｏｋ Ｈｏ ，Ｍａｎ Ｓｈｉｎｇ Ｗｏｎｇ ＯＲＣＩＤ ｌｏｇｏ＊ ａｎｄ Ｈｕｎｇ－Ｗｉｎｇ Ｌｉ，Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７，８，４０１２－４０１８）に見出すことができる。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、個々のアミロイド凝集体分解能において行われる。
「個々のアミロイド凝集体分解能」には、該方法がサンプル中の単一のアミロイド凝集体を検出及び／若しくは測定すること（すなわち、該方法が、サンプル中の多数の個々のアミロイド凝集体を同時には検出及び／若しくは測定しない）、及び／又は該方法がサンプル中の各個々のアミロイド凝集体を検出及び／若しくは測定することが含まれる。あるいは、「個々のアミロイド凝集体分解能」は、「単一粒子分解能」又は「単一分子分解能」と称される場合もある。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、時間分解検出を含む。言い換えれば、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、時間分解検出を使用して行われる。「時間分解検出」法は、化学分野の当業者に周知であり、本明細書の実施例に詳細に記載される。実施例で論じられる通り、時間分解検出は、本明細書に記載の方法で使用するのに特に有効である。
一実施形態では、該方法は、蛍光相関分光法に基づく分析手段を包含し、この場合、観察体素において観察される分子／粒子／凝集体の数は、個々の分子／粒子／凝集体が測定されるシグナルに実質的に寄与できる程度に十分に少ない。体素における分子／粒子／凝集体の数は、好ましくは、約１０００未満、約５００未満、約１００未満、例えば、約５０未満、約２５未満であるはずである。体素において観察される分子／粒子／凝集体の数は、特に、観察体素のサイズ（体積）及び溶液中の凝集体の濃度の関数である。観察体素における分子／粒子／凝集体の数が増加するにつれて、個々の凝集体の測定されるシグナルに対する寄与が低下する。体素における凝集体が多いと、個々の凝集体の測定されるシグナルに対する相関性は低く、最終的には、ゼロになる。しかし、分子／粒子／凝集体の数が少ない場合、観察体素を通る個々の分子／粒子／凝集体の通過が観察される。この場合、測定されるシグナルは、従って、単一事象発生（ｓｅｏ）と称される場合もある。
また、凝集体は高い蛍光収率を有することも有利であり、これは、検出化合物単独では蛍光を発しない／弱い蛍光しか発しないが、高い蛍光収率を有する包含化合物を得るために対象となる個々のアミロイド凝集体と会合することができる検出剤を有することが好ましいことを示す。高い蛍光収率を有する検出剤は、より低いエネルギーレベルに戻ったときに多数の光子を提供することができる。蛍光相関分光法に基づく分析は、単一光子感度を有する検出器を含むことが更に有益である。
実施形態によれば、分析の前にアミロイドペプチド（タンパク質）、アミロイドモノマー、アミロイドマルチマー、アミロイド凝集体、アミロイド巨大凝集体等の任意のアミロイド性化合物を増幅させる必要はない。具体的には、単一分子（粒子）分解能を提供する分析技術を実行する場合、アミロイド性実体を更に増幅させる必要はない。従って、単一分子分解能蛍光分光法等の蛍光分光分析を含む本発明の方法では、アミロイド増幅工程を実行する必要はない。
より更なる実施形態によれば、該方法は、非標的アミロイドの分子／ペプチド／タンパク質／凝集体（アミロイド実体）を使用する必要がない、又は標的アミロイドの分子／ペプチド／タンパク質／凝集体と非標的アミロイドの分子／凝集体とを混合することを含む工程を含む必要がない。非標的アミロイド実体は、分析される体液に由来するものではない任意のアミロイド実体又は分析される体液由来の操作されたアミロイド実体を含む。非標的アミロイド実体の例としては、組み換え的に形成されたアミロイド実体、又は（分析される体液中にみられるアミロイド実体から生じ得る）病的沈着物に由来するアミロイド実体が挙げられる。非標的アミロイド実体と標的アミロイド実体との混合によって集塊（重合）が誘導されて、凝集したアミロイドの量が増幅する。
従って、実施形態は、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断する方法であって、
－ 該被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と；
－ 該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
を含み、
非標的アミロイド実体（非標的アミロイドの分子及び／又はペプチド及び／又はタンパク質及び／又は凝集体）を使用する必要がない方法に関する。
時間分解検出では、「個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程は、サンプル全体に対して同時には行われない。その代わり、サンプルの１つの画分を１回に測定し、単位時間にわたって多数のサンプルの画分を測定する。幾つかの実施形態では、測定されるサンプルの画分は、下記の通り「観察体素
」である。時間分解検出を使用するとき、サンプルの画分内に存在する個々のアミロイド凝集体のみが測定及び／又は検出される。従って、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズは、個々のアミロイド凝集体が検出及び／若しくは測定されるサンプル画分の頻度に基づいて、並びに／又は個々のアミロイド凝集体の特徴に基づいて決定される。理解される通り、「時間分解検出」は、マイクロ秒以下の分解能を有する光子計数と定義することができる。
従って、一実施形態では、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程は、サンプル中（例えば、サンプルの画分中）の個々のアミロイド凝集体の頻度（例えば、発生頻度）を決定することを含み、この場合、該方法は、時間分解検出を使用して行われる。
この実施形態では、個々のアミロイド凝集体の頻度が高いほど、個々のアミロイド凝集体の量及び／又は濃度が多くなる。測定頻度の概念については本明細書で説明され（特に、実施例において）、本明細書に記載の本発明の各態様に適用可能である。
更なる実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、単位時間における個々のアミロイド凝集体の頻度を決定することを含む。
幾つかの実施形態では、個々のアミロイド凝集体の頻度は、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度と称される。単一事象発生（ｆＳＥＯ）とアミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断との関連を表１に例示する。単一事象発生は、個々のアミロイド凝集体の検出と同等である。一実施形態では、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度は、個々のアミロイド凝集体の濃度に比例し得る。関連する実施形態では、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度は、単位時間あたりの単一事象発生の平均数として計算される。
一実施形態では、単位時間は、約０．０５マイクロ秒（μｓ）以上；例えば、約０．１μｓ以上；約０．１５μｓ以上；約０．２μｓ以上；約０．２５μｓ以上；約０．３μｓ以上；約０．３５μｓ以上；約０．４μｓ以上；約０．４５μｓ以上；約０．５μｓ以上；約０．６μｓ以上；約０．７μｓ以上；約０．８μｓ以上；約０．９μｓ以上；約１μｓ以上；約１．５μｓ以上；約２μｓ以上；約２．５μｓ以上；約３μｓ以上；約４μｓ以上；約５μｓ以上；約６μｓ以上；約７μｓ以上；約８μｓ以上；約９μｓ以上；約１０μｓ以上；約２０μｓ以上；約３０μｓ以上；約４０μｓ以上；約５０μｓ以上；約６０μｓ以上；約７０μｓ以上；約８０μｓ以上；約９０μｓ以上；約０．１ミリ秒以上；約０．２ミリ秒以上；約０．３ミリ秒以上；約０．４ミリ秒以上；約０．５ミリ秒以上；約０．６ミリ秒以上；約０．７ミリ秒以上；約０．８ミリ秒以上；約０．９ミリ秒以上；約１ミリ秒以上；約２ミリ秒以上；約３ミリ秒以上；約４ミリ秒以上；約５ミリ秒以上；約６ミリ秒以上；約７ミリ秒以上；約８ミリ秒以上；約９ミリ秒以上；約１０ミリ秒以上；約２０ミリ秒以上；約３０ミリ秒以上；約４０ミリ秒以上；約５０ミリ秒以上；約６０ミリ秒以上；約７０ミリ秒以上；約８０ミリ秒以上；約９０ミリ秒以上；約０．１秒以上；約０．２秒以上；約０．３秒以上；約０．４秒以上；約０．５秒以上；約０．６秒以上；約０．７秒以上；約０．８秒以上；約０．９秒以上；約１秒以上；約２秒以上；約３秒以上；約４秒以上；約５秒以上；約６秒以上；約７秒以上；約８秒以上；約９秒以上；約１０秒以上；約２０秒以上；約３０秒以上；約４０秒以上；約５０秒以上；約６０秒以上；約１２０秒以上；約１８０秒以上；約２４０秒以上；約３００秒以上；約３６０秒以上；約４２０秒以上；約４８０秒以上；約５４０秒以上；約６００秒以上；約１２００秒以上；約１８００秒以上；約２４００秒以上；約３０００秒以上；又は約３６００秒以上、好ましくは、約０．２μｓ以上又は３，０００秒以上である。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体の頻度（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度）が、約０．１以上；例えば：約０．２以上；約０．３以上；約０．４以上；約０．５以上；約０．６以上；約０．７以上；約０．８以上；約０．９以上；約１以上；約１．１以上；約１．２以上；約１．３以上；約１．４以上；約１．５以上；約１．６以上；約１．７以上；約１．８以上；約１．９以上；約２以上；約２．２以上；約２．４以上；約２．６以上；約２．８以上；約３以上；約３．２以上；約３．４以上；約３．６以上；約３．８以上；約４以上；約４．２以上；約４．４以上；約４．６以上；約４．８以上；約５以上；約５．５以上；約６以上；約６．５以上；約７以上；約７．５以上；約８以上；約８．５以上；約９以上；約９．５以上；又は約１０以上、好ましくは、約１．５以上である場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
更なる実施形態では、個々のアミロイド凝集体の頻度（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度）が、約０．１×１０－３ｓ－１以上；例えば：約０．２×１０－３ｓ－１以上；約０．３×１０－３ｓ－１以上；約０．４×１０－３ｓ－１以上；約０．５×１０－３ｓ－１以上；約０．６×１０－３ｓ－１以上；約０．７×１０－３ｓ－１以上；約０．８×１０－３ｓ－１以上；約０．９×１０－３ｓ－１以上；約１×１０－３ｓ－１以上；約１．１×１０－３ｓ－１以上；約１．２×１０－３ｓ－１以上；約１．３×１０－３ｓ－１以上；約１．４×１０－３ｓ－１以上；約１．５×１０－３ｓ－１以上；約１．６×１０－３ｓ－１以上；約１．７×１０－３ｓ－１以上；約１．８×１０－３ｓ－１以上；約１．９×１０－３ｓ－１以上；約２×１０－３ｓ－１以上；約２．２×１０－３ｓ－１以上；約２．４×１０－３ｓ－１以上；約２．６×１０－３ｓ－１以上；約２．８×１０－３ｓ－１以上；約３×１０－３ｓ－１以上；約３．２×１０－３ｓ－１以上；約３．４×１０－３ｓ－１以上；約３．６×１０－３ｓ－１以上；約３．８×１０－３ｓ－１以上；約４×１０－３ｓ－１以上；約４．２×１０－３ｓ－１以上；約４．４×１０－３ｓ－１以上；約４．６×１０－３ｓ－１以上；約４．８×１０－３ｓ－１以上；約５×１０－３ｓ－１以上；約５．５×１０－３ｓ－１以上；約６×１０－３ｓ－１以上；約６．５×１０－３ｓ－１以上；約７×１０－３ｓ－１以上；約７．５×１０－３ｓ－１以上；約８×１０－３ｓ－１以上；約８．５×１０－３ｓ－１以上；約９×１０－３ｓ－１以上；約９．５×１０－３ｓ－１以上；又は約１０×１０－３ｓ－１以上、好ましくは、約１．５×１０－３ｓ－１以上である場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
好ましい実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、約５０分間以上の単位時間における個々のアミロイド凝集体の頻度を決定することを含み、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度が約１．５（例えば、１．５×１０－３ｓ－１）以上である場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
一実施形態では、単一事象発生（ｆＳＥＯ）及び減衰時間、すなわち、拡散時間（τＤ）の特徴は、それぞれ、個々のアミロイド凝集体の量及びサイズと比例し得る。単一事象発生（ｆＳＥＯ）の特徴には、単一事象発生のシグナル（又は強度）が含まれる。減衰時間の特徴には、拡散時間（τＤ）の強度が含まれる。
拡散時間の分布から、分子／粒子／凝集体のサイズのプロファイルを各個々について決定することができる。サイズの分布は、疾患状態に反映され得、疾患進行についての情報を提供することができる。
一実施形態では、単一事象発生（ｆＳＥＯ）の減衰時間又は拡散時間（τＤ）が増加した場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
単一事象発生（例えば、１つずつ個々の構造化可溶性アミロイド凝集体の通過）を観察することによって、アミロイド凝集体が観察体素を通過するのにかかる時間を分析することが可能になる（例えば、個々の蛍光強度バーストの幅を分析するために）。構造化可溶性凝集体が大きいほど、その動きは緩徐になり、バーストは広くなる。構造化可溶性アミロイド凝集体が観察体素を通過するのにかかる平均時間を決定するために、時間的自己相関を使用してシグナルを解析し、時間的自己相関曲線（ｔＡＣＣ）を導出する。ｔＡＣＣの特徴的な減衰時間は、小さな構造化可溶性アミロイド凝集体については短く、大きな構造化可溶性アミロイド凝集体については長い。
従って、一実施形態では、「サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」工程は、特に、該方法が個々のアミロイド凝集体の頻度を決定することを含む場合、時間的自己相関曲線（ｔＡＣＣ）を提供することを含む。ｔＡＣＣを提供する（又は導出する）方法についての更なる説明は、実施例に提供される。
図６に提示するデータ解析は、２つの群について記録されたｔＡＣＣ間の特徴的な減衰時間において明らかな差を示し、患者群では減衰時間が顕著に長い。正規化されたｔＡＣＣの評価は、分析される系が複雑ではなく、かつサイズが均一な粒子を含有するのではなく、異なるサイズの粒子の混合物を含有することを示す。対照群におけるアミロイド凝集体（ＴｈＴに結合している）の平均拡散時間は約５ｍｓであり、患者群における粒子の平均拡散時間は約１５ｍｓである。これは、アミロイド凝集体における分子量の差が、２つの群間で約２７倍であることを示す。従って、患者群は、より多数のナノプラークに加えて、血清中により大きなＴｈＴ活性構造化凝集体を保有している可能性がある。
一実施形態では、１つ以上の対照サンプル（以下に記載の通り、このような１つ以上のサンプルは１以上の対照被験体に由来する）と比較したときにサンプルにおける減衰時間（特にｔＡＣＣの減衰時間）が長い場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
一実施形態では、サンプル中のアミロイド凝集体の分子量が、１つ以上の対照サンプル（以下に記載の通り、このような１つ以上のサンプルは１以上の対照被験体に由来する）と比較したときに約２倍以上大きい；例えば：約３倍以上大きい；約４倍以上大きい；約５倍以上大きい；約６倍以上大きい；約７倍以上大きい；約８倍以上大きい；約９倍以上大きい；約１０倍以上大きい；約１１倍以上大きい；約１２倍以上大きい；約１３倍以上大きい；約１４倍以上大きい；約１５倍以上大きい；約１６倍以上大きい；約１７倍以上大きい；約１８倍以上大きい；約１９倍以上大きい；約２０倍以上大きい；約２１倍以上大きい；約２２倍以上大きい；約２３倍以上大きい；約２４倍以上大きい；約２５倍以上大きい；約２６倍以上大きい；約２７倍以上大きい；約２８倍以上大きい；約２９倍以上大きい；又は約３０倍以上大きい、好ましくは、約２７倍以上大きい場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
一実施形態では、減衰時間（すなわち、拡散時間（τＤ））（特に、ｔＡＣＣの減衰時間）が約６ｍｓ以上；例えば：約７ｍｓ以上；約８ｍｓ以上；約９ｍｓ以上；約１０ｍｓ以上；約１１ｍｓ以上；約１２ｍｓ以上；約１３ｍｓ以上；約１４ｍｓ以上；約１５ｍｓ以上；約１６ｍｓ以上；約１７ｍｓ以上；約１８ｍｓ以上；約１９ｍｓ以上；又は約２０ｍｓ以上、好ましくは、約１５ｍｓ以上である場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
別の実施形態では、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、全内部蛍光顕微鏡観察（ＴＩＲＦ）；及び／又は画像相関分光法；
及び／又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び／又は超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）を含む。言い換えれば、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、全内部蛍光顕微鏡観察（ＴＩＲＦ）；及び／又は画像相関分光法；及び／又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び／又は超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）を用いて行われる。好ましくは、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定は、全内部反射蛍光顕微鏡観察（ＴＩＲＦ）及び画像相関分光法を含む。
蛍光相関分光法は、単一の粒子／凝集体／分子の分解能を提供する好適な方法論である。単一分子分解能をうまく達成するためには、好適な検出器によって検出される観察体素が小さいことが重要である。観察体素が小さいほど、所与の瞬間に存在する／観察される粒子の数が少ない。従って、シグナル対バックグラウンド比は、観察体素サイズの減少とともに改善される。小さな観察体素を達成するための１つの選択肢は、サンプルと検出器との間の光学経路に特定の配置の光学素子、例えば、共焦点顕微鏡における共役焦点面配置を有することである。このようにして得られた共焦点観察体素の体積は、約１０－１１リットルよりも小さく、典型的には、約１０－１３～約１０－１６リットルである。図１～１４は、共焦点光学配置を使用して得られたデータを例示する。
全内部反射（ＴＩＲ）の実現によって、更により小さな観察体素を達成することができる。ＴＩＲを提供するための１つの代替案は、光学素子の後方焦点面に集光して、光学素子の（主な）光軸に対して角度をなす典型的には平行な出射光を生成することである。光学素子の後方焦点面における入射光の集束の位置に依存して、出射光の光学素子の光軸に対する角度は変化する。光学素子は、好適には、対物レンズである。出射光のＴＩＲを提供するための対物レンズは、好適には約０．９超、約１．０超、約１．１超、約１．２超の高い開口数を有することが好ましい。開口数は、最高約２．０であってよい。
非常に小さな観察体素を提供するための更なる可能性は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）光学配置の実現である。ここでは、特定の波長及び明確な強度プロファイルの光（中心に強度最小値を有する）を使用して、蛍光が発せられる体積を低減する（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２０１１ １０１（７）：１６５１－１６６０ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１１．０９．００６．）。
非常に小さな観察体素を提供するための更に別の可能性は、スペクトルのＵＶ－ＶＩＳ領域からの電磁放射線を本質的に遮断することができる材料の薄層が沈着している透明基材の実現である（図１５及び１６）。電磁放射線遮断能を有する薄層は、透明基材にまで至る複数の開口部を有して、有効にウェルを形成する（図１７）。開口部の寸法は、衝突電磁放射線から生じるエバネッセント場のみが進行することができるようなものである。全内部反射なしにエバネッセント場が生成される現象は、ウェルの寸法、例えばその直径が、入射光の波長よりも小さい場合に生じる。典型的には、開口部は、衝突光の波長よりも小さな直径を有する透明基材によって限定される円形状のウェル底部に一致する円形状を有する。ウェル底部の面積に依存して、体素をゼプトリットル（１０－２１リットル）まで小さくすることができる。約３０～８０ｎｍのウェル底部の直径から、約１０×１０－２１リットル～約１００×１０－２１リットル以下の体素が生じる（図１７ｂ、ｃ）。好ましくは円形に成形された複数のウェルを含む電磁放射線遮断薄層を有するこれら基材は、ゼプトリットル導波管と称される場合もある。電磁放射線遮断材料は、蛍光分光法で使用するのに好適な電磁放射線を本質的に遮断することができる任意の好適な材料であってよい。好適な電磁放射線遮断材料は、蒸着プロセスに適した金属である。電磁放射線遮断層は、幾つかの異なる金属の層を含み得る。時に、金属層（複数可）を透明基材によりうまく固定する目的で、透明基材と主（一次）金属層との間に第２の金属層が配置される。金属の例としては、任意の所与の波長で透過率を著しく低下させる金属が挙げられる。
好適な金属は、アルミニウム、クロム、金である。特定の金属の層の厚さは、金属及び波長の関数である。二重金属層の例は、金と透明基材との間にクロムが位置するクロム－金層である。透明基材は、好適には、融解石英等の二酸化ケイ素含有材料である。ゼプトリットル導波管は、典型的には、ナノサイズの複数のウェルを有する。ゼプトリットル導波管は、数百万個のナノウェルを有し得る。各ナノウェルは、各別々の単一光子計数ピクセルが導波管の各ナノウェルに整列するように、（場合により）単一光子アバランシェ発光ダイオードのアレイと整列させてもよい。従って、ゼプトリットル導波管の実現は、蛍光相関分光法の領域における前代未聞のシグナル対ノイズ比及び超並列化の能力を提供する。
共焦点体素を使用する蛍光相関分光法は、光の入射ビームを光ビームのアレイ（複数の光ビーム）に分割することができる光学素子の実現によって並列化することができる。ビームを分割するための好適な光学素子は、回折光学素子（ＤＯＥ）である。図１８は、回折光学素子（ＤＯＥ）を含む超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）のための機器における光学配置を示す。ＤＯＥは、高開口数対物レンズを通過した後、サンプル中に１０２４の共焦点体素を提供する光ビームのアレイ（ここでは３２×３２）を提供する。ＤＯＥは、任意の好適な数の二次ビームを提供するように構成されてもよい。好適なＤＯＥを用いると、約１０，０００以下の個々のビーム、約１００，０００以下、そして、更には１００万以下の個々のビームを容易に提供することができる。更に、多重共焦点配置を使用することによって、測定時間を著しく、例えば３０００ｓ（図１～１４）から６０ｓ（図１８及び１９）に短縮することができ、拡散時間の分布（図１９Ｃ）を効率的に導出することができる。次に、これにより、各個々について、高い統計的確実性で、分子／粒子／凝集体のサイズ分布プロファイルを決定することが可能になる。これは、どのくらい疾患が進行しているかを判定するため及び／又はどのくらい疾患が進行するかを予測するために大変有益である。
全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡観察；及び／又は画像相関分光法；及び／又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、及び／又は超並列蛍光相関分光法（ｍｐＦＣＳ）の方法は、物理学／物理化学分野の当業者には公知である。
一実施形態では、時間分解検出は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を含み、これは、データを解析するために時間的自己相関分析を使用している。言い換えれば、時間分解検出は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用して実行される。「蛍光相関分光法（ＦＣＳ）」は、化学分野の当業者に公知である蛍光を検出するために使用される方法であり、本明細書の実施例で詳細に説明される。実施例で論じられる通り、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、本発明の方法で使用するのに特に有効である。
一実施形態では、ＦＣＳは、マルチプレックスＦＣＳである。マルチプレックスＦＣＳは、１超のサンプルを同時に測定できるようにすることによってより多くのサンプルを測定することを可能にし、従って、方法の処理量を増加させるので有利である。
一実施形態では、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって検出される蛍光は、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを表す。好ましい実施形態では、該方法は、蛍光部分を含む検出剤をサンプルに添加する工程を更に含み、該蛍光部分によって発せられる蛍光は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって検出され、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを表す。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体の頻度は、蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）を使用して計算される。ＦＩＦＡは、単位時間あたりのピーク（すなわち、個々のアミロイド凝集体）数として計算することができ、該ピークは、以下で論じる通り、対照サンプ
ル、例えば「サンプル中の蛍光の対照レベル」の少なくとも標準偏差２個分又は５個分よりも大きい強度を有する（好ましくは、少なくとも対照サンプルの標準偏差の５倍大きい）。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度が、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度よりも多い場合；並びに／又は
該サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズが、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも大きい場合、該アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
本発明の一部として使用するのに好適な対照サンプルは、生物学又は医学分野の当業者に公知であり、本明細書に概説する対照が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、対照サンプルは、１以上の対照被験体由来の対照サンプル；インビトロ対照サンプル；陰性対照サンプル；及びサンプル中の蛍光の対照レベルを含むか又はからなるリストから選択される１つ以上である。
「対照被験体」には、アミロイド関連疾患を有しない被験体が含まれる。本発明の方法では、対照被験体は、年齢及び／又は性別が一致していてよい。好ましくは、対照被験体は、被験体と比較したときに年齢及び／又は性別が一致している。「年齢及び／又は性別が一致している」には、全員が同じ又は同様の年齢及び／又は性別になるように対照被験体を選択することが含まれる。本発明の方法のために適切な対照被験体を選択する方法は、医学分野の当業者に公知である。
「インビトロ対照サンプル」には、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズが既知であるように研究室で調製された対照サンプルが含まれる。このようなインビトロ対照サンプルを生成する方法は、化学分野の当業者に公知であり、例えば、個々のアミロイド凝集体を形成することができるペプチド及びタンパク質モノマーの生成は、固相合成を使用して行ってよい。
「陰性対照サンプル」には、対照サンプルを体液サンプルから取り分け、検出剤が添加されていない対照サンプルに対して本明細書に記載の方法を行うことが含まれる。例えば、体液サンプルを２つ（以上の）体積に分割し、第１の体積を検出剤が添加された「体液のサンプル」とし、第２の体積を検出剤が添加されていない「陰性対照サンプル」とする。従って、この対照サンプルは、方法の実験条件下におけるサンプルについてのバックグラウンド読み取り値を提供する。
本明細書で論じる通り、本発明の特に好ましい実施形態は、時間分解検出及び蛍光を使用してサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定することである。この方法を使用して、本明細書に記載の方法の対象である体液の同じサンプルにおける蛍光の対照（又はバックグラウンド）レベルを決定することができ、これについては以下で更に論じる。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度は、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズよりも約２０％以上多い；例えば：約２５％以上多い；約３０％以上多い；約３５％以上多い；約４０％以上多い；約４５％以上多い；約５０％以上多い；約５５％以上多い；約６０％以上多い；約６５％以上多い；約７０％以上多い；約７５％以上多い；約８０％以上多い；約８５％以上多い；約９０％以上多い；約９５％以上多い、好ましくは、約５０％以上多い、及び／又は
サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも約２０％以上大きい；例えば：約２５％以上大きい；約３０％以上大きい；約３５％以上大きい；約４０％以上大きい；約４５％以上大きい；約５０％以上大きい；約５５％以上大きい；約６０％以上大きい；約６５％以上大きい；約７０％以上大きい；約７５％以上大きい；約８０％以上大きい；約８５％以上大きい；約９０％以上大きい；約９５％以上大きい、好ましくは、約５０％以上大きい。
サンプル中の個々のアミロイド凝集体が対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも「大きい」というとき、サンプル中の個々のアミロイド凝集体が、対照サンプル中にみられる凝集体よりも凝集体１個あたりのペプチドがより多い及び／又は高分子量を有することが含まれる。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約１０倍以上；例えば：分子量の約１１倍以上；分子量の約１２倍以上；分子量の約１３倍以上；分子量の約１４倍以上；分子量の約１５倍以上；分子量の約１６倍以上；分子量の約１７倍以上；分子量の約１８倍以上；分子量の約１９倍以上；分子量の約２０倍以上；分子量の約２１倍以上；分子量の約２２倍以上；分子量の約２３倍以上；分子量の約２４倍以上；分子量の約２５倍以上；分子量の約２６倍以上；分子量の約２７倍以上；分子量の約２８倍以上；分子量の約２９倍以上；分子量の約３０倍以上；分子量の約３５倍以上；分子量の約４０倍以上；分子量の約４５倍以上；又は対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約５０倍以上、好ましくは、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約２７倍以上である。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度は、対照サンプル中よりも約２倍以上多い；例えば、対照サンプル中よりも約３倍以上多い；約４倍以上多い；約５倍以上多い；約６倍以上多い；約７倍以上多い；約８倍以上多い；約９倍以上多い；約１０倍以上多い、好ましくは、対照サンプル中よりも約５倍以上多い；並びに／又はサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、対照サンプル中よりも約２倍以上大きい；例えば、対照サンプル中よりも約３倍以上大きい；約４倍以上大きい；約５倍以上大きい；約６倍以上大きい；約７倍以上大きい；約８倍以上大きい；約９倍以上大きい；約１０倍以上大きい、好ましくは、対照サンプル中よりも約５倍以上大きい。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度は、対照サンプル中よりも標準偏差約２個分以上多い；例えば、対照サンプル中よりも標準偏差約３個分以上多い；標準偏差約４個分以上多い；約５倍以上多い；標準偏差約６個分以上多い；標準偏差約７個分以上多い；標準偏差約８個分以上多い；標準偏差約９個分以上多い；標準偏差約１０個分以上多い、好ましくは、対照サンプル中よりも標準偏差約５個分以上多い；並びに／又は
サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、対照サンプル中よりも標準偏差約２個分以上大きい；例えば、対照サンプル中よりも標準偏差約３個分以上大きい；標準偏差約４個分以上大きい；約５倍以上大きい；標準偏差約６個分以上大きい；標準偏差約７個分以上大きい；標準偏差約８個分以上大きい；標準偏差約９個分以上大きい；標準偏差約１０個分以上大きい、好ましくは、対照サンプル中よりも標準偏差約５個分以上大きい。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の量及び／又は濃度が多いほど、より深刻であると診断される及び／又はより深刻であると予後診断される。
一実施形態では、サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズが大きいほど、より深刻であると診断される及び／又はより深刻であると予後診断される。
診断及び／又は予後診断の文脈における「深刻」には、アミロイド関連疾患の発症及び／若しくは進行が急速に進行する可能性が高いこと、並びに／又は被験体がまもなくアミロイド関連疾患の１つ以上の症状を示す可能性があること、並びに／又は被験体がアミロイド関連疾患の重篤な症状を示すであろうこと、並びに／又は被験体がまもなく死亡する可能性があることが含まれる。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体のサイズは、平均サイズである。
生物学及び／又は統計学分野の当業者は、個々のアミロイド凝集体の平均サイズについて理解し、計算することができる。「平均サイズ」には、平均（ｍｅａｎ）がアベレージ平均（ａｖｅｒａｇｅ ｍｅａｎ）であることが含まれる。
当業者に理解される通り、本発明の方法で使用される体液サンプルの種類が、検出可能な個々のアミロイド凝集体のサイズをある程度決定づけ得る。例えば、体液サンプルとしての尿の場合、検出可能な個々のアミロイド凝集体の最大サイズは、糸球体濾過に起因するサイズ制限によって限定され得る。
本発明の方法では、対照サンプルは、アミロイド関連疾患を有していない１以上の対照被験体；例えば：約２以上の対照被験体；約３以上の対照被験体；約４以上の対照被験体；約５以上の対照被験体；約６以上の対照被験体；約７以上の対照被験体；約８以上の対照被験体；約９以上の対照被験体；約１０以上の対照被験体；約１１以上の対照被験体；約１２以上の対照被験体；約１３以上の対照被験体；約１４以上の対照被験体；約１５以上の対照被験体；約１６以上の対照被験体；約１７以上の対照被験体；約１８以上の対照被験体；約１９以上の対照被験体；約２０以上の対照被験体；約２５以上の対照被験体；約３０以上の対照被験体；約３５以上の対照被験体；約４０以上の対照被験体；約４５以上の対照被験体；約５０以上の対照被験体；約６０以上の対照被験体；約７０以上の対照被験体；約８０以上の対照被験体；約９０以上の対照被験体；約１００以上の対照被験体に由来する体液サンプル、好ましくは約３０以上の対照被験体に由来する体液サンプルを含み得る。
一実施形態では、２以上の対照被験体が存在する場合、対照サンプルは、２以上の対照被験体における個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの平均（好ましくは、アベレージ平均）である。
蛍光の測定及び／又は検出を使用してサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する一実施形態では、対照サンプルは、「サンプル中の蛍光の対照レベル」（例えば、「全体的なシグナル」）であり、蛍光（すなわち、蛍光シグナル）は、サンプル中の蛍光の対照レベルよりも高い蛍光のレベルを有する。言い換えれば、蛍光の対照レベルよりも高い蛍光のレベルは、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを表す。
幾つかの実施形態では、「蛍光のレベル」は、蛍光のピーク（すなわち、シグナルの標準偏差の５倍よりも大きい蛍光の測定値）、例えば、サンプル中の蛍光の対照レベルを上回る検出可能な蛍光のピークである。
一実施形態では、該方法は、サンプル中の蛍光の対照レベルを検出及び／又は測定する工程、例えば、蛍光変動を検出及び／又は測定する工程を含む。一実施形態では、「サンプル中の蛍光の対照レベルを検出及び／又は測定する」工程は、「サンプルに検出剤を添加する」工程の前に行われる。
一実施形態では、蛍光は、蛍光の対照レベルよりも約２倍以上高い；例えば、蛍光の対照レベル（例えば、「全体的なシグナル」）よりも約３倍以上；約４倍以上；約５倍以上；約６倍以上；約７倍以上；約８倍以上；約９倍以上；約１０倍以上高い、好ましくは、蛍光の対照レベル（例えば、「全体的なシグナル」）よりも約５倍以上高い蛍光のレベル（例えば、蛍光のピーク）を有する。
一実施形態では、蛍光は、蛍光の対照レベルよりも標準偏差約２個分以上高い；例えば、蛍光の対照レベル（例えば、「全体的なシグナル」）よりも標準偏差約３個分以上；標準偏差約４個分以上；標準偏差約５個分以上；標準偏差約６個分以上；標準偏差約７個分以上；標準偏差約８個分以上；標準偏差約９個分以上；標準偏差約１０個分以上高い、好ましくは、蛍光の対照レベル（例えば、「全体的なシグナル」）よりも標準偏差約５個分以上高い蛍光のレベル（例えば、蛍光のピーク）を有する。
本明細書で論じる通り、一実施形態では、蛍光の対照レベルは、サンプル中の蛍光のバックグラウンドレベルであり、これは、蛍光のバックグラウンドレベルの分散又はベースラインシグナル（これは全体的なシグナルと称される場合もある）と称される場合もある。生物学分野の当業者には理解される通り、体液のサンプルは特定のレベルの自己蛍光を有し得、これは、体液サンプル間で異なる場合がある。この例は、本願の図３に提供される。蛍光のバックグラウンドレベルは、約１３２．５ｋＨｚに起伏のある線であり、蛍光のピークは、これを上回る約１５０ｋＨｚにある。この具体例では、これら蛍光のピークは、個々のアミロイド凝集体を表すものであり、そのシグナルは、蛍光のバックグラウンドレベルの標準偏差の約５倍よりも高い。検出剤からの蛍光を検出及び／又は測定するとき、自己蛍光のバックグラウンドレベルを考慮することが時に必要であり、蛍光のバックグラウンドレベルを上回る検出及び／又は測定された蛍光は、サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを表す。
時間分解検出を使用する一実施形態では、サンプル中の蛍光の対照レベルは、時間分解検出のベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散である。この具体的な実施形態では、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散は、任意の個々のアミロイド凝集体を含まない体液のサンプルの画分（複数可）における時間分解検出測定値（複数可）又はサンプルの全体的なシグナルであり得る。全体的なシグナルは、時間分解検出の過程において測定される蛍光測定値である。従って、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散は、時間分解検出の単位時間全体にわたって提供され得る。
一実施形態では、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散を上回る蛍光の各ピーク（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ））は、個々のアミロイド凝集体を示す（好ましくは、蛍光のピークは、全体的なシグナルよりも少なくとも標準偏差５個分高い）。言い換えれば、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散を上回る蛍光の各ピーク（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ））は、頻度１を表し、２つのピークは頻度２を表す等である。特に好ましい実施形態では、蛍光のピーク（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ））は、個々のアミロイド凝集体を示すベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散（例えば、全体的なシグナル）を上回る蛍光のレベルの急激かつ一時的な上昇である。
一実施形態では、蛍光の対照レベル（例えば、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散は、時間分解検出（例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ））の単位時間全体にわたって測定された蛍光の平均レベル、好ましくはアベレージ平均である。
好ましい実施形態では、蛍光は、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散よりも約２倍以上高い；例えば、蛍光のバックグラウンドレベルの分散（例えば、全体的なシグナル）よりも約３倍以上；約４倍以上；約５倍以上；約６倍以上；約７倍以上；約８倍以上；約９倍以上；約１０倍以上高い、好ましくは、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散（例えば、全体的なシグナル）よりも約５倍以上高い蛍光のピークを有する。
好ましい実施形態では、蛍光は、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散よりも標準偏差約２個分以上高い；例えば、蛍光のバックグラウンドレベルの分散（例えば、全体的なシグナル）よりも標準偏差約３個分以上；標準偏差約４個分以上；標準偏差約５個分以上；標準偏差約６個分以上；標準偏差約７個分以上；標準偏差約８個分以上；標準偏差約９個分以上；標準偏差約１０個分以上高い、好ましくは、ベースラインシグナル又は蛍光のバックグラウンドレベルの分散（例えば、全体的なシグナル）よりも標準偏差約５個分以上高い蛍光のピークを有する。
一実施形態では、サンプルは、約３０マイクロリットル（μｌ）～約３００マイクロリットル（μｌ）の体積を有する。
一実施形態では、サンプルは、約５００マイクロリットル（μｌ）以下；例えば、約４９０マイクロリットル（μｌ）以下；約４８０マイクロリットル（μｌ）以下；約４７０マイクロリットル（μｌ）以下；約４６０マイクロリットル（μｌ）以下；約４５０マイクロリットル（μｌ）以下；約４４０マイクロリットル（μｌ）以下；約４３０マイクロリットル（μｌ）以下；約４２０マイクロリットル（μｌ）以下；約４１０マイクロリットル（μｌ）以下；約４００マイクロリットル（μｌ）以下；約３９０マイクロリットル（μｌ）以下；約３８０マイクロリットル（μｌ）以下；約３７０マイクロリットル（μｌ）以下；約３６０マイクロリットル（μｌ）以下；約３５０マイクロリットル（μｌ）以下；約３４０マイクロリットル（μｌ）以下；約３３０マイクロリットル（μｌ）以下；約３２０マイクロリットル（μｌ）以下；約３１０マイクロリットル（μｌ）以下；約３００マイクロリットル（μｌ）以下；約２９０マイクロリットル（μｌ）以下；約２８０マイクロリットル（μｌ）以下；約２７０マイクロリットル（μｌ）以下；約２６０マイクロリットル（μｌ）以下；約２５０マイクロリットル（μｌ）以下；約２４０マイクロリットル（μｌ）以下；約２３０マイクロリットル（μｌ）以下；約２２０マイクロリットル（μｌ）以下；約２１０マイクロリットル（μｌ）以下；約２００マイクロリットル（μｌ）以下；約１９０マイクロリットル（μｌ）以下；約１８０マイクロリットル（μｌ）以下；約１７０マイクロリットル（μｌ）以下；約１６０マイクロリットル（μｌ）以下；約１５０マイクロリットル（μｌ）以下；約１４０マイクロリットル（μｌ）以下；約１３０マイクロリットル（μｌ）以下；約１２０マイクロリットル（μｌ）以下；約１１０マイクロリットル（μｌ）以下；約１００マイクロリットル（μｌ）以下；約９０マイクロリットル（μｌ）以下；約８０マイクロリットル（μｌ）以下；約７０マイクロリットル（μｌ）以下；約６０マイクロリットル（μｌ）以下；約５０マイクロリットル（μｌ）以下；約４０マイクロリットル（μｌ）以下；約３０マイクロリットル（μｌ）以下；約２０マイクロリットル（μｌ）以下；又は約１０マイクロリットル（μｌ）以下の体積を有する。好ましい実施形態では、サンプルは、１５０マイクロリットル（μｌ）以下の体積を有する。別の好ましい実施形態では、サンプルは、２００マイクロリットル（μｌ）以下の体積を有する。
時間分解検出（例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ））を使用して該方法を行うとき、実施例に説明する通り、サンプルを処理して観察体素（ＯＶＥ）等の画分にしてよい。
一実施形態では、画分（例えば、観察体素）は、約１マイクロリットル（μｌ）以下；
例えば、約０．１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．０１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．００１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．０００１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．００００１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．０００００１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．００００００１マイクロリットル（μｌ）以下；約０．０００００００１マイクロリットル（μｌ）以下；約１フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．１フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．２フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．３フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．４フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．５フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．６フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．７フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．８フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．９フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．０１フェムトリットル（ｆｌ）以下；約０．００１フェムトリットル（ｆｌ）以下；又は約０．０００１フェムトリットル（ｆｌ）以下、好ましくは、約０．２フェムトリットル（ｆｌ）以下の体積を有する。実施形態によれば、観察体積は、約１０－２０リットル～約１０－２２リットル、例えば、ゼプトリットルの範囲であってよい。
一実施形態では、該方法は、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度を決定している間、サンプルを循環させるためにフローセルを使用することを含む。フローセルは、顕微鏡分野の当業者に公知の装置である。時間分解検出を行っている間、フローセルを使用して、装置を通してサンプルを循環させることができる。この方法では、遭遇するナノプラークの頻度を増加させることができ、凝集体が自由に拡散するのを待つのではなく、流れによってその運動を推進する。測定を効率化することができ、従って、分析時間が短縮されるので、これは有利であり得る。記載の方法に好適な例示的なフローセルは、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ－ＵＳ（ｗｗｗ．ｗａｒｎｅｒｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）から入手することができ、例えば、ＲＣ－３０ＨＶ及びＲＣ－３０ＷＡチャンバーである。
一実施形態では、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量が、１個以上の個々のアミロイド凝集体；例えば：約２個以上の個々のアミロイド凝集体；約３個以上の個々のアミロイド凝集体；約４個以上の個々のアミロイド凝集体；約５個以上の個々のアミロイド凝集体；約６個以上の個々のアミロイド凝集体；約７個以上の個々のアミロイド凝集体；約８個以上の個々のアミロイド凝集体；約９個以上の個々のアミロイド凝集体；約１０個以上の個々のアミロイド凝集体；約１５個以上の個々のアミロイド凝集体；約２０個以上の個々のアミロイド凝集体；約２５個以上の個々のアミロイド凝集体；約３０個以上の個々のアミロイド凝集体；約５０個以上の個々のアミロイド凝集体；約１００個以上の個々のアミロイド凝集体；約２００個以上の個々のアミロイド凝集体；約３００個以上の個々のアミロイド凝集体；約４００個以上の個々のアミロイド凝集体；約５００個以上の個々のアミロイド凝集体；約１，０００個以上の個々のアミロイド凝集体；約２，０００個以上の個々のアミロイド凝集体；約３，０００個以上の個々のアミロイド凝集体；約４，０００個以上の個々のアミロイド凝集体；約５，０００個以上の個々のアミロイド凝集体；又は約１０，０００個以上の個々のアミロイド凝集体である場合、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断が提供される。
一実施形態では、該方法は、間隔をおいて、例えば、２回以上、例えば、３回以上；４回以上；５回以上；６回以上；７回以上；８回以上；９回以上；１０回以上；１１回以上；１２回以上；１３回以上；１４回以上；１５回以上；１６回以上；１７回以上；１８回以上；１９回以上；２０回以上；２５回以上；３０回以上；３５回以上；４０回以上；４５回以上；回以上；又は５０回以上繰り返される。
経時的に該方法を繰り返すことによって、診断及び／又は予後診断を経時的に追跡することができ、それによって、診断及び／又は予後診断を見直し、修正することができる。
従って、該方法を２回以上繰り返す場合、２回目及びそれ以降の繰り返しについては、決定に基づいてアミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する工程は、決定に基づいてアミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を修正する工程であってもよい。
一実施形態では、繰り返される本発明の第１の態様の方法間の期間は、１日間以上；例えば、約２日間以上；約３日間以上；約４日間以上；約５日間以上；約６日間以上；約１週間以上；約２週間以上；約３週間以上；約４週間以上；約１ヶ月間以上；約５週間以上；約６週間以上；約７週間以上；約８週間以上；約２ヶ月間以上；約３ヶ月間以上；約４ヶ月間以上；約５ヶ月間以上；約６ヶ月間以上；約７ヶ月間以上；約８ヶ月間以上；約９ヶ月間以上；約１０ヶ月間以上；約１１ヶ月間以上；約１年間以上；約２年間以上；約３年間以上；約４年間以上；約５年間以上；約６年間以上；約７年間以上；約８年間以上；約９年間以上；又は約１０年間以上、好ましくは、約１ヶ月間以上である。
一実施形態では、被験体及び／又は対照被験体は、げっ歯類（例えば、マウス及び／又はラット及び／又はハムスター及び／又はモルモット及び／又はスナネズミ及び／又はウサギ）；及び／又はイヌ科動物（例えば、イヌ）；及び／又はネコ科動物（例えば、ネコ）；霊長類（例えば、ヒト及び／又はサル及び／又は類人猿）；及び／又はウマ科動物（例えば、ウマ）；及び／又はウシ亜科動物（例えば、ウシ）；及び／又はイノシシ亜科動物（例えば、ブタ）；及び／又は非ヒト哺乳類を含む群のうちの１つ以上である。好ましくは、被験体はヒトであり、好ましくは、被験体及び対照被験体の両方がヒトである。
実施形態では、被験体及び／又は対照被験体は生存している。好ましい実施形態では、被験体は生存している。
一実施形態では、該方法は、被験体に対するアミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する工程を更に含む。
「治療を選択及び／又は提供する」には、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断に基づいて、その疾患に適切な治療を特定できることが含まれる。アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断に基づいて、医学分野の当業者は、適切な治療を選択及び／又は提供することができる。
好ましくは、「被験体に対するアミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する」工程は、「決定に基づいてアミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する」工程の後に行われる。
一実施形態では、治療は、アミロイド関連疾患の症状及び／若しくは徴候の数及び／若しくは重篤度を低減する、並びに／又はアミロイド関連疾患の原因を治療する；並びに／又は神経調節プロセスを改善する；並びに／又は神経伝達プロセスを改善する；並びに／又は個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度及び／若しくはサイズを減少させるものである。
本明細書に開示する通り、治療には、対症療法的治療、及び／又は実験的治療、及び／又は理学療法が含まれる。
一実施形態では、治療は、レボドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ）；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ、例えば、ドネペジル、ガランタミン、及びリバスチグミン）；Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）阻害剤（例えば、メマンチン）；セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）阻害剤；モノクローナル抗体（モノクローナル抗体アナログを含む）；及び／又はタファミジスを含む群から選択される１つ以上である。医学分野の当業者は、本
明細書で論じる治療について精通しており、いつ選択及び／又は提供すべきかを理解している。
ＡＣｈＥＩは、アセチルコリンエステラーゼ酵素がアセチルコリンを破壊するのを阻害し、それによって、神経伝達物質アセチルコリンの作用のレベル及び持続期間の両方を増大させる。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストメマンチンは、損傷した細胞から放出されるグルタミン酸がそれに対して放出されているＮＭＤＡ受容体を部分的にブロックすることによって、学習及び記憶に関与する脳内の重要な神経伝達物質であるグルタミン酸の活性を制御する。タファミジス（商品名Ｖｙｎｄａｑｅｌ）は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の正確に折り畳まれた四量体形態を安定化させ、それによって、疾患の個体内においてＴＴＲ凝集体が形成され、蓄積される速度を減速させる。モノクローナル抗体は、血液脳関門を通過することができ、可溶性アミロイドβ凝集体（具体的には、脳内の不溶性原線維）を選択的に標的とし、それによって、アミロイドβ凝集体の負荷を低減する。前臨床試験において、モノクローナル抗体アナログが、プラークを有するトランスジェニックマウス脳からＡβをクリアランスできることが示されている（Ｓｅｖｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１６ ５３７：５０－５６ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９３２３）。
好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患はパーキンソン病であり、治療はＬ－ＤＯＰＡを含む。
別の好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患は家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）であり、治療はタファミジスを含む。
更に別の好ましい実施形態では、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であり、治療は、セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）阻害剤及び／又はモノクローナル抗体（モノクローナル抗体アナログを含む）を含む。
一実施形態では、セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）阻害剤は、ベルベセスタットを除く。
一実施形態では、治療は、アミロイド関連疾患の治療を被験体に施すことを含む。好ましい実施形態では、「アミロイド関連疾患の治療を被験体に施す」工程は、「被験体に対するアミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する」工程の後に行われる。
本発明の第２の態様は、被験体におけるアミロイド関連疾患を治療する方法であって、
－ 該被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と；
－ 該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該決定に基づいて、該被験体を該アミロイド関連疾患を有すると同定する工程と；
－ 該被験体に対する該アミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する工程と；を含む。
本発明の第１の態様に関連して上に定義した特徴が、本発明の第２の態様の方法にも適用されることが理解されるであろう。例えば、本発明の第１の態様における「決定に基づいて、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する」に関して論じた特徴は、「決定に基づいて、被験体をアミロイド関連疾患を有すると同定する」ために使用することができる。
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、該方法は、以下の順に、
－ 該被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と；
－ 該サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該決定に基づいて、該被験体を該アミロイド関連疾患を有すると同定する工程と；
－ 該被験体に対する該アミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する工程と；を含む。
一実施形態では、治療は、アミロイド関連疾患の治療を被験体に施すことを含む。好ましい実施形態では、「アミロイド関連疾患の治療を被験体に施す」工程は、「被験体に対するアミロイド関連疾患の治療を選択及び／又は提供する」工程の後に行われる。
本発明の第３の態様は、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定する方法であって、
－ 被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 剤を該被験体に投与する工程と；
－ 該被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程と；
－ 該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
－ 該比較に基づいて、該剤を該アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
を含む方法を提供する。
「剤をアミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する」には、それまで同定されたことのない治療がアミロイド関連疾患を治療するのに有用であるかどうか；並びに／又はアミロイド関連疾患の症状及び／若しくは徴候の数及び／若しくは重篤度を低減するのに有用であるかどうか；並びに／又は神経調節プロセスを改善するのに有用であるかどうか；並びに／又は神経伝達プロセスを改善するのに有用であるかどうか；並びに／又は個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度及び／若しくはサイズを減少させるのに有用であるかどうかを判定することが含まれる。あるいは、「剤をアミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する」には、被験体に対するアミロイド関連疾患の治療の有効性を判定することが含まれる。言い換えれば、被験体におけるアミロイド関連疾患の治療の有効性を追跡することが含まれる。
本発明の第３の態様は、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定するインビボ法に関する。
本発明の第１の態様及び／又は第２の態様に関連して上に定義した特徴が、本発明の第３の態様の方法にも適用されることが理解されるであろう。例えば、本発明の第１の態様における「決定に基づいて、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する」に関して論じた特徴は、「比較に基づいて、剤をアミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する」ために使用することができる。
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、該方法は、以下の順に、
－ 試験被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 剤を該被験体に投与する工程と；
－ 該試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程と；
－ 該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
－ 該比較に基づいて、該剤を該アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
を含む。
一実施形態では、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度が、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度よりも少ない場合、並びに／又は
第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズが、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも小さい場合、剤がアミロイド関連疾患を治療するためのものと同定される。
第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体が第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも「小さい」というとき、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体が、第１のサンプル中にみられる凝集体よりも凝集体１個あたりのペプチドがより少ない又は低分子量を有することが含まれる。
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、剤の投与後に試験被験体がより少ない及び／又はより小さい個々のアミロイド凝集体を有する場合、その剤が、アミロイド関連疾患の治療において役割を有する可能性があると考える。個々のアミロイド凝集体の数及び／又はサイズの減少が大きいほど、アミロイド関連疾患の治療において剤がより有効である可能性がある。
一実施形態では、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度は、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度及び／若しくはサイズよりも約２０％以上少ない；例えば：約２５％以上少ない；約３０％以上少ない；約３５％以上少ない；約４０％以上少ない；約４５％以上少ない；約５０％以上少ない；約５５％以上少ない；約６０％以上少ない；約６５％以上少ない；約７０％以上少ない；約７５％以上少ない；約８０％以上少ない；約８５％以上少ない；約９０％以上少ない；約９５％以上少ない、好ましくは、約５０％以上少ない；並びに／又は
第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも約２０％以上小さい；例えば：約２５％以上小さい；約３０％以上小さい；約３５％以上小さい；約４０％以上小さい；約４５％以上小さい；約５０％以上小さい；約５５％以上小さい；約６０％以上小さい；約６５％以上小さい；約７０％以上小さい；約７５％以上小さい；約８０％以上小さい；約８５％以上小さい；約９０％以上小さい；約９５％以上小さい、好ましくは、約５０％以上小さい。
一実施形態では、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約１０倍以上；例えば：約１１倍以上；分子量の約１２倍以上；分子量の約１３倍以上；分子量の約１４倍以上；分子量の約１５倍以上；分子量の約１６倍以上；分子量の約１７倍以上；分子量の約１８倍以上；分子量の約１９倍以上；分子量の約２０倍以上；分子量の約２１倍以上；分子量の約２２倍以上；分子量の約２３倍以上；分子量の約２４倍以上；分子量の約２５倍以上；分子量の約２６倍
以上；分子量の約２７倍以上；分子量の約２８倍以上；分子量の約２９倍以上；分子量の約３０倍以上；分子量の約３５倍以上；分子量の約４０倍以上；分子量の約４５倍以上；又は第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約５０倍以上、好ましくは、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の分子量の約２７倍以上である。
一実施形態では、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度は、第２のサンプル中よりも約２倍以上多い；例えば、第１のサンプル中よりも約３倍倍以上多い；約４倍以上多い；約５倍以上多い；約６倍以上多い；約７倍以上多い；約８倍以上多い；約９倍以上多い；約１０倍以上多い、好ましくは、第２のサンプル中よりも約５倍以上多い；並びに／又は
第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、第２のサンプル中よりも約２倍以上大きい；例えば、第１のサンプル中よりも約３倍以上大きい；約４倍以上大きい；約５倍以上大きい；約６倍以上大きい；約７倍以上大きい；約８倍以上大きい；約９倍以上大きい；約１０倍以上大きい、好ましくは、第２のサンプル中よりも約５倍以上大きい。
一実施形態では、第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度は、第２のサンプル中よりも標準偏差約２個分以上多い；例えば、第１のサンプル中よりも標準偏差約３個分以上多い；標準偏差約４個分以上多い；約５倍以上多い；標準偏差約６個分以上多い；標準偏差約７個分以上多い；標準偏差約８個分以上多い；標準偏差約９個分以上多い；標準偏差約１０個分以上多い、好ましくは、第２のサンプル中よりも標準偏差約５個分以上多い；並びに／又は
第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズは、第２のサンプル中よりも標準偏差約２個分以上大きい；例えば、第１のサンプル中よりも標準偏差約３個分以上大きい；標準偏差約４個分以上大きい；約５倍以上大きい；標準偏差約６個分以上大きい；標準偏差約７個分以上大きい；標準偏差約８個分以上大きい；標準偏差約９個分以上大きい；標準偏差約１０個分以上大きい、好ましくは、第２のサンプル中よりも標準偏差約５個分以上大きい。
本発明の第１の態様に関して論じたのと同様に、一実施形態では、「第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」及び／又は「第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」は、単位時間における個々のアミロイド凝集体の頻度（例えば、単一事象発生（ｆＳＥＯ））を決定することを含む。好ましい実施形態では、第１のサンプル及び第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の頻度を比較し、第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の頻度が第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の頻度よりも低い場合、剤を、アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；
を間隔をおいて繰り返し、
任意で、上記工程を２回以上、例えば、３回以上；４回以上；５回以上；６回以上；７回以上；８回以上；９回以上；１０回以上；１１回以上；１２回以上；１３回以上；１４回以上；１５回以上；１６回以上；１７回以上；１８回以上；１９回以上；２０回以上；２５回以上；３０回以上；３５回以上；４０回以上；４５回以上；回以上；又は５０回以上繰り返す。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、本発明の第３の態様の比較工程における第１のサンプルは、２個以上の第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの平均（好ましくは、アベレージ平均）である。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、繰り返した工程間の期間は、１時間以上；例えば、約２時間以上；約３時間以上；約４時間以上；約５時間以上；約６時間以上；約７時間以上；約８時間以上；約９時間以上；約１０時間以上；約１１時間以上；約１２時間以上；約１３時間以上；約１４時間以上；約１５時間以上；約１６時間以上；約１７時間以上；約１８時間以上；約１９時間以上；約２０時間以上；約２１時間以上；約２２時間以上；約２３時間以上；約１日間以上；約２日間以上；約３日間以上；約４日間以上；約５日間以上；約６日間以上；約１週間以上；約２週間以上；約３週間以上；約４週間以上；約１ヶ月間以上；約２ヶ月間以上；約３ヶ月間以上；約４ヶ月間以上；約５ヶ月間以上；約６ヶ月間以上；約７ヶ月間以上；約８ヶ月間以上；約９ヶ月間以上；約１０ヶ月間以上；約１１ヶ月間以上；又は約１２ヶ月間以上である。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返し、
任意で、上記工程を２回以上、例えば、３回以上；４回以上；５回以上；６回以上；７回以上；８回以上；９回以上；１０回以上；１１回以上；１２回以上；１３回以上；１４回以上；１５回以上；１６回以上；１７回以上；１８回以上；１９回以上；２０回以上；２５回以上；３０回以上；３５回以上；４０回以上；４５回以上；回以上；又は５０回以上繰り返す。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、本発明の第３の態様の比較工程における第２のサンプルは、２個以上の第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの平均（好ましくは、アベレージ平均）である。
一実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、繰り返した工程間の期間は、１時間以上；例えば、約２時間以上；約３時間以上；約４時間以上；約５時間以上；約６時間以上；約７時間以上；約８時間以上；約９時間以上；約１０時間以上；約１１時間以上；約１２時間以上；約１３時間以上；約１４時間以上；約１５時間以上；約１６時間以上；約１７時間以上；約１８時間以上；約１９時間以上；約２０時間以上；約２１時間以上；約２２時間以上；約２３時間以上；約１日間以上；約２日間以上；約３日間以上；約４日間以上；約５日間以上；約６日間以上；約１週間以上；約２週間以上；約３週間以上；約４週間以上；約１ヶ月間以上；約２ヶ月間以上；約３ヶ月間以上；約４ヶ月間以上；約５ヶ月間以上；約６ヶ月間以上；約７ヶ月間以上；約８ヶ月間以上；約９ヶ月間以上；約１０ヶ月間以上；約１１ヶ月間以上；又は約１２ヶ月間以上である。
好ましい実施形態では、
－ 試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、試験被験体からの第２のサンプルの第１の提供は、試験被験体に剤を投与する工程の直後に行われる。
一実施形態では、試験被験体は、げっ歯類（例えば、マウス及び／又はラット及び／又はハムスター及び／又はモルモット及び／又はスナネズミ及び／又はウサギ）；及び／又はイヌ科動物（例えば、イヌ）；及び／又はネコ科動物（例えば、ネコ）；霊長類（例えば、ヒト及び／又はサル及び／又は類人猿）；及び／又はウマ科動物（例えば、ウマ）；及び／又はウシ亜科動物（例えば、ウシ）；及び／又はイノシシ亜科動物（例えば、ブタ）；及び／又は魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）；及び／又は昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ）；及び／又は両生類（例えば、アフリカツメガエル）；及び／又は爬虫類；及び／又は線虫（例えば、Ｃ．エレガンス）を含む群のうちの１つ以上である。
一実施形態では、試験被験体は、非ヒト、例えば、非ヒト哺乳類である。好ましい実施形態では、非ヒト哺乳類は、げっ歯類（例えば、マウス及び／又はラット及び／又はハムスター及び／又はモルモット及び／又はスナネズミ及び／又はウサギ）；及び／又はイヌ科動物（例えば、イヌ）；及び／又はネコ科動物（例えば、ネコ）；非ヒト霊長類（例えば、サル；及び／又は類人猿）；及び／又はウマ科動物（例えば、ウマ）；及び／又はウシ亜科動物（例えば、ウシ）；及び／又はイノシシ亜科動物（例えば、ブタ）を含む群のうちの１つ以上である。
本発明の第４の態様は、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定する方法であって、
－ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 剤を該試験流体に投与する工程と；
－ 該試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程と；
－ 該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
－ 該比較に基づいて、該剤を該アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
を含む方法を提供する。
本発明の第３の態様は、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定するインビトロ及び／又はエクスビボ法に関する。
本発明の第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様に関連して上に定義した特徴が、本発明の第４の態様の方法にも適用されることが理解されるであろう。例えば、本発明の第１の態様における「決定に基づいて、アミロイド関連疾患の診断及び／又は予後診断を提供する」に関して論じた特徴は、「比較に基づいて、剤を該アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する」ために使用することができる。同様に、本発明の第３の態様における「第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」及び／又は「第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する」に関して論じた特徴は、本発明の第４の態様に使用することもできる。
本発明の第４の態様の好ましい実施形態では、該方法は、以下の順に、
－ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 剤を該試験流体に投与する工程と；
－ 該試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程と；
－ 該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
－ 該比較に基づいて、該剤を該アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
を含む。
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、剤の投与後に試験被験体がより少ない及び／又はより小さい個々のアミロイド凝集体を有する場合、その剤が、アミロイド関連疾患の治療において役割を有する可能性があると考える。個々のアミロイド凝集体の数及び／又はサイズの減少が大きいほど、アミロイド関連疾患の治療において剤がより有効である可能性がある。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；
を間隔をおいて繰り返し、
任意で、上記工程を２回以上、例えば、３回以上；４回以上；５回以上；６回以上；７回以上；８回以上；９回以上；１０回以上；１１回以上；１２回以上；１３回以上；１４
回以上；１５回以上；１６回以上；１７回以上；１８回以上；１９回以上；２０回以上；２５回以上；３０回以上；３５回以上；４０回以上；４５回以上；回以上；又は５０回以上繰り返す。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
を間隔をおいて繰り返した場合、本発明の第４の態様の比較工程における第１のサンプルは、２個以上の第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの平均（好ましくは、アベレージ平均）である。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程；並びに
－ 該第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、繰り返した工程間の期間は、１時間以上；例えば、約２時間以上；約３時間以上；約４時間以上；約５時間以上；約６時間以上；約７時間以上；約８時間以上；約９時間以上；約１０時間以上；約１１時間以上；約１２時間以上；約１３時間以上；約１４時間以上；約１５時間以上；約１６時間以上；約１７時間以上；約１８時間以上；約１９時間以上；約２０時間以上；約２１時間以上；約２２時間以上；約２３時間以上；約１日間以上；約２日間以上；約３日間以上；約４日間以上；約５日間以上；約６日間以上；約１週間以上；約２週間以上；約３週間以上；約４週間以上；約１ヶ月間以上；約２ヶ月間以上；約３ヶ月間以上；約４ヶ月間以上；約５ヶ月間以上；約６ヶ月間以上；約７ヶ月間以上；約８ヶ月間以上；約９ヶ月間以上；約１０ヶ月間以上；約１１ヶ月間以上；又は約１２ヶ月間以上である。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返し、
任意で、上記工程を２回以上、例えば、３回以上；４回以上；５回以上；６回以上；７回以上；８回以上；９回以上；１０回以上；１１回以上；１２回以上；１３回以上；１４回以上；１５回以上；１６回以上；１７回以上；１８回以上；１９回以上；２０回以上；２５回以上；３０回以上；３５回以上；４０回以上；４５回以上；回以上；又は５０回以上繰り返す。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、本発明の第３の態様の比較工程における第２のサンプルは、２個以上のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度
及び／又はサイズの平均（好ましくは、アベレージ平均）である。
一実施形態では、
－ 試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体のアミロイドの存在及び／又は量及び／又は濃度アミロイドの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、繰り返した工程間の期間は、１時間以上；例えば、約２時間以上；約３時間以上；約４時間以上；約５時間以上；約６時間以上；約７時間以上；約８時間以上；約９時間以上；約１０時間以上；約１１時間以上；約１２時間以上；約１３時間以上；約１４時間以上；約１５時間以上；約１６時間以上；約１７時間以上；約１８時間以上；約１９時間以上；約２０時間以上；約２１時間以上；約２２時間以上；約２３時間以上；約１日間以上；約２日間以上；約３日間以上；約４日間以上；約５日間以上；約６日間以上；約１週間以上；約２週間以上；約３週間以上；約４週間以上；約１ヶ月間以上；約２ヶ月間以上；約３ヶ月間以上；約４ヶ月間以上；約５ヶ月間以上；約６ヶ月間以上；約７ヶ月間以上；約８ヶ月間以上；約９ヶ月間以上；約１０ヶ月間以上；約１１ヶ月間以上；又は約１２ヶ月間以上である。
好ましい実施形態では、
－ 試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程；
－ 第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程；並びに
－ 第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、該第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程；
を間隔をおいて繰り返した場合、試験流体からの第２のサンプルの第１の提供は、試験流体に剤を投与する工程の直後に行われる。
一実施形態では、該方法は、インビトロ及び／又はエクスビボで実施される。
一実施形態では、試験流体は、体液である。
好ましい実施形態では、試験流体は、血液、及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／又は唾液、及び／又は滑液、及び／又は糞便、及び／又は尿を含む又はからなる群のうちの１つ以上の体液であり、好ましくは血液である。
別の実施形態では、試験流体は、インビトロ試験流体である。
「インビトロ試験流体」には、試験流体が研究室で調製され、インビトロ試験流体の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズが既知であることが含まれる。
本発明の第５の態様は、例えば本明細書に定義する本発明の方法を使用して、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断するための、被験体における個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度を決定するための使用を提供する。
本発明の第６の態様は、例えば本明細書に定義する本発明の方法を使用して、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／又は予後診断するための、時間分解検出の使用を
提供する。
本発明の第７の態様は、例えば本明細書に定義する本発明の方法を使用して、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定するための、個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定するための使用を提供する。
本発明の第８の態様は、例えば本明細書に定義する本発明の方法を使用して、アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定するための、時間分解検出の使用を提供する。
本発明の第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様に関連して上に定義した特徴が、本発明の第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の使用にも適用されることが理解されるであろう。
本発明の第９の態様は、例えば本明細書に定義する本発明の方法を使用する、本発明の第１の態様及び／若しくは第２の態様及び／若しくは第３の態様及び／若しくは第４の態様の方法、並びに／又は本発明の第５の態様及び／若しくは第６の態様及び／若しくは第７の態様及び／若しくは第８の態様のうちのいずれか１つの使用のためのキットオブパーツを提供する。
一実施形態では、キットオブパーツは、
－ 本明細書に記載の検出剤、好ましくは、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）；
－ 時間分解検出のための手段、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）のための顕微鏡；及び／又は
－ 対照サンプル
を含むか又はからなるリストのうちの１つ以上を含む。
本発明の第９の態様の一実施形態では、キットオブパーツは、説明書を含む。説明書は、本明細書に記載の使用及び／又は方法及び／又は組成物に関する記述的資料、教材、マーケティング資料、又は他の文書である。
キットの情報提供文書の形態は限定されない。情報は、様々なフォーマットで提供され得、印刷されたテキスト、コンピュータ可読文書、録画、若しくは録音、又は例えばインターネットにおける実質的な文書へのリンク若しくはアドレスを提供する情報が挙げられる。
好ましい実施形態では、キットオブパーツは、被験体におけるアミロイド関連疾患を診断及び／若しくは予後診断するための並びに／又はアミロイド関連疾患を治療する剤を同定するための説明書を含む。
次に、１つ以上の非限定的な図面及び例を参照して本発明について説明する。
この明細書における見かけ上先に公開された文書の一覧又は考察は、必ずしも、該文書が現在の技術水準の一部又は技術常識であることを認めると解釈されるべきではない。
実施例１：血清における分析
概要
フェムトリットル以下のサイズの観察体素においてチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光強度ゆらぎの時間分解検出を使用することによって、見かけ上健常個体及びアルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者の血清中の非常に低レベルの小さな構造化アミロイド形成性ナ
ノプラークを単一分子感度で検出することができた。小さな構造化アミロイド形成性ナノプラークに遭遇する頻度及びそのサイズは、対照被験体よりもＡＤと診断された個体の血清中において著しく高かった。本発明者らによる試験の結果は、バルク蛍光ＴｈＴ分光法とは異なり、時間分解ＴｈＴ蛍光強度ゆらぎ分析では、血清中の小さな構造化アミロイド形成性ナノプラークの直接検出、定量、及びサイズ決定が可能であることを示す。この方法は、免疫ベースのプローブの使用にも放射性トレーサ、シグナル増幅、又はタンパク質分離技術の使用にも依存せず、末梢血循環（図１～１１及び２０～２２）、脳脊髄液（図１２）、唾液（図１３）、及び尿（図１４）を含む体液中の構造的に修飾されたタンパク質を迅速かつコスト効率よく早期に決定するための低侵襲的試験を提供する。
略記
ＡＤ－アルツハイマー病；Ａβ－アミロイドβペプチド；ＣＮＳ－中枢神経系；ＣＰＳＭ－１分子あたり１秒あたりのカウント数；ＣＳＦ－脳脊髄液；ＦＣＳ－蛍光相関分光法；ＦＩＦＡ－蛍光強度ゆらぎ分析；軽度認知機能障害－ＭＣＩ；ＯＶＥ－観察体素；Ｒｈ６Ｇ－ローダミン６Ｇ；単一事象発生－ＳＥＯ；主観的認知障害－ＳＣＩ；ｔＡＣＣ－時間的自己相関曲線；ＴｈＴ－チオフラビンＴ。
序論
アルツハイマー病（ＡＤ）は、荒廃的神経変性病であり、世界中で認知症の最も一般的な原因である（１、２）。ＡＤは、罹患した個体の生命維持に必要な知能を徐々に破壊し、認知能力を著しく低下させる。ＡＤによって誘導される損傷の程度は、罹患した人が、最終的にはもはや自身の世話をすることができなくなり、残りの人生は常にケア及び支援を必要とするほどである。残念なことに、集中的な研究及び大きな社会的要求にもかかわらず、信頼できかつコスト効率のよいＡＤの早期診断法は未だ揺籃期である。これは、新規薬物の開発の妨げにもなっており、現在ＡＤの治療法は存在していない。
更なる進展の主な障害は、ＡＤ発症の根底にある複雑な動的プロセスについての重要な基本的知見が欠けていることである。分子機序は未だ完全には理解されていないが、罹患した個体の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの構造化凝集体への自己集合及びいわゆる老人性プラークへの蓄積を伴う、Ａβペプチドの産生及びクリアランスの不均衡がＡＤの極初期の徴候であることはよく知られている。この考えを考慮して、アミロイドカスケード仮説は、Ａβペプチドの誤った折り畳み、凝集、及び沈着がＡＤの主な原因であると提唱している（３）。Ａβペプチドは、タンパク質分解プロセスを介してアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から誘導される３９～４２アミノ酸長のペプチドである。Ａβペプチドの最も一般的な形態は、Ａβ４０及びＡβ４２である（（４）に概説）。
Ａβの凝集機序は、複雑である。該機序は、蛍光分光法及び蛍光相関分光法を含む様々な異なる分析技術を使用して調べられている（（５）及びその参照文献）。早くから、ベンゾチアゾール塩チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイが、蛍光分光法及び顕微鏡観察によるアミロイド検出についての標準的な方法になっている（６、７）。より最近の研究に示されている通り、ひだ状のβシート二次構造を多く有するアミロイド形成性凝集体は、ＴｈＴに容易に結合し、そのスペクトル特性を著しく変化させて、吸収スペクトルをより長波長側にシフトさせ、蛍光量子収量を著しく増加させる（図１、挿入図）（８～１２）。
ＡＤの診断法については、未だ激しい論争中である（１３～１６）。潜在的な患者の精神的退化が目立つ前に診断するために、信頼できるバイオマーカーが利用可能であることが必要とされている（１７）。Ａβに対する血清及びＣＳＦ自己抗体が有望であることが示されており、更なる研究が保証されている（１８、１９）が、これまでの結果は、特に
楽観的な材料になるものではなかった。ＰＥＴ及び放射性トレーサを使用する脳イメージングは、＞１ｍｍのサイズの脳内におけるアミロイドの原線維沈着物を確実に映すであろう（２０～２２）。免疫化学的技術を使用した脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβペプチド（及びＴａｕタンパク質）の含量の測定も信頼できると考えられる（２３～２５）。しかし、ＰＥＴ及びＣＳＦの方法論は、侵襲的かつ高価である。トピックの概説（１３、１４）では、著者は、診断法として血漿中のＡβを単に測定することの欠点を記載しており、血液検査をＰＥＴ及びＣＳＦの結果と相互に関連付けようとする試みは今までのところ説得力のあるものではないことを示している。２つの技術によって測定されるＡβの構造状態が不均一かつ異なることが、恐らく実験を困難にしている理由の１つである：免疫化学的方法は、Ａβペプチド（複数可）の可溶性形態を測定するが、一方、ＰＥＴ法は、脳内の沈降した不溶性ペプチド凝集体を測定する。両方ともがＡβペプチドの存在及び挙動に通じるものであったとしても、２種類の測定値の間に明らかな直接的関連は存在しない。追加のバイオマーカー方法論に基づく早期ＡＤ診断のための新規、非侵襲的、かつ信頼できる方法が明らかに切実に必要とされている。このような方法が存在しないことは、新規薬物の開発の妨げにもなっており、脳内のアミロイド負荷を低減することを目的とする新規治療法の開発は、経時的に繰り返し同じ個体において構造化アミロイド形成性凝集体のレベルを定期的に同定及び特性評価できる可能性に大きく依存している。
ここで、本発明者らは、アミロイド感受性色素ＴｈＴで単に標識された血清の蛍光ベースの試験を提示する。この方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）のための時間分解かつ高感度単一分子蛍光技術を使用する観察に基づく。本発明者らは、以前、ＴｈＴベースのＦＣＳアッセイ（ＴｈＴ－ＦＣＳ）を使用して、インビトロにおける原線維形成プロセス中のＡβペプチド凝集体の不均一性及びターンオーバーについて研究した（５）。本研究において、本発明者らは、ＡＤと診断された患者由来の血清と対照個体由来の血清との間に、患者の血清中に視認できる（本明細書ではナノプラークと命名した）ＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体の数及びサイズにみられる著しい差が存在することを証明する。極度に小さな（＜フェムトリットル）観察体積を通るこれら単一ナノプラーク粒子の通過は、リアルタイムで観察し、カウントすることができる。ナノプラークの濃度に比例する通過数は、ＡＤ患者及び対照由来の血清において著しく異なる。
材料及び方法
患者コホート及び倫理
見かけ上健常な献血者（対照群）及びプライマリ・ケア設定において検査した後Ｍｅｍｏｒｙ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｕｄｄｉｎｇｅ）に付託された個体（患者コホート）から、インフォームドコンセントの際に血液サンプルを得た。血液サンプルの採取及び取り扱いは、ストックホルムの地域倫理委員会によって承認された（許可番号：２０１２／１０１９－３１／１）。
承認時、ＡＤ診断はまだ確立されておらず、患者は、ＡＤ症状の治療に通常使用されるコリンエステラーゼ阻害剤又はＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト等の医薬物質を全く服用していなかった。しかし、高齢であることから、患者コホートの多くの個体が、加齢に関係する健康上の問題を抱えており、幾つかの処方薬を服用していた。詳細な人口統計及び他の関連する患者情報を表１に示す。
採血、並びに血清、血漿、及び細胞溶解物サンプルの調製プロトコル
静脈穿刺用の真空管システム（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して上肢の浅静脈から血液を採取し、下記の通り処理して血清を得る。時間分解検蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）に供する前にＴｈＴをサンプルに添加した。
血清：血清を抽出するために、凝固プロセスを促進するためにチューブの内壁に噴霧された主な血餅活性化因子成分としてＳｉＯ２を含む微粉化シリカ粒子を含有し、トロンビンは含有しない、Ｒｅｄ ＢＤ Ｈｅｍｏｇａｒｄ（商標）Ｃｌｏｓｕｒｅを備えるＢＤ
Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｅｒｕｍチューブに５ｍｌの血液を回収する。血液凝固を活性化するために、チューブを１８０°反転させ、元に戻すことを５～６回行い、血液を６０分間凝固させる。その後、チューブを２５００×ｇで１０分間遠心分離し、血餅の上方の上清、すなわち血清を、混濁度及び溶血の証拠について目視検査する。中等度の混濁度及び溶血は結果のアウトカムに影響を与えないことが別の対照実験で証明されてはいたものの（データは示さず）、濁った血清サンプル及び肉眼で確認できるピンク色に変色したサンプルは、更なる分析には供さなかった。
即時使用する場合、２００μｌの血清を８ウェルチャンバー付カバーガラス（Ｌａｂ－Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）のウェルに分注し、最終濃度が２０μＭ ＴｈＴになるように１．６μｌの２．５ｍＭ ＴｈＴと混合し、下記の通りＦＩＦＡに供する。全ての実験をデュープリケートで行う。
分析のアウトカムに対する短期血清保存の影響を評価するために、血清を懸濁させ、２００μｌのアリコートを０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓａｆｅ－Ｌｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅｓに移し、－２０℃で２、４、又は２４週間保存する。凍結融解サイクルは１回だけ許容した。
血漿：血漿を抽出するために、血液１ｍｌあたり抗凝固剤Ｋ３ＥＤＴＡを１．８ｍｇ含有するＬａｖｅｎｄｅｒ ＢＤ Ｈｅｍｏｇａｒｄ（商標）Ｃｌｏｓｕｒｅを備えるＢＤ
Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌａｓｔｉｃ Ｋ３ＥＤＴＡチューブに５ｍｌの血液を回収して、～７ｍＭのＥＤＴＡ濃度を得る。高ＥＤＴＡ濃度（１０ｍＭ以下）が誘導期の長さにもインビトロＡβペプチド凝集プロセス中の蛍光成長曲線の傾きにも影響を及ぼさないことを示す（データは示さず）バルクＴｈＴ蛍光分光測定に基づいて、このＥＤＴＡ濃度はＡβ凝集にもＴｈＴアッセイにも干渉しない。チューブを穏やかに１８０°反転させ、元に戻すことを１０回行い、６０分間沈降させる。その後、チューブを２５００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞層の上方の上清、すなわち血漿を、混濁度及び溶血の証拠について目視検査する。上記の通り、濁った血漿サンプル及び肉眼で確認できるピンク色に変色した血漿サンプルは廃棄し、更なる分析には供さなかった。即時使用する場合、２００μｌの血漿を８ウェルチャンバー付カバーガラスのウェルに分注し、最終濃度が２０μＭ ＴｈＴになるように１．６μｌの２．５ｍＭ ＴｈＴと混合し、血清について記載したのと同じ手順に従ってＦＩＦＡに供する。
限られた実験セットにおいて、クエン酸バッファを使用することの利点を評価するために、Ｌｉｇｈｔ Ｂｌｕｅ ＢＤ Ｈｅｍｏｇａｒｄ（商標）Ｃｌｏｓｕｒｅを備えるＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＴＡＤチューブに血漿を回収する。ＥＤＴＡ又はクエン酸血漿サンプル間の差は観察されなかった。
細胞溶解物：血液細胞溶解物を調製するために、血漿を除去した後、Ｌａｖｅｎｄｅｒ
ＢＤ Ｈｅｍｏｇａｒｄ（商標）Ｃｌｏｓｕｒｅを備えるＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌａｓｔｉｃ Ｋ３ＥＤＴＡチューブの底部に残存する細胞ペレットに１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を０．１ｍｌ添加し；その内容物を２５００×ｇで１０分間遠心分離し、分析のために細胞溶解物を取り出す。即時分析する場合、２００μｌの細胞溶解物を８ウェルチャンバー付カバーガラスのウェルに分注し、最終濃度が２０μＭ ＴｈＴになるように１．６μｌの２．５ｍＭ ＴｈＴと混合し、血清について記載したのと同じ手順に従ってＦＩＦＡに供する。
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）におけるショートバックグラウンド
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、希釈水溶液中の明るい蛍光分子を検出するための、最高の単一分子感度を有する定量分析法である（２６～３２）。ＦＣＳは、従来の機器設定において約２×１０－１６ｌ～１０×１０－１６ｌである非常に小さな体積における自発的蛍光強度ゆらぎの時系列を高時間分解能で観察することによって、単一分子感度を実現する。このような小さな体積では、１回に見る分子の数が少ないことによって、溶媒分子等の接近しやすい分子から生じるバックノイズが著しく低下する。従って、小さな観察体積を通る明るい蛍光分子の通過によって蛍光強度が顕著に変化し、これは容易に検出することができる。
小さな観察体積を生成するために、ＦＣＳ用の機器は、共焦点顕微鏡における光学素子の特定の配置を利用して、高開口数（ＮＡ）対物レンズを通して入射レーザー光をサンプルに鋭く集束し、焦点外の光を排除するために検出器の前の光学的共役面にピンホールを配置することによって、蛍光が検出される体積を更に低減する（図１Ａ）。このように、観察体素（ＯＶＥ）を通る分子の位置において微細なゆらぎが自発的に熱駆動されることから（図１Ｃ）、（非）平衡定常状態の周りに生じる蛍光強度ゆらぎを観察できるのに十分な程度小さな微小ＯＶＥが生成される（図１Ｂ）。これらゆらぎを経時的に記録し、分析して、サンプル濃度を表すＯＶＥ内の平均分子数、及び平均移行時間、すなわち分子がＯＶＥを通過するのに必要な時間、いわゆる、対象となる分子の拡散係数（Ｄ）によって、すなわち、所与の粘度の媒体中における該分子のサイズ及び形状によって定義される並進拡散時間（τＤ）に関する情報を抽出する（図１Ｄ）。
様々な方法を使用して、ＦＣＳ実験において記録された蛍光強度ゆらぎを分析することができる（２８、３０）。典型的には、時間的自己相関分析を適用して時間的自己相関曲線（ｔＡＣＣ）を導出し、ｔＡＣＣの振幅からＯＶＥにおける平均分子数を、そして、ｔＡＣＣの特徴的な減衰時間から拡散時間を読み取る（２６、２７、３０）。時間的自己相関分析、並びにＯＶＥにおける平均分子数及び調べた粒子の並進拡散係数を導出する方法の詳細については、「蛍光強度ゆらぎの時間的自己相関分析」に記載する。この試験では、機器の較正に時間的自己相関分析を使用するが、実際のデータ解析は、以下のデータ解析に記載の通り、単一事象発生の頻度を分析することによって実施される。この方法は、「１００ｎｍのフルオスフィアの希釈水懸濁液を使用するデータ解析の検証」に詳細に記載するフルオスフィア（ｄ＝１００ｎｍ）の希釈水懸濁液の標準系列を使用して検証される。
時間分解ＴｈＴ蛍光強度ゆらぎ測定
Ｃ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０×、ＮＡ＝１．２、水浸ＵＶ－ＶＩＳ－ＩＲ対物レンズを備える倒立顕微鏡からなるＣｏｎｆｏＣｏｒ ２システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、時間分解蛍光強度ゆらぎ測定を実施する。アルゴンレーザーの４５８ｎｍラインを使用してＴｈＴ蛍光を励起する。対物レンズを通過することによって入射レーザー光がサンプルに強く集束され；対物レンズで測定されるレーザー強度は６μＷである。弾性散乱光及びスペクトル的に異なる蛍光は、同じ対物レンズを通して後方に集束され、ＨＦＴ４５８主ダイクロイックビームスプリッタを使用して分
離される。発せられた光は、ピンホールを通過してシリコンアバランシェ発光ダイオード検出器（ＳＰＣＭ－ＡＱＲ－１Ｘ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）に入ることによって空間的に選別される。検出器の前方のピンホールサイズは、７０μｍ（１Ａｉｒｙ）に設定した。
機器の較正：ローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）の標準水溶液、１０～２５ｎＭを機器の較正に使用する。この目的のために、時間的自己相関分析を適用した（「蛍光強度ゆらぎの時間的自己相関分析」に記載の通り）。上記の通りＴｈＴに使用したのと同じ光学設定をＲｈ６Ｇに使用し、一連の１０回の連続測定においてシグナルを記録した（各測定は１０ｓ持続）。これら設定下で、Ｒｈ６Ｇの並進拡散時間はτＤ，Ｒｈ６Ｇ＝（２４±２）μｓ（ｎ＝４６０）であると求められ；１分子あたり１秒あたりのカウント数（ＣＰＭＳ）はＣＰＭＳ＝（５．１±０．６）ｋＨｚであり、構造パラメータはＳ＝７であった（図Ｓ１）。ＯＶＥサイズは、
Figure 0007389049000005
ｌであると求められた。本発明者らの研究室で利用可能な個人的に改造したＣｏｎｆｏｒＣｏｒ３システムを使用して、ＦＣＳ測定を検証した（３３）。あるシステム又は他のシステムを使用して得られた測定のアウトカム間で有意な差は観察されなかった。
血清における測定：ＴｈＴ血清蛍光強度ゆらぎを、一連の３００回の測定で記録し（各測定は１０ｓ持続）、合計３０００ｓのランタイムを得た。すべての測定は、空調された室内において２０℃で実施した。下記の通りデータを評価した。
データ解析
ＯＶＥを通るＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性ナノプラークの偶発的通過を反映しているＴｈＴ蛍光強度の稀なバーストを同定するために自動化単一事象計数分析を実施しすることにより、構造化アミロイド形成性ナノプラークがＯＶＥを通過する頻度を求める。この目的のために、Ｍａｔｌａｂソフトウェアを使用してプログラムを書いた。蛍光ピーク、すなわち「単一事象」は、全時系列の標準偏差（ＳＤ）の５倍大きい値だけ全時系列の平均蛍光強度＜Ｆ（ｔ）＞と異なる蛍光強度の増加ΔＦ（ｔ）として定義される、ΔＦ（ｔ）＝（Ｆ（ｔ）－＜Ｆ（ｔ）＞）＞５×ＳＤ。次いで、観察された蛍光ピーク数を全測定時間（ここでは３０００ｓ）に対して正規化し、それによって得られた単一事象発生（ｆＳＥＯ）の頻度をｓ－１で表し、サンプル間で比較する。
ＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体のサイズは、以下のように求める。全ての記録された時間トレースを時間的自己相関分析に供した。ＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体の通過が観察される時間トレースからはｔＡＣＣが得られたが、バックグラウンドシグナルしか含んでいなかった時間トレースはｔＡＣＣを全く示さなかったので、更なる分析から除外した。次いで、全てのｔＡＣＣを同じ振幅に対して正規化し、τ＝１０μｓにおけるＧ（τ）＝１、患者群又は対照群の同じ群からの全てのｔＡＣＣを合わせて、それぞれ患者群及び対照群についての平均ｔＡＣＣを得た。次いで、ｔＡＣＣの特徴的な減衰時間の差からサイズの差を評価し、ｔＡＣＣの特徴的な減衰時間が長いほど、ナノプラークのサイズが大きい。
ｆＳＥＯ及びＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体のサイズを求めるための上記手順を、「１００ｎｍのフルオスフィアの希釈水懸濁液を使用するデータ解析の検証」に記載の通り、１００ｎｍのフルオスフィアの希釈水懸濁液を使用して検証した、図Ｓ２及びＳ３。これら対照実験は、提案されたアプローチを使用して拡散時間が正確に求められること（図Ｓ２）、そして、較正曲線を用いてｆＳＥＯからＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性オリゴマー凝集体の濃度を評価できること（図Ｓ３）を確認する。
時間分解ＴｈＴ血清ＦＩＦＡを実施する研究者は、データ解析が完了するまで個々の診
断について知らされなかった。同様に、診断は標準的な臨床試験を使用して確定され、時間分解ＴｈＴ血清蛍光強度ゆらぎ分析の結果は、試験が完了し、コードが明らかになるまで、臨床家には知らされなかった。対照及び患者のコホートにおける平均ｆＳＥＯ値が有意に異なるかどうかを評価するために、オンラインで利用可能なＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／ｔｔｅｓｔ１．ｃｆｍ？Ｆｏｒｍａｔ＝ＳＤ）を使用して独立ｔ検定分析を実施した。
化学物質
全ての化学物質は、更に精製することなく使用し、以下の通り商業的供給元から購入した：ローダミン６Ｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；チオフラビンＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；カルボキシラート官能化量子ドット名のクリスタル、ｄ＝２０ｎｍ、５２５ｎｍで発光極大（Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５ ＩＴＫ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ）、及び直径ｄ＝１００ｎｍの黄色－緑蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ：５０５／５１５）カルボキシラート修飾ポリスチレンナノ／ミクロスフィア（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）Ｓｉｚｅ Ｋｉｔ ＃２）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）。使用前に、フルオスフィア懸濁液を３０～６０分間超音波処理した。
蛍光強度ゆらぎの時間的自己相関分析
時間的自己相関分析では、シグナル自己相似性分析を実施してデータにおける非ランダム性を検出し、そして、データがランダムではない場合には適切な時系列モデルを同定する。このプロセスの第１の工程として、いわゆる正規化強度自己相関関数Ｇ（τ）を計算する：
（式中、＜Ｆ（ｔ）＞は、全時系列にわたる平均蛍光強度であり；δＦ（ｔ）＝Ｆ（ｔ）－＜Ｆ（ｔ）＞は、時点ｔで記録された蛍光強度のゆらぎであり；δＦ（ｔ＋τ）＝Ｆ（ｔ＋τ）－＜Ｆ（ｔ）＞は、後の時点ｔ＋τで記録された同じ時系列における蛍光強度のゆらぎであり；τは、その間の時間差である）。
次いで、正規化自己相関関数Ｇ（ｔ）を、様々な時間差τの関数としてプロットして、自己相関曲線ＡＣＣを得る。ランダムであるプロセスについては、全ての時間差値について
Figure 0007389049000007
となる。ランダムではないプロセスについては、ＡＣＣは、τ→０のときにＧ（τ）の最大限度値を有し、これは長い時間差ではＧ（τ）＝１の値まで減少するが、このことは、蛍光シグナルの初期特性値とその時点の特性値との間の相関が失われていることを示す。蛍光分子の自由三次元（３Ｄ）並進拡散によって生じる蛍光強度ゆらぎの最も単純な場合では、ＡＣＣは１つの特徴的な減衰時間を有し、これは、分子がＯＶＥを通過するのにかかる平均時間を表す、すなわち、並進拡散時間（τＤ）と等しい。ｔ＝０におけるＧ（ｔ）の限度値は、ＯＶＥにおける平均分子数（Ｎ）に反比例しており、従って、その濃度を表す（２６、２７）。
Ｎ及びτＤ値を抽出するために、理論的自己相関関数（ＡＦｔ）を使用して実験的に得られたＡＣＣをフィッティングさせる。例えば、サンプル中に１つの蛍光種が存在し、一重項状態と三重項状態との間の遷移が、観察された蛍光に影響を与える唯一の分子内プロセスである場合、ＡＣＣは、以下のＡＦｔを使用して記載することができる：
式（２）中、Ｎは、ＯＶＥにおける分子の平均数であり；Ｓは、構造パラメータとも呼ばれる空間パラメータであり、
（式中、ωｘｙ及びωｚは、それぞれＯＶＥの１／ｅ２放射方向及び軸方向半径であり；τは、時間差であり；τＤは、並進拡散時間であり；Ｔは、三重項状態における分子の平均平衡画分であり、τＴは、項間交差及び三重項減衰についての速度定数に関連する三重項相関時間である。
ＯＶＥの空間的特性は、機器の較正測定において実験的に求められる。較正は、濃度及び並進拡散係数が既知である参照蛍光色素の標準溶液を使用して実施する。標準溶液について記録された実験的に導出されるＡＣＣに、全てのパラメータが自由に変動することができるように自己相関関数（２）をフィッティングさせ、フィッティングによってＮ、τＤ、Ｓ２、Ｔ、及びτＴの値を求める。参照色素についての並進拡散係数Ｄの既知の値及びτＤの決定値を使用して、ＯＶＥの放射方向半径を以下から求めることができ：
軸方向半径ωｚは、構造パラメータＳ２から求めることができる。全ての更なる測定について、構造パラメータ値は、較正測定において求められる値に固定される。
本発明者らによるシステムでは、水中Ｒｈ６Ｇの標準溶液を機器の較正に使用した（図Ｓ１）。
１００ｎｍのフルオスフィアの希釈水懸濁液を使用するデータ解析の検証
既知の濃度１ｆＭ≦ｃ≦５０ｎＭのフルオスフィア（ｄ＝１００ｎｍ）の希釈水懸濁液を使用して拡散時間決定手順を検証し（図Ｓ２）、単一事象をカウントすることによって、すなわち単一事象発生ｆＳＥＯの頻度を求めることによって濃度を検証した（図Ｓ３）。
血清における自己蛍光測定。
ＴｈＴを含まない血清を、得られた結果に対する確率的誤差の影響を評価するための対照として使用した（図Ｓ４）。分かる通り、ＴｈＴを含まない血清中でも時折蛍光強度ピークが検出されるが（薄灰色及び縞模様の薄灰色）、その平均発生頻度はＴｈＴを含む血清よりも有意に低く（黒色及び濃灰色）；対照及び患者群においてこれらピークが発生する頻度に差はなく；標準偏差は平均よりも大きく、このことは、確率的誤差の平均値がゼロと有意には異ならないことを示唆している（図Ｓ４）。
結果
血清自己蛍光及び血清ＴｈＴ蛍光
血清は、様々なクラスの化学化合物の複雑な水性混合物であり、そのうち脂質（トリグリセリドの形態）及びタンパク質（アルブミン及び免疫グロブリン）が最も大量に存在する。血清を構成する化合物の多くは、天然に蛍光性であり、４５８ｎｍで光を吸収し、例えば、フラビン（ＦＡＤ）及びピリジン性（ＮＡＤＨ）の補酵素及び脂肪色素である。結果として、血清は自己蛍光を示し、また、振幅Ａ血清＝（０．００３±０．００２）及び単一の特徴的な減衰時間τ血清＝（５５±１５）μｓの明確なｔＡＣＣを生じさせる（図２Ａ、黒色）。これら実験データにフィッティングさせることができた最も単純な理論的モデルは、三重項なしの自由３Ｄ拡散についての自己相関関数であった（２７におけるＡＦ１）。Ｒｈ６Ｇを用いた機器の較正によって求められた値に固定した構造パラメータ、Ｓｐ＝５を保持すると、フィッティングによって導出されるパラメータ値は、Ｎ＝３００及びτＤ＝５５μｓである。
ＴｈＴを血清に添加すると、幾つかの重要な差が観察される。最も顕著には、ｔＡＣＣの振幅が顕著に減少し（ＡＴｈＴ＝（０．００１４±０．０００７））、長い特徴的な減衰時間を有する１つ以上の成分の小さいが識別可能な寄与が観察される（図２Ａ、灰色）。従って、これら実験データにフィッティングさせることができた最も単純な理論的モデルは、三重項なしの２成分の自由３Ｄ拡散についての自己相関関数であった（２７におけるＡＦ３）。ベストフィッティング自己相関関数から導出されるパラメータ値は、Ｎ＝７５０、τＤ１＝４０μｓ、τＤ２＝１００ｍｓ、ｙ１＝０．９４、及びｙ２＝０．０６である。構造パラメータは、較正実験で求めた値で固定した、Ｓｐ＝５。フィッティングにより導出された第１の成分の特徴的な減衰時間τＤ１＝４０μｓは、ＴｈＴを含まない血清における特徴的な減衰時間τＤ＝５５μｓと非常に類似しており；同じ振幅に対して正規化されたＡＣＣが密接に重複することを示す実験的知見と一致している、τ＝１０μｓにおいてＧ（τ）＝１（図２Ｂ）。
ＴｈＴ添加時にＯＶＥにおいて観察可能な分子の平均数が増加することを示すＡＣＣの振幅の減少は、ＴｈＴを添加しなければ視認できないＴｈＴ反応性実体が視認できるようになることと一致している。Ｃｈａｕｈａｎら（３４）及びＧｒｉｆｆｉｎら（３５）によるバルク蛍光分光法によって、血清中のＴｈＴ蛍光を詳細に特性評価した。浮選分画を使用して、Ｇｒｉｆｆｉｎらは、血清中のＴｈＴ反応性の約９４％が血清の非ａｐｏＢ含有画分に関連していることを示すことができ、ベースラインＴｈＴ血清蛍光に主に寄与するものとして水溶性血清アルブミンの糖化物及び他の化学付加物を同定した（３５）。著しく長い拡散時間を有する第２の成分の出現が観察されたことは、非常に低レベルで存在する大きなＴｈＴ反応性実体が可視化されること、ひいては、第２の成分の振幅は比較的小さいことと一致している。
既に公開されている結果（３４、３５）に基づいて予測される通り、平均血清ＴｈＴ蛍光強度は個体間で顕著なばらつきを示した（表１）。しかし、バルクＴｈＴ蛍光分光法による以前の所見とは対照的に、患者ＣＲｐ＝（２０２±９２）ｋＨｚと対照群ＣＲｃ＝（１５５±４３）ｋＨｚとの間の平均カウント速度値は、両側Ｐ値Ｐ＝０．０１２６から明らかである通り、有意に異なっていた。
ＴｈＴ蛍光強度におけるゆらぎの時間分解検出から、ＯＶＥを通るＴｈＴ反応性アミロイド形成性構造化ナノプラークの通過が明らかになる
ＴｈＴ血清蛍光の時間分解検出から、時系列の標準偏差（ＳＤ）よりも５倍よりも大きい値だけ平均蛍光強度と異なる蛍光強度に非常によく同定可能なピークが稀に発生することが明らかになる、（Ｆ（ｔ）－＜Ｆ（ｔ）＞）＞５×ＳＤ（図３）。既に示されている通り、本発明者らはこれらピークを「単一事象」と呼ぶ。
これら突発が、電気的妨害もＯＶＥを通じた小さな気泡又は塵粒の偶発的通過も反映しておらず、ＴｈＴ反応性アミロイド形成性構造化ナノプラークの通過を反映していることを確認するために、ＴｈＴを含まない血清中で対照測定を実施した。分かる通り（「血清における自己蛍光測定」における図Ｓ４）、ＴｈＴを添加する前にも時折蛍光強度ピークが検出されるが、その平均発生頻度はＴｈＴを含む血清よりも有意に低く；対照及び患者のサンプルにおいてこれらピークが発生する頻度に差はなく；標準偏差は平均よりも大きく、このことは、確率的誤差の平均値がゼロと有意には異ならないことを示唆している。
従って、本発明者らは、血清中の構造化ナノプラークの濃度の直接的尺度として、蛍光強度バーストの発生、すなわち単一事象の発生及び「単一事象発生の頻度」（ｆＳＥＯ）と呼ばれるその出現頻度を提示する。
ＡＤ患者の血清中の単一事象発生の頻度は、見かけ上健常な対照の血清中よりも高い
材料及び方法に記載の通り計算した単一事象発生の頻度：データ解析の小区分は、患者群ｆＳＥＯｐ＝（２．３±１．７）×１０－３ｓ－１と対照群ｆＳＥＯｃ＝（１．５±１．２）×１０－３ｓ－１との間で異なる。独立ｔ検定分析によって求められた両側Ｐ値、Ｐ＝０．０４１８は、患者群と対照群との間の単一事象発生頻度の差が統計的に有意であることを示唆している（図４Ａ）。コードを明らかにし、臨床診断に基づいて患者をサブグループに分類した後も、ＡＤ患者ｆＡＤ ＳＥＯｐ＝（２．５±１．５）×１０－３ｓ－１と対照群ｆＳＥＯｃ＝（１．５±１．２）×１０－３ｓ－１との間の差は統計的に有意なままである、Ｐ＝０．０４２０（図４Ｂ）。
本発明者らによる分析は、単一事象発生の頻度が（１．６±１．０）×１０－５ｓ－１年－１の傾き及び（９．４±０．６）×１０－４ｓ－１の切片で増加する（図５、実線）ことから明らかである通り、構造化アミロイド形成性ナノプラークの血清濃度が加齢と共に若干増加することも示す。しかし、調整されたＲ二乗値Ｒ２ ａｄｊ＝０．０３２は、この相関が非常に弱いことを示す。実際のところ、同じデータセットは、傾きゼロの線形回帰でフィッティングさせることができ、切片が（１．３±０．２）×１０－３ｓ－１であり、残差平方和（ＲＳＳ）の値は、ベストフィット線形回帰ＲＳＳｌｒ＝６６．７よりも傾きゼロの線形回帰ＲＳＳｚ－ｓｌｒ＝３０．２の方が低い。
ＡＤ患者の血清中のＴｈＴ反応性アミロイド形成性構造化ナノプラークのサイズは、見かけ上健常な対照の血清中よりも大きい
材料及び方法：データ解析に記載の通り実施した時間的自己相関分析は、２つの群について記録されたｔＡＣＣ間で特徴的な減衰時間の明らかな差を示し、患者群では減衰時間が顕著に長い（図６）。正規化されたｔＡＣＣの評価は、分析される系が複雑であり、サイズが均一な粒子を含有するのではなく、非常に異なるサイズの粒子の混合物を含有することを示す。対照群におけるＴｈＴ活性粒子の平均拡散時間は約５ｍｓであり、患者群における粒子の平均拡散時間は約１５ｍｓであり、これは、球状分子の場合、２つの群間の分子量の差が約２７倍であることに相当する。明らかに、患者群は、より多数のナノプラークに加えて、血清中により大きなＴｈＴ活性構造化凝集体を保有する。
血清中の時間分解ＴｈＴ蛍光強度ゆらぎ分析に対するＣＳＦにおける臨床アウトプット
本発明者らは、血清における時間分解ＴｈＴ ＦＩＦＡによって得られた結果を、アミロイドベータペプチドの４２アミノ酸形態（Ａβ４２）のＣＳＦレベル及びｔａｕタンパク質の全ＣＳＦレベル（ｔ－Ｔａｕ）を含む脳脊髄液（ＣＳＦ）における確立されている生化学的バイオマーカーを使用して得られた結果と比較した。この比較は、時間分解ＴｈＴ血清ＦＩＦＡによって得られた結果が、ＣＳＦ生化学的分析によって得られた結果と明らかに一致することを示す（図７）。ＣＳＦ中のＡβ４２レベルに基づくＡＤ診断につい
ての一般的に許容されている限度は、＜５５０ｎｇｌ－１である（３６）。図７に提示するデータに基づいて、本発明者らは、血清におけるｆＳＥＯ＞１．５×１０－３ｓ－１の限度がＡＤの指標であることを示唆する。
考察
アミロイド原線維及び構造化アミロイド形成性オリゴマーの存在下において、ＴｈＴは、遊離色素とは顕著に異なる蛍光励起及び発光スペクトルを取得する（図１、挿入図）（８～１２）。この蛍光変化は、一般的に、ＴｈＴのアミロイド形成性構造との相互作用に特異的であると考えられ、ネイティブなタンパク質モノマー又は非晶質凝集体への結合時には誘導されない（６、７）。この特性に起因して、蛍光顕微鏡によって組織アミロイド沈着物を可視化するためにＴｈＴが広く使用されており（３７～３９）；ＴｈＴ同族体は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を使用するインビボイメージングのための基剤であり（４０～４２）；ＴｈＴは、インビトロにおける精製タンパク質及びペプチドからのアミロイド原線維形成の時系列をモニタリングするために、古典的なバルク蛍光分光法によるタンパク質凝集の基礎研究において不可欠である（５、４３、４４）。
古典的バルクＴｈＴ蛍光分光法は、Ａβ凝集体の動態の基礎研究にとって非常に重要であるが（４３）、この方法も重大な制約を有している。最も顕著には、古典的なバルクＴｈＴ蛍光分光法は、サンプル中に存在する全てのＡβ凝集体状態にわってＴｈＴ蛍光シグナルを平均化すること、及び典型的には約１～１０ｓであるシグナル積分時間でＴｈＴ蛍光強度を時間的に平均化することを含む。このような測定条件下では、稀なアミロイド形成性構造化凝集体から生じるシグナルの寄与が小さすぎて、バックグラウンドと区別することができない。従って、アミロイドの関与する疾患の生物医学的診断におけるバルクＴｈＴ蛍光分光法の有用性は、限定されることが示されている（３４、３５）。
バルクＴｈＴ蛍光分光法とは対照的に、フェムトリットル以下のＯＶＥにおけるＴｈＴ蛍光強度ゆらぎの時間分解検出は、このような平均化を含まないので（５）、ＯＶＥを通るＴｈＴ活性構造化アミロイド形成性凝集体の通過を正確に同定することができる（図３）。従って、本発明者らは、ＴｈＴ血清蛍光強度ゆらぎの時間分解検出を使用する血清中の構造化アミロイド形成性凝集体の検出を初めて報告する。更に、本発明者らは、ＡＤ診断と、血清ＡＤ中でＴｈＴ反応性構造化アミロイド形成性凝集体が生じる平均頻度との間に正の相関があることを証明する（図４及び７）。ＡＤを発症するリスクのある個体を早期に同定するためのこの方法の能力はまだ確立されていないが、本発明者らの結果は、免疫ベースのプローブの使用にも放射性トレーサ、シグナル増幅、又はタンパク質分離技術の使用にも依存しない、単一分子感度を有するこの新規方法が、末梢血循環、ＣＳＦ（図Ｓ５）だけでなく、唾液及び尿等の他のよりアクセスしやすい生体液中（それぞれ図Ｓ６、Ｓ７）でも構造的に修飾されたタンパク質を迅速かつコスト効率よく早期に決定するための低侵襲的試験を提供し得ることを明らかに示している。
最も頻繁に使用される酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、デジタルＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ（４５、４６）サンドイッチＥＬＩＳＡ（４７）等の方法、及び最近Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎら（４８）によって概説された関連する方法、及び免疫沈降－質量分析法（ＩＰ－ＭＳ）（４９）の結果を確認するために使用することができる免疫ベースのアッセイは、いずれも、抗体－抗原反応の特異性及び感度に関連する共通の固有の制約を有している（５０～５２）。Ａβ免疫ベースのアッセイの場合、幾つか例を挙げると、典型的には以下の困難さに遭遇する：過剰に存在するモノマーＡβが、抗体の結合部位を占有する場合があり、それによって、Ａβオリゴマーの検出を妨げる（５３）；ｐ３ペプチド及びＡＰＰプロセシングの非アミロイド形成経路に由来するＡβ異化ペプチドによる干渉が、結果の解釈に不確実性を与える場合がある（５４）；シグナル増幅及び検
出用の物質が本質的に不安定であり、酵素の非存在下でさえもシグナルを生成する場合がある（４８）。ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、２Ｄ－ＰＡＧＥ、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、及び関連技術を使用するプロテオミクスアプローチは、高い感度及び特異性で対象となる分子を直接特性評価し、それによって、貴重な情報を提供する（５５）。しかし、ダイナミックレンジの制限から生体液等の複雑な混合物中の低含量のタンパク質を検出することが困難である、インタクトなより大きなタンパク質を測定することができない、及びサンプル調製手順が複雑であることからこれら技術は複雑である（５６）。結果として、プロテオミクス研究で発見されたＣＳＦバイオマーカーで、これまでに臨床に到達したものはない（５７）。
まとめると、ＣＳＦ及び血漿の生化学分析に臨床的に使用されている現在利用可能な免疫ベースの方法では、ＡＤ患者のＣＳＦ及び血漿中でＡβ４２の濃度が低下することが示されることを強調したい（２３、３６、４９、５８～６０）。これは、Ｋｌａｖｅｒら（５３）及びその中に引用されている参照文献で論じられている通り、抗体は主としてモノマーＡβペプチドを認識するが、凝集によってＡβペプチドが免疫化学では認識されにくい状態になるという事実に起因している可能性が高い。対照的に、本発明者らの方法は、脳内にみられる原線維中に存在する実際のアミロイド状態に対応する血清中のＴｈＴ活性状態を測定する。明らかに、図７に提示するデータから分かるように、２種類の所見はいずれも患者のＡＤ病態と相関しているが、本発明者らの方法は、情報を引き出すために単純な血液検査に依存する。提案した方法の定量限界は、４０を超えるＡβモノマーを含む構造化凝集体について対抗の単一分子感度に到達する、他に類を見ないものである。更に、提案した方法では、病期（早期対後期）の貴重な指標及び疾患進行の信頼性の高い予測因子となり得る構造化凝集体のサイズ分布を決定することも可能である。
実施例２：ＣＳＦにおける分析
添加剤を全く使用せずにポリプロピレンチューブ内において－８０℃で保存した脳脊髄液（ＣＳＦ）アリコート０．５ｍｌを使用した。サンプルを室温で６０分間解凍した。その後、各ウェルにＴｈＴ水溶液を１０μｌ含有する８ウェルチャンバー付カバーガラスにアリコート２００μｌを移した。数回分注／吸い込みを行うことによってサンプルを穏やかに混合し、分析に供した。分析はデュープリケートで実施した。
実施例３：尿における分析
見かけ上健常なドナー由来の朝起きてすぐの中間尿試料を、尿保存剤を全く使用せずに滅菌容器に回収した。試料を室温で６０分間沈降させた。その後、各ウェルにＴｈＴ水溶液を１０μｌ含有する８ウェルチャンバー付カバーガラスにアリコート２００μｌを移した。数回分注／吸い込みを行うことによってサンプルを穏やかに混合し、分析に供した。分析はデュープリケートで実施した。
実施例４：：唾液における分析
朝、朝食の２時間後、及び朝の衛生行動後に見かけ上健常なドナーから唾液サンプルを採取した。この時間中、ドナーは水しか摂取しなかった。サンプル採取の直前に脱イオン水で流すことによって口内をおおまかに清浄化した後、自然に流れる唾液２ｍｌを受動的にサンプリングし（吸引なし）、氷浴に浸漬している滅菌容器に回収した。回収後、各ウェルにＴｈＴ水溶液を１０μｌ含有する８ウェルチャンバー付カバーガラスにアリコート２００μｌを移した。数回分注／吸い込みを行うことによってサンプルを穏やかに混合し、１５分間加温にし、分析に供した。分析はデュープリケートで実施した。
参照文献
１． Ｐｒｉｎｃｅ，Ｍ．，Ｃｏｍａｓ－Ｈｅｒｒｅｒａ，Ａ．，Ｋｎａｐｐ，Ｍ．，Ｇｕｅｒｃｈｅｔ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｄｏｕ，Ｍ．（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１６．Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ
２． （２０１７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ．ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．
３． Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｈａｒｄｙ，Ｊ．（２０１６）ＥＭＢＯ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，５９５－６０８
４． Ｗａｌｌｉｎ，Ｃ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｊａｒｖｅｔ，Ｊ．，Ｗaｒｍｌaｎｄｅｒ，Ｋ．Ｔ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｒaｓｌｕｎｄ，Ａ．（２０１７ ｉｎ ｐｒｅｓｓ）Ｉｓ
ｒａｅｌ Ｊ．Ｃｈｅｍ．５７
５． Ｔｉｉｍａｎ，Ａ．，Ｊａｒｖｅｔ，Ｊ．，Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ．，ａｎｄ Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ，Ｖ．（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４，７２０３－７２１１
６． Ｎａｉｋｉ，Ｈ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ，Ｔ．（１９８９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７７，２４４－２４９
７． ＬｅＶｉｎｅ，Ｈ．，３ｒｄ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３０９，２７４－２８４
８． Ｂｉａｎｃａｌａｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｓ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ １８０４，１４０５－１４１２
９． Ｗｏｌｆｅ，Ｌ．Ｓ．，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｎａｔｈ，Ａ．，Ｂｌａｈｏ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．（２０１０）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
１０７，１６８６３－１６８６８
１０． Ｆｒｅｉｒｅ，Ｓ．，ｄｅ Ａｒａｕｊｏ，Ｍ．Ｈ．，Ａｌ－Ｓｏｕｆｉ，Ｗ．，ａｎｄ Ｎｏｖｏ，Ｍ．（２０１４）Ｄｙｅｓ Ｐｉｇｍ．１１０，９７－１０５
１１． Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．Ｋ．，Ｍｏｒａ，Ａ．Ｋ．，ａｎｄ Ｎａｔｈ，Ｓ．（２０１５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１，１４０４２－１４０４５
１２． Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ，Ｉ．Ｍ．，Ｓｕｌａｔｓｋａｙａ，Ａ．Ｉ．，Ｍａｓｋｅｖｉｃｈ，Ａ．Ａ．，Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．，ａｎｄ Ｔｕｒｏｖｅｒｏｖ，Ｋ．Ｋ．（２０１６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８８，７１８－７２４
１３． Ｏｈ，Ｅ．Ｓ．，Ｔｒｏｎｃｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ｆａｎｇｍａｒｋ Ｔｕｃｋｅｒ，Ｓ．Ｍ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ
１０，１９５－２０７
１４． Ｔｏｌｅｄｏ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｈａｗ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄ Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．（２０１３）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ ５，８
１５． Ｏ’Ｂｒｙａｎｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｍｉｅｌｋｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｉｓｓｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｌｉｓｔａ，Ｓ．，Ｖａｎｄｅｒｓｔｉｃｈｅｌｅ，Ｈ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｌｅｗｃｚｕｋ，Ｐ．，Ｐｏｓｎｅｒ，Ｈ．，Ｈａｌｌ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．，Ｆｏｎｇ，Ｙ．Ｌ．，Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｊ．，Ｊｅｒｏｍｉｎ，Ａ．，Ｂａｔｒｌａ－Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ａ．，Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｇ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，Ｋ．，Ｇｒａｍｍａｓ，Ｐ．，Ｇｕｐｔａ，Ｖ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．，Ｈａｍｐｅｌ，Ｈ．，ａｎｄ Ｂｉｏｆｌｕｉｄ Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ａ．（２０１７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １３，４５－５８
１６． Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ６，１５－２４
１７． Ｃｏｕｎｔｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｉｋｏｎｏｍｏｖｉｃ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｅｒｃａｄｏ，Ｎ．，Ｖｅｇａ，Ｉ．Ｅ．，ａｎｄ Ｍｕｆｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＮｅｕｒｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １４，３５－５３
１８． ＤｅＭａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ａ．，Ｎａｇｅｌｅ，Ｅ．Ｐ．，Ｓａｒｋａｒ，Ａ．，Ａｃｈａｒｙａ，Ｎ．Ｋ．，Ｇｏｄｓｅｙ，Ｇ．，Ｇｏｌｄｗａｓｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｋｏｓｃｉｕｋ，Ｍ．，Ｔｈａｙａｓｉｖａｍ，Ｕ．，Ｈａｎ，Ｍ．，Ｂｅｌｉｎｋａ，Ｂ．，Ｎａｇｅｌｅ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ，Ｉ．（２０１６）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ３，５１－６２
１９． Ｗｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌｉ，Ｌ．（２０１６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，３６１－３７２
２０． Ｓａｉｎｔ－Ａｕｂｅｒｔ，Ｌ．，Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｌ．，Ｃｈｉｏｔｉｓ，Ｋ．，Ｌｅｕｚｙ，Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｖｉｅｉｔｅｚ，Ｅ．，ａｎｄ Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ａ．（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １２，１９
２１． Ｇａｒｉｂｏｔｔｏ，Ｖ．，Ｈｅｒｈｏｌｚ，Ｋ．，Ｂｏｃｃａｒｄｉ，Ｍ．，Ｐｉｃｃｏ，Ａ．，Ｖａｒｒｏｎｅ，Ａ．，Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ａ．，Ｎｏｂｉｌｉ，Ｆ．，Ｒａｔｉｂ，Ｏ．，ａｎｄ Ｇｅｎｅｖａ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｏａｄｍａｐ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ，Ｂ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ５２，１８３－１９５
２２． Ｃｈｉｏｔｉｓ，Ｋ．，Ｓａｉｎｔ－Ａｕｂｅｒｔ，Ｌ．，Ｂｏｃｃａｒｄｉ，Ｍ．，Ｇｉｅｔｌ，Ａ．，Ｐｉｃｃｏ，Ａ．，Ｖａｒｒｏｎｅ，Ａ．，Ｇａｒｉｂｏｔｔｏ，Ｖ．，Ｈｅｒｈｏｌｚ，Ｋ．，Ｎｏｂｉｌｉ，Ｆ．，Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ａ．，ａｎｄ Ｇｅｎｅｖａ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｏａｄｍａｐ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ，Ｂ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ５２，２１４－２２７
２３． Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｎ．，Ｓｊｏｇｒｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．（２００３）Ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ： ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４，１４７－１５５
２４． Ｈｕ，Ｗ．Ｔ．，Ｗａｔｔｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｈａｗ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，Ｂａｓｒａ，Ｓ．，Ｇｌａｓｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｌａｈ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｌｅｖｅｙ，Ａ．Ｉ．（２０１５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，１３１－１３９
２５． Ｌｅｗｃｚｕｋ，Ｐ．，Ｌｅｌｅｎｔａｌ，Ｎ．，Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｐ．，Ｍａｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｋｏｒｎｈｕｂｅｒ，Ｊ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ： ＪＡＤ ４３，１８３－１９１
２６． Ｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．（２００１）Ｔｒａｆｆｉｃ ２，７８９－７９６
２７． Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ，Ｖ．，Ｐｒａｍａｎｉｋ，Ａ．，Ｙａｋｏｖｌｅｖａ，Ｔ．，Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．，Ｔｅｒｅｎｉｕｓ，Ｌ．，ａｎｄ Ｂａｋａｌｋｉｎ，Ｇ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ： ＣＭＬＳ ６２，５３５－５５０
２８． Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３９６，１７０－１７５
２９． Ｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．（２０１１）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ
１０１，２８５５－２８７０
３０． Ｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５１８，１１－４１
３１． Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ，Ｊ．（２０１７）Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ｊｏｕｒｎａｌ ： ＥＢＪ
３２． Ｅｌｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
３３． Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ，Ｖ．，Ｈｅｉｄｋａｍｐ，Ｍ．，Ｍｉｎｇ，Ｙ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｔｅｒｅｎｉｕｓ，Ｌ．，ａｎｄ Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．（２００８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，１８１７６－１８１８１
３４． Ｃｈａｕｈａｎ，Ａ．，Ｐｉｒｔｔｉｌａ，Ｔ．，Ｃｈａｕｈａｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｍｅｈｔａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｈ．Ｍ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １５４，１５９－１６３
３５． Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｏｋ，Ｙ．Ｆ．，Ｊａｎｕｓｚｅｗｓｋｉ，Ａ．Ｓ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋａｒｓｃｈｉｍｋｕｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｒｏｍａｓ，Ｅ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｂ．，Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｍ．，Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｌ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｇ．Ｊ．（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，２７８－２８６
３６． Ｔａｐｉｏｌａ，Ｔ．，Ａｌａｆｕｚｏｆｆ，Ｉ．，Ｈｅｒｕｋｋａ，Ｓ．Ｋ．，Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，Ｈａｒｔｉｋａｉｎｅｎ，Ｐ．，Ｓｏｉｎｉｎｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐｉｒｔｔｉｌａ，Ｔ．（２００９）Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６６，３８２－３８９
３７． Ｓｏｌｅ－Ｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｓ．，Ｓｊｏｖａｌｌ，Ｐ．，Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ，Ｖ．，Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｒ．，Ｃｏｄｉｔａ，Ａ．，Ｓａｌｖｅ，Ｓ．，Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃ，Ｎ．，Ｍｏｈａｍｍｅｄ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．，ＬａＦｅｒｌａ，Ｆ．Ｍ．，Ｊａｃｏｂ，Ｓ．，Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｇｉｍｅｎｅｚ－Ｌｌｏｒｔ，Ｌ．，Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ，Ｍ．，Ｔｅｒｅｎｉｕｓ，Ｌ．，ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．（２０１３）Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ １２５，１４５－１５７
３８． Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｆ．，Ｇａｎｄｈｉ，Ｓ．，Ｍａｇｄａｌｉｎｏｕ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｗ．，Ｄｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｏｓａｔｔｏ，Ｌ．，Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ，Ｍ．，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．Ｓ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｉｌｊｉｎａ，Ｍ．，Ｃｒｅｍａｄｅｓ，Ｎ．，Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｏｏｄ，Ｎ．Ｗ．，ａｎｄ Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｄ．（２０１６）ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７，３９９－４０６
３９． Ｇｒｏｅｎｎｉｎｇ，Ｍ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ３，１－１８
４０． Ｍａｔｈｉｓ，Ｃ．Ａ．，Ｍａｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｌｏｐｒｅｓｔｉ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｌｕｎｋ，Ｗ．Ｅ．（２０１２）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４２，４２３－４３２
４１． Ｓｖｅｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｒａｈｍａｎ，Ｏ．，ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｈ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ３９，４８４－５０１
４２． Ｓｖｅｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｈｅｌｌｓｔｒoｍ－Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｅ．，
Ｒａｈｍａｎ，Ｏ．，ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｈ．（２０１２）Ａｍｙｌｏｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＰＥＴ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．ｉｎ Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ － Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．－Ｈ．ｅｄ．，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ
４３． Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｉ．，Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．，Ｌｕｈｅｓｈｉ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ，Ｅ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ａ．，Ｒａｊａｈ，Ｌ．，Ｏｔｚｅｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｍ．，Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｔ．Ｐ．（２０１３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，９７５８－９７６３
４４． Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｐ．（２０１０）Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２７７，１３８０－１３８８
４５． Ｃｈａｎｇ，Ｌ．，Ｒｉｓｓｉｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｉｅｃｈ，Ｔ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ Ｄｕｆｆｙ，Ｄ．Ｃ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ３７８，１０２－１１５
４６． Ｒｉｓｓｉｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｋａｎ，Ｃ．Ｗ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｔ．Ｇ．，Ｈｏｗｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｐｉｅｃｈ，Ｔ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｐ．，Ｃｈａｎｇ，Ｌ．，Ｒｉｖｎａｋ，Ａ．Ｊ．，Ｆｅｒｒｅｌｌ，Ｅ．Ｐ．，Ｒａｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｒｏｖｕｎｃｈｅｒ，Ｇ．Ｋ．，Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｄｕｆｆｙ，Ｄ．Ｃ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，５９５－５９９
４７． Ｈｏｌｔｔａ，Ｍ．，Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｏ．，Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ，Ｕ．，Ｈｅｒｔｚｅ，Ｊ．，Ｍｉｎｔｈｏｎ，Ｌ．，Ｎａｇｇａ，Ｋ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｎ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，ａｎｄ Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．（２０１３）ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８，ｅ６６３８１
４８． Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ，Ｕ．，Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．，ａｎｄ Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．（２０１６）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ３，９８－１０２
４９． Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｎ．，Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ，Ｖ．Ｌ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｄｏｅｃｋｅ，Ｊ．，Ｄｏｒｅ，Ｖ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｑ．Ｘ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．，Ｒｏｗｅ，Ｃ．，Ｔｏｍｉｔａ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．，Ａｒａｈａｔａ，Ｙ．，Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｋ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５４，２４９－２５４
５０． Ｒｅｖｅｒｂｅｒｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｂｅｒｉ，Ｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ＝ Ｔｒａｓｆｕｓｉｏｎｅ ｄｅｌ ｓａｎｇｕｅ ５，２２７－２４０
５１． Ｓｃｈｉｅｔｔｅｃａｔｔｅ，Ｊ．，Ａｎｃｋａｅｒｔ，Ｅ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｚ，Ｊ．（２０１２）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈｉｕ，Ｎ．Ｈ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｋ．ｅｄｓ．），ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ
５２． Ｓａｉｋｉ，Ｈ．（２０１２）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｂ．ｉｎ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｂｕｅｌｚｅｉｎ，Ｅ．ｅｄ．，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ
５３． Ｋｌａｖｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｐａｔｒｉａｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｆｉｎｋｅ，Ｊ．Ｍ．
，ａｎｄ Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １９５，２４９－２５４
５４． Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂｒａｙｎｅ，Ｃ．（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １６，１
５５． Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，Ｄ．，Ａａｒｓｌａｎｄ，Ｄ．，ａｎｄ Ｚｕｂａｒｅｖ，Ｒ．Ａ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７，４１９２９
５６． Ｈｉｒｓｃｈ，Ｊ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｔｔｈａｙ，Ｍ．Ａ．（２００４）Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２８７，Ｌ１－２３
５７． Ｐｏｒｔｅｌｉｕｓ，Ｅ．，Ｂｒｉｎｋｍａｌｍ，Ｇ．，Ｐａｎｎｅｅ，Ｊ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｒ．，Ｂｒｉｎｋｍａｌｍ，Ａ．，ａｎｄ Ｇｏｂｏｍ，Ｊ．（２０１７）Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １４，１００７－１０２０
５８． Ｌｉｎ，Ｙ．Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｔ．，Ｙａｏ，Ｙ．Ｃ．，Ｊｕｏ，Ｌｏ，Ｙ．Ｋ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｇｅｒ，Ｌ．Ｐ．，ａｎｄ Ｌｕ，Ｐ．Ｊ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ： ＪＡＤ １８，９０７－９１８
５９． Ｊａｎｅｌｉｄｚｅ，Ｓ．，Ｓｔｏｍｒｕｄ，Ｅ．，Ｐａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｓ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｈ．，ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｎ，Ｄ．，Ｊｅｒｏｍｉｎ，Ａ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｈａｎｌｏｎ，Ｄ．，Ｔａｎ Ｈｅｈｉｒ，Ｃ．Ａ．，Ｂａｋｅｒ，Ｄ．，Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．，ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｏ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６，２６８０１
６０． Ｎｉｔｓｃｈ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｅｂｅｃｋ，Ｇ．Ｗ．，Ｄｅｎｇ，Ｍ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｕ．Ｉ．，Ｔｅｎｎｉｓ，Ｍ．，Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．Ｂ．，Ｖｉｇｏ－Ｐｅｌｆｒｅｙ，Ｃ．，Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ，Ｉ．，Ｗｕｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｈｙｍａｎ，Ｂ．Ｔ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３７，５１２－５１８
６１． Ｖｉｔａｌ Ｍ，Ｂｒｏｎｚｉ Ｄ，Ｋｒｍｐｏｔ ＡＪ，Ｎｉｋｏｌｉｃ ＳＮ，Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｆ－Ｊ，Ｊｕｎｇｈａｎｓ Ｃ，Ｔｉｓａ Ｓ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｔ，Ｖｕｋｏｊｅｖｉｃ Ｖ，Ｔｅｒｅｎｉｕｓ Ｌ，Ｚａｐｐａ Ｆ，Ｒｉｇｌｅｒ Ｒ，Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｐｈｏｔｏｎ ａｖａｌａｎｃｈｅ ｃａｍｅｒａ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｔｙ．ＩＥＥＥ Ｊ．Ｓｅｌ．Ｔｏｐ．Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４ ２０：３４４－３５３
６２． Ｍ Ｊ Ｌｅｖｅｎｅ，Ｊ Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｓ Ｗ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ Ｆｏｑｕｅｔ，Ｈ Ｇ Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ａｎｄ Ｗ Ｗ Ｗｅｂｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｖｏｌ．２９９，Ｎｏ．５６０７（Ｊａｎ．３１，２００３）ｐｐ．６８２－６８６）．

Claims (23)

  1. 被験体におけるアミロイド関連疾患の有無及び／又は予後を特定する方法であって、アミロイド関連疾患が個々のアミロイド凝集体に関連し、
    前記方法が、
    ・ 前記被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と、
    ・ 前記サンプルに検出剤を添加し、前記検出剤が、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応する工程と、
    ・ 前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
    を含み、
    前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）及び蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）を含む時間分解検出に基づく分析を含み、前記方法が、個々のアミロイド凝集体の増幅を含まず、
    ここで、前記サンプル中の前記個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度が、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／若しくは量及び／若しくは濃度よりも多い場合；並びに／又は
    前記サンプル中の前記個々のアミロイド凝集体のサイズが、対照サンプル中の個々のアミロイド凝集体のサイズよりも大きい場合に、前記被験体がアミロイド関連疾患に罹患している、及び／又はその予後が悪いと特定される、方法。
  2. 非標的アミロイドの分子／ペプチド／タンパク質／凝集体（アミロイド実体）を使用する必要がない、又は標的アミロイドの分子／ペプチド／タンパク質／凝集体と非標的アミロイドの分子／凝集体とを混合することを含む工程を含む必要がない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記体液が、血液、及び／又は脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／又は唾液、及び／又は尿、及び／又は滑液、及び／又は糞便からなる群のうちの１つ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記血液のサンプルが、全血、及び／又は血清、及び／又は血漿、及び／又は細胞溶解物、及び／又は赤血球、白血球、及び／又は血小板からなる群のうちの１つ以上である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記体液が、血漿及び／又は血清からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記体液が、血清から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 各被験体毎にアミロイドの分子／粒子／凝集体のサイズプロファイルを決定することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記血液のサンプルが、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）酵素及び／若しくはＦＡＤ脂肪色素；並びに／又はピリジン性（ＮＡＤＨ）酵素及び／若しくはＮＡＤＨ脂肪色素からなる群のうちの１つ以上を含まない、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記検出剤が、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応したときに蛍光を発光する蛍光部分を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記検出剤が、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、及び／又はＡＲＣＡＭ１、及び／又は五量体ホルミルチオフェン酢酸（ｐＦＴＡＡ）、及び／又は４－（ジシアノビニル）－ジュロリジン（ＤＣＶＪ）、及び／又は１－アミノ－８－ナフタレンスルホナート（ＡＮＳ）、及び／又はビス－ＡＮＳ、及び／又は２－［Ｎ－ビス－（３－ジメチルアミノプロピル）－アミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）からなる群のうちの１つ以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記個々のアミロイド凝集体が、アミロイドオリゴマー；アミロイドナノ凝集体；及び／又はアミロイド老人性凝集体；及び／又はアミロイド原線維；及び／又はアミロイド前原線維を含む群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記個々のアミロイド凝集体が、２０以上のペプチド；例えば：３０以上；４０以上；５０以上；６０以上；７０以上；８０以上；９０以上；又は１００以上のペプチドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記アミロイドナノ凝集体が、２０のタンパク質又はペプチド～１００，０００のタンパク質又はペプチドを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記老人性アミロイド凝集体が、１，０００，０００超のタンパク質又はペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記個々のアミロイド凝集体が、１枚以上のベータ（β）シートを含み、前記検出剤が、１枚以上のベータ（β）シートを含む個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記アミロイド関連疾患が、アルツハイマー病；及び／又はパーキンソン病；及び／又はハンチントン病；及び／又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；及び／又は２型糖尿病；及び／又は全身性アミロイドーシス；及び／又はプリオン病（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ））；及び／又はアミロイド軽鎖アミロイドーシス；及び／又は多発性骨髄腫；及び／又は炎症；及び／又は腎不全；及び／又は白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）アミロイドーシス；及び／又は多発ニューロパシーを伴うトランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（家族性アミロイド多発ニューロパシー（ＦＡＰ）又はＳｋｅｌｌｅｆｔｅｓｊｕｋａｎとしても知られている）；及び／又は血液透析関連アミロイドーシス；及び／又は脳アミロイドアンギオパシー；及び／又は家族性内蔵アミロイドーシス；及び／又は原発性皮膚アミロイドーシス；及び／又は脳アミロイドアンギオパシー；及び／又はプロラクチノーマ；及び／又は家族性角膜アミロイドーシス；及び／又は心房の老人性アミロイド；及び／又は甲状腺髄様がん；及び／又は医薬品インスリン誘発性アミロイドーシスを含む群から選択される１つ以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記アルツハイマー病が、主観的認知障害；軽度認知障害；アルツハイマー病；及び血管性認知症を伴うアルツハイマー病を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記アミロイド関連疾患が、アルツハイマー病であり、前記個々のアミロイド凝集体が、アミロイドベータ（β）ペプチド（βペプチド）、例えば、β４０及び／又はβ４２及び／又はβ４３を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定が、個々のアミロイド凝集体分解能において行われる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 被験体（ヒトを除く）におけるアミロイド関連疾患を治療する方法であって、アミロイド関連疾患が個々のアミロイド凝集体に関連し、
    前記方法が、
    ・ 前記被験体由来の体液のサンプルを提供する工程と、
    ・ 前記サンプルに検出剤を添加し、前記検出剤が、個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応する工程と、
    ・ 前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と、
    ・ 前記決定に基づいて、前記被験体を前記アミロイド関連疾患を有すると同定する工程と；
    を含み、
    前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）及び蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）を含む時間分解検出に基づく分析を含み、前記方法が、個々のアミロイド凝集体の増幅を含まない、方法。
  21. 前記治療が、前記アミロイド関連疾患の治療を前記被験体に施すことを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定する方法であって、
    ・ 試験被験体由来の体液の第１のサンプルを提供する工程と；
    ・ 前記第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
    ・ 剤を投与された前記試験被験体由来の体液の第２のサンプルを提供する工程と；
    ・ 前記第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
    ・ 前記第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、前記第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
    ・ 前記比較に基づいて、前記剤を前記アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
    を含み、アミロイド関連疾患が個々のアミロイド凝集体に関連し、前記方法が、前記サンプルに検出剤を添加し、前記検出剤が個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応することを更に含み、前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）及び蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）を含む時間分解検出に基づく分析を含み、前記方法が、個々のアミロイド凝集体の増幅を含まない、
    方法。
  23. アミロイド関連疾患を治療するための剤を同定する方法であって、
    ・ 試験流体由来の第１のサンプルを提供する工程と；
    ・ 前記第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
    ・ 剤を前記試験流体に投与する工程と；
    ・ 前記試験流体由来の第２のサンプルを提供する工程と；
    ・ 前記第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズを決定する工程と；
    ・ 前記第１のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定を、前記第２のサンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定と比較する工程と；
    ・ 前記比較に基づいて、前記剤を前記アミロイド関連疾患を治療するためのものと同定する工程と；
    を含み、
    アミロイド関連疾患が個々のアミロイド凝集体に関連し、前記方法が、前記サンプルに検出剤を添加し、前記検出剤が個々のアミロイド凝集体と結合及び／又は会合及び／又は反応することを更に含み、前記サンプル中の個々のアミロイド凝集体の存在及び／又は量及び／又は濃度及び／又はサイズの決定が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）及び蛍光強度ゆらぎ分析（ＦＩＦＡ）に基づく分析を含み、前記方法が、個々のアミロイド凝集体の増幅を含まない、方法。
JP2020554847A 2018-04-03 2019-04-01 アミロイド関連疾患を診断する方法 Active JP7389049B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1805466.8 2018-04-03
GBGB1805466.8A GB201805466D0 (en) 2018-04-03 2018-04-03 Methods
PCT/EP2019/058206 WO2019192969A1 (en) 2018-04-03 2019-04-01 Method for the diagnosis of amyloid-associated diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021519930A JP2021519930A (ja) 2021-08-12
JP7389049B2 true JP7389049B2 (ja) 2023-11-29

Family

ID=62142284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020554847A Active JP7389049B2 (ja) 2018-04-03 2019-04-01 アミロイド関連疾患を診断する方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220026446A1 (ja)
EP (1) EP3775884B1 (ja)
JP (1) JP7389049B2 (ja)
CN (1) CN112639470A (ja)
GB (1) GB201805466D0 (ja)
WO (1) WO2019192969A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL241595B1 (pl) * 2020-02-12 2022-10-31 Univ Warszawski Sposób, zestaw oraz zastosowanie tioflawiny T do wykrywania monomerów i agregatów białka, tioflawina T do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek oraz sposób generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T
CN113008850B (zh) * 2021-02-07 2022-02-25 首都医科大学宣武医院 诊断阿尔茨海默病的用途及诊断阿尔茨海默病的装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001517800A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 エボテック バイオシステムズ アクチェン ゲゼルシャフト 病原性タンパク質沈着の基礎構造の会合の測定方法
JP2009168500A (ja) 2007-12-17 2009-07-30 Olympus Corp 分子の凝集検出方法及び凝集阻害剤のスクリーニング方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008030973A2 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of protein folding disorders
US9910049B2 (en) * 2014-09-11 2018-03-06 Amprion, Inc. Detection of misfolded amyloid beta protein
CN102429906B (zh) * 2010-09-29 2013-08-07 国家纳米科学中心 氮杂环化合物在制备抑制淀粉样多肽毒性的药物中的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001517800A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 エボテック バイオシステムズ アクチェン ゲゼルシャフト 病原性タンパク質沈着の基礎構造の会合の測定方法
JP2009168500A (ja) 2007-12-17 2009-07-30 Olympus Corp 分子の凝集検出方法及び凝集阻害剤のスクリーニング方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y Guan et al，Real-time monitoring of Alzheimer's-related amyloid aggregation via probe enhancement -fluorescence correlation spectroscopy，Chemical Neuroscience，2016年09月16日，vol.16, no.6，1503-1508

Also Published As

Publication number Publication date
EP3775884A1 (en) 2021-02-17
EP3775884B1 (en) 2024-05-08
WO2019192969A1 (en) 2019-10-10
GB201805466D0 (en) 2018-05-16
US20220026446A1 (en) 2022-01-27
JP2021519930A (ja) 2021-08-12
CN112639470A (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
De et al. Soluble aggregates present in cerebrospinal fluid change in size and mechanism of toxicity during Alzheimer’s disease progression
Wildburger et al. Diversity of amyloid-beta proteoforms in the Alzheimer’s disease brain
Horrocks et al. Single-molecule imaging of individual amyloid protein aggregates in human biofluids
Blennow et al. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease
EP1882944B1 (en) Method for the detection of amyloid-beta oligomers in body fluids
Kim et al. Antibody-based magnetic nanoparticle immunoassay for quantification of Alzheimer’s disease pathogenic factor
Wennström et al. Cellular localization of p-tau217 in brain and its association with p-tau217 plasma levels
US20100105098A1 (en) Methods of Identifying Disease Biomarkers in the Lense of the Eye
CN1198214A (zh) 通过定量p97来诊断和监测阿尔海默氏病
Funke et al. Single particle detection of Aβ aggregates associated with Alzheimer’s disease
WO2014089104A1 (en) Method for detection of aggregates in biological samples
JP7389049B2 (ja) アミロイド関連疾患を診断する方法
Schaffrath et al. Patients with isolated REM-sleep behavior disorder have elevated levels of alpha-synuclein aggregates in stool
EP2756311B1 (en) Method for diagnosing alzheimer's disease
Zhang et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers in the diagnostic assays of Alzheimer’s disease
Tan et al. Cognitively impaired aged Octodon degus recapitulate major neuropathological features of sporadic Alzheimer’s disease
Kulenkampff et al. An antibody scanning method for the detection of α-synuclein oligomers in the serum of Parkinson's disease patients
Zheng et al. Oral Mucosa Derived α− Synuclein as a Potential Diagnostic Biomarker for Parkinson′ s Disease
Choi et al. PyrPeg, a blood–brain-barrier-penetrating two-photon imaging probe, selectively detects Neuritic Plaques, Not Tau Aggregates
Choi et al. Correlation of amyloid PET ligand florbetapir F 18 (18F-AV-45) binding with β-amyloid aggregation and neuritic plaque deposition in postmortem brain tissue
US20080070233A1 (en) Quantitative analysis and typing of subcellular particles
Aksnes et al. Comparison of cerebrospinal fluid amyloidogenic nanoplaques with core biomarkers of Alzheimer’s disease
Saleeb et al. Two-color coincidence single-molecule pulldown for the specific detection of disease-associated protein aggregates
Polanco et al. Characterisation of Amyloid Aggregation and Inhibition by Diffusion-Based Single-Molecule Fluorescence Techniques
Zarrouk et al. Impact of C24: 0 on actin-microtubule interaction in human neuronal SK-N-BE cells: evaluation by FRET confocal spectral imaging microscopy after dual staining with rhodamine-phalloidin and tubulin tracker green

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20201201

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220214

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230502

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230707

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231024

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231116

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7389049

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150