CN112639470A - 淀粉样物质相关疾病的诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明在整体上涉及用于诊断和/或预后淀粉样物质相关疾病的方法，治疗淀粉样物质相关疾病的方法，和用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，以及相关的用途和试剂盒套件。
Description
背景技术
本发明在整体上涉及用于诊断和/或预后淀粉样物质相关疾病的方法、治疗淀粉样物质相关疾病的方法和用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，以及相关的用途和试剂盒。
淀粉样物质相关疾病的特征在于患者中淀粉样原纤维的存在和累积并聚集。淀粉样物质相关疾病的公知实例是阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病。这些疾病常常导致患者健康和心理状况恶化，有时持续很长时间，并常常导致死亡。淀粉样物质相关疾病的发病机理和症状通常对患者及其家庭造成很大的创伤。阿尔茨海默病是全世界痴呆症的最常见病因(Prince等，World Alzheimer Report 2016.London,UK:2016and Alzheimer’sDisease Facts and Figures.Alzheimer’s Association.2017)。
治疗和管理淀粉样物质相关疾病症状的关键是早期诊断以及疾病进展的明确预后。然而，由于淀粉样物质相关疾病常常发展缓慢，并且缺乏已知的疾病早期生物标志物，因此患者通常在接受任何诊断和/或预后之前已经患上了非常确定的疾病。在某些情况下，使用生物标志物鉴定疾病的方法只能在验尸后进行，这没有给患者提供益处。这大大延迟了患者能够接受及时和适当治疗的时间，这对健康是有害的。
因此，需要研发用于淀粉样物质相关疾病的早期诊断和预后的方法。
US 6,498,017公开了一种用于鉴定与蛋白质沉积相关的疾病的方法。所述方法的重要特征是使用探针，所述探针通常是与待检测靶标为相同类型的化合物。通过将病理性蛋白质沉积物接受物理和/或化学手段(例如，超声波破碎、去污剂)合适地获得探针。所述探针与作为核的疾病相关沉积物结合提供了聚合过程，从而放大了所测量的信号。
WO 2016/04090 A1提出了一种用于确定样品中错误折叠的Aβ蛋白存在的方法。该方法必不可少的是在分析之前整合一个扩增Aβ蛋白的步骤。
Tiiman等(Biochemistry 2015,54,7203-7211)涉及Aβ聚集的动力学，并且更具体地涉及结构化Aβ聚集体的时间依赖性生长。动力学研究是在包含重组冻干Aβ42的模型溶液上进行的。
Guan(ACS Chem.Neurosci.2015,6,1503-1508)和WO 2017/004560公开了一种具有有价值的光谱特征的新型荧光商品(ARCAM-1)，尤其是与Aβ的蛋白质聚集体结合时。当ARCAM-1与Aβ聚集体结合时，与未结合的ARCAM-1相比，荧光发射显著增加。使用引入了合成的Aβ42的模型系统评估了ARCAM-1的光谱性质。
Wennmalm等(Anal.Chem.2015,87,11700-11705)提出了一种通过提供FRET和FCS(荧光相关光谱)以高灵敏度检测淀粉样物质节拍(beat)寡聚物的系统。将合成的荧光标记的Aβ40和Aβ42用作模型物质。
发明内容
在这种背景下，发明人研发了一种新方法，其可以早期诊断和预后淀粉样物质相关疾病。
发明人的研发涉及测定患者中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，并且是基于以下令人惊讶的发现：可以在患者体液(如血液或脑脊液(CSF))中鉴定患有淀粉样物质相关疾病的患者中出现的单个的淀粉样物质聚集体。发明人已经发现了这些单个的淀粉样物质聚集体可以在疾病非常确定前得到充分鉴定并且可使用其他已知方法检测，并且单个的淀粉样物质聚集体的检测提供了非常有效的疾病诊断和/或预后。发明人的技术的再一个优势是可以检测低水平的单个的淀粉样物质聚集体；因为低水平的单个的淀粉样物质聚集体有时候存在于淀粉样物质相关疾病的早期，这有助于确定早期诊断和/或预后。
因此，本发明的第一个方面提供了一种用于诊断和/或预后受试者的淀粉样物质相关疾病的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液样品；和
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
优选，所述方法进一步包括基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的步骤。更优选，基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的步骤在测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的步骤之后。
因此，本发明提供了非常有效的用于诊断和预后活着的患者中淀粉样物质相关疾病的早期且无创的方法，其还适用于追踪淀粉样物质相关疾病的治疗效果。所述方法进一步可用于治疗淀粉样物质相关疾病，以及鉴定和研发治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。对于这些应用特别有用的是本文所述的方法可以用于随着时间重复地常规地鉴定和表征同一患者中的淀粉样物质聚集体的水平。本发明还提供了对应于本文所述方法的试剂盒。
本发明方法的再一个优势在于，由于它是在体液上进行的，因此是无创的或微创的，因此患者的不适感较小。此外，由于该方法能够检测出疾病的早期征兆，因此可以在活着的患者中进行，而不仅仅是验尸。这也允许该方法重复多次，以便监测活着的患者中的疾病进展。
术语“淀粉样物质相关疾病”是医学领域的技术人员已知的。淀粉样物质相关疾病有时候被称为淀粉样物质变性病，并且包括其中淀粉样物质在受试者中积累的疾病。淀粉样物质是粘附在一起形成聚集体的特定肽或特定蛋白质的许多拷贝的积累，其继而结合形成原纤维。因此，原纤维可以是比聚集体更大的结构。以聚集体和/或原纤维形式，肽或蛋白质不再具有其生理功能。当淀粉样物质聚集体和原纤维在受试者的组织中积累时，它们常常破坏那些组织的功能，这可能导致淀粉样物质相关疾病的病理。
通过“测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”，我们包括测定单个的聚集体。所述测定不涉及测定聚集体的总量或浓度，相反是总体存在内的单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。因此，所述的方法不同于现有的方法，如果存在并且适用的情况下，现有方法仅检测淀粉样物质原纤维的总量和/或大组。如本文所讨论的，“单个的淀粉样物质聚集体”是针对淀粉样物质相关疾病的早期生物标志物，其使得可以早期诊断和/或预后。
通过“单个的淀粉样物质聚集体”，我们包括肽或蛋白质的聚集，其是、或形成、与淀粉样物质相关疾病相关的结构。术语“单个的淀粉样物质聚集体”可以是指结构化的淀粉样物质聚集体，其包括具有限定的二级结构的淀粉样物质聚集体，如包含β褶片的淀粉样物质聚集体。术语“淀粉样物质聚集体”用于指可以形成与淀粉样物质相关疾病相关的结构的任何肽或蛋白质。尽管该术语有时候在本领域用于指淀粉样物质β肽(其形成与阿尔茨海默病相关的结构)，为了本申请的目的，其不限于该肽。
通常认为“肽”是包含两个或更多个氨基酸但不超过约50个氨基酸的分子；例如：约三至约50个氨基酸；约四至约50个氨基酸；约五至约50个氨基酸；约六至约50个氨基酸；约七至约50个氨基酸；约八至约50个氨基酸；约九至约50个氨基酸；约十至约50个氨基酸；约20至约50个氨基酸；约30至约50个氨基酸；或约40至约50个氨基酸。
通常认为“蛋白质“是包含约50或更多个氨基酸的分子；例如，约60或更多个；约70或更多个；约80或更多个；约90或更多个；约100或更多个；约150或更多个；约200或更多个；约250或更多个；约300或更多个；约350或更多个；约400或更多个；约450或更多个；或约500或更多个氨基酸。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体不包括无定形淀粉样物质聚集体。通过“无定形淀粉样物质聚集体“，我们包括不具有充分限定的二级结构的淀粉样物质聚集体，如不具有β褶层结构的淀粉样物质聚集体。
本发明在整体上涉及单个的淀粉样物质聚集体的检测，以及单个的淀粉样物质聚集体的表征。将所述检测和表征描述为“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”，并且通过它，我们包括“鉴定和/或计算和/或检测”样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
通过“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在”，我们包括测定样品中是否存在单个的淀粉样物质聚集体。如以下进一步讨论的，在样品是来自患者的体液的情况中，并且如果单个的淀粉样物质聚集体存在于患者的体液中，那么患者被诊断为患有淀粉样物质相关疾病。
通过“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的数量”，我们包括测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的总数。如以下进一步讨论的，在样品是来自患者的体液的情况中，患者体液中单个的淀粉样物质聚集体的数量越高，淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后越差。
通过“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸”，我们包括测定单个的淀粉样物质聚集体中的肽的数量，和/或测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的维度，和/或测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的度量；和/或测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量。如以下进一步讨论的，在样品是来自患者的体液的情况中，患者体液中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸越大，淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后越差。
通过“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的浓度”，我们包括鉴定样品中单个的淀粉样物质聚集体的相对含量。如以下进一步讨论的，在样品是来自患者的体液的情况中，患者体液中单个的淀粉样物质聚集体的浓度越高，淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后越差。
在本发明第一个方面的优选实施方案中，所述方法包括以下顺序的步骤：
-提供来自受试者的体液样品；
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；和
-基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
再一个实施方案涉及用于诊断和/或预后受试者中的淀粉样物质相关疾病的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供选自来自受试者的血浆和/或血清的样品；和
-通过基于荧光光谱(合适地是荧光相关光谱)的分析测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
术语“诊断”和“预后(prognosis)”是医学领域的技术人员已知的。
通过“诊断”，我们包括可以用于鉴定受试者是否患有淀粉样物质相关疾病的方法。通过“预后”，我们包括可以用于鉴定淀粉样物质相关疾病在受试者中进展可能有多快，和/或受试者中的淀粉样物质相关疾病的症状和/或体征可能变得多严重和/或受试者是否可能死于淀粉样物质相关疾病，和/或患者可能死于淀粉样物质相关疾病有多快，和/或评估已经施用于或实施于受试者的治疗对淀粉样物质相关疾病的有效性，和/或将来可能施用于或实施于受试者的治疗对于淀粉样物质相关疾病的可能有效性的方法。换句话说，通过预后，我们包括追踪先前已经施用于或实施于受试者的淀粉样物质相关疾病治疗的效果。
如果存在并且适用的情况下，用于淀粉样物质相关疾病的治疗将是医学领域中的技术人员已知的。
通过“治疗”，我们包括意图为治愈淀粉样物质相关疾病的治疗，和/或意图为降低淀粉样物质相关疾病的症状和/或体征的数量和/或严重性，和/或姑息疗法，和/或实验性治疗，和/或物理治疗。本文讨论了用于淀粉样物质相关疾病的特定治疗。
在一个实施方案中，体液是来自包括以下物质的或由以下物质组成的组中的一种或多种：血液和/或脑脊液(CSF)和/或唾液和/或尿液和/或滑液和/或粪便。在优选实施方案中，体液包括血液。在可替换的优选实施方案中，体液包括唾液。在再一个可替换的优选实施方案中，体液包括尿液。在再一个实施方案中，体液选自血浆和/或血清。在再一个实施方案中，体液选自血清。在可替换的实施方案中，体液包括血细胞，尤其是红细胞、白细胞和凝血细胞。根据再一个实施方案，血细胞可以是溶解的。
本发明特别令人惊讶的发展是可以使用血液、尿液、滑液、粪便和/或唾液体液样品诊断或预后淀粉样物质相关疾病。之前，研究已经表明了使用已知方法是不可能使用血液样品诊断淀粉样物质相关疾病阿尔茨海默病的-特别地，如这里所述(Oh等，Neuromolecular medicine.2008；10(3):195-207和Toledo等，Alzheimer's research&therapy.2013；5(2):8)。然而，这些先前的方法中认识到的问题在本发明中通过检测单个的淀粉样物质聚集体被克服了，因为它们现在已经显示出是用于淀粉样物质相关疾病的有效早期生物标志物。对于尿液、唾液、滑液、粪便和CSF样品，之前没有提出检测那些体液中单个的淀粉样物质聚集体可以用于淀粉样物质相关疾病(如阿尔茨海默病)的诊断或预后。
尿液、唾液、粪便和血液体液的特别优势在于可以使用最小创伤(侵入)的方法从受试者提供它们，而且尿液、粪便和唾液样品的提供无需医疗专业人员的协助。
对于本发明的目的，医学领域的技术人员将知道怎样可以提供体液样品。例如，可以通过医疗专业人员，通过使用针从静脉抽血来获得血液体液样品。
在一个实施方案中，血液样品是来自包括以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：全血；血清；血浆；血细胞；红细胞、白细胞和/或凝血细胞；血细胞裂解物。
从受试者收集的血液特别包含悬浮于血浆中的血细胞。主要类型的血细胞是红细胞(红血细胞)、白细胞(白血细胞)和凝血细胞(血小板)。根据一个实施方案，从血液获得血细胞是有利的并且由此获得血浆。此外，可以从血浆除去凝血因子，并且由此接受血清。可以通过离心将全血分成几个部分。通过离心，将全血分成血浆和红细胞，并且在这个部分之间，是白细胞和血小板的薄层。尽管全血可以直接用作分析样品，但在某些情况中，优选除去血细胞，并将血浆用作分析样品。此外，从血浆除去任何凝血因子并使用血清(作为样品)用于分析也是可取的。
通过“细胞裂解物”，我们包括红细胞、白细胞和/或凝血细胞(即，血小板)细胞裂解物。
可以使用本领域已知的方法，如通过涉及将全血液样品品离心的血液分级，来分离血液的特定成分(如红细胞、白细胞和/或凝血细胞)。
在一些情况中，FAD酶和脂色素(lipopigment)以及NADH酶和脂色素可能会导致方法灵敏度降低，因为它们自发荧光。因此，在使用所述方法前从体液样品除去这些分子可能会有一些优势。
在一个实施方案中，体液样品不包含来自包含以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶和/或FAD脂色素；和/或吡啶类(NADH)酶和/或NADH脂色素。
在特定的实施方案中，血液样品不包含来自包含以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶和/或FAD脂色素；和/或吡啶类(NADH)酶和/或NADH脂色素。
在特定的实施方案中，CSF样品不包含来自包含以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶和/或FAD脂色素；和/或吡啶类(pyridinic)(NADH)酶和/或NADH脂色素。
怎样从样品中除去黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶、FAD脂色素、吡啶类(NADH)酶和/或NADH脂色素是化学领域的技术人员已知的。例如，FAD在5％三氯乙酸中在37℃下在20小时内完全水解成FMN，如Burch HB,Bessey OA,Lowry OH.Fluorometric Measurements ofRiboflavin and its Natural Derivatives in Small Quantities of Blood Serum andCells.J Biol Chem.1948 175(1):457-470中所述的。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体选自：淀粉样物质寡聚物；淀粉样物质纳米聚集体；和/或淀粉样物质衰老(senile)聚集体；和/或淀粉样物质原纤维(fibril)；和/或淀粉样物质初原纤维(protofibril)。优选，单个的淀粉样物质聚集体是淀粉样物质纳米聚集体。这些淀粉样物质聚集体是由易于在受试者中形成淀粉样物质聚集体的肽和/或蛋白质交叉反应形成的。
淀粉样物质纳米聚集体可以称为淀粉样物质纳米斑块或结构化淀粉样物质纳米斑块，如包括β-褶层二级结构的那些。术语“淀粉样物质纳米聚集体”描述包括肽数量多于二聚体和三聚体的(并且其可以描述为结构化超分子装配体)，但其尚未形成淀粉样物质原纤维或衰老淀粉样物质聚集体(其可以称为衰老斑块)。这些区别是生物学或化学领域的技术人员将理解的。
淀粉样物质寡聚物和淀粉样物质初原纤维是在淀粉样物质原纤维生长过程中观察到的可溶性肽装配体。它们含有显著含量的β-层结构，因此能够结合ThT，因此可以产生ThT荧光。尽管淀粉样物质寡聚物和淀粉样物质原纤维包括结构上异质的超分子装配体，但通常认为寡聚物较小并且早于原纤维形成。另外，认为寡聚物采用更常见的球形，而不是原纤维特征性的伸长的和环样形状。原纤维中的结构有序度介于寡聚物和原纤维之间。寡聚物和原纤维的分子量在40-3000kDa的范围中(Nichols等，Biochemistry.2015 54(13):2193-2204；Byron&Vestergaard Curr.Opin.Struct.Biol.2015 35:76-86)。
淀粉样物质原纤维是伸长的或环样形状的伸长的、单链样超分子装配体，其生长并合并成淀粉样物质原纤维。原纤维可以具有2-10nm范围的直径并且约100-200nm长。淀粉样物质原纤维是伸长的、多链样分子装配体，其具有较高的长径比，并且直径范围为10-100nm。原纤维产生了衰老斑块，其是由复杂交织的成熟原纤维组成的异质结构(NicholsMR,Colvin BA,Hood EA,Paranjape GS,Osborn DC,Terrill-Usery SE.Biophysicalcomparison of soluble amyloid-β(1-42)protofibrils,oligomers,and protofilaments.Biochemistry.2015 54(13):2193-2204.doi:10.1021/bi500957g；Byron O,Vestergaard B.Protein–protein interactions:a supra-structural phenomenondemanding trans-disciplinary biophysical approaches.Curr.Opin.Struct.Biol.2015 35:76–86；Relini A.Amyloid like protofibrils with different physicalproperties.Bio-nanoimaging:Protein Misfolding and Aggregation,VladimirUversky和Yuri Lyubchenko编辑，2013Technology&Engineering.)。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体包括一个或多个beta(β)层(如β褶层)。如生物学或化学领域的技术人员已知的，beta(β)层是二级蛋白结构，其通常是氨基酸的扭转链。两个或更多个beta(β)层的结合常常是肽累积的介质，如形成与淀粉样物质相关疾病相关的单个的淀粉样物质聚集体。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体可以被2-(4-(二甲基氨基)苯基)-3,6-二甲基苯并[d]噻唑鎓-3-氯化物结合(硫磺素T(ThT))(Groenning,M.(2010)Bindingmode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloidfibrils-current status.Journal of Chemical Biology 3,1-18)。ThT是结合beta(β)层结构的分子，并且可从Sigma-Aldrich获得。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体包含约20或更多个肽或蛋白质；例如，约30或更多；约40或更多；约50或更多；约60或更多；约70或更多；约80或更多；约90或更多；约100或更多；约200或更多；约300或更多；约400或更多；约500或更多；约600或更多；约700或更多；约800或更多；约900或更多；约1,000或更多；约2,000或更多；约3,000或更多；约4,000或更多；约5,000或更多；约6,000或更多；约7,000或更多；约8,000或更多；约9,000或更多；约10,000或更多；约20,000或更多；约30,000或更多；约40,000或更多；约50,000或更多；约60,000或更多；约70,000或更多；约80,000或更多；约90,000或更多；约100,000或更多；约200,000或更多；约300,000或更多；约400,000或更多；约500,000或更多，或约1,000,000或更多个肽或蛋白质，优选约40或更多个肽或蛋白质。
如将得知的，淀粉样物质纳米聚集体可以包括约20个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽，如：约30个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约40个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约50个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约60个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约70个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约80个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约90个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约100个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约200个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约300个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约400个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约500个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约600个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约700个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约800个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约900个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约2,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约3,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约4,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约5,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约6,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约7,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约8,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约9,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约10,000个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽；约40个蛋白质或肽至约1,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约2,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约3,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约4,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约5,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约6,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约7,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约8,000个蛋白质或肽；约1,000个蛋白质或肽至约8,000个蛋白质或肽；或约1,000个蛋白质或肽至约10,000个蛋白质或肽。
如将得知的，淀粉样物质原纤维可以包括超过100,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质，如：约200,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质；约300,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质；约400,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质；或约500,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质。
如将得知的，衰老淀粉样物质聚集体可以包括超过1,000,000个肽或蛋白质。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括将检测剂加入样品中的步骤。
优选，“将检测剂加入样品中”的步骤在“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或大小”的步骤之前。
更优选，“将检测剂加入样品中”的步骤在“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或大小”的步骤之前，且在“提供来自受试者的体液样品”的步骤之后。
在一个实施方案中，检测剂与单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应。优选，检测剂与单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应；使得检测剂成为可检测和/或可测量的，或变得更容易检测和/或更容易测量和/或产生更高的可测量输出。
通过“检测剂与单个的淀粉样物质聚集体结合”，我们包括与单个的淀粉样物质聚集体形成分子键(如共价键)的检测剂。
通过“检测剂与单个的淀粉样物质聚集体缔合”，我们包括与单个的淀粉样物质聚集体形成非共价相互作用(如静电相互作用，和/或pi(π)-相互作用，和/或范德华相互作用，和/或疏水性相互作用)的检测剂。
通过“检测剂与单个的淀粉样物质聚集体反应”，我们包括不一定需要与单个的淀粉样物质聚集体结合或缔合和/或接近单个的淀粉样物质聚集体以起到作用的检测剂。
通过“导致检测剂变成可检测的”，我们包括在单个的淀粉样物质聚集体存在下，检测剂与其结合和/或缔合和/或反应时，可以鉴定或检测检测剂的存在。换句话说，使用本文所述的方法，如果样品不包含单个的淀粉样物质聚集体，则不可能鉴定或检测出检测剂的存在。
通过“导致检测剂变成可测量的”，我们包括在单个的淀粉样物质聚集体存在下，检测剂与其结合和/或缔合和/或反应时，可以定量检测剂的含量和/或评估检测剂的相对含量或相对水平。检测剂的含量或水平可以用于定量单个的淀粉样物质聚集体的数量和/或浓度和/或尺寸。
在一个实施方案中，测定包括检测和/或测量检测剂。为了避免疑惑，这个测定可以作为以下步骤的一部分来进行，“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”。
通过“检测剂的检测”，我们包括检测或鉴定检测剂的存在。通过“检测剂的测量”，我们包括定量检测剂的含量和/或评估检测剂的相对含量或相对水平。检测剂的含量或水平可以用于定量单个的淀粉样物质聚集体的数量和/或浓度和/或尺寸。
在一个实施方案中，检测剂与包含一个或多个betaβ-层的单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应。
在一个实施方案中，检测剂包含荧光部分和/或生物发光部分。生物学和/或化学领域的技术人员将理解术语“荧光部分”和“生物发光部分”包括什么。
在一个实施方案中，检测剂包含荧光部分并在与单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应时产生或释放荧光。
在优选实施方案中，添加包含荧光剂的检测剂，并将来自检测剂的荧光的测量和/或检测用于测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
在再一个可替换的实施方案中，检测剂包含生物发光部分并在与单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应时产生或释放光。
在一个实施方案中，检测剂及是来自包括以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：硫磺素T(ThT)和/或ARCAM1和/或五聚甲酰基噻吩乙酸(pFTAA)和/或4-(二氰基乙烯基)-久洛里定(julolidine)(DCVJ)和/或1-氨基-8-萘磺酸盐(ANS)和/或双-ANS和/或2-[N-双-(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓(PicoGreen)。优选，检测剂包含硫磺素T(ThT)和/或ARCAM1。更优选，检测剂包含硫磺素T(ThT)。
ARCAM1是芳基氰基酰胺，其结合beta(β)-层(Guan等，2015,ACS ChemicalNeuroscience,6:1503-1508)。
在一个实施方案中，检测剂是来自包括以下物质或由以下物质组成的组中的一种或多种：硫磺素T(ThT)和/或ARCAM1和/或五聚甲酰基噻吩乙酸(pFTAA)和/或4-(二氰基乙烯基)-久洛里定(DCVJ)和/或1-氨基-8-萘磺酸盐(ANS)和/或双-ANS和/或2-[N-双-(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓(PicoGreen)的变体或衍生物或修饰物。
在一个实施方案中，淀粉样物质相关疾病与单个的淀粉样物质聚集体相关，优选单个的淀粉样物质聚集体包含一个或多个beta(β)-层。
通过“淀粉样物质相关疾病与单个的淀粉样物质聚集体相关”，我们包括淀粉样物质相关疾病是由单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或累计导致或恶化的。
在一个实施方案中，淀粉样物质相关疾病是选自以下的一种或多种：阿尔茨海默病；和/或帕金森病；和/或亨廷顿病；和/或肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和/或2型糖尿病；和/或系统性淀粉样变性；和/或朊病毒病(如克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD))；和/或淀粉样物质轻链淀粉样变性；和/或多发性骨髓瘤；和/或炎症；和/或肾衰竭；和/或白细胞趋化因子2(LECT2)淀粉样变性；和/或甲状腺素转运蛋白相关的遗传性淀粉样变性伴多发性神经病(也称为家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或Skelleftesjukan)；和/或与血液透析相关的淀粉样变性；和/或脑淀粉样血管病；和/或家族性内脏淀粉样变性；和/或原发性皮肤淀粉样变性；和/或脑淀粉样血管病；和/或催乳素瘤；和/或家族性角膜淀粉样变性；和/或老年性心房淀粉样变性；和/或甲状腺髓样癌；和/或药物性胰岛素衍生的淀粉样变性。上述疾病是医学领域的技术人员已知的。
在优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病。
在可替换的优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是帕金森病。
在再一个可替换的实施方案中，淀粉样物质相关疾病是亨廷顿病。
在再一个可替换的实施方案中，淀粉样物质相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病，其随着时间缓慢发展，诊断后的平均寿命通常为三至九年。但是，由于缺乏可靠的疾病早期标志物，阿尔茨海默病的诊断通常被延迟很多。当前，诊断依赖于表现出行为症状的患者，该行为症状常常非常微妙且难以观察，如短期记忆丧失。基于当前的方法，很难预知患者恶化可能有多快。因此，特别需要一种有效的方法来及早诊断阿尔茨海默病，并能够提供可靠的预后。本发明通过检测单个的淀粉样物质聚集体解决了这个问题，发明人已证明其提供了有效的早期诊断标志物和通过其评估预后的可靠标志物。
相似地，帕金森病、亨廷顿病和ALS是使用行为症状诊断的慢性疾病，并且其缺乏有效的早期诊断和预后标志物。与本文所述的所有淀粉样物质相关疾病一样，特别需要有效的方法来早期诊断帕金森病、亨廷顿病和ALS，并且能够提供可靠的预后。本发明通过检测单个的淀粉样物质聚集体解决了这个问题，发明人已证明其提供了有效的早期诊断标志物和通过其评估预后的可靠标志物。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病选自包括以下的组：主观认知障碍；轻度认知障碍；阿尔茨海默病；以及伴有血管性痴呆的阿尔茨海默病。这些类型的阿尔茨海默病是医学领域的技术人员已知的。
主观认知障碍(SCI)，也称为主观记忆障碍，涉及认知能力下降的受试者，包括记忆障碍，但是这种恶化无法通过标准测试加以证实。在没有客观的认知功能障碍或抑郁的情况下，有时将SCI视为正常衰老中的常见过渡阶段。
轻度认知障碍(MCI)，也称为初期痴呆或孤立的记忆障碍，是一种脑功能综合症，涉及超出了根据受试者年龄所预期那些的但不足以干扰他们日常活动的认知障碍的发作和发展。MCI可能是正常衰老和痴呆之间的过渡阶段。MCI的原因尚不清楚，并因此没有预防措施也没有治疗方法。在美国，MCI在美国ICD-10-CM医学诊断代码中已指定为G31.84。
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，其特征是脑的大脑皮层中的神经细胞和神经连接的不可逆破坏，并且大脑质量明显丧失。结果，出现了随时间恶化的痴呆症状。最终，该疾病变得严重到足以使该受试者不能执行日常任务并且如果没有持续的护理就无法生存。尽管人们对基础的生化变化了解很多，但AD的病因仍然未知，并且目前尚无治愈AD的方法。如本文所讨论的，也没有用于早期AD诊断的可靠生物标志物，也没有可靠的疾病进展生物标志物。通常用于AD治疗的治疗剂减慢疾病进程并缓解某些症状和/或体征，但不能治愈患者。
伴有血管性痴呆的阿尔茨海默病(也称为混合性痴呆)是一种常见的包括AD和血管性痴呆的合并症，即由大脑供血减少引起的认知衰退。在伴有痴呆的血管性痴呆症状的阿尔茨海默病中，由于双重原因，如记忆和语言问题，集中力和注意力丧失，推理和判断上的困难，视觉感知上的困难等加重。
在一个实施方案中，单个的淀粉样聚集体包括选自以下列表的一种或多种肽或蛋白质，所述列表包括：淀粉样物质beta(β)肽(β肽)(例如：beta(β)40和/或beta(β)42和/或beta(β)43)；和/或淀粉样物质轻链；和/或血清淀粉样物质A蛋白(SAA)；和/或白细胞趋化因子2(LECT2)；和/或甲状腺素转运蛋白(transthyretin)；和/或beta(β)2微球蛋白；和/或胰淀素(amylin)；和/或朊病毒蛋白；和/或胱抑素(cystatin)C(CST3)；和/或载脂蛋白A1(APOA1)；和/或纤维蛋白原α链(FGA)；和/或溶菌酶(LYZ)；和/或制瘤素(oncostatin)-M特异性受体亚基β(OSMR)；和/或整合膜蛋白2B(ITM2B)；和/或催乳素；和/或角膜上皮素(keratoepithelin)；和/或心房利钠因子；和/或降钙素；和/或Huntingtin；和/或alpha(α)-突触核蛋白；和/或胰岛素。
在一个实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括淀粉样物质beta(β)肽，例如，β40和/或β42和/或β43。在优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括β40和β42。在可替换的优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括β40。在再一个可替换的优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括β42。在另一个可替换的实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括单独的β40和/或β42，或在与其他肽和/或蛋白质的共同聚集体中。
在本发明的各种实施方案中：
-淀粉样物质相关疾病是淀粉样物质轻链淀粉样变性病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括淀粉样物质轻链；和/或
-淀粉样物质相关疾病是多发性骨髓瘤，并且单个的淀粉样物质聚集体包括淀粉样物质轻链；和/或
-淀粉样物质相关疾病是炎症，并且单个的淀粉样物质聚集体包括血清淀粉样物质A蛋白(SAA)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是白细胞趋化因子2(LECT2)淀粉样变性病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括白细胞趋化因子2(LECT2)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是肾衰竭，并且单个的淀粉样物质聚集体包括白细胞趋化因子2(LECT2)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是甲状腺素转运蛋白相关的遗传性淀粉样变性伴多发性神经病(也称为家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或Skelleftesjukan)，并且单个的淀粉样物质聚集体包括甲状腺素转运蛋白；和/或
-淀粉样物质相关疾病是家族性淀粉样多发性神经病(FAP)，并且单个的淀粉样物质聚集体包括甲状腺素转运蛋白；和/或
-淀粉样物质相关疾病是与血液透析相关的淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括beta(β)2微球蛋白；和/或
-淀粉样物质相关疾病是2型糖尿病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括胰淀素；和/或
-淀粉样物质相关疾病是朊病毒病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括朊病毒蛋白；和/或
-淀粉样物质相关疾病是脑淀粉样血管病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括胱抑素C(CST3)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是家族性内脏淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括载脂蛋白A1(APOA1)和/或纤维蛋白原α链(FGA)和/或溶菌酶(LYZ)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是原发性皮肤淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括制瘤素(oncostatin)-M特异性受体亚基β(OSMR)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是脑淀粉样血管病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括整合膜蛋白2B(ITM2B)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是催乳素瘤，并且单个的淀粉样物质聚集体包括催乳素；和/或
-淀粉样物质相关疾病是家族性角膜淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括角膜上皮素；和/或
-淀粉样物质相关疾病是老年性心房淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括心房利钠因子(atrial natriuretic factor)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是甲状腺髓样癌，并且单个的淀粉样物质聚集体包括降钙素；和/或
-淀粉样物质相关疾病是亨廷顿病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括Huntingtin；和/或
-淀粉样物质相关疾病是帕金森病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括alpha(α)-突触核蛋白；和/或
-淀粉样物质相关疾病是药物性胰岛素衍生的淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括胰岛素；和/或
-淀粉样物质相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)，并且单个的淀粉样物质聚集体包括铜-锌超氧化物歧化酶1(SOD1)；和/或
-淀粉样物质相关疾病是系统性淀粉样变性，并且单个的淀粉样物质聚集体包括单克隆免疫球蛋白(Ig)轻(L)链或L-链片段。
将认识到尽管淀粉样物质聚集体可能主要包含单一类型的肽或蛋白质(例如，当淀粉样物质相关疾病是淀粉样物质轻链淀粉样变性时，单个的淀粉样聚集体可能主要包含淀粉样物质轻链)，在某些情况下淀粉样物质聚集体还可包含其他类型的肽和/或蛋白质。
在一个实施方案中，(特别地，其中淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病)所述方法进一步包括下列步骤：
-测定样品中Tau蛋白的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；和，
-基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
Tau是神经变性的标志物，可以用于阿尔茨海默病的诊断和预后中，并且可以在体液中检测，如脑脊液(CSF)、血清、唾液和尿液(Hei-Nga Chan,Di Xu,See-Lok Ho,ManShing Wong ORCID logo*和Hung-Wing Li,Ultra-sensitive detection of proteinbiomarkers for diagnosis of Alzheimer’s disease.Chem.Sci.,2017,8,4012-4018)。结合生物标志物的鉴定通常可以改进诊断和预后的方法，如结合本文所述的涉及单个的淀粉样聚集体的方法和涉及Tau的方法可能就是这种情况。
在一个实施方案中，Tau蛋白是磷酸化Tau蛋白。
在一个实施方案中，其中测定了Tau蛋白的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，所述方法进一步包括添加再一种检测剂，所述检测剂在Tau存在下结合和/或缔合和/或反应，如五聚甲酰基噻吩乙酸(pFTAA)。
Brelstaff和同事描述了使用pFTAA检测Tau的方法(Brelstaff等，FrontNeurosci.2015年5月29日；9:184)。关于检测Tau蛋白的其他指导可以在Chan等，2017中找到(Hei-Nga Chan,Di Xu,See-Lok Ho,Man Shing Wong ORCID logo*和Hung-Wing Li,Ultra-sensitive detection of protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer’sdisease.Chem.Sci.,2017,8,4012-4018)。
在一个实施方案中，测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸是在单个的淀粉样物质聚集体分辨率下。
通过“单个的淀粉样物质聚集体分辨率”，我们包括检测和/或测量样品中的单个淀粉样物质聚集体的方法(即，所述方法没有同时检测和/或测量样品中的多个单个的淀粉样物质聚集体)，和/或检测和/或测量样品中的每个单个的淀粉样物质聚集体的方法。或者，“单个的淀粉样物质聚集体分辨率”可以称为“单颗粒分辨率”或“单分子分辨率”。
在一个实施方案中，测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括时间分辨检测。换句话说，测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸是使用时间分辨检测进行的。“时间分辨检测”方法将是化学领域的技术人员公知的，并且详细描述于本文的实施例中。如实施例中讨论的，时间分辨检测对于与本文所述的方法一起使用特别有效。
在一个实施方案中，所述方法包括基于荧光相关光谱的分析装置，其中在观察体积元件中观察到的分子/颗粒/聚集体的数量足够少，足以使单个的分子/颗粒/聚集体实质上对测量信号有所贡献。在体积元件中的分子/颗粒/聚集体的数量应优选低于约1000，低于约500，低于约100，例如低于约50，低于约25。在体积元件中观察到的分子/颗粒/聚集体的数量尤其是观察体积元件的尺寸(体积)和溶液中聚集体浓度的函数。随着观察体积元件中分子/颗粒/聚集体数量的增加，单个的聚集体对测量信号的贡献降低。在体积元件中聚集体数量高的情况下，单个的聚集体与测量信号的相关性低，并最终接近零。然而，如果分子/颗粒/聚集体的数量少，则观察到单个的分子/颗粒/聚集体通过观察体积元件。因此，在这种情况下，所测量的信号可以被称为单个事件发生(seo)。
聚集体具有高荧光产率也是有利的，这意味着优选具有能够与感兴趣的单个的淀粉样聚集体缔合以产生具有高荧光产率的包合物的检测剂，而检测化合物自身是非荧光的/弱荧光的。当恢复到较低的能量水平时，具有高荧光产率的检测剂能够提供大量的光子。对于基于荧光相关光谱的分析，包括具有单光子灵敏度的检测仪是进一步有益的。
根据一个实施方案，在分析之前，不需要扩增任何淀粉样物质化合物，例如淀粉样物质肽(蛋白质)，淀粉样物质单体，淀粉样物质多聚体，淀粉样物质聚集体，淀粉样物质大聚集体。如果实施了可提供单分子(颗粒)分辨率的分析技术，则特别不需要淀粉样物质实体的进一步扩增。因此，在本发明的方法中不需要实施淀粉样物质扩增步骤，本发明方法包括荧光光谱分析，如单分子分辨率荧光光谱。
根据再另一个实施方案，所述方法不需要使用非靶标淀粉样物质分子/肽/蛋白质/聚集体(淀粉样物质实体)或包括如下步骤：包括将靶标淀粉样物质分子/肽/蛋白质/聚集体与非靶标淀粉样物质分子/聚集体混合的步骤。非靶标淀粉样物质实体包括不是源自待分析的体液的任何淀粉样物质实体，或不是来自待分析的体液的操作的淀粉样物质实体。非靶标淀粉样物质实体的实例包括重组形成的淀粉样物质实体或衍生自病理性沉积的淀粉样物质实体(其可以源自待分析的体液中发现的淀粉样物质实体)。非靶标和靶标淀粉样物质实体的混合物诱导集聚(聚合)，从而增加了聚集的淀粉样物质的量。
因此，一个实施方案涉及用于诊断和/或预后受试者的淀粉样物质相关疾病的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液样品；和
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
并且其中所述方法不需要使用非靶标淀粉样物质实体(非靶标淀粉样物质分子和/或肽和/或蛋白质和/或聚集体)。
在时间分辨检测中，“测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”的步骤不在整个样品上同时进行。相反，在一个时间测量样品的一部分，在一个时间单位内多次测量样品的几个部分。在一些实施方案中，待测量的样品部分是如下所述的“观察体积元件”。使用时间分辨检测时，只测量和/或检测样品部分内存在的单个的淀粉样物质聚集体。因此，基于其中检测和/或测量单个的淀粉样物质聚集体的样品部分的频率，和/或基于那些单个的淀粉样物质聚集体的特征，来测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。如所知的，“时间分辨检测”可以定义为亚微秒分辨率的光子计数。
因此，在一个实施方案中，“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”的步骤包括测定样品中(如样品部分中)单个的淀粉样物质聚集体的频率(如出现的频率)，其中所述方法使用时间分辨检测来进行。
在这个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体频率越高，单个的淀粉样物质聚集体的数量(含量)和/或浓度越高。本文(特别是实施例)解释了测量频率的概念，并且适用于本文所述发明的每个方面。
在再一个实施方案中，测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括测定单位时间内单个的淀粉样物质聚集体的频率。
在一些实施方案中，将单个的淀粉样物质聚集体的频率称为单个事件发生频率(fSEO)。单个事件发生(fSEO)与淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的相关性在表1中举例说明了。单个事件发生等同于单个的淀粉样物质聚集体的检测。在一个实施方案中，单个事件发生频率(fSEO)可以与单个的淀粉样物质聚集体的浓度成比例。在相关实施方案中，单个事件发生频率(fSEO)计算为每单位时间的单个事件发生的平均数量。
在一个实施方案中，单位时间为约0.05微秒(μs)或更多；例如，约0.1μs或更多；约0.15μs或更多；约0.2μs或更多；约0.25μs或更多；约0.3μs或更多；约0.35μs或更多；约0.4μs或更多；约0.45μs或更多；约0.5μs或更多；约0.6μs或更多；约0.7μs或更多；约0.8μs或更多；约0.9μs或更多；约1μs或更多；约1.5μs或更多；约2μs或更多；约2.5μs或更多；约3μs或更多；约4μs或更多；约5μs或更多；约6μs或更多；约7μs或更多；约8μs或更多；约9μs或更多；约10μs或更多；约20μs或更多；约30μs或更多；约40μs或更多；约50μs或更多；约60μs或更多；约70μs或更多；约80μs或更多；约90μs或更多；约0.1毫秒或更多；约0.2毫秒或更多；约0.3毫秒或更多；约0.4毫秒或更多；约0.5毫秒或更多；约0.6毫秒或更多；约0.7毫秒或更多；约0.8毫秒或更多；约0.9毫秒或更多；约1毫秒或更多；约2毫秒或更多；约3毫秒或更多；约4毫秒或更多；约5毫秒或更多；约6毫秒或更多；约7毫秒或更多；约8毫秒或更多；约9毫秒或更多；约10毫秒或更多；约20毫秒或更多；约30毫秒或更多；约40毫秒或更多；约50毫秒或更多；约60毫秒或更多；约70毫秒或更多；约80毫秒或更多；约90毫秒或更多；约0.1秒或更多；约0.2秒或更多；约0.3秒或更多；约0.4秒或更多；约0.5秒或更多；约0.6秒或更多；约0.7秒或更多；约0.8秒或更多；约0.9秒或更多；约1秒或更多；约2秒或更多；约3秒或更多；约4秒或更多；约5秒或更多；约6秒或更多；约7秒或更多；约8秒或更多；约9秒或更多；约10秒或更多；约20秒或更多；约30秒或更多；约40秒或更多；约50秒或更多；约60秒或更多；约120秒或更多；约180秒或更多；约240秒或更多；约300秒或更多；约360秒或更多；约420秒或更多；约480秒或更多；约540秒或更多；约600秒或更多；约1200秒或更多；约1800秒或更多；约2400秒或更多；约3000秒或更多；或约3600秒或更多，优选约0.2μs或更多，或约3,000秒或更多。
在一个实施方案中，如果单个的淀粉样物质聚集体的频率(如单个事件发生频率(fSEO))为约0.1或更高；例如：约0.2或更高；约0.3或更高；约0.4或更高；约0.5或更高；约0.6或更高；约0.7或更高；约0.8或更高；约0.9或更高；约1或更高；约1.1或更高；约1.2或更高；约1.3或更高；约1.4或更高；约1.5或更高；约1.6或更高；约1.7或更高；约1.8或更高；约1.9或更高；约2或更高；约2.2或更高；约2.4或更高；约2.6或更高；约2.8或更高；约3或更高；约3.2或更高；约3.4或更高；约3.6或更高；约3.8或更高；约4或更高；约4.2或更高；约4.4或更高；约4.6或更高；约4.8或更高；约5或更高；约5.5或更高；约6或更高；约6.5或更高；约7或更高；约7.5或更高；约8或更高；约8.5或更高；约9或更高；约9.5或更高，或约10或更高，优选约1.5或更高，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
在再一个实施方案中，如果单个的淀粉样物质聚集体的频率(如单个事件发生频率(fSEO))为约0.1×10-3s-1或更高；例如：约0.2×10-3s-1或更高；约0.3×10-3s-1或更高；约0.4×10-3s-1或更高；约0.5×10-3s-1或更高；约0.6×10-3s-1或更高；约0.7×10-3s-1或更高；约0.8×10-3s-1或更高；约0.9×10-3s-1或更高；约1×10-3s-1或更高；约1.1×10-3s-1或更高；约1.2×10-3s-1或更高；约1.3×10-3s-1或更高；约1.4×10-3s-1或更高；约1.5×10-3s-1或更高；约1.6×10-3s-1或更高；约1.7×10-3s-1或更高；约1.8×10-3s-1或更高；约1.9×10-3s-1或更高；约2×10-3s-1或更高；约2.2×10-3s-1或更高；约2.4×10-3s-1或更高；约2.6×10-3s-1或更高；约2.8×10-3s-1或更高；约3×10-3s-1或更高；约3.2×10-3s-1或更高；约3.4×10-3s-1或更高；约3.6×10-3s-1或更高；约3.8×10-3s-1或更高；约4×10-3s-1或更高；约4.2×10-3s-1或更高；约4.4×10-3s-1或更高；约4.6×10-3s-1或更高；约4.8×10-3s-1或更高；约5×10-3s-1或更高；约5.5×10-3s-1或更高；约6×10-3s-1或更高；约6.5×10-3s-1或更高；约7×10-3s-1或更高；约7.5×10-3s-1或更高；约8×10-3s-1或更高；约8.5×10-3s-1或更高；约9×10-3s-1或更高；约9.5×10-3s-1或更高；或约10×10-3s-1或更高，优选约1.5×10-3s-1或更高，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
在优选实施方案中，测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括测定约50分钟或更多的单位时间内的单个的淀粉样物质聚集体的频率，并且如果单个事件发生频率(fSEO)为约1.5(如1.5×10-3s-1)或更高，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
在一个实施方案中，单个事件发生(fSEO)和衰减时间(即，扩散时间(τD))的特征，可以分别与单个的淀粉样物质聚集体的数量和尺寸成比例。通过单个事件发生(fSEO)的特征，我们包括单个事件发生的信号(或强度)。通过衰减时间的特征，我们包括扩散时间(τD)的强度。
从扩散时间的分布，可以确定每个单个的分子/颗粒/聚集体尺寸的分布图。尺寸分布可反映疾病状态并提供有关疾病预后的信息。
在一个实施方案中，如果单个事件发生(fSEO)的衰减时间或扩散时间(τD)增加，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
观察单个事件发生(如单独的结构化可溶性淀粉样物质聚集体一次通过)可以分析淀粉样物质聚集体通过观察体积元件所花费的时间(如，以分析单独的荧光强度爆发的宽度)。结构化可溶性淀粉样物质聚集体越大，它们的移动越慢，且爆发越宽。为了测定结构化可溶性淀粉样物质聚集体通过观察体积元件花费的平均时间，将时间自相关(temporalautocorrelation)用于分析信号并得出时间自相关曲线(tACC)。对于小的结构化可溶性淀粉样物质聚集体，tACC的特征性衰减时间短，而对于大的结构化可溶性淀粉样物质聚集体，tACC的特征性衰减时间长。
因此，在一个实施方案中，“测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”的步骤包括提供时间自相关曲线(tACC)，特别是其中所述方法包括测定单个的淀粉样物质聚集体的频率。实施例中提供了怎样提供(或获得)tACC的更多解释。
图6中呈现的数据分析显示了针对两组记录的tACC之间的特征性衰减时间的明显差异，患者组的衰减时间显著更长。标准化的tACC的评价显示出所分析的系统是复杂的并且不含尺寸均一的颗粒，而是含有不同尺寸颗粒的混合物。对照组中的淀粉样物质聚集体(其结合ThT)的平均扩散时间为约5ms，而患者组中颗粒的平均扩散时间为约15ms。这表明了淀粉状蛋白聚集体的分子量差异在两组之间为约27倍。因此，除了较大量的纳米斑块，患者组可以在血清中携带更大的ThT活性结构化聚集体。
在一个实施方案中，如果与一个或多个对照样品(如来自一位或多位对照受试者的一个或多个样品，如以下所述的)相比时，样品中的衰减时间(特别地，tACC的衰减时间)更长，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
在一个实施方案中，如果与一个或多个对照样品(如来自一位或多位对照受试者的一个或多个样品，如以下所述的)相比时，样品中的淀粉样物质聚集体的分子量为约2倍或更多倍高，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后；例如：为约三倍或更多倍；约四倍或更多倍；约五倍或更多倍；约六倍或更多倍；约七倍或更多倍；约八倍或更多倍；约九倍或更多倍；约10倍或更多倍；约11倍或更多倍；约12倍或更多倍；约13倍或更多倍；约14倍或更多倍；约15倍或更多倍；约16倍或更多倍；约17倍或更多倍；约18倍或更多倍；约19倍或更多倍；约20倍或更多倍；约21倍或更多倍；约22倍或更多倍；约23倍或更多倍；约24倍或更多倍；约25倍或更多倍；约26倍或更多倍；约27倍或更多倍；约28倍或更多倍；约29倍或更多倍；或约30倍或更多倍；优选约27倍或更多倍。
在一个实施方案中，如果衰减时间(即，扩散时间(τD))(特别地，tACC的衰减时间)为约6ms或更长，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后；例如，约7ms或更长；约8ms或更长；约9ms或更长；约10ms或更长；约11ms或更长；约12ms或更长；约13ms或更长；约14ms或更长；约15ms或更长；约16ms或更长；约17ms或更长；约18ms或更长；约19ms或更长；或约20ms或更长，优选约15ms或更长。
在可替换的实施方案中，测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括全内荧光显微镜(TIRF)；和/或图像相关光谱；和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)；和/或大规模平行荧光相关光谱(mpFCS)。换句话说，使用全内荧光显微镜(TIRF)；和/或图像相关光谱；和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)；和/或大规模平行荧光相关光谱(mpFCS)来确定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。优选，单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的确定包括全内反射荧光显微镜(TIRF)和图像相关光谱。
荧光相关光谱是提供单个颗粒/聚集体/分子分辨率的合适方法。为了令人满意地达到单分子分辨率，重要的是由合适的检测仪检测的观察体积元件要小。观察体积元件越小，在给定时刻存在/观察到的颗粒数量越少。因此，信噪比随观察体积元件尺寸的减小而提高。实现小的观察体积元件的一种选择是在样品和检测仪之间的光路中具有光学元件的特定布置，如共焦显微镜中的共轭焦平面布置。因此获得的共焦观察体积元件的体积小于约10-11升，并且通常为约10-13至约10-16升。图1-14举例说明了使用共焦光学装置获得的数据。
通过实施全内反射(TIR)，甚至可以实现更小的观测体积元件。提供TIR的一种替代方案是将光聚焦在光学元件的后焦面上，从而产生与光学元件的(主)光轴成角度的出射光，通常是准直的光。取决于入射光在光学元件的后焦平面处的聚焦位置，相对于出射光的光学元件的光轴的角度将变化。光学元件适当地是物镜。用于提供出射光的TIR的物镜优选地具有高数值孔径，适当地高于约0.9，高于约1.0，高于约1.1，高于约1.2。数值孔径可能高达2.0左右。
提供非常小的观测体积元件的另一种可能性是提供受激发射损耗(STED)光学装置。在此使用特定波长和不同强度分布(中心处的强度最小)的光来减少从其发出荧光的体积(Mueller等，Biophys.J.2011 101(7)：1651-1660doi：10.1016/j.bpj.2011.09.006)。
提供非常小的观测体积元件的另一种可能性是提供透明基板，在其上沉积一层材料薄层，该材料薄层能够基本上阻挡来自光谱的UV-VIS区的电磁辐射(图15和16)。具有电磁阻挡能力的薄层在透明基板上有多个开口，有效地形成了阱(图17)。开口的尺寸使得只能产生由撞击的电磁辐射引起的渐逝场。当阱的尺寸(如其直径)小于入射光的波长时，就会出现在没有全内反射的情况下产生渐逝场的现象。通常，开口具有圆形形状，该圆形形状等于由透明基板限制的圆形阱底部，其直径小于撞击光的波长。根据阱底的面积，可以实现低至zepto-升(10-21升)的体积元件。阱底直径介于约30至80nm之间，可生成约10×10-21升至约100×10-21升的体积元件(图17b，c)。这些具有薄的电磁辐射阻挡层的基板，包括多个优选形成为圆形的阱，可以被称为zepto-升波导(zepto-litre wave-guides)。电磁辐射阻挡材料可以是能够基本上阻挡适用于荧光光谱的电磁辐射的任何合适的材料。合适的电磁辐射阻挡材料是适用于气相沉积工艺的金属。电磁辐射阻挡层可包括几层不同的金属。有时，第二金属层位于透明基板和主(主要)金属层之间，目的是更好地将金属层固定到透明基板上。金属的实例包括在任何给定波长下显著降低透射率的那些金属。合适的金属是铝、铬、金。特定金属层的厚度是金属和波长的函数。双金属层的一个示例是铬-金层，其中铬位于金和透明基板之间。透明基板合适地是含二氧化硅材料，如熔融二氧化硅。zepto-升波导通常具有多个纳米尺寸的阱。zepto-升波导可能具有数百万个纳米孔(阱)。每个纳米阱可以与单光子雪崩光电二极管(photon avalanche photodiode)的阵列(光学地)对准，使得每个离散的单个光子计数像素与波导的每个纳米阱对准。因此，采用zepto-升波导可以实现荧光相关光谱学领域中前所未有的信噪比以及大规模并行化的能力。
通过使用能够将入射光束分成光束阵列(多个光束)的光学元件的实施，可以使使用共焦体积元件的荧光相关光谱平行化。用于分离光束的合适的光学元件是衍射光学元件(DOE)。图18示出了包括衍射光学元件(DOE)的用于大规模平行荧光相关光谱法(mpFCS)的仪器中的光学装置。DOE提供了一个光束阵列(在此：32×32)，该光束在通过高数值孔径物镜后，在样品中提供1024个共焦体积元件。可以将DOE配置为提供任何合适数量的辅助光束。使用合适的DOE，可以轻松提供多达10,000个单独光束，多达100,000个甚至100万个单独光束。而且，通过使用多个共焦布置，测量时间可以显著缩短，例如，从3000s(图1-14)缩短至60s(图18和19)，并且可以有效地得出扩散时间的分布(图19C)。反过来，这使我们能够以高的统计可信度确定每个单个的分子/颗粒/聚集体尺寸分布图。这对于确定疾病进展到何种程度和/或预测疾病的进展速度有多快非常重要。
全内反射荧光(TIRF)显微镜的方法；和/或图像相关光谱；和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或大规模平行荧光相关光谱法(mpFCS)是物理学/物理化学领域的技术人员已知的。
在一个实施方案中，时间分辨检测包括荧光相关光谱法(FCS)，其使用时间自相关分析来分析数据。换句话说，使用荧光相关光谱法(FCS)进行时间分辨检测。“荧光相关光谱法(FCS)”是化学领域的技术人员已知的用于检测荧光的方法，并且在本文的实施例中进行了详细描述。如实施例中所讨论的，荧光相关光谱法(FCS)对于与本发明的方法一起使用特别有效。
在一个实施例中，FCS是多重FCS。多重FCS通过允许同时测量超过一个样品，从而可以测量更多样品，因此具有优势，因为它可以提高所述方法的通量。
在一个实施方案中，通过荧光相关光谱法(FCS)检测的荧光代表了单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。在一个优选的实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：将包含荧光部分的检测剂加入样品中，并且通过荧光相关光谱法(FCS)检测由荧光部分发射的荧光，并表示单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸小。
在一个实施方案中，使用荧光强度涨落分析(fluorescence intensityfluctuation analysis，FIFA)计算单个的淀粉样物质聚集体的频率。FIFA可以计算为每单位时间的峰数(即单个的淀粉样物质聚集体)，所述峰的强度大于对照样品至少两个或五个标准偏差，如“样品中荧光的对照水平”，如下所述(优选，比对照样品的标准偏差大至少五倍)。
在一个实施方案中，如果样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度高于对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度；和/或样品中单个的淀粉样物质聚集体的大小大于对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的大小，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
适合用作本发明一部分的对照样品是生物学或医学领域的技术人员已知的，其包括但不限于本文概述的对照。在一些实施方案中，对照样品是选自包括以下的或由以下组成的列表的一种或多种：来自一个或多个对照受试者的对照样品；体外对照样品；阴性对照样品；和样品中荧光的对照水平。
通过“对照受试者”，我们包括没有淀粉样物质相关疾病的受试者。在本发明的方法中，对照受试者可以按年龄和/或性别匹配。优选，与受试者相比时，对照受试者按年龄和/或性别来匹配。通过“按年龄和/或性别匹配”，我们包括选择对照受试者，使他们都具有相同或相似的年龄和/或性别。如何为本发明的方法选择合适的对照受试者是医学领域的技术人员已知的。
通过“体外对照样品”，我们包括在实验室制备对照样品，以使其具有已知的单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量量和/或浓度和/或尺寸。如何产生这样的体外对照样品是化学领域的技术人员已知的，例如，可以使用固相合成进行可以从其形成单个的淀粉样物质聚物的肽和蛋白质单体的生产。
通过“阴性对照样品”，我们包括从体液样品中移去的对照样品，并且对对照样品进行本文所述的方法，但不添加检测剂。例如，将体液样品分为两个(或更多)体积，第一个体积为“体液样品”，并添加了检测剂，第二个体积为“阴性对照样品”，未添加检测剂。因此，在该方法的实验条件下，该对照样品为样品提供了背景读数。
如本文所讨论的，本发明特别优选的实施方案是使用时间分辨检测和荧光测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。使用这种方法，可以测定是本文所述方法受试者的同一体液样品中的荧光对照(或背景)水平，这将在下面进一步讨论。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度比对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸高约20％或更多；例如：高约25％或更多；高约30％或更多；高约35％；高约40％或更多；高约45％或更多；高约50％或更多；高约55％或更多；高约60％或更多；高约65％或更多；高约70％或更多；高约75％或更多；高约80％或更多；高约85％或更多；高约90％或更多；高约95％或更多，优选高约50％或更多；和/或样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸比对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸大约20％或更多；例如：大约25％或更多；大约30％或更多；大约35％；大约40％或更多；大约45％或更多；大约50％或更多；大约55％或更多；大约60％或更多；大约65％或更多；大约70％或更多；大约75％或更多；大约80％或更多；大约85％或更多；大约90％或更多；大约95％或更多，优选大约50％或更多。
当我们提及样品中单个的淀粉样物质聚集体比对照样品中单个的淀粉样物质聚集体“大”时，我们包括样品中单个的淀粉样物质聚集体物与对照样品中发现的聚集体相比，每个聚集体具有更多的肽，和/或它们具有更高的分子量。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸是对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约10倍或更多；例如：分子量的约11倍或更多；分子量的约12倍或更多；分子量的约13倍或更多；分子量的约14倍或更多；分子量的约15倍或更多；分子量的约16倍或更多；分子量的约17倍或更多；分子量的约18倍或更多；分子量的约19倍或更多；分子量的约20倍或更多；分子量的约21倍或更多；分子量的约22倍或更多；分子量的约23倍或更多；分子量的约24倍或更多；分子量的约25倍或更多；分子量的约26倍或更多；分子量的约27倍或更多；分子量的约28倍或更多；分子量的约29倍或更多；分子量的约30倍或更多；分子量的约35倍或更多；分子量的约40倍或更多；分子量的约45倍或更多；或对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约50倍或更多，优选对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约27倍或更多。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度为对照样品中的约两倍或更高；例如，约三倍或更多；约四倍或更多；约五倍或更多；约六倍或更多；约七倍或更多；约八倍或更多；约九倍或更多；为对照样品中的约十倍或更多，优选为对照样品中的约五倍或更多；和/或样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸为对照样品中的约两倍或更大；例如，约三倍或更多；约四倍或更多；约五倍或更多；约六倍或更多；约七倍或更多；约八倍或更多；约九倍或更多；比对照样品中的约十倍或更多，优选为对照样品中的约五倍或更多。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度比对照样品中的高约两个标准偏差或更多；例如，高约三个标准偏差或更多；高约四个标准偏差或更多；高约五个标准偏差或更多；高约六个标准偏差或更多；高约七个标准偏差或更多；高约八个标准偏差或更多；高约九个标准偏差或更多；比对照样品中的高约十个标准偏差或更多，优选比对照样品种的高约五个标准偏差或更多；和/或样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸比对照样品中的大约两个标准差或更多；例如，大约三个标准差或更多；大约四个标准差或更多；大约五个标准差或更多；大约六个标准差或更多；大约七个标准差或更多；大约八个标准差或更多；大约九个标准差或更多；比对照样品中的大约十个标准偏差或更多，优选比对照样品中的大约五个标准偏差或更多。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的数量和/或浓度越高，诊断越严重和/或预后越严重。
在一个实施方案中，样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸越大，诊断越严重和/或预后越严重。
通过在诊断和/或预后内容中的“严重”，我们包括淀粉样物质相关疾病的发作和/或进展将很快进行的可能性较高，和/或受试者可能很快表现出淀粉样物质相关疾病的一种或多种症状，和/或受试者将表现出淀粉样物质相关疾病的严重症状，和/或受试者可能很快死亡。
在一个实施方案中，单个的淀粉样物质聚集体的尺寸是平均尺寸。
生物学和/或统计学中的技术人员将理解并且将能够计算单个的淀粉样物质聚集体的平均尺寸。通过“平均尺寸”，我们包括平均是算数平均值。
如本领域技术人员将得知的，本发明方法中使用的体液样品的类型可能在一定程度上决定了可以检测的单个的淀粉样物质聚集体的尺寸。例如，对于尿液作为体液样本，可检测到的单个的淀粉样物质聚集体的最大尺寸可能由肾小球滤过引起的尺寸限制来定义。
在本发明的方法中，对照样品可以包括来自一个或多个没有淀粉样物质相关疾病的对照受试者的体液样品；例如：约两个或更多的对照受试者；约三个或更多的对照受试者；约四个或更多的对照受试者；约五个或更多的对照受试者；约六个或更多的对照受试者；约七个或更多的对照受试者；约八个或更多的对照受试者；约九个或更多的对照受试者；约十个或更多的对照受试者；约11个或更多的对照受试者；约12个或更多的对照受试者；约13个或更多的对照受试者；约14个或更多的对照受试者；约15个或更多的对照受试者；约16个或更多的对照受试者；约17个或更多的对照受试者；约18个或更多的对照受试者；约19个或更多的对照受试者；约20个或更多的对照受试者；约25个或更多的对照受试者；约30个或更多的对照受试者；约35个或更多的对照受试者；约40个或更多的对照受试者；约45个或更多的对照受试者；约50个或更多的对照受试者；约60个或更多的对照受试者；约70个或更多的对照受试者；约80个或更多的对照受试者；约90个或更多的对照受试者；约100个或更多的对照受试者，优选是来自约30个或更多的对照受试者的体液样本。
在一个实施方案中，有两个或多个对照受试者时，对照样品是两个或多个对照受试者中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的平均值(最好是算数平均值)。
在一个实施方案中，如果使用荧光的测量和/或检测来测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，则对照样品为“样品中荧光的对照水平”(例如，“整体信号”)和荧光(即，荧光信号)所包含的荧光水平高于样品中对照荧光的水平。换句话说，荧光水平高于对照荧光之上的水平代表单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
在一些实施方案中，“荧光水平”是荧光峰(即，大于信号标准偏差五倍的荧光测量值)，如可以在样品中荧光的对照水平以上检测到的荧光峰。
在一个实施方案中，该方法包括检测和/或测量样品中荧光的对照水平的步骤，如检测和/或测量荧光波动。在一个实施方案中，“检测和/或测量样品中的荧光的对照水平”的步骤在“将检测剂加入样品中”的步骤之前。
在一个实施方案中，荧光包括为荧光对照水平的约两倍或更高的荧光水平(如荧光中的峰)；例如，为荧光的对照水平(例如，“整体信号”)的约三倍或更多；约四倍或更多；约五倍或更多；约六倍或更多；约七倍或更多；约八倍或更多；约九倍或更多；约十倍或更多，优选为荧光的对照水平(例如，“整体信号”)的约五倍或更高。
在一个实施方案中，荧光包括比荧光对照水平高约两个标准偏差或更多的荧光水平(如荧光中的峰)；例如，比荧光的对照水平(例如，“整体信号”)高约三个标准偏差或更多；约四个标准偏差或更多；约五个标准偏差或更多；约六个标准差或更多；约七个标准偏差或更多；约八个标准偏差或更多；约九个标准偏差或更多；约十个标准偏差或更多，优选比荧光的对照水平(例如，“整体信号”)高约五个标准偏差或更多。
如本文讨论的，在一个实施方案中，荧光的对照水平是样品中荧光的背景水平，其可以称为荧光背景水平的变化或基线信号(也可以称为整体信号)。如生物学领域的技术人员将理解的那样，体液样品可能具有一定水平的自发荧光，其在体液样品之间可能有所不同。在本申请的图3中提供了一个示例。荧光的背景水平是大约132.5kHz处的不均匀线，荧光峰在高于该水平的大约150kHz处。在这个特定示例中，那些荧光峰代表单个的淀粉样物质聚集体，并且它们的信号约高于荧光背景水平标准偏差的五倍。有时在检测和/或测量来自检测剂的荧光时，有必要考虑自身荧光的背景水平，所检测和/或测量的荧光高于荧光背景之上的水平代表样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
在其中使用时间分辨检测的一个实施方案中，样品中荧光的对照水平是时间分辨检测的基线信号或荧光背景水平的变化。在这个特定实施方案中，基线信号或荧光背景水平的变化可以是不包含任何单个的淀粉样物质聚集体的体液样品的一部分中的时间分辨检测测量或样品的整体信号。整体信号是在时间分辨检测过程中进行的荧光测量。因此，可以在时间分辨检测的整个时间单位中提供基线信号或荧光背景水平的变化。
在一个实施方案中，高于基线信号或荧光背景水平的变化的每个荧光峰(如单个事件发生(fSEO))表示单个的淀粉样物质聚集体(优选，荧光峰至少比整体信号高五个标准差)。换句话说，高于基线信号或荧光背景水平的变化的每个荧光峰(如单个事件发生(fSEO))代表一个频率，而两个峰代表两个频率，依此类推。在特别优选的实施方案中，荧光峰(如单个事件发生(fSEO))是高于基线信号或荧光背景水平(例如，整体信号)的急剧且短暂的增加，其表示单个的淀粉样物质聚集体。
在一个实施方案中，荧光的对照水平(如基线信号或荧光背景水平的变化)是时间分辨检测(如荧光相关光谱法(FCS))的整个时间单位内测量的平均荧光水平，优选算数平均值。
在优选实施方案中，荧光包括比基线信号或荧光背景水平的变化高约两倍或更多的峰；例如，比荧光背景水平的变化(例如，整体信号)高约三倍或更多；约四倍或更多；约五倍或更多；约六倍或更多；约七倍或更多；约八倍或更多；约九倍或更多；约十倍或更多，优选比基线信号或荧光背景水平的变化(例如，整体信号)高约五倍或更多。
在优选实施方案中，荧光包括比基线信号或荧光背景水平的变化高约两个标准偏差或更多的峰；例如，，比荧光背景水平的变化(例如，整体信号)高约三个标准偏差或更多；约四个标准偏差或更多；约五个标准偏差或更多；约六个标准偏差或更多；约七个标准偏差或更多；约八个标准偏差或更多；约九个标准偏差或更多；约十个标准偏差或更多，优选比基线信号或荧光背景水平的变化(例如，整体信号)高约五个标准偏差或更多。
在一个实施方案中，样品包括约30微升(μl)至约300微升(μl)的体积。
在一个实施方案中，样品包括约500微升(μl)或更少的体积；例如，约490微升(μl)或更少；约480微升(μl)或更少；约470微升(μl)或更少；约460微升(μl)或更少；约450微升(μl)或更少；约440微升(μl)或更少；约430微升(μl)或更少；约420微升(μl)或更少；约410微升(μl)或更少；约400微升(μl)或更少；约390微升(μl)或更少；约380微升(μl)或更少；约370微升(μl)或更少；约360微升(μl)或更少；约350微升(μl)或更少；约340微升(μl)或更少；约330微升(μl)或更少；约320微升(μl)或更少；约310微升(μl)或更少；约300微升(μl)或更少；约290微升(μl)或更少；约280微升(μl)或更少；约270微升(μl)或更少；约260微升(μl)或更少；约250微升(μl)或更少；约240微升(μl)或更少；约230微升(μl)或更少；约220微升(μl)或更少；约210微升(μl)或更少；约200微升(μl)或更少；约190微升(μl)或更少；约180微升(μl)或更少；约170微升(μl)或更少；约160微升(μl)或更少；约150微升(μl)或更少；约140微升(μl)或更少；约130微升(μl)或更少；约120微升(μl)或更少；约110微升(μl)或更少；约100微升(μl)或更少；约90微升(μl)或更少；约80微升(μl)或更少；约70微升(μl)或更少；约60微升(μl)或更少；约50微升(μl)或更少；约40微升(μl)或更少；约30微升(μl)或更少；约20微升(μl)或更少；或约10微升(μl)或更少。在优选实施方案中，样品包括150微升(μl)或更少的体积。在可替换的优选实施方案中，样品包括200微升(μl)或更少的体积。
使用时间分辨检测(如荧光相关广谱法(FCS))进行所述方法时，可以将样品加工成几个部分，如观察体积元件(OVE)，如在实施例中解释的。
在一个实施方案中，所述部分(如观察体积元件)包括约1微升(μl)或更少的体积；例如，约0.1微升(μl)或更少；约0.01微升(μl)或更少；约0.001微升(μl)或更少；约0.0001微升(μl)或更少；约0.00001微升(μl)或更少；约0.000001微升(μl)或更少；约0.0000001微升(μl)或更少；约0.00000001微升(μl)或更少；约1飞升(fl)或更少；约0.1飞升(fl)或更少；约0.2飞升(fl)或更少；约0.3飞升(femtolitre，fl)或更少；约0.4飞升(fl)或更少；约0.5飞升(fl)或更少；约0.6飞升(fl)或更少；约0.7飞升(fl)或更少；约0.8飞升(fl)或更少；约0.9飞升(fl)或更少；约0.01飞升(fl)或更少；约0.001飞升(fl)或更少；约0.0001飞升(fl)或更少；优选约0.2飞升(fl)或更少。根据一个实施方案，观察体积可以从约10-20升降至约10-22升，如在zepto-升范围中。
在一个实施方案中，所述方法包括使用流通池来循环样品，同时测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度。流通池是显微镜技术人员已知的装置。流通池可用于将样品循环通过装置，同时进行时间分辨检测。通过这种方式，可以增加遇到纳米斑块的频率-与其等待聚集体自由扩散，不如通过流动来推动它们的移动。这可能是有利的，因为它可以加快测量速度，从而缩短分析时间。适用于所述方法的示例性流通池可从Warner Instruments-US(www.warneronline.com)获得，如RC-30HV和RC-30WA室。
在一个实施方案中，如果单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量是一个单个的淀粉样物质或更多，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后；例如，约两个单个的淀粉样物质或更多；约三个单个的淀粉样物质或更多；约四个单个的淀粉样物质或更多；约五个单个的淀粉样物质或更多；约六个单个的淀粉样物质或更多；约七个单个的淀粉样物质或更多；约八个单个的淀粉样物质或更多；约九个单个的淀粉样物质或更多；约10个单个的淀粉样物质或更多；约15个单个的淀粉样物质或更多；约20个单个的淀粉样物质或更多；约25个单个的淀粉样物质或更多；约30个单个的淀粉样物质或更多；约50个单个的淀粉样物质或更多；约100个单个的淀粉样物质或更多；约200个单个的淀粉样物质或更多；约300个单个的淀粉样物质或更多；约400个单个的淀粉样物质或更多；约500个单个的淀粉样物质或更多；约1,000个单个的淀粉样物质或更多；约2,000个单个的淀粉样物质或更多；约3,000个单个的淀粉样物质或更多；约4,000个单个的淀粉样物质或更多；约5,000个单个的淀粉样物质或更多；或约6,000个单个的淀粉样物质或更多。
在一个实施方案中，以间隔重复所述方法，如两次或更多；例如，三次或更多；四次或更多；五次或更多；六次或更多；七次或更多；八次或更多；九次或更多；10次或更多；11次或更多；12次或更多；13次或更多；14次或更多；15次或更多；16次或更多；17次或更多；18次或更多；19次或更多；20次或更多；25次或更多；30次或更多；35次或更多；40次或更多；45次或更多；或多次或更多；或50次或更多。
随着时间的推移重复该方法允许随着时间的推移追踪诊断和/或预后，从而允许对诊断和/或预后进行检查和修订。因此，将所述方法重复两次或更多次时，对于第二次或随后的重复，基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的步骤可以是修改以所述测定为基础的淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的步骤。
在一个实施方案中，重复本发明的第一方面的方法之间的时间间隔是一天或更长；例如，约两天或更长；约三天或更长；约四天或更长；约五天或更长；约六天或更长；约一周或更长；约两周或更长；约三周或更长；约四周或更长；大约一个月或更长；约五周或更长；约六周或更长；约七周或更长；约八周或更长；约两个月或更长；约三个月或更长；约四个月或更长；约五个月或更长；约六个月或更长；约七个月或更长；约八个月或更长；约九个月或更长；约10个月或更长；约11个月或更长；约一年或更长；约两年或更长；约3年或更长；约4年或更长；约5年或更长；约6年或更长；约7年或更长；约8年或更长；约九年或更长；或约十年或更长，优选约一个月或更长。
在一个实施方案中，受试者和/或对照受试者是来自包括以下的组中的一种或多种：啮齿动物(例如，小鼠，和/或大鼠，和/或仓鼠，和/或豚鼠，和/或沙鼠，和/或兔)；和/或犬科动物(例如，狗)；和/或猫科动物(例如猫)；灵长类动物(例如，人；和/或猴；和/或猿)；和/或马科动物(例如，马)；和/或牛科动物(例如牛)；和/或猪科动物(例如猪)；和/或非人类哺乳动物。优选，受试者是人类，优选地受试者和对照受试者都是人类。
在一个实施方案中，受试者和/或对照受试者是活的。在优选实施方案中，受试者是活的。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗。
通过“选择和/或提供治疗”，我们包括基于淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后，可以鉴定用于所述疾病的适当治疗。基于淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后，医学领域的技术人员将能够选择和/或提供适当的治疗。
优选，“给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗”的步骤在“基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后”的步骤之后。
在一个实施方案中，治疗是减少淀粉样物质相关疾病的症状数量和/或严重性和/或体征的治疗，和/或治疗淀粉样物质相关疾病的原因；和/或改善神经调节过程；和/或改善神经传递过程；和/或减少单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
如本文所讨论的，通过治疗，我们包括姑息治疗和/或实验性治疗和/或物理疗法。
在一个实施方案中，治疗是选自以下的一种或多种：左旋多巴(L-DOPA)；乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI，如多奈哌齐，加兰他敏和利伐斯的明)；N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)抑制剂(如美金刚)；分泌酶1(BACE1)抑制剂；单克隆抗体(包括单克隆抗体类似物)；和/或Tafamidis。医学领域的技术人员将熟悉本文讨论的治疗，并且知道何时应选择和/或提供它们。
AChEIs抑制乙酰胆碱酯酶分解乙酰胆碱，从而增加了神经递质乙酰胆碱的作用水平和作用时间。NMDA受体拮抗剂美金刚胺通过部分阻断NMDA受体(受损细胞向所述受体释放谷氨酸)调节谷氨酸的活性，谷氨酸是大脑中参与学习和记忆的重要神经递质。Tafamidis(商品名Vyndaqel)稳定了甲状腺素转运蛋白(TTR)的正确折叠的四聚体形式，从而减慢了TTR聚集体在患病个体中形成和累积的速度。单克隆抗体能够穿过血脑屏障，并选择性靶向可溶性淀粉样物质β聚集体(特别是大脑中的不溶性原纤维)，其降低了淀粉样物质β聚集体载荷。临床前研究表明了单克隆抗体类似物可以清除带有斑块的转基因小鼠大脑中的Aβ(Sevigny等，Nature 2016 537:50-56doi:10.1038/nature19323)。
在优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是帕金森病，并且治疗包括L-DOPA。
在可替换的优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是家族性淀粉样多发性神经病(FAP)，并且治疗包括Tafamidis。
在再一个可替换的优选实施方案中，淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且治疗包括分泌酶1(BACE1)抑制剂和/或单克隆抗体(包括单克隆抗体类似物)。
在一个实施方案中，分泌酶1(BACE1)抑制剂排除verubecestat。
在一个实施方案中，治疗包括将用于淀粉样物质相关疾病的治疗施用于受试者。在优选实施方案中，“将用于淀粉样物质相关疾病的治疗施用于受试者”的步骤在“给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗”的步骤之后。
本发明的第二个方面提供了用于治疗受试者的淀粉样物质相关疾病的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液样品；
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-基于所述测定来鉴定受试者具有淀粉样物质相关疾病；和，
-给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗。
应当理解，以上关于本发明的第一个方面定义的特征适用于本发明的第二个方面的方法。例如，在本发明的第一个方面中关于“基于测定来提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后”所讨论的特征可以用于“基于所述测定来鉴定受试者具有淀粉样物质相关疾病”。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，所述方法包括以下顺序的步骤：
-提供来自受试者的样品；
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-基于所述测定来鉴定受试者具有淀粉样物质相关疾病；和
-给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗。
在一个实施方案中，所述治疗包括将用于淀粉样物质相关疾病的治疗施用于受试者。在优选实施方案中，“将用于淀粉样物质相关疾病的治疗施用于受试者”的步骤在“给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗”的步骤之后。
本发明的第三个方面提供了用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂给药于受试者；
-提供来自受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
通过“鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂”，我们包括确定之前未鉴定的治疗是否可用于治疗淀粉样物质相关疾病，和/或是否可用于减少淀粉样物质相关疾病的症状数量和/或严重性和/或体征，和/或是否可用于改善神经调节过程；和/或是否可用于改善神经传递过程，和/或是否可用于减少单个的淀粉样聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。或者，通过“鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂”，我们包括测定用于受试者的淀粉样物质相关疾病的治疗的有效性。换句话说，我们包括追踪受试者中淀粉样物质相关疾病的治疗效果。
本发明的第三个方面涉及鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的体内方法。
应当理解，以上关于本发明的第一个方面和/或第二个方面定义的特征适用于本发明的第三个方面的方法。例如，在本发明的第一个方面中关于“基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后”所讨论的特征可以用于“基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂”。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，所述方法包括以下顺序的步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂给药于受试者；
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
在一个实施方案中，如果第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度低于第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度；和/或第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸小于第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸，则将活性剂鉴定为是用于治疗淀粉样物质相关疾病的。
当我们提到第二样品中单个的淀粉样物质聚集体比第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸“小”时，我们包括第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的每个聚集体的肽比第一样品中发现的聚集体少，或具有较低的分子量。
不希望受到任何理论的束缚，发明人认为，如果在给药所述活性剂后测试受试者单个的淀粉样物质聚集体较少和/或较小，则该活性剂在治疗淀粉样物质相关的疾病中很可能起着作用。单个的淀粉样物质聚集体的数量和/或尺寸的减少越大，该活性剂在治疗淀粉样物质相关疾病中很可能越有效。
在一个实施方案中，第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度比第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸低约20％或更多；例如，低约25％或更多；低约30％或更多；低约35％或更多；低约40％或更多；低约45％或更多；低约50％或更多；低约55％或更多；低约60％或更多；低约65％或更多；低约70％或更多；低约75％或更多；低约80％或更多；低约85％或更多；低约90％或更多；低约95％或更多，优选低约50％或更多；和/或
第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸比第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸小约20％或更多；例如，小约25％或更多；小约30％或更多；小约35％或更多；小约40％或更多；小约45％或更多；小约50％或更多；小约55％或更多；小约60％或更多；小约65％或更多；小约70％或更多；小约75％或更多；小约80％或更多；小约85％或更多；小约90％或更多；小约95％或更多，优选小约50％或更多。
在一个实施方案中，第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸是第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约10倍或更多；例如，为分子量的约11倍或更多；分子量的约12倍或更多；分子量的约13倍或更多；分子量的约14倍或更多；分子量的约15倍或更多；分子量的约16倍或更多；分子量的约17倍或更多；分子量的约18倍或更多；分子量的约19倍或更多；分子量的约20倍或更多；分子量的约21倍或更多；分子量的约22倍或更多；分子量的约23倍或更多；分子量的约24倍或更多；分子量的约25倍或更多；分子量的约26倍或更多；分子量的约27倍或更多；分子量的约28倍或更多；分子量的约29倍或更多；分子量的约30倍或更多；分子量的约35倍或更多；分子量的约40倍或更多；分子量的约45倍或更多；或为第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约50倍或更多，优选为第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的分子量的约27倍或更多。
在一个实施方案中，第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度为第二样品中的约两倍或更高；例如，第一样品中为约三倍或更高；约四倍或更高；约五倍或更高；约六倍或更高；约七倍或更高；约八倍或更高；约九倍或更高；约十倍或更高，优选为第二样品中的约五倍或更高；和/或第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸为第二样品中的约两倍或更大；例如，为第二样品中大约三倍或更大；约四倍或更大；约五倍或更大；约六倍或更大；约七倍或更大；约八倍或更大；约九倍或更大；约十倍或更大，优选为第二样品中的约五倍或更大。
在一个实施方案中，第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度比第二样品中的高约两个标准差或更多；例如，比第二样品中的高约三个标准差或更高；高约四个标准差或更高；高约五个标准差或更高；高约六个标准差或更高；高约七个标准差或更高；高约八个标准差或更高；高约九个标准差或更高；高约十个标准差或更高，优选比第二样品中的高约五个标准差或更高；和/或第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸比第二样品中的大约两个标准差或更多；例如，比第二样品中的大约三个标准差或更大；大约四个标准差或更大；大约五个标准差或更大；大约六个标准差或更大；大约七个标准差或更大；大约八个标准差或更大；大约九个标准差或更大；大约十个标准差或更大，优选比第二样品中的大约五个标准差或更大。
类似地，如关于本发明的第一方面所讨论的，在一个实施方案中，“测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”和/或“测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”包括测定单位时间内单个的淀粉样物质聚集体的频率(如单个事件发生(fSEO))。在优选实施方案中，比较第一样品和第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的频率，并且如果第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的频率低于第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的频率，则将所述活性剂鉴定为是用于治疗淀粉样物质相关疾病的。
在一个实施方案中，以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或大小，
任选，其中将所述步骤重复两次或更多；例如，三次或更多；四次或更多；五次或更多；六次或更多；七次或更多；八次或更多；九次或更多；10次或更多；11次或更多；12次或更多；13次或更多；14次或更多；15次或更多；16次或更多；17次或更多；18次或更多；19次或更多；20次或更多；25次或更多；30次或更多；35次或更多；40次或更多；45次或更多；或多次或更多；或50次或更多。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，
本发明第三个方面的比较步骤中的第一样品是两个或更多个第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的平均值(优选算数平均值)。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，
重复步骤之间的时间段为一小时或更长；例如，约两小时或更长；约三小时或更长；约四小时或更长；约五小时或更长；约六小时或更长；约七小时或更长；约八小时或更长；约九小时或更长；约10小时或更长；约11小时或更长；约12小时或更长；约13小时或更长；约14小时或更长；约15小时或更长；约16小时或更长；约17小时或更长；约18小时或更长；约19小时或更长；约20小时或更长；约21小时或更长；约22小时或更长；约23小时或更长；约一天或更长；约两天或更长；约三天或更长；约四天或更长；约五天或更长；约六天或更长；约一周或更长；约两周或更长；约三周或更长；约四周或更长；约一个月或更长；约两个月或更长；约三个月或更长；约四个月或更长；约五个月或更长；约六个月或更长；约七个月或更长；约八个月或更长；约九个月或更长；约10个月或更长；约11个月或更长；或约12个月或更长。
在一个实施方案中，以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸进行比较；
任选，其中将所述步骤重复两次或更多；例如：三次或更多；四次或更多；五次或更多；六次或更多；七次或更多；八次或更多；九次或更多；10次或更多；11次或更多；12次或更多；13次或更多；14次或更多；15次或更多；16次或更多；17次或更多；18次或更多；19次或更多；20次或更多；25次或更多；30次或更多；35次或更多；40次或更多；45次或更多；或多次或更多；或50次或更多。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸进行比较；
本发明第三个方面的比较步骤中的第二样品是两个或更多个第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的平均值(优选算数平均值)。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸进行比较；
重复步骤之间的时间段为一小时或更长；例如，约两小时或更长；约三小时或更长；约四小时或更长；约五小时或更长；约六小时或更长；约七小时或更长；约八小时或更长；约九小时或更长；约10小时或更长；约11小时或更长；约12小时或更长；约13小时或更长；约14小时或更长；约15小时或更长；约16小时或更长；约17小时或更长；约18小时或更长；约19小时或更长；约20小时或更长；约21小时或更长；约22小时或更长；约23小时或更长；约一天或更长；约两天或更长；约三天或更长；约四天或更长；约五天或更长；约六天或更长；约一周或更长；约两周或更长；约三周或更长；约四周或更长；约一个月或更长；约两个月或更长；约三个月或更长；约四个月或更长；约五个月或更长；约六个月或更长；约七个月或更长；约八个月或更长；约九个月或更长；约10个月或更长；约11个月或更长；或约12个月或更长。
在优选实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸，和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸进行比较；
来自测试受试者的第二样品的第一次提供就在将活性剂给药于测试受试者的步骤之后立即进行。
在一个实施方案中，测试受试者是来自包括以下的组中的一种或多种：啮齿动物(例如，小鼠，和/或大鼠，和/或仓鼠，和/或豚鼠，和/或沙鼠，和/或兔)；和/或犬科动物(例如，狗)；和/或猫科动物(例如猫)；灵长类动物(例如，人；和/或猴；和/或猿)；和/或马科动物(例如，马)；和/或牛科动物(例如牛)；和/或猪科动物(例如猪)；和/或鱼(例如，斑马鱼)；和/或昆虫(例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；和/或两栖动物(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis))；和/或爬行动物；和/或线虫(例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))。
在一个实施方案中，测试受试者是非人类，例如，非人类哺乳动物。在优选实施方案中，非人类哺乳动物是来自包括以下的组中的一种或多种：啮齿动物(例如，小鼠，和/或大鼠，和/或仓鼠，和/或豚鼠，和/或沙鼠，和/或兔)；和/或犬科动物(例如，狗)；和/或猫科动物(例如猫)；非人灵长类动物(例如，猴；和/或猿)；和/或马科动物(例如，马)；和/或牛科动物(例如牛)；和/或猪科动物(例如猪)。
本发明的第四个方面提供了一种用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂施用于测试流体；
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和，
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
本发明的第三个方面涉及鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的体外和/或离体方法。
将认识到以上关于本发明的第一个方面和/或第二个方面和/或第三个方面定义的特征适用于本发明的第四个方面的方法。例如，关于本发明的第一个方面中的“基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后”所讨论的特征可以用于“基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂”。相似地，关于本发明的第三个方面中的“测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”和/或“测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸”所讨论的特征也可以用于本发明的第四个方面。
在本发明第四个方面的优选实施方案中，所述方法包括以下顺序的步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂施用于测试流体；
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和，
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
不希望受到任何理论的束缚，发明人认为如果给药活性剂后测试流体具有较低和/或较小的单个的淀粉样物质聚集体，则活性剂很可能在治疗淀粉样物质相关疾病中具有作用。单个的淀粉样物质聚集体的数量和/或尺寸的减少越大，很可能活性剂在治疗淀粉样物质相关疾病中越有效。
在一个实施方案中，以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
任选，其中将所述步骤重复两次或更多；例如：三次或更多；四次或更多；五次或更多；六次或更多；七次或更多；八次或更多；九次或更多；10次或更多；11次或更多；12次或更多；13次或更多；14次或更多；15次或更多；16次或更多；17次或更多；18次或更多；19次或更多；20次或更多；25次或更多；30次或更多；35次或更多；40次或更多；45次或更多；或多次或更多；或50次或更多。
在一个实施方案，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
本发明的第四个方面的比较步骤中的第一样品是两个或更多个第一样品中的单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的平均值(优选算数平均值)。
在一个实施方案中，以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；和
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
重复步骤之间的时间段为一小时或更长；例如，约两小时或更长；约三小时或更长；约四小时或更长；约五小时或更长；约六小时或更长；约七小时或更长；约八小时或更长；约九小时或更长；约10小时或更长；约11小时或更长；约12小时或更长；约13小时或更长；约14小时或更长；约15小时或更长；约16小时或更长；约17小时或更长；约18小时或更长；约19小时或更长；约20小时或更长；约21小时或更长；约22小时或更长；约23小时或更长；约一天或更长；约两天或更长；约三天或更长；约四天或更长；约五天或更长；约六天或更长；约一周或更长；约两周或更长；约三周或更长；约四周或更长；约一个月或更长；约两个月或更长；约三个月或更长；约四个月或更长；约五个月或更长；约六个月或更长；约七个月或更长；约八个月或更长；约九个月或更长；约10个月或更长；约11个月或更长；或约12个月或更长。
在一个实施方案中，以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；
任选，其中将所述步骤重复两次或更多；例如：三次或更多；四次或更多；五次或更多；六次或更多；七次或更多；八次或更多；九次或更多；10次或更多；11次或更多；12次或更多；13次或更多；14次或更多；15次或更多；16次或更多；17次或更多；18次或更多；19次或更多；20次或更多；25次或更多；30次或更多；35次或更多；40次或更多；45次或更多；或多次或更多；或50次或更多。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；
本发明的第三个方面的比较步骤中的第二样品是两个或更多个样品中的单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的平均值(优选算数平均值)。
在一个实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；
重复步骤之间的时间段为一小时或更长；例如，约两小时或更长；约三小时或更长；约四小时或更长；约五小时或更长；约六小时或更长；约七小时或更长；约八小时或更长；约九小时或更长；约10小时或更长；约11小时或更长；约12小时或更长；约13小时或更长；约14小时或更长；约15小时或更长；约16小时或更长；约17小时或更长；约18小时或更长；约19小时或更长；约20小时或更长；约21小时或更长；约22小时或更长；约23小时或更长；约一天或更长；约两天或更长；约三天或更长；约四天或更长；约五天或更长；约六天或更长；约一周或更长；约两周或更长；约三周或更长；约四周或更长；约一个月或更长；约两个月或更长；约三个月或更长；约四个月或更长；约五个月或更长；约六个月或更长；约七个月或更长；约八个月或更长；约九个月或更长；约10个月或更长；约11个月或更长；或约12个月或更长。
在优选实施方案中，其中以间隔重复以下步骤：
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；和
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；
来自测试流体的第二样品的第一次提供就在将活性剂给药于测试流体的步骤之后立即进行。
在一个实施方案中，所述方法在体外和/或离体进行。
在一个实施方案中，测试流体是体液。
在优选实施方案中，测试流体是来自包括以下的或由以下组成的组中的一种或多种体液：血液和/或脑脊液(CSF)和/或唾液和/或滑液和/或粪便和/或尿液，优选血液。
在可替换的实施方案中，测试流体是体外测试流体。
通过“体外测试流体”，我们包括在实验室制备测试流体，并且体外测试流体具有已知的单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
本发明的第五个方面提供了测定受试者中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度用于诊断和/或预后受试者中的淀粉样物质相关疾病的用途，例如使用本文限定的本发明的方法。
本发明的第六个方面提供了时间分辨检测用于诊断和/或预后受试者中的淀粉样物质相关疾病的用途，例如使用本文限定的本发明的方法。
本发明的第七个方面提供了测定受试者中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸用于鉴定治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的用途，例如使用本文限定的本发明的方法。
本发明的第八个方面提供了时间分辨检测用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的用途，例如使用本文限定的本发明的方法。
将认识到相对于本发明的第一个方面和/或第二个方面和/或第三个方面和/或第四个方面限定的特征适用于本发明的第五个方面和/或第六个方面和/或第七个方面和/或第八个方面的用途。
本发明的第九个方面提供了用于本发明的第一个方面和/或第二个方面和/或第三个方面和/或第四个方面的方法和/或本发明的第五个方面和/或第六个方面和/或第七个方面和/或第八个方面中任一个用途的试剂盒套件。
在一个实施方案中，试剂盒套件包括一个或多个来自包括以下的或由以下组成的列表：
-如本文所述的检测剂，优选硫磺素T(ThT)；
-用于时间分辨检测的装置，如用于荧光相关光谱法(FCS)的显微镜；和/或
-对照样品。
在本发明第九个方面的一个实施方案中，试剂盒套件包括说明书。说明书可以是涉及本文所述的用途和/或方法和/或组合物的描述性、说明性、行销性或其他材料。
试剂盒的信息材料不限于形式。可以以多种格式提供信息，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或提供到例如互联网上的实质性材料的链接或地址的信息。
在优选的实施方案中，试剂盒套件包括用于诊断和/或预后受试者的淀粉样物质相关疾病和/或用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的说明书。
现在将参照一个或多个非限制性附图和实施例来描述本发明。
在本说明书中对显然是先前公开的文件的列出或讨论不必一定认为该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
附图说明
图1.荧光相关光谱法(FCS)的仪器设置示意图。
A.倒置共聚焦显微镜中的光学装置示意图。入射激光(深灰色)被主二向色分束器反射，并被物镜急剧聚焦到样品中，从而产生类似双圆锥的照明体积。可以吸收入射激光的照明体积中的分子被激发，但是未结合的ThT分子(浅灰色点)以及小的淀粉样物质寡聚物和肽/蛋白质单体(深灰色点)不发出荧光，而ThT反应性的结构化淀粉样物质寡聚物发出荧光(星星)。物镜将弹性散射的入射光(深灰色)和光谱上不同的荧光(浅灰色)收集回去，并由主二向色分束器分离，该分束器反射弹性散射的光并允许波长比入射/弹性散射的激光长的荧光穿过针孔到达检测器。
B.通过用显微镜物镜(深灰色)和理想化的扁长的椭球体形式的从其检测到荧光的观察体积元件(OVE)将入射激光聚焦，在样品中产生双圆锥样照明体积的放大图像(浅灰色)。
C.通过雪崩光电二极管(APD)检测器检测通过OVE的荧光分子/粒子发出的光子，该检测器以电脉冲响应每个检测到的光子。在特定时间间隔内检测到的源自光子的电脉冲数量(所谓的分箱时间)对应于在给定时间点测得的光强度。在此示例的是使用与上述相同的光学设置在血清中稀释的量子点悬浮液中记录的荧光强度涨落时间序列。
D.电信号被传输到数字信号相关单元，并在线计算相应的归一化自相关函数G(τ)，以产生通过实验得出的时间自相关曲线(tACC)。此处显示的tACC来自C中显示的时间轨迹。插图：硫磺素T(ThT)化学式(上)。下：ThT在水(黑色虚线)和含有胰岛素的结构化淀粉样物质寡聚物的水溶液(灰色实线)中的ThT荧光发射光谱。小插图中显示了水(黑色虚线)和胰岛素淀粉样物质原纤维水溶液(灰色虚线)中ThT的归一化基态吸收光谱。图片从Singh等，2015复制，获得了皇家化学学会(Royal Society of Chemistry)的许可。
图2.血清自身荧光和血清ThT荧光的FCS分析。
A.在没有ThT(黑点)和ThT(灰圈)的血清中记录的实验ACC，以及相应的最佳拟合理论AF(实线)。对于在没有ThT的血清中的测量，拟合实验数据的最简单理论模型是无三重态的自由3D扩散AF。通过拟合得出的参数值为：N＝300和τD＝55。结构参数固定为校准实验中确定的值Sp＝5。对于含有ThT的血清中的测量，拟合实验数据的最简单理论模型是无三重态的两个成分的自由3D扩散AF。通过拟合得出的参数值为：N＝750，τD1＝40μs，τD2＝100ms，y1＝0.94和y2＝0.06。结构参数固定为校准实验中确定的值Sp＝5。
B.A.中显示的时间自相关曲线归一化为相同的振幅，在τ＝10μs时G(τ)＝1。
图3.随时间记录的血清ThT中的时间分辨荧光强度涨落。
荧光强度中清晰可见的峰反映了明亮的ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物(即纳米斑)的稀疏通过(rare passage)。
图4.患者和对照组中发生ThT反应性结构性化淀粉样物质低聚聚集体的频率。
A.患者组(深条纹灰色)和对照组(深灰色)中单个事件发生的平均频率。误差条表示标准偏差(±SD)。
B.不同诊断组中单个事件发生的平均频率。
图5.血清中ThT反应性结构化淀粉样物质纳米斑的浓度随年龄增长而增加。
在显然健康的对照者(黑圈)和患者(灰点)中作为年龄函数的单个事件发生频率。来自AD患者的数据为浅灰色线条。暗灰色的线点来自有胃旁路手术的患者。线性回归方程的斜率是(1.6±1.0)×10-5s-1年-1，截距(9.4±0.6)10-4s-1。调整后的R平方值
表明此相关性非常弱。
图6.患者和对照组中的转换扩散时间，即ThT反应性结构化淀粉样物质低聚聚集体的尺寸。
对照组(黑点)和患者(灰圈)组的时间自相关曲线(tACC)显示，患者组的特征衰减时间更长，表明该组中观察到的结构化聚集体更大。
图7.临床CSF参数与血清中单个事件发生频率的相关性。
A.作为CSF中Aβ42水平函数的CSF中总Tau水平相对于Aβ42水平的比率。带有深灰色边缘的浅灰色点表示来自诊断为AD的个体的数据。在所有图中，虚线表示基于CSF中Aβ42水平进行的AD诊断的公认极限，[Aβ42]<550ng l-1。
B.血清中单个事件发生的频率作为CSF中Aβ42水平的函数。大点表示来自诊断为AD的个体的数据，而小点表示来自患者群中未诊断为AD的个体的数据。
C.CSF和血清测量值之间的比较。浅灰色轴和符号与CSF中的测量有关，显示了作为CSF中Aβ42水平函数的CSF中总Tau水平相对于Aβ42水平的比率。深灰色纵坐标和符号与血清中的测量有关。深灰色符号表示作为CSF中Aβ42水平的函数的血清中单个事件发生的频率。大点代表来自基于多模式临床评估被诊断为AD的个体的数据。浅灰色线点表示来自胃旁路手术患者的数值。
图S1(图8)。仪器校准。
使用与ThT分析相同的光学设置，在25nM Rh6G水溶液(黑圈)中记录了时间自相关曲线。通过拟合OVE中平均分子数得出的自由三维(3D)扩散(浅灰色)的自相关函数，N＝2.5；转换扩散时间，τ＝24μs；结构参数Sp＝7。在这些条件下，Rh6G每秒每分子和秒的平均计数为CPSM＝(5.1±0.6)kHz。
图S2(图9)。由分析单个事件发生频率确定的fluospheres扩散时间在实验误差内与通过时间自相关分析获得的值一致。
A.50nM的fluospheres含水悬浮液中记录的荧光强度涨落。B.50pM的fluospheres含水悬浮液中记录的荧光强度涨落。C.通过分析100nm fluospheres的50nM或50pM含水悬浮液中记录的荧光强度涨落获得的归一化到相同幅度的tACC，在τ＝10μs时，Gn(τ)＝1。实线：从一系列10个连续获得的荧光强度涨落测量获得的平均归一化tACC，每个单独的测量持续10s，在50nM的100nm fluospheres含水悬浮液中记录的。点划线：通过针对50pM的100nm fluospheres含水悬浮液中3000s记录的荧光强度涨落的时间自相关分析获得的归一化tACC。点线：从300连续获得的荧光强度涨落测量获得的平均归一化tACC，每个单独的测量持续10s，在50pM的100nm fluospheres含水悬浮液中记录的。短划线：通过分析荧光强度涨落获得的平均归一化tACC，每个单独的测量持续10s，在50pM的100nm fluospheres含水悬浮液中记录的，其中按照数据分析中所述的，鉴定单个事件发生。点划线、点线和短划线的tACC获自同一样品中进行的测量，但使用不同的数据分析程序。归一化tACC的重叠表明了所有测试的程序在实验误差内产生了相同的结果。
图S3(图10)。单个事件发生频率fSEO与c≤10fM的稀水悬浮液中100nmfluospheres的实际浓度成线性比例。
回归线的斜率为(2.3±0.3)，并且测定系数R2＝0.92。
图S4(图11)。
针对对照(黑色)和患者(深灰色)组的含有ThT血清中的单个事件发生的平均频率与针对对照(浅灰色)和患者(浅灰色条纹)组的不含ThT血清中的测量进行比较的对照试验。
图S5(图12)。明显健康对照受试者的CSF中的ThT分析。
A.添加ThT前(黑色)和添加ThT后(灰色)CSF中随时间记录的荧光强度涨落。B.相应的时间自相关曲线。
图S6(图13)。明显健康对照受试者的唾液中的ThT分析。
A.添加ThT前(黑色)和添加ThT后(灰色)唾液中随时间记录的荧光强度涨落。B.相应的时间自相关曲线。
图S7(图14)。明显健康对照受试者的尿液中的ThT分析。
A.添加ThT前(黑色)和添加ThT后(灰色)尿液中随时间记录的荧光强度涨落。B.相应的时间自相关曲线。
图15.单分子荧光成像系统的示意图，该系统具有使用金属膜构建在透明熔融石英基板上的zepto升观察波导。金属膜中的一个孔被放大。(M J Levene,J Korlach,S WTurner,M Foquet,H G Craighead和W W Webb,Science vol.299,No.5607(2003年1月31日)pp.682-686)。
图16.zepto升观察波导的直径。
A.针对50nm直径和100nm深度的zepto-升波导的强度分布的三维有限元时域模拟(Three dimensional finite-element time-domain simulation)(对数标尺)。金属材料是Al(铝)。
B.针对孔直径的不同直径的S(z)曲线。C.有效观察体积元件尺寸(Veff)和相应的针对其的浓度，体积中平均存在一个分子(<N>＝1)(M J Levene,J Korlach,S W Turner,MFoquet,H G Craighead和W W Webb,Science vol.299,No.5607(2003年1月31日)pp.682-686)。
图17：带有zepro-升波导阵列的熔融石英盖玻片
A.带有上盖垫片的盖玻片用于分离用于单独实验的阵列。B和C.波导规模的连续增加。D.单独孔的扫描电子显微镜图像。(M J Levene,J Korlach,S W Turner,M Foquet,HG Craighead和W W Webb,Science vol.299,No.5607(2003年1月31日)pp.682-686)。
图18.用于大规模平行荧光相关光谱法(mpFCS)的仪器中光学装置的示意图。
使用安装在滤光片轮(NDFW)上的具有不同传输功率的中性密度滤光片调节强度的单个激光束(L1和L2)被扩展，通过潜望镜组件(PA)引导并由衍射光学元件(DOE)上的聚焦透镜(L3)聚焦，所述衍射光学元件设计成用于将单个激光束分成32×32(1024)个光束的矩形阵列。在显微镜后端口的像平面上形成32×32激光束点的照明矩阵，并通过显微镜的中继光学(relay optics，RO)引导至长通二向色镜(LPDM)并通过物镜(OBJ)引导至样品中。物镜收集的荧光通过LPMD并被引导至匹配的2D阵列(如果是单光子雪崩光电二极管(SPAD摄像机))。上：使用薄层罗丹明(Rhodamine)6G(Rh6G)和18.0百万像素数字单镜头反射(DSLR)相机(导航相机)在显微镜物镜焦平面上生成的照明矩阵图像。在中心可见零级衍射峰(Vital M,Bronzi D,Krmpot AJ,Nikolic SN,Schmitt F-J,Junghans C,Tisa S,Friedrich T,Vukojevic V,Terenius L,Zappa F,Rigler R,A single-photon avalanchecamera for fluorescence lifetime imaging microscopy and correlationspectroscopty.IEEE J.Sel.Top.Quantum Electron.2014 20:344-353)。
图19.使用大规模平行荧光相关光谱法(mpFCS)测定溶液和血清中淀粉样物质聚集体的尺寸分布。
A.1024观察体积元件中的扩散时间图。
B.所有1024个观测体积元件的扩散直方图。
C.反应开始后3小时，以一个观察体积在淀粉样物质β1-42(Aβ42)肽水溶液(20μM Aβ42，10μM ThT，室温(RT≈21℃))中记录的时间序列。
D.血清样品中以一个观察体积元件记录的时间序列。在背景上方清晰可见的荧光强度爆发反映了ThT反应性纳米斑的通过。
图20.单个事件发生频率(fSEO)的测量反映了诊断为阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)的个体和明显健康个体(对照)的血清中结构化Th-T反应性淀粉样物质聚集体的数量的差异。
在箱-须图(box-and-whisker plot)中，箱表示数据平均值上下的一个标准偏差(中间的实线)，水平虚线是中值，而须的末端为5-95％间隔。
图21.血清中临床CSF参数与单个事件发生频率(fSEO)之间的相关性。
A.作为CSF中Aβ42水平函数的CSF中总Tau水平相对于Aβ42水平的比率。带有深灰色边缘的浅灰色点表示来自诊断为AD的个体的数据。浅灰色点表示来自诊断为MCI的个体的数据。在所有图中，垂直虚线表示基于CSF中Aβ42水平进行的AD诊断的公认极限，[Aβ42]≤550ng l-1。B.血清中单个事件发生的频率作为CSF中Aβ42水平的函数。大的带有黑色边缘的深灰色点表示来自诊断为AD的个体的数据。小的深灰色点表示来自诊断为MCI的患者群中的个体的数据。水平虚线表示血清中fSEO的截留值，fSEO≥1.5×10-3s-1(5.4h-1)。C.CSF和血清测量值之间的比较。浅灰色轴和符号与CSF中的测量有关，显示了作为CSF中Aβ42水平函数的CSF中总Tau水平相对于Aβ42水平的比率。深灰色纵坐标和符号与血清中的测量有关。深灰色符号表示作为CSF中Aβ42水平函数的血清中单个事件发生的频率。大点代表来自基于多模式临床评估被诊断为AD的个体的数据。B.和C.中由浅灰色圈圈起来的点表示来自诊断为MCI的经过胃旁路手术的患者的值。
图22.患有MCI和AD的个体中神经退行性病变相对淀粉样物质负荷的贡献。
通过结合CSF和血液分析数据，可以根据神经变性和淀粉样物质变性负荷的程度将患者分成如下四组：I-低神经变性(lNDG)和低淀粉样变性负荷(lAL)；II-低神经变性(lNDG)和高淀粉样物质负荷(hAL)；III-高神经变性(hNDG)和高淀粉样物质负荷(hAL)；IV-高神经变性(hNDG)和低淀粉样物质负荷(lAL)。根据这种分类，表现出低神经变性和高淀粉样物质负荷的MCI患者可能处于患有AD的风险中。在这些个体中，淀粉样物质β生理机能被破坏，而神经变性仍然很低。
具体实施方式
实施例1：血清中的分析
概述
通过在亚飞升(sub-femtoliter)尺寸的观察体积元件中使用时间分辨检测硫磺素T(ThT)荧光强度涨落，我们能够以单分子灵敏度检测到明显健康的个体和诊断为患有阿尔茨海默病(AD)的患者的血清中极低水平的小的结构化淀粉样物质纳米斑块。诊断为患有AD的个体的血清中遇到小的结构化淀粉样物质纳米斑块的频率及其尺寸显著高于对照组。我们的研究结果表明，与大量(bulk)荧光ThT光谱法不同，时间分辨ThT荧光强度涨落分析可以直接检测，定量和测定血清中小的结构化淀粉样物质纳米斑块的尺寸。该方法既不依靠基于免疫的探针的使用，也不依靠放射性示踪剂、信号放大或蛋白质分离技术的使用，并且提供了一种微创测试来快速且经济地及早测定体液中结构改变的蛋白质，包括外周血循环(图1-11和20-22)、脑脊液(图12)、唾液(图13)和尿液(图14)。
缩写
AD-阿尔茨海默病；Aβ-淀粉样β肽；CNS-中枢神经系统；CPSM-每分子每秒的计数；CSF-脑脊液；FCS-荧光相关光谱法；FIFA-荧光强度涨落分析；轻度认知障碍-MCI；OVE-观察体积元件；Rh6G-罗丹明6G；单个事件发生-SEO；主观认知障碍-SCI；tACC-时间自相关曲线；ThT-硫磺素T。
引言
阿尔茨海默病(AD)是毁灭性的神经退行性疾病，并且是全世界痴呆症的最常见原因(1，2)。AD逐渐破坏受影响个体的重要精神能力，并显著降低其认知能力。由AD引起的损害程度使得受影响的人最终不再能够照顾自己，并且在他们的余生中需要不断的照顾和帮助。不幸的是，尽管进行了深入的研究和巨大的社会需求，但可靠且经济高效的AD早期诊断方法仍处于起步阶段。这也阻碍了新药的研发，并且目前还没有治愈AD的方法。
取得进一步进展的主要障碍是，缺乏有关AD发展背后复杂动态过程的重要基础知识。尽管尚不完全清楚其分子机制，但众所周知，淀粉样物质β(Aβ)肽的产生和清除不平衡，伴随着它们自组装成结构化聚集体并在受影响个体的中枢神经系统(CNS)中积累成所谓的老年斑，是AD的早期迹象。考虑到该概念，淀粉样物质级联假设提出Aβ肽的错误折叠、聚集和沉积是AD的主要原因(3)。Aβ肽是39-42个氨基酸长的肽，其通过蛋白水解加工衍生自淀粉样物质前体蛋白(APP)。Aβ肽最常见的形式是Aβ40和Aβ42(在(4)中进行了综述)。
Aβ的聚集机制很复杂。已使用多种不同的分析技术对它们进行了研究，包括荧光光谱和荧光相关光谱((5)和其中的参考文献)。在苯并噻唑盐的早期，硫磺素T(ThT)荧光测定法已成为通过荧光光谱和显微镜检查淀粉样物质的标准方法(6,7)。正如最近的研究表明，富含β-褶层二级结构的淀粉样物质聚集体易于结合ThT并显著改变其光谱性质，将吸收光谱移向更长的波长并显著提高了荧光量子产率(图1，插图)(8-12)。
AD的诊断方法仍处于激烈争论中(13-16)。为了在潜在患者的精神退行不明显之前进行诊断，需要可靠的生物标志物(17)。针对Aβ的血清和CSF自身抗体已显示出希望并有待进一步研究(18,19)，但迄今为止结果并不特别令人鼓舞。使用PET和放射性示踪剂进行的大脑成像将可靠地反映出大脑中尺寸>1mm的淀粉样物质的原纤维沉积物(20-22)。使用免疫化学技术测量脑脊液(CSF)中Aβ肽(和Tau蛋白)的含量也被认为是可靠的(23-25)。但是，PET和CSF方法都是侵入性的并且昂贵。在论题综述(13，14)中，作者列出了简单测量血浆Aβ作为诊断方法的弊端，并表明到目前为止，将血液研究与PET或CSF结果相关联的尝试尚无说服力。两种技术测量的Aβ的异质和不同的结构状态是造成实验困难的一个可能原因：免疫化学方法测量可溶性形式的Aβ肽，而PET方法测量脑中沉淀的不溶性肽聚集体。即使两种测量都与Aβ肽的存在和行为有关，也没有明确的直接联系。显然，迫切需要一种基于其他生物标记物方法的新的、无创且可靠的方法来进行早期AD诊断。缺乏此类方法也阻碍了新药的研发-旨在减轻大脑中淀粉样物质负担的新疗法的研发决定性地取决于随着时间重复地在同一个体中常规识别和表征结构化淀粉样物质聚集体的水平的可能性。
在这里，我们提出了基于荧光的血清研究，简单地用淀粉样物质敏感染料ThT标记。该方法基于使用时间分辨和高度敏感的单分子荧光技术进行荧光相关光谱(FCS)的观察结果。我们之前已使用基于ThT的FCS分析(ThT-FCS)，以在体外研究Aβ肽聚集体在其原纤维形成过程中的异质性和周转率(5)。在本研究中，我们证明从ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物(在此称为纳米斑块，在患者血清中是明显可见的)的数量和大小来看，诊断的AD患者和对照个体的血清之间存在显著差异。可以实时观察并计数这些单个纳米斑块颗粒通过极小的(<飞升)观察体积的通过。AD患者和对照的血清中与纳米斑块的浓度成正比的传代次数存在显著差异。
材料和方法
患者群和伦理
在显然健康的血液供体(对照组)以及在基层医疗机构检查后转诊至哈丁德卡罗林斯卡大学医院记忆诊所(Memory Clinic，Karolinska University Hospital，Huddinge)的个体(患者群)的知情同意下，采集血液样品。斯德哥尔摩地区道德委员会批准了血液样品的收集和处理，许可证号为nr.2012/1019-31/1。
在尚未确认AD诊断时，患者未服用通常用于治疗AD症状的任何药物，如胆碱酯酶抑制剂或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，它们典型地用于治疗AD症状。但是，由于年龄大，患者群中的许多个体都存在与年龄相关的健康问题，并且正在服用某些处方药。表1给出了详细的人口统计状况和其他相关患者信息。
表1.患者和对照受试者的人口统计状况、药物治疗和诊断。
血液采集以及血清、血浆和细胞裂解液样品制备方案
使用抽真空的静脉穿刺管系统(BD
管，Becton，Dickinson andCompany)收集来自上肢浅静脉的血液，并按如下所述进行处理以产生血清。在进行时间分辨荧光强度涨落分析(FIFA)之前，将ThT添加到样品中。
血清：
为了提取血清，将5毫升血液收集在带有红色BD HemogardTM Closure的BD
Plastic血清试管中，该试管包含喷洒在试管内壁上的以SiO2为主要凝结激活剂成分的微粉化二氧化硅颗粒，以加速凝结过程，并且不包含凝血酶。为了激活血液凝结，将试管轻轻倒置180°并返回5-6次，然后使血液凝结60分钟。此后，将试管以2500×g离心10分钟，并目测检查凝块上方的上清液(即血清)的浊度和溶血的证据。即使我们在单独的对照实验中确定了中度混浊和溶血不影响结果的成果，但混浊的血清样品和具有明显可见的粉红色变色的样品也没有进行进一步分析(数据未显示)。
对于立即使用，将200μl血清等分到8-孔室盖玻片的小孔中(Lab-Tek ChamberedCoverglass，Thermo Scientific，美国)，与1.6μl的2.5mM ThT混合至20μM ThT的最终浓度，并按如下所述进行FIFA处理。所有实验均一式二份进行。
为了评估短期血清存储对分析结果的影响，将血清悬浮，并将200μl等分试样转移到0.5ml Eppendorf Safe-Lock离心管中，并在-20℃下保存2、4或24周。仅允许一个冻融循环。
血浆：
为了提取血浆，在带有Lavender BD HemogardTM Closeure的BD
Plastic K3EDTA管中收集5ml血液，所述管含有每1ml血液1.8mg抗凝剂K3EDTA，产生～7mM的EDTA浓度。EDTA的这种浓度既不会干扰Aβ的聚集，也不会干扰ThT的测定，这是基于大量(bulk)ThT荧光光谱测量结果，其显示出高EDTA浓度(高达10mM)对体外Aβ肽聚集过程中的滞后相的长度或荧光生长曲线的斜率都没有影响(数据未显示)。将试管轻轻倒置180°并倒转10次，然后沉静60min。此后，将试管以2500×g离心10分钟，并目测检查细胞层上方的上清液(即血浆)的浊度和溶血的迹象。如上所述，丢弃浑浊的血浆样品和具有明显可见的粉红色变色的血浆样品，并且不进行进一步的分析。对于立即使用，将200μl血浆等分到8-孔室盖玻片的孔中，与1.6μl 2.5mM ThT混合至20μM ThT的终浓度，并按照以上针对血清描述的相同步骤进行FIFA处理。
在一组有限的实验中，将血浆收集在带有Light Blue BD HemogardTM Closure的BD
CTAD管中，以评估使用柠檬酸盐缓冲液的优势。未观察到EDTA或柠檬酸盐血浆样品之间的差异。
细胞裂解液：
为了制备血细胞裂解液，在去除血浆后，将0.1ml在150mM NaCl中的1％Triton X-100溶液加入保留在带有Lavender BD HemogardTM Closeure的BD
Plastic K3EDTA管底部的细胞沉淀中；将内容物以2500×g离心10分钟，然后取出细胞裂解液进行分析。对于立即分析，将200μl细胞裂解液等分到8-孔室盖玻片的孔中，与1.6μl2.5mM ThT混合至20μM ThT的终浓度，并按照以上针对血清描述的相同步骤进行FIFA处理。
关于荧光相关光谱(FCS)的简短背景介绍
荧光相关光谱法(FCS)是一种定量分析方法，对于检测稀水溶液中的亮荧光分子具有极高的单分子灵敏度(26-32)。FCS通过以高时间分辨率观察非常小的体积(在常规仪器设置中约为2×10-16l-10×10-16l)中自发荧光强度涨落的时间过程来实现单分子灵敏度。在这么小的体积中，一次查看少量分子可大大降低源自大量取用中存在的分子(如溶剂分子)的背景噪声。因此，明亮的荧光分子通过小的观察体积将引起能够容易地检测到的荧光强度的显著变化。
为了产生微小的观察体积，用于FCS的仪器利用了共聚焦显微镜中光学元件的特定布置，以通过高数值孔径(NA)物镜将入射激光锐利地聚焦到样品中，并通过在检测器前面的光学共轭平面上放置一个针孔来消除散焦光以进一步减小从其检测荧光的体积(图1A)。这样，样品中就会产生一个微型观察体积元件(OVE)(图1B)，其足够小，可以观察到由于自发的、通过OVE在分子位置的热驱动微观波动而在(非)平衡稳态附近出现的荧光强度涨落(图1C)。随时间记录这些波动并进行分析，以提取有关OVE中平均分子数量(其代表样品浓度)和平均过渡时间(即分子通过OVE所需的时间)的信息，因此所谓的转换扩散时间(τD)，其由目标分子的扩散系数(D)(即在给定粘度的介质中的尺寸和形状)来定义(图1D)。
可以使用不同的方法来分析FCS实验中记录的荧光强度涨落(28，30)。通常，应用时间自相关分析来导出时间自相关曲线(tACC)，并从tACC的振幅和tACC的特征衰减时间的扩散时间中读出OVE中平均分子数(26，27，30)。在“荧光强度涨落的时间自相关分析”中给出了时间自相关分析的详细信息，以及如何得出OVE中平均分子数和所研究粒子的平移扩散系数。在这项研究中，将时间自相关分析用于仪器校准，而实际数据分析是通过分析以下所述的数据分析中的单个事件发生频率来进行的。使用标准系列的fluospheres稀水悬浮液(d＝100nm)验证了该方法，其在“使用100nm fluospheres稀水悬浮液的数据分析的验证”中有详细描述。
时间分辨ThT荧光强度涨落测量
使用ConfoCor 2系统(Carl Zeiss，Jena，德国)进行时间分辨荧光强度涨落测量，该系统由配备了C-Apochromat，40×，NA＝1.2，水浸UV-VIS-IR物镜的倒置显微镜组成。ThT荧光是使用458nm的氩激光线激发的。入射激光通过物镜紧密聚焦在样品中；物镜测得的激光强度为6μW。弹性散射的光和光谱不同的荧光通过同一物镜向后收集，并使用HFT 458主二向色分束器分离。通过穿过针孔到达硅雪崩光电二极管检测器(SPCM-AQR-1X；PerkinElmer，USA)，对发射光进行空间滤波。检测器前面的针孔尺寸设置为70μm(1艾里)。
仪器校准：罗丹明6G(Rh6G)的标准水溶液(10-25nM)用于仪器校准。为此，应用了时间自相关分析(如“荧光强度涨落的时间自相关分析”中所述的)。如上所述，将用于ThT的相同光学设置用于Rh6G，并且在一系列的10次连续测量中记录了信号，每次测量持续10s。在这些设置下，Rh6G的转换扩散时间确定为τD,Rh6G＝(24±2)μs(n＝460)；每分子每秒的计数(CPMS)为CPMS＝(5.1±0.6)kHz，且结构参数为S＝7(图S1)。OVE尺寸确定为V≈2.0×10-16l。使用我们实验室中可用的单独改进的ConforCor3系统对FCS测量进行了验证(33)。没有观察到使用一种或另一种系统获得的测量结果之间的显著差异。
对血清的测量：在一系列的300次测量中记录了ThT血清荧光强度的波动，每次测量持续10s，总运行时间为3000s。所有测量均在20℃的空调房间内进行。如下所述评估数据。
数据分析
通过进行自动化单个事件计数分析来鉴定反映出ThT反应性结构化淀粉样物质纳米斑块偶尔通过OVE的ThT荧光强度中的稀疏爆发，以测定结构化淀粉样物质纳米斑块通过OVE的频率。为此，使用Matlab软件编写了一个程序。荧光峰(即“单个事件”)定义为荧光强度的增加△F(t)，其与整个时间序列的平均荧光强度<F(t)>的差值大于整个时间序列的标准偏差(SD)的五倍，△F(t)＝(F(t)-<F(t)>)>5×SD。然后将观察到的荧光峰数归一化成总测量时间(此处为3000s)，并将由此获得的单个事件发生频率(fSEO)以s-1表示，并在样品之间进行比较。
ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物的尺寸通过以下方式来测定。将所有记录的时间轨迹进行时间自相关分析。观察到ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物通过的时间迹线产生了tACC，而仅包含背景信号的时间迹线未显示任何tACC，因此被排除在进一步分析之外。然后将所有tACC归一化成相同的幅度，在τ＝10μs时G(τ)＝1，并且将来自同一组(患者或对照组)的所有tACC合并，分别得出患者和对照组的平均tACC。然后根据tACC的特征衰减时间的差异来评估尺寸差异-tACC的特征衰减时间越长，纳米斑块的尺寸就越大。
如“使用100nm fluospheres的稀水悬浮液的数据分析的验证”中所述的，上述用于测定ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物的fSEO和尺寸的程序已使用100nm fluospheres的稀水悬浮液进行了验证，图S2和S3。这些对照实验证实了使用提出的方法正确地测定了扩散时间(图S2)，并且可以通过校准曲线从fSEO评估ThT反应性结构化淀粉样物质寡聚物的浓度(图S3)。
进行时间分辨的ThT血清FIFA的研究人员对个体的诊断是不知情的，直到完成数据分析。同样，使用标准临床测试建立诊断，并且直到完成研究并显示密码后，临床医生才知道时间分辨的ThT血清荧光强度涨落分析的结果。为了评估对照和患者群中的平均fSEO值是否显著不同，使用在线可用的GraphPad软件工具(http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm？Format＝SD)进行了未配对的t检验分析。
化学品
所有化学品无需进一步纯化即可使用，并购自如下商业渠道：罗丹明6G(Sigma-Aldrich)；硫磺素T(Sigma-Aldrich)；羧酸盐官能化的量子点纳米晶体，d＝20nm，在525nm处有最大发射(
525ITKTM羧基量子点)和黄绿色荧光(Ex/Em：505/515)，来自Molecular Probes的羧酸改性的直径为d＝100nm的聚苯乙烯纳米/微球(
Size Kit#2)。在使用前，将fluosphere悬浮液超声处理30-60分钟。
荧光强度涨落(波动)的时间自相关分析
在时间自相关分析中，进行信号自相似性分析以检测数据中的非随机性，并在数据不是随机的情况下鉴定适当的时间序列模型。作为此过程的第一步，计算出所谓的归一化强度自相关函数G(τ)：
其中<F(t)>是整个时间序列的平均荧光强度；δF(t)＝F(t)-<F(t)>是在时间点t记录的荧光强度的波动；δF(t+τ)＝F(t+τ)-<F(t)>是在随后的时间点t+τ记录的相同时间序列中荧光强度的波动；τ是它们之间的时间差。
然后将归一化的自相关函数G(t)绘制成不同时滞τ的函数，以得出自相关曲线ACC。对于随机过程，对于所有滞后时间值，G(t)≈1。对于非随机过程，ACC具有G(τ)τ→0的最大极限值，其在长时间间隔内会减小到G(τ)＝1值，这表明荧光信号的初始值与当前特性值之间的相关性已丢失。对于由荧光分子的自由三维(3D)转化扩散产生的荧光强度涨落的最简单情况，ACC具有一个特征性衰减时间，它表示分子通过OVE所花费的平均时间，即等于平移扩散时间(τD)。t＝0时的G(t)极限值与OVE中的平均分子数量(N)成反向相关，并且因此代表了它们的浓度(26，27)。
为了提取N和τD值，使用理论自相关函数(AFt)拟合实验获得的ACC。例如，如果样品中存在一种荧光物质，并且单重态和三重态之间的过渡是唯一影响所观察分子的荧光的分子内过程，则可以使用以下AFt描述ACC：
在等式(2)中，N是OVE中的平均分子数；S是空间参数，也称为结构参数，
其中
和
分别是OVE的1/e2径向和轴向半径，τ是时间滞后；τD是转化扩散时间；T是三重态分子的平均平衡分数，τT是三重态相关时间，与系统间交叉和三重态衰变的速率常数相关。
OVE的空间特性在仪器校准测量中通过实验确定。使用其浓度和转化扩散系数已知的参考荧光染料标准溶液进行校准。通过自相关函数(2)拟合实验得出的针对标准溶液记录的ACC，该函数允许所有参数自由变化，并且通过拟合测定N、τD，S2，T和τT的值。使用参考染料的转换扩散系数D的已知值和τD的测定值，可以从以下公式确定OVE的径向半径：
并且从结构参数S2确定轴向半径
对于所有其他测量，结构参数值固定为校准测量中测定的值。
对于我们的系统，使用Rh6G在水中的标准溶液来进行仪器校准(图S1)。
使用100nm fluospheres的稀水悬浮液的数据分析的验证
将已知浓度(1fM≤c≤50nM)的fluospheres(d＝100nm)稀水悬浮液用于验证扩散时间确定程序(图S2)和通过单个事件计数(即通过测定单个事件发生频率fSEO)来确定的浓度(图S3)。
血清的自发荧光测量
将不含ThT的血清用作评估随机干扰对所得结果的影响的对照(图S4)。可以看出，尽管偶尔在不含ThT的血清中检测到荧光强度峰(浅灰色和浅灰色条纹)，但其平均发生频率却明显低于含ThT血清的(黑色和深灰色)；在对照和患者组中，出现这些峰值的频率没有差异；并且标准偏差大于平均值，表明随机干扰的平均值与零之间无显著差异(图S4)。
结果
血清自发荧光和血清ThT荧光
血清是不同类别化合物的复杂含水混合物，其中脂质(以甘油三酸酯的形式)和蛋白质(白蛋白和免疫球蛋白)含量很高。包含血清所包含的许多化合物具有天然荧光性，并在458nm处吸收光，如黄素(FAD)和吡啶(NADH)辅酶和脂色素。结果，血清表现出自发荧光，并且还产生截然不同的tACC，其幅度为A血清＝(0.003±0.002)，并且单个特征性衰减时间τ血清＝(55±15)μs(图2A，黑色)。可以拟合这些实验数据的最简单理论模型是无三重态的自由3D扩散的自相关函数(在(27)中为AF1)。将结构参数固定为通过使用Rh6G，Sp＝5的仪器校准确定的值，通过拟合得出的参数值为：N＝300和τD＝55μs。
将ThT加入血清中时，会观察到几个重要的区别。最显著的是，tACC的幅度显著下降(AThT＝(0.0014±0.0007))，并且观察到一个或多个具有长特征性衰减时间的成分的微小但可辨别的贡献(图2A，灰色)。因此，拟合这些实验数据的最简单理论模型是一种自相关函数，用于两个没有三重态的组分的自由3D扩散(在(27)中为AF3)。从最佳拟合自相关函数得出的参数值为：N＝750，τD1＝40μs，τD2＝100ms，y1＝0.94和y2＝0.06。结构参数固定为在校准实验中确定的值Sp＝5。通过拟合得出的第一组分的特征性衰减时间τD1＝40μs与不含ThT血清中的特征性衰减时间非常相似，τD＝55μs；与实验结果一致，实验结果表明归一化为相同幅度的ACC紧密重叠，在τ＝10μs时G(τ)＝1(图2B)。
ACC幅度的减小(表明添加ThT后OVE中可观察分子的平均数量增加)与使否则不可见的ThT反应性实体可见是一致的。Chauhan等(34)和Griffin等(35)的大量(bulk)荧光光谱法详细表征了血清中的ThT荧光。使用浮选分离，Griffin等能够显示血清中约94％的ThT反应性与不含apoB的血清部分有关，并确定了水溶性血清白蛋白的糖化和其他化学加成物是基线ThT血清荧光的主要贡献者(35)。观察到的具有明显更长的扩散时间的第二组分的出现与使得以非常低的水平存在的大的ThT反应性实体可见相一致，因此第二组分的振幅相对小。
正如基于先前发表的结果所预期的(34，35)，平均血清ThT荧光强度在个体之间显示出相当大的差异(表1)。但是，与先前通过大量ThT荧光光谱法观察到的结果相反，患者CRp＝(202±92)kHz和对照组CRc＝(155±43)kHz之间的平均计数率值显著不同，如从两尾P值得出，P＝0.0126。
ThT荧光强度涨落的时间分辨检测揭示了ThT反应性淀粉样物质结构化纳米斑块
通过OVE
ThT血清荧光的时间分辨检测揭示了很少出现非常好识别的荧光强度峰，该峰与平均荧光强度相差一个比时间序列的标准偏差(SD)大出超过五倍的值，((F(t)-<F(t)>)>5×SD(图3)。如前所述，我们将这些峰值称为“单个事件”。
为了确定这些爆发不反映电干扰或偶尔有小气泡或灰尘颗粒通过OVE，而是反映ThT反应性淀粉样物质结构化纳米斑块的通过，在不含ThT的血清中进行对照测量。如图所示(“血清的自发荧光测量”中的图S4)，尽管在添加ThT之前偶尔在血清中检测到荧光强度峰值，但其平均发生频率明显低于含有ThT的血清。在对照和患者样品中出现这些峰的频率没有差异；并且标准偏差大于平均值，表明随机扰动的平均值与零没有显著差异。
因此，我们呈现了荧光强度爆发的发生，即单个事件的发生及其出现的频率，称为“单个事件发生频率”(fSEO)，作为我们对血清中结构化纳米斑块浓度的直接测量。
AD患者血清中的单个事件发生频率高于显然健康对照的血清中的
按照材料和方法：数据分析小节中描述的计算的单个事件发生频率在患者组fSEOp＝(2.3±1.7)×10-3s-1和对照组fSEOc＝(1.5±1.2)×10-3s-1之间不同。通过不成对t检验分析确定的两尾P值P＝0.0418表明了患者组和对照组之间的单个事件发生频率的差异具有统计学意义(图4A)。在揭示了密码并基于临床诊断将患者分成亚组后，AD患者fAD SEOp＝(2.5±1.5)×10-3s-1和对照组fSEOc＝(1.5±1.2)×10-3s-1之间的差异仍具有统计学意义，P＝0.0420(图4B)。
我们的分析还显示了随着年龄的增长，结构化淀粉样物质纳米斑块的血清浓度会有所增加，这可以从单个事件发生频率看出，其斜率(1.6±1.0)×10-5s-1年-1和截距(9.4±0.6)×10-4s-1增大(图5，实线)。但是，调整后的R平方值
表明此相关性非常弱。实际上，同一数据集可以用零斜率线性回归拟合，其截距为(1.3±0.2)×10-3s-1，并且残差平方和(residual sum of squares，RSS)值对于零斜率线性回归RSSz-slr＝30.2低于最佳拟合线性回归RSSlr＝66.7。
AD患者血清中ThT反应性淀粉样物质结构化纳米斑块的尺寸大于显然健康对照的
血清中的
按照材料和方法：数据分析中所述的进行的时间自相关分析显示，两组记录的tACC之间的特征性衰减时间存在明显差异，而患者组的衰减时间明显更长(图6)。归一化的tACC的评估表明，所分析的系统复杂，并且不包含尺寸均一的颗粒，而是包含不同尺寸的颗粒的混合物。对照组中ThT活性颗粒的平均扩散时间约为5ms，而患者组中的颗粒平均扩散时间约为约15ms，对于球状分子，对应于两组之间的分子量差约为27倍。显然，除了较大量的纳米斑块，患者组在血清中还携带着较大的ThT活性结构化聚集体。
CSF的临床输出与血清中时间分辨的ThT荧光强度涨落分析
我们比较了血清中时间分辨的ThT FIFA所获得的结果与脑脊液(CSF)中使用已建立的生化生物标志物所获得的结果，包括淀粉样物质β肽(Aβ42)的42个氨基酸形式的CSF水平和tau蛋白(t-Tau)的总CSF水平。比较表明，时间分辨的ThT血清FIFA获得的结果与CSF生化分析获得的结果明显匹配(图7)。基于CSF中的Aβ42水平进行AD诊断的公认极限是<550ngl-1(36)。基于图7中呈现的数据，我们认为血清中fSEO的极限>1.5×10-3s-1可指示AD。
讨论
在存在淀粉样物质原纤维和结构化淀粉样物质寡聚物的情况下，ThT获得了与游离染料光谱明显不同的荧光激发和发射光谱(图1，插图)(8-12)。通常认为这种荧光变化是ThT与淀粉样物质结构的相互作用特异性的，并且与天然蛋白单体或无定形聚集体结合后不会引起荧光变化(6，7)。由于这种特性，ThT已被广泛用于通过荧光显微镜观察组织淀粉样物质沉积(37-39)；ThT同系物是使用正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)进行体内成像的基础(40-42)；并且ThT是经典的大量荧光光谱在蛋白质聚集的基础研究中监测从体外纯化的蛋白质和肽形成淀粉样物质原纤维的时间过程中必不可少的(5，43，44)。
尽管经典的大量ThT荧光光谱对于Aβ聚集动力学的基础研究是非常重要的(43)，但该方法也有严重的局限性。最值得注意的是，经典的大量ThT荧光光谱法涉及样品中存在的所有Aβ聚集状态的平均ThT荧光信号，以及ThT荧光强度的时间平均，使用通常为1-10s阶的信号整合时间(43)。在这样的测量条件下，源自稀疏的淀粉样物质结构化聚集体的信号贡献太小，以致无法从背景中分辨出来。因此，已显示出大量的ThT荧光光谱法在以淀粉样物质为特征的疾病的生物医学诊断中的实用性受到限制(34，35)。
与大量ThT荧光光谱法不同，亚飞升OVE中的ThT荧光强度涨落的时间分辨检测不涉及这种平均(5)，这使我们能够准确地确定ThT活性结构化淀粉样物质聚集体通过OVE(图3)。因此，我们首次报告了使用ThT血清荧光强度涨落的时间分辨检测方法检测血清中结构化淀粉样物质聚集体。此外，我们证明AD诊断与血清AD中发生ThT反应性结构化淀粉样物质聚集体的平均频率之间存在正相关(图4和图7)。尽管该方法用于早期识别处于罹患AD风险中的个体的能力仍有待建立，但我们的结果清楚地表明这种具有单分子灵敏度的新方法既不依赖于使用基于免疫的探针，也不依赖于使用使用放射性示踪剂、信号放大或蛋白质分离技术，其可以提供微创检测，用于快速且经济高效地尽早测定外周血循环、CSF(图S5)中的，以及其他更容易获得的生物流体，如唾液和尿液(分别为图S6和S7)中的结构修饰蛋白。
基于免疫的测定可用于证实该方法的结果，如最常用的酶联免疫吸附测定(ELISA)、数字ELISA、夹心ELISA(45，46)、夹心ELISA(47)以及最近由Andreasson等综述的相关方法(48)和免疫沉淀-质谱(IP-MS)(49)，都具有与抗体-抗原反应的特异性和灵敏度相关的共同固有局限性(50-52)。在基于Aβ免疫的测定中，通常会遇到以下困难(仅举几个例子)：过量存在的单体Aβ会占据抗体上的结合位点，从而干扰Aβ寡聚物的检测(53)；来自APP处理的非淀粉样物质生成途径的p3肽和Aβ分解代谢的肽的干扰可能对结果的解释带来不确定性(54)；用于信号放大和检测的底物固有地不稳定，并且即使在不存在酶的情况下也可能产生信号(48)。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、2D-PAGE、液相色谱(LC)、质谱(MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、电喷雾电离(ESI)质谱、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和相关技术的蛋白质组学方法，以高灵敏度和特异性直接表征目标分子，从而提供了有价值的信息(55)。然而，由于动态范围的限制，难以检测复杂混合物(如生物流体)中的低丰度蛋白质使得这些技术变得复杂；无法测量完整的较大蛋白质并涉及样品制备程序(56)。结果，迄今为止，尚未有在蛋白质组学研究中发现的CSF生物标志物已经到达临床(57)。
总而言之，我们想强调的是，目前临床上可用于脑脊液和血浆生化分析的基于免疫的方法表明，AD患者CSF和血浆中的Aβ42浓度降低(23，36，49，58-60)。这很可能是由于以下事实：抗体在很大程度上识别单体Aβ肽，而聚集使Aβ肽进入不易被免疫化学识别的状态，如Klaver等(53)和其中引用的参考文献所述的。相比之下，我们的方法测量的是血清中ThT活性状态，其对应于脑中看到的原纤维中存在的实际淀粉样物质状态。显然，从图7中呈现的数据可以看出，两种类型的观察都与患者的AD病理相关，但是我们的方法依靠简单的血液测试来得出信息。所提出的方法的定量限制是空前的，对于包含40种以上Aβ单体的结构化聚集体，达到了最终的单分子灵敏度。此外，所提出的方法还使我们能够确定结构化聚集体尺寸的分布，这可能是有价值的疾病阶段(早期vs晚期)的指标，也是可靠的疾病进展预测指标。
实施例2：CSF中的分析
使用0.5ml在无任何添加剂的情况下在-80℃下储存在聚丙烯管中的脑脊髓液(CSF)等分试样。使样品在室温下融化60min。此后，将200μl等分试样转移至每孔中含有10μl ThT水溶液的8孔室盖玻片中。通过分配/抽提几次将样品轻轻混合，并进行分析。分析一式两份进行。
实施例3：尿液中的分析
将来自显然健康的供体的早晨第一次尿液中游标本收集到一个没有任何尿液防腐剂的无菌容器中。使样品在室温下沉静60min。此后，将200μl等分试样转移至每孔中含有10μl ThT水溶液的8孔室盖玻片中。通过分配/抽提几次将样品轻轻混合，并进行分析。分析一式两份进行。
实施例4：唾液中的分析
在早晨早餐后2小时并且在早晨卫生操作后，从显然健康的供体采集唾液样品。在此期间，供体只能喝水。在样品采集前用去离子水冲洗粗略清洁口腔后，被动采样(无抽吸)2ml自然流动的唾液并收集到浸入冰浴中的无菌容器中。收集后，将200μl等分试样转移至每孔中含有10μl ThT水溶液的8孔室盖玻片中。通过分配/抽提几次将样品轻轻混合，使其温热15min并进行分析。分析一式两份进行。
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Claims (57)
1.一种用于受试者中淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液样品；和
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
2.根据权利要求1的方法，其中体液是来自由以下物质组成的组中的一种或多种：血液和/或脑脊液(CSF)和/或唾液和/或尿液和/或滑液和/或粪便。
3.根据权利要求2的方法，其中血液样品是来自由以下物质组成的组中的一种或多种：全血和/或血清和/或血浆和/或细胞裂解物和/或红细胞、白细胞和/或凝血细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中体液选自由血浆和/或血清组成的组。
5.根据权利要求1的方法，其中体液选自血清。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法不包括单个的淀粉样物质聚集体的扩增。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括基于荧光光谱的分析。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括基于荧光相关光谱和荧光强度涨落分析(FIFA)的分析。
9.根据前述权利要求1-7任一项的方法，其中测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括基于荧光相关光谱的分析。
10.根据权利要求9的方法，其中可以针对每位受试者测定淀粉样物质分子/颗粒/聚集体的尺寸特征。
11.根据权利要求2至10任一项的方法，其中血液样品不包含来自由以下物质组成的组中的一种或多种：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)酶和/或FAD脂色素；和/或吡啶类(NADH)酶和/或NADH脂色素。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中单个的淀粉样物质聚集体选自包括以下的组：淀粉样物质寡聚物；淀粉样物质纳米聚集体；和/或淀粉样物质衰老聚集体；和/或淀粉样物质原纤维；和/或淀粉样物质初原纤维。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中单个的淀粉样物质聚集体包含约20或更多个肽；例如，约30或更多；约40或更多；约50或更多；约60或更多；约70或更多；约80或更多；约90或更多；或约100或更多个肽，优选约40或更多个肽。
14.根据权利要求12或13的方法，其中淀粉样物质纳米聚集体包含约20个蛋白质或肽至100,000个蛋白质或肽。
15.根据权利要求12或13的方法，其中衰老淀粉样物质聚集体包含超过1,000,000个蛋白质或肽。
16.根据权利要求12或13的方法，其中淀粉样物质原纤维包含超过100,000个肽或蛋白质至1,000,000个肽或蛋白质。
17.根据前述权利要求任一项的方法，进一步包括将检测剂加入样品中的步骤。
18.根据权利要求17的方法，其中所述测定包括检测剂的检测和/或测量。
19.根据权利要求17或18的方法，其中检测剂与包含一个或多个beta(β)-片的单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应。
20.根据权利要求17-19任一项的方法，其中检测剂包含荧光部分，该荧光部分在与单个的淀粉样物质聚集体结合和/或缔合和/或反应时发出荧光。
21.根据权利要求17-20任一项的方法，其中检测剂是来自由以下物质组成的组中的一种或多种：硫磺素T(ThT)和/或ARCAM1和/或五聚甲酰基噻吩乙酸(pFTAA)和/或4-(二氰基乙烯基)-久洛里定(DCVJ)和/或1-氨基-8-萘磺酸盐(ANS)和/或双-ANS和/或2-[N-双-(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓(PicoGreen)。
22.根据前述权利要求任一项的方法，其中淀粉样物质相关疾病与包含一个或多个beta(β)-片的单个的淀粉样物质聚集体相关。
23.根据前述权利要求任一项的方法，其中淀粉样物质相关疾病是选自包括以下疾病的组中的一种或多种：阿尔茨海默病；和/或帕金森病；和/或亨廷顿病；和/或肌萎缩性侧索硬化(ALS)；和/或2型糖尿病；和/或系统性淀粉样变性；和/或朊病毒病(如克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD))；和/或淀粉样物质轻链淀粉样变性；和/或多发性骨髓瘤；和/或炎症；和/或肾衰竭；和/或白细胞趋化因子2(LECT2)淀粉样变性；和/或甲状腺素转运蛋白相关的遗传性淀粉样变性伴多发性神经病(也称为家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或Skelleftesjukan)；和/或与血液透析相关的淀粉样变性；和/或脑淀粉样血管病；和/或家族性内脏淀粉样变性；和/或原发性皮肤淀粉样变性；和/或脑淀粉样血管病；和/或催乳素瘤；和/或家族性角膜淀粉样变性；和/或老年性心房淀粉样变性；和/或甲状腺髓样癌；和/或药物性胰岛素衍生的淀粉样变性。
24.根据权利要求23的方法，其中阿尔茨海默病选自包括以下的组：主观认知障碍；轻度认知障碍；阿尔茨海默病；以及伴有血管性痴呆的阿尔茨海默病。
25.根据权利要求23或24的方法，其中淀粉样物质相关疾病是阿尔茨海默病，并且单个的淀粉样物质聚集体包括淀粉样物质beta(β)淀粉样肽(β肽)，例如β40和/或β42和/或β43。
26.根据前述权利要求任一项的方法，其中测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸是以单个的淀粉样物质聚集体分辨率来测定的。
27.根据前述权利要求任一项的方法，其中测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸包括时间分辨检测。
28.根据权利要求27的方法，其中时间分辨检测包括荧光相关光谱(FCS)。
29.根据权利要求28的方法，其中由荧光相关光谱(FCS)检测的荧光表示单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸。
30.根据权利要求29的方法，其中荧光包括高于对照荧光水平的荧光水平。
31.根据权利要求30的方法，其中荧光包括的荧光水平是对照荧光水平的约两倍或更高，优选约五倍或更高。
32.根据权利要求30或31的方法，其中对照荧光水平是样品中的背景荧光水平。
33.根据权利要求30-32任一项的方法，其中对照荧光水平是在荧光相关光谱(FCS)过程中测量的平均荧光水平。
34.根据前述权利要求任一项的方法，其中样品包含约30微升(μl)至约300微升(μl)的体积。
35.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法进一步包括基于所述测定提供淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后的步骤。
36.根据权利要求35的方法，其中如果单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量是一个单个的淀粉样物质聚集体，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
37.根据权利要求35或36的方法，其中如果样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度高于对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度；和/或样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸大于对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸，则提供了淀粉样物质相关疾病的诊断和/或预后。
38.根据权利要求37的方法，其中样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度比对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度高约20％或更多，优选约50％或更多；和/或
样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸比对照样品中单个的淀粉样物质聚集体的尺寸大约20％或更多，优选约50％或更多。
39.根据权利要求37或38的方法，其中对照样品包括来自一个或多个未患有淀粉样物质相关疾病的对照受试者的体液样品。
40.根据前述权利要求任一项的方法，其中以一定间隔重复之前任一项权利要求的方法，如重复两次或更多。
41.根据权利要求40的方法，其中重复所述方法之间的时间段为一天或更长。
42.根据前述权利要求任一项的方法，其中受试者和/或对照受试者是来自包括以下的组中的一种或多种：啮齿动物(例如，小鼠，和/或大鼠，和/或仓鼠，和/或豚鼠，和/或沙鼠，和/或兔)；和/或犬科动物(例如，狗)；和/或猫科动物(例如猫)；灵长类动物(例如，人；和/或猴；和/或猿)；和/或马科动物(例如，马)；和/或牛属动物(例如牛)；和/或猪科动物(例如猪)。
43.根据前述权利要求任一项的方法，进一步包括给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗的步骤。
44.用于治疗受试者的淀粉样物质相关疾病的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自受试者的体液样品；
-测定样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-基于所述测定来鉴定受试者患有淀粉样物质相关疾病；和，
-给受试者选择和/或提供用于淀粉样物质相关疾病的治疗。
45.根据权利要求44的方法，其中所述治疗包括将用于淀粉样物质相关疾病的治疗施用于受试者。
46.用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自测试受试者的体液的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂给药于受试者；
-提供来自测试受试者的体液的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
47.根据权利要求46的方法，其中测试受试者是来自包括以下的组中的一种或多种：啮齿动物(例如，小鼠，和/或大鼠，和/或仓鼠，和/或豚鼠，和/或沙鼠，和/或兔)；和/或犬科动物(例如，狗)；和/或猫科动物(例如猫)；灵长类动物(例如，人；和/或猴；和/或猿)；和/或马科动物(例如，马)；和/或牛科动物(例如牛)；和/或猪科动物(例如猪)；和/或鱼(例如，斑马鱼)；和/或昆虫(例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；和/或两栖动物(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis))；和/或爬行动物；和/或线虫(例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))。
48.根据权利要求46或47的方法，其中测试受试者是非人类，例如非人类哺乳动物。
49.用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
-提供来自测试流体的第一样品；
-测定第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将活性剂施用于测试流体；
-提供来自测试流体的第二样品；
-测定第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸；
-将第一样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定与第二样品中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸的测定进行比较；和
-基于所述比较来把所述活性剂鉴定为用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂。
50.根据权利要求49的方法，其中所述方法在体外和/或离体进行。
51.根据权利要求49或50的方法，其中测试流体是体液。
52.测定受试者中单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸用于诊断和/或预后受试者的淀粉样物质相关疾病的用途。
53.时间分辨检测用于诊断和/或预后受试者的淀粉样物质相关疾病的用途。
54.测定单个的淀粉样物质聚集体的存在和/或数量和/或浓度和/或尺寸用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的用途。
55.时间分辨检测用于鉴定用于治疗淀粉样物质相关疾病的活性剂的用途。
56.用于权利要求1-51任一项的方法和/或权利要求52-55任一项的用途的试剂盒套件。
57.如本文关于所附权利要求、说明书描述、实施例和附图所述的方法，或用途，或试剂盒套件。
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