PL241595B1

PL241595B1 - Sposób, zestaw oraz zastosowanie tioflawiny T do wykrywania monomerów i agregatów białka, tioflawina T do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek oraz sposób generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T

Info

Publication number: PL241595B1
Application number: PL432889A
Authority: PL
Inventors: Piotr HAŃCZYC; Piotr Hańczyc; Piotr FITA; Piotr Fita
Original assignee: Univ Warszawski
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2022-10-31
Also published as: PL432889A1; WO2021162565A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania monomerów i agregatów białka, obejmujący następujące etapy: a) doprowadzenie do kontaktu tioflawiny T i białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, z wytworzeniem mieszaniny tioflawina T - białko; b) wylanie i równomierne rozprowadzenie mieszaniny wytworzonej w etapie a) na stałym podłożu oraz wysuszenie z uzyskaniem stałej warstwy; c) naświetlanie stałej warstwy uzyskanej w etapie b) wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm2 do 10 mJ/cm2 z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tioflawiny T w postaci unieruchomionej na stałym podłożu do wykrywania monomerów i agregatów białka oraz tioflawina T unieruchomiona na stałym podłożu do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest układ optyczny do wykrywania monomerów i agregatów białka, zawierający tioflawinę T oraz białko, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, charakteryzujący się tym, że jest w postaci unieruchomionej na stałym podłożu. Przedmiotem wynalazku jest również sposób generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T obejmujący następujące etapy: a) unieruchomienie tioflawiny T na stałym podłożu, oraz b) naświetlanie tioflawiny T unieruchomionej na stałym podłożu wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm2 do 10 mJ/cm2 z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej.

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wykrywania monomerów i agregatów białka, zastosowania tioflawiny T unieruchomionej w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do wykrywania monomerów i agregatów białka oraz zestawu do wykrywania monomerów i agregatów białka, zawierającego podłoże stałe oraz mieszaninę tioflawiny T i białka. Wynalazek dotyczy również tioflawiny T unieruchomionej w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek oraz sposobu generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T.

Amyloid jest postacią nieregularnej struktury białka, które jest związane z licznymi wyniszczającymi chorobami, takimi jak choroba Alzheimera, Parkinsona lub choroba Creutzfeldta - Jakoba. Jedna z najprostszych metod wykrywania agregatów białka amyloidu polega na barwieniu ich fluoroforami organicznymi, których wydajność fluorescencji wzrasta w wyniku wiązania elektrostatycznego z agregatami w postaci fibryli. Spośród cząsteczek organicznych, najczęściej stosowanym fluoroforem do wykrywania amyloidu jest tioflawina T (ThT) (Gade Malmos, K.; Blancas-Mejia, L. M.; Weber, B.; Buchner, J.; Ramirez-Alvarado, M.; Naiki, H.; Otzen, D., ThT 101: a primer on the use of thioflavin T to investigate amyloid formation. Amyloid2017, 24 (1), 1-16). Obrazowanie immunohistochemiczne i fluorescencyjne przy użyciu barwnika tioflawiny T jest standardem do wykrywania agregacji białek (Biancalana, M.; Koide, S., Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics 2010, 1804 (7), 1405-1412). Tioflawina jest powszechnie stosowana w laboratoriach badawczych, a także w przyszpitalnych jednostkach badawczych. Służy do badań agregacji in vitro w probówkach testowych, a także w płynach mózgowo-rdzeniowych, w krwi i w próbkach tkanek pośmiertnych (Green, A. J., RT-QuIC: a new test for sporadic CJD. Practical neurology 2019, 19 (1), 49-55; Tiiman, A.; Jelić, V.; Jarvet, J.; Jaremo, P.; Bogdanović, N.; Rigler, R.; Terenius, L.; Graslund, A.; Vukojević, V., Amyloidogenic nanoplaques in blood serum of patients with Alzheimer’s disease revealed by time-resolved thioflavin t fluorescence intensity fluctuation analysis. Journal of Alzheimer's Disease 2019, (Preprint), 1-12; Sundaram, G.; Binz, K.; Sharma, V.; Yeung, M.; Sharma, V., Live-cell fluorescence imaging: assessment of thioflavin T uptake in human epidermal carcinoma cells. MedChemComm 2018, 9 (6), 946-950). W obecności fibryli tioflawina T wykazuje kilkukrotny wzrost wydajności kwantowej fluorescencji, co tłumaczy się zahamowaniem wzajemnej rotacji segmentów cząsteczkowych (Hanczyc, P.; Justyniarski, A.; Kim, J.; Mikhailovsky, A.; Ivanova, M., Surface patterns of insulin fibrils revealed by time-resolved spectroscopy measurements of fluorescent probes. Journal of Luminescence 2018, 201, 31-37). Uważa się, że obecność struktury β- harmonijki w fibrylach jest krytyczna dla fluorescencji tioflawiny T, ponieważ nie obserwuje się zwiększenia emisji dla natywnych białek lub oligomerycznych postaci przedfibrylarnych, które tej struktury nie zawierają. To sprawia, że metody wykrywania oparte na fluorescencji tioflawiny T są niewrażliwe na wczesny etap agregacji białka, tzw. etap zarodkowania agregacji. Etap zarodkowania jest uważany za kluczową fazę, podczas której powstają toksyczne oligomery związane z rozwojem chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym celem wynalazku było opracowanie sposobu umożliwiającego wykrywanie pośrednich agregatów białek, które są kluczowe dla rozpoznania na wczesnym etapie ponad 30 chorób związanych z amyloidem, w tym choroby Alzheimera lub Parkinsona.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania monomerów i agregatów białka, obejmujący następujące etapy:

a) doprowadzenie do kontaktu tioflawiny T i białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, z wytworzeniem mieszaniny tioflawina T - białko;

b) wylanie i równomierne rozprowadzenie mieszaniny wytworzonej w etapie a) na stałym podłożu oraz wysuszenie z uzyskaniem stałej warstwy;

c) naświetlanie stałej warstwy uzyskanej w etapie b) wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm² do 10 mJ/cm² z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej;

d) wyznaczenie parametrów wzmocnionej emisji spontanicznej, takich jak próg wzmocnienia światła, szerokość widma, intensywność oraz długość fali i

e) określenie postaci białka na podstawie parametrów wyznaczonych w etapie d).

Korzystnie, za pomocą określonego powyżej sposobu wykrywa się monomer lub agregat białka wybranego z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe, a korzystniej wykrywa się monomer lub agregat β-amyloidu.

PL 241 595 B1

Korzystnie, etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μΜ.

Korzystnie, stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.

Korzystnie, stosuje się roztwór białka w buforze fosforanowym, wodzie, w tym wodzie destylowanej lub wodzie o pH2.

Korzystnie, wytwarza się mieszaninę o stężeniu białka w zakresie od 1 mM do 1,5 mM.

Korzystnie, roztwór białka inkubuje się w temperaturze w zakresie od 30°C do 65°C przez okres czasu od 24 godzin do 13 dni przed zmieszaniem z roztworem tioflawiny T.

Korzystnie, jako roztwór tioflawiny T stosuje się bufor reakcyjny do zastosowania w metodzie RT-QuIC, zawierający rekombinowane białko pochodzenia ludzkiego, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, w stężeniu w zakresie od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml.

Korzystnie, w przypadku stosowania buforu reakcyjnego do metody RT-QuIC, jako roztwór białka stosuje się płyn mózgowordzeniowy.

Korzystnie, jako stałe podłoże w etapie b) stosuje się podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.

Korzystnie, suszenie w etapie b) przeprowadza się na powietrzu bądź na płycie grzewczej w temperaturze w zakresie od 27°C do 65°C, przez okres czasu od 5 minut do 1 godziny.

Korzystnie, uzyskuje się stałą warstwę o grubości w zakresie od 50 μm do 300 μm, a korzystniej w zakresie od 90 μm do 110 μm.

Korzystnie, stałą warstwę uzyskaną w etapie b) naświetla się wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 0,3 mJ/cm² do 3,3 mJ/cm².

Korzystnie, etapy a) do e) powtarza się w różnych punktach czasowych od momentu przygotowania roztworu białka do kilkunastu dni.

Korzystnie, odstępy pomiędzy różnymi punktami czasowymi wynoszą od kilkunastu minut do kilku dni.

Korzystnie, monomery i agregaty białka wykrywa się w próbkach krwi, próbkach płynu mózgowordzeniowego lub w próbkach tkanek pośmiertnych ssaka in vitro.

Korzystnie, wykrywa się takie postacie agregatów białka jak oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.

Korzystnie, określony powyżej sposób stosuje się do diagnozowania choroby związanej z agregacją białek.

Korzystnie, określony powyżej sposób stosuje się do diagnozowania choroby związanej z agregacją β-amyloidu, korzystniej stosuje się go do diagnozowania choroby wybranej z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, Parkinsona lub Creutzfeldta - Jakoba, a najkorzystniej do diagnozowania choroby Alzheimera.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tioflawiny T unieruchomionej w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do wykrywania monomerów i agregatów białka, przy czym tioflawina T jest unieruchomiona razem z białkiem, którego monomer lub agregat ma być wykrywany.

Korzystnie, stała warstwa ma grubość w zakresie od 50 μm do 300 μm, a korzystniej w zakresie od 90 μm do 110 μm.

Korzystnie, stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.

Korzystnie, tioflawinę T stosuje się do wykrywania monomerów i agregatów białka w próbkach krwi, próbkach płynu mózgowordzeniowego lub w próbkach tkanek pośmiertnych ssaka in vitro.

Korzystnie, agregaty białka są wybrane z grupy obejmującej oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.

Korzystnie, białko jest wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe, a korzystniej białkiem jest β-amyloid.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest tioflawina T unieruchomiona w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek, przy czym tioflawina T jest unieruchomiona razem z białkiem, którego agregacja jest związana z diagnozowaną chorobą.

Korzystnie, stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.

Korzystnie, diagnozowaną chorobą jest choroba związana z agregacją białka β-amyloidu, korzystniej diagnozowana choroba jest wybrana z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, Parkinsona lub Creutzfeldta - Jakoba, a najkorzystniej jest to choroba Alzheimera.

PL 241 595 B1

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania monomerów i agregatów białka, zawierający podłoże stałe oraz mieszaninę tioflawiny T i białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, charakteryzujący się tym, że mieszanina jest w postaci warstwy stałej unieruchomionej na stałym podłożu.

Korzystnie, białko jest wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulnę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe, a korzystniej białkiem jest β-amyloid.

Korzystnie, stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.

Korzystnie, wykrywane agregaty są wybrane z grupy obejmującej oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T obejmujący następujące etapy:

a) unieruchomienie tioflawiny T na stałym podłożu, oraz

b) naświetlanie tioflawiny T unieruchomionej na stałym podłożu wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm² do 10 mJ/cm² z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej.

Korzystnie, etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem polimeru, z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μM.

Korzystnie, jako roztwór polimeru stosuje się wodny roztwór polialkoholu winylowego) o stężeniu w zakresie od 5% (wag./obj.) do 10% (wag./obj.).

Korzystnie, stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.

Również korzystnie, etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem białka z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μM.

Korzystnie, stosuje się roztwór białka w buforze fosforanowym, wodzie, w tym wodzie destylowanej lub wodzie o pH 2.

Korzystnie, stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.

Korzystnie, roztwór białka inkubuje się w temperaturze w zakresie od 30°C do 65°C przez okres czasu od 24 godzin do 13 dni, przed zmieszaniem z roztworem tioflawiny T.

Korzystnie, jako roztwór tioflawiny T stosuje się bufor reakcyjny do zastosowania w metodzie RT-QulC, zawierający rekombinowane białko pochodzenia ludzkiego w stężeniu w zakresie od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml.

Korzystnie, stosuje się białko wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe.

Korzystnie, wytworzoną mieszaninę tioflawiny T wylewa się i równomiernie rozprowadza na stałym podłożu oraz suszy się z uzyskaniem stałej warstwy.

Korzystnie, suszenie przeprowadza się na powietrzu lub na płycie grzewczej w temperaturze w zakresie od 27°C do 65°C, przez okres czasu od 5 minut do 1 godziny.

Korzystnie, jako stałe podłoże w etapie a) stosuje się podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.

Korzystnie, etap b) przeprowadza się z zastosowaniem wiązki impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 0,3 mJ/cm² do 3,3 mJ/cm².

W niniejszym wynalazku ograniczenie związane z brakiem wrażliwości fluorescencji tioflawiny T w roztworze na etap zarodkowania agregacji zostało przezwyciężone przez przeniesienie mieszaniny tioflawina T - białko do cienkiej warstwy w stanie stałym i przez wzmocnienie sygnału fluorescencji tioflawiny T w procesie generacji wzmocnionej emisji spontanicznej. Monitorując wzmocnioną spontaniczną emisję, osiąga się niezwykłą wrażliwość na wykrywanie przedfibrylarnych postaci agregatów białek, przy czym próg dla wzmocnionej emisji spontanicznej znacząco zależy od etapu agregacji. W niniejszym wynalazku wykazano, że tioflawina T oddziałuje z monomerem białka i wszystkimi pośrednimi postaciami agregatów białka pozbawionymi motywu β-harmonijki w strukturze, jeśli unieruchomi się ją na podłożu w postaci stałej warstwy. Zatem wykazano, że w przeciwieństwie do obec nego stanu techniki, badanie emisji tioflawiny T może być stosowane do wykrywania oligomerów amyloidu i

PL 241 595 B1 oceny poziomu ryzyka wystąpienia chorób neurodegeneracyjnych u pacjentów przed wystąpieniem u nich objawów klinicznych.

Niniejszy wynalazek ma ogromne znaczenie, gdy weźmie się pod uwagę fakt, że tioflawina T jest barwnikiem histologicznym często stosowanym jako główny marker do barwienia białka amyloidowego. Zatem nie będzie wymagana zmiana protokołów do analizy biomateriałów, takich jak płyn mózgowordzeniowy (CSF) lub próbki tkanek pośmiertnych. Proste rozszerzenie istniejącej metodologii fluorescencji poprzez wzmocnienie emisji spontanicznej tioflawiny T może być wykorzystane do precyzyjnego wykrywania oligomerów amyloidu uważanych za toksyczne i odpowiedzialne za inicjowanie licznych wyniszczających chorób neurodegeneracyjnych.

Wyniki badań przeprowadzonych za pomocą sposobu według wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1 (a) przedstawia widma wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T (ThT) zmieszanej z fibrylami białka lizozymu (linia przerywana), insuliny (linia ciągła) i β-laktoglobuliny (linia kropkowana) w postaci cienkich warstw; Fig. 1 (b) przedstawia wyniki pomiaru intensywności fluorescencji stacjonarnej tioflawiny T w obecności agregatów białka lizozymu w funkcji czasu, przy czym kwadraty na wykresie odpowiadają intensywności fluorescencji zarejestrowanej dla warstw zawierających tioflawinę T oraz białko lizozymu, a kółka odpowiadają intensywności fluorescencji zarejestrowanej dla tioflawiny T zmieszanej z białkiem lizozymu w roztworze wodnym.

Fig. 2 (a) przedstawia progi wzmocnienia światła w tioflawinie T z białkiem lizozymu w postaci warstw przygotowanych w odstępach czasu odpowiadających poszczególnym etapom agregacji białka. Biała część figury odpowiada etapowi zarodkowania (nukleacji), w którym tworzą się pre-agregaty białkowe tj. oligomery, a szara część figury odpowiada etapowi fibrylizacji, w którym tworzą się fibryle. Kwadraty odpowiadają progom wzmocnienia światła (mJ/cm²), a zaznaczona linia wyznacza trend wyznaczonych progów w zależności od czasu agregacji białka; Fig. 2 (b) przedstawia schemat prezentujący wpływ stopnia agregacji białka na zjawisko wzmocnienia emisji spontanicznej, gdzie górny schemat przedstawia mieszaninę tioflawiny T z białkiem niezagregowanym, środkowy przedstawia mieszaninę tioflawiny T z oligomerami, a dolny mieszaninę tioflawiny T z fibrylami. Skala po prawej stronie wykresów przedstawia umownie stopień rozpraszania światła przez różne typy agregatów wysuszonych w postaci warstw.

Fig. 3 (a) przedstawia wzór strukturalny barwnika tioflawiny T oraz diagram Jabłońskiego przedstawiający czteropoziomowy układ poziomów energetycznych; Fig. 3 (b) przedstawia widma absorpcji (linia ciągła), emisji (linia kropkowana) oraz wzmocnionej emisji spontanicznej (linia przerywana) tioflawiny T w matrycy polimerowej alkoholu poliwinylowego, Fig. 3 (c) przedstawia widma emisji spontanicznej oraz wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T w warstwach PVA mierzone w funkcji gęstości energii wiązki impulsów laserowych (energii pompowania); a Fig. 3 (d) przedstawia przykładowe wyznaczenie progu wzmocnienia światła wraz z zależnością progu od stężenia tioflawiny T w mieszaninie przed wylaniem warstwy.

Fig. 4 przedstawia kinetykę fluorescencji zarejestrowaną dla kryształów tioflawiny T (linia przerywana), dla tioflawiny T rozpuszczonej w matrycy alkoholu poliwinylowego (linia kropkowana) oraz dla mieszaniny tioflawiny T i niezagregowanego białka lizozymu (linie ciągłe). Najkrótszy zanik przedstawia funkcję odpowiedzi instrumentalnej układu pomiarowego.

Wynalazek ilustrują podane poniżej przykłady.

Początkowo badano trzy białka: β-laktoglobulinę, insulinę i lizozym. Wszystkie białka oraz tioflawinę zakupiono od Sigma-Aldrich.

W pierwszej kolejności przygotowano roztwory tioflawiny T, białka lizozymu, białka insuliny oraz białka β-laktoglobuliny.

Tioflawinę T rekrystalizowano z wody i przygotowano jej roztwór o stężeniu 1 mM w wodzie destylowanej. Stężenie wyznaczono na podstawie absorbancji przy 412 nm, przyjmując wartość molowego współczynnika ekstynkcji 36 000 M^-1 cm^-1.

Białko lizozymu rozpuszczono w wodzie o pH 2 (0,003 mM H2SO4), uzyskując roztwór białka o stężeniu 1,5 mM, który następnie przesączono przez filtr o średnicy porów 0,45 μm. Roztwór podstawowy inkubowano w temperaturze 65°C przez 13 dni lub stosowano go natychmiast po wytworzeniu w przypadku badania monomerów. Po 8 dniach otrzymano lepki roztwór wskazujący na tworzenie się fibryli lizozymu.

Białko insuliny rozpuszczono w wodzie o pH 2 (0,003 mM H2SO4), uzyskując roztwór o stężeniu białka wynoszącym 1,0 mM, który następnie przesączono przez filtr o średnicy porów 0,45 μm. Roztwór podstawowy inkubowano w temperaturze 65°C przez 24 godziny.

PL 241 595 B1

Białko β-laktoglobuliny rozpuszczono w wodzie o pH 2 (0,003 mM H2SO4), uzyskując roztwór o stężeniu białka wynoszącym 1,3 mM, który następnie przesączono przez filtr o średnicy porów 0,45 μm. Roztwór podstawowy inkubowano w temperaturze 65°C przez 5 dni.

W zależności od eksperymentu, inkubację białka prowadzono również w innych temperaturach, a mianowicie 37°C, 45°C oraz 55°C.

W ten sam sposób można przygotować roztwory powyższych białek w buforze fosforanowym oraz w wodzie destylowanej.

Następnie, z każdego powyższego roztworu podstawowego białka pobrano 250 μl roztworu i przeniesiono do oddzielnych probówek. Do każdej probówki dodano po 2,14 μl roztworu tioflawiny T, wytwarzając mieszaninę tioflawina T - białko, w której stężenie tioflawiny wynosiło 8,5 μΜ, a stężenie białka wynosiło odpowiednio 1,49 mM dla białka lizozymu, 0,99 mM dla białka insuliny i 1,29 mM dla białka β-laktoglobuliny.

W analogiczny sposób przygotowano mieszaniny tioflawina T - białko o różnych stężeniach tioflawiny T, a mianowicie o stężeniach wynoszących 1,08 μM, 2,15 μM, 3,2 μM, 4,4 μM, 20 μM oraz 40 μM, poprzez dodanie do 250 μl roztworu poszczególnych białek odpowiednio 0,27 μl, 0,53 μl, 0,8 μl, 1,1 μl, 5 μl oraz 10 μl uprzednio przygotowanego roztworu tioflawiny T. Z uwagi na niewielką ilość dodawanego roztworu tioflawiny T, stężenia poszczególnych białek nie ulegają znacznym zmianom w stosunku do wartości w roztworach podstawowych.

W przypadku przygotowywania próbki biologicznej, w której roztworem białka był płyn mózgowordzeniowy w pierwszej kolejności wytworzono bufor reakcyjny do metody RT-QuiC, który składał się z buforu fosforanowego (pH 8,2), 2 μM tioflawiny T i 0,1 mg/ml ludzkiego rekombinowanego białka amyloidu o pełnej długości. Do buforu reakcyjnego dodano 5 μl, 10 μl lub 15 μl nierozcieńczonego płynu mózgowordzeniowego do końcowej objętości wynoszącej 100 μl. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 120 godzin.

Tak przygotowane mieszaniny wylano i równomiernie rozprowadzono na szkiełka mikroskopowe. Następnie szkiełka poddano suszeniu na powietrzu w temperaturze otoczenia przez 15 minut w celu uzyskania stałych warstw. Przygotowano i przebadano kilka grubości warstw, a mianowicie 50 μm, 75 μm, 90 μm, 110 μm, 140 μm, 170 μm oraz 200 μm.

W innych eksperymentach szkiełka suszono na płycie grzewczej w temperaturach 37°C, 45°C, 55°C oraz 65°C. Temperatura suszenia odpowiadała temperaturze inkubacji podstawowego roztworu białka. Eksperymenty, w których szkiełka suszono na płycie grzewczej zamiast na powietrzu prowadzono w celu uniknięcia dużych zmian strukturalnych w agregatach, które mogą zachodzić samoczynnie podczas długotrwałego suszenia na powietrzu w temperaturze otoczenia.

Następnie szkiełka z wytworzonymi na nich warstwami montowano w uchwycie pomiarowym prostopadle do kierunku padania wiązki laserowej.

Badane warstwy były wzbudzane impulsami femtosekundowymi o centralnej długości fali 400 nm uzyskanymi przez podwojenie częstotliwości wyjściowej wiązki układu wzmacniacza femtosekundowego opartego na krysztale szafiru (Coherent Legend Elite Duo) pracującego z częstotliwością powtarzania 5 kHz. Alternatywnie można stosować impulsy o centralnej długości fali z zakresu 375-450 nm. Do wytworzenia drugiej harmonicznej światła (SH) wiązki wyjściowej wzmacniacza zastosowano kryształ β-boranu baru (BBO). Energię otrzymanych impulsów SH regulowano obracając płytkę półfalową zamontowaną przed kryształem BBO. Światło SH zostało oddzielone od światła o częstości podstawowej za pomocą pary dichroicznych zwierciadeł. Za zwierciadłami zwiększono średnicę wiązki teleskopem utworzonym przez parę soczewek sferycznych, a następnie zogniskowano soczewką cylindryczną. Początkowo stosowano wiązkę impulsów laserowych o małej gęstości energii (1 mJ/cm²), następnie stopniowo zwiększano gęstość energii aż do 9 mJ/cm² i na poszczególnych etapach sprawdzano widmo światła emitowanego przez próbkę. W momencie zawężenia widma, co jest charakterystyczne dla wzmocnionej emisji spontanicznej (ang. amplified spontaneous emission, ASE), zagęszczano liczbę pomiarów. Miało to miejsce w zakresie gęstości energii od 0,3 do 3,3 mJ/cm². Wzmocniona emisja spontaniczna była wykrywana w płaszczyźnie warstwy wzdłuż kierunku liniowego ogniskowania soczewki cylindrycznej. Światło ASE zbierano za pomocą włókna optycznego i dostarczono do spe ktrometru Ocean Optics USB 2000, którego rozdzielczość spektralna wynosiła około 4 nm.

Na podstawie powyższego pomiaru wyznaczano próg wzmocnienia światła, tzn. gęstość energii wiązki impulsów laserowych, przy której pojawia się zjawisko ASE, czyli charakterystyczne zawężenie widma emisji. Wartość tego progu zależy od etapu agregacji białka, a zatem na jej podstawie można

PL 241 595 B1 określić rodzaj agregatu białka obecnego w mieszaninie, co przykładowo opisano poniżej dla mieszaniny tioflawina T - białko lizozymu.

Poniżej przedstawiono wyniki badań różnych warstw przygotowywanych sposobem opisanym powyżej.

Mechanizm leżący u podstaw wynalazku, mianowicie wzmocnienie światła przez wzbudzoną tioflawinę T w postaci cienkiej warstwy, został zaobserwowany we wszystkich badanych układach tioflawiny T z białkiem, co przedstawiono na Fig. 1 (a).

Sugeruje to, że zaprezentowane podejście może być zastosowane do wykrywania różnych postaci agregatów praktycznie każdego białka występującego w naturze, w tym β-amyloidu, α-synukleiny lub białka prionowego, zwłaszcza z uwagi na fakt, że w stanie techniki znane jest już wykrywanie złogów białka β-amyloidu z zastosowaniem tioflawiny T.

Idealnym układem modelowym do badania nieprawidłowo sfałdowanych pośrednich postaci agregatów białka w warunkach in vitro jest lizozym ze względu na bardzo powolną kinetykę agregacji, która zwykle trwa kilka dni przed wytworzeniem dojrzałych fibryli. Z tego względu lizozym został wybrany do bardziej szczegółowej analizy. W celu porównania właściwości fluorescencyjnych mieszaniny tioflawiny T z białkiem w postaci warstwy z właściwościami fluorescencyjnymi tej mieszaniny w postaci roztworu, sposobem opisanym powyżej przygotowywano mieszaniny tioflawiny T i lizozymu, w której stężenie tioflawiny T wynosiło 4,4 μM, stężenie białka wynosiło 1,5 mM, a rozpuszczalnikiem była zakwaszona woda o pH 2. Roztwór białka, który stosowano do wytwarzania mieszanin był w sposób ciągły inkubowany w temperaturze 65°C. W różnych punktach czasowych (5 minut, 15 minut, 30 minut, 45 minut, 1 godzina i 45 minut, 4 godziny i 15 minut, 10 godzin, 25 godzin, 50 godzin, 75 godzin, 100 godzin, 127 godzin, 165 godzin, 210 godzin, 300 godzin od momentu przygotowania roztworu białka) pobierano z niego próbkę (250 μl) i dodawano do niego 1,1 μl roztworu tioflawiny T. Poszczególne punkty czasowe odpowiadały różnym etapom agregacji białka. W każdym z tych punktów czasowych przeprowadzano pomiar intensywności fluorescencji stacjonarnej dla mieszaniny tioflawina T - białko lizozymu w postaci roztworu. Analogiczny eksperyment w tych samych punktach czasowych przeprowadzono dla mieszanin tioflawina T - białko lizozymu, które wylewano na szkiełka mikroskopowe w postaci warstw o grubości 110 μm.

Wyniki pomiarów przedstawiono na Fig. 1 (b). W przeciwieństwie do ogólnej wiedzy zaobserwowano, że tioflawina T oddziałuje z monomerem białka i wszystkimi pośrednimi postaciami białka w stanie stałym. Pomiary fluorescencji stacjonarnej ujawniły, że każda postać białka lizozymu zapobiega krystalizacji barwnika w cienkich warstwach, co powoduje wzrost intensywności sygnału fluorescencji. Wykazano, że poprzez zestalenie układu tioflawina T-białko możliwe jest rejestrowanie widma emisyjnego związanego barwnika już w fazie zarodkowania przedfibrylarnego. Jednak standardowa fluorescencja próbek cienkich warstw ma podobną intensywność fluorescencji w każdym badanym przypadku, co ogranicza potencjalne rozpoznawanie określonych postaci agregatów. W związku z tym, dla warstw tioflawina T - białko przeprowadzono pomiary parametrów wzmocnionej emisji spontanicznej w różnych punktach czasowych od momentu przygotowania roztworu podstawowego białka, do którego dodawano roztwór tioflawiny T w tych punktach czasowych, do pełnego zagregowania białka tj. do kilkunastu dni.

Przykładowo, dla mieszaniny tioflawina T - białko lizozymu, wytworzono wodny roztwór tioflawiny T o stężeniu 1 mM oraz wodny roztwór białka lizozymu o stężeniu 1,5 mM. Z tak przygotowanych roztworów wytworzono mieszaninę białka i tioflawiny T, w której stężenie tioflawiny T wynosiło 2,15 μM, poprzez zmieszanie 250 μl roztworu białka oraz 0,53 μl roztworu tioflawiny T. Mieszaninę tę natychmiast po wytworzeniu wylano na szkiełko mikroskopowe, wysuszono na powietrzu przez 15 minut i następnie przeprowadzono pomiary wzmocnionej emisji spontanicznej sposobem opisanym powyżej. Następnie wytworzony roztwór białka inkubowano w sposób ciągły od momentu wytworzenia w temperaturze 65°C przez 13 dni i w określonych punktach czasowych (tj. 5 minut, 15 minut, 30 minut, 45 minut, 1 godzina i 45 minut, 4 godziny i 15 minut, 10 godzin, 25 godzin, 50 godzin, 75 godzin, 100 godzin, 127 godzin, 165 godzin, 210 godzin, 300 godzin od momentu wytworzenia roztworu białka) pobierano z niego 250 μl, dodawano do tego 0,53 μl roztworu tioflawiny T, mieszaninę wylewano na szkiełko i suszono na płycie grzewczej w temperaturze 65°C przez 5 minut. Następnie każdą z warstw wzbudzano wiązką impulsów laserowych sposobem opisanym powyżej i określano próg wzmocnienia światła, na podstawie którego określano rodzaj agregatu białka obecnego w mieszaninie. Wszystkie badane warstwy miały grubość 110 μm.

Wyniki tych pomiarów są przedstawione na Fig. 2 (a) i (b). Punkt początkowy na Fig. 2 (a) odpowiada pomiarom progów ASE wykonanym w tioflawinie T z monomerami lizozymu odlewanymi w warunkach otoczenia. Próg dla mieszaniny monomeru lizozymu z tioflawiną T wynosi 0,9 mJ/cm². Próg

PL 241 595 B1 zmniejsza się następnie w ciągu pierwszej godziny inkubacji białka, gdy ulega ono denaturacji, a monomery białkowe agregują w oligomery. Po pierwszej godzinie progi mieszczą się w zakresie 0,30,7 mJ/cm² do trzeciego dnia inkubacji, który odpowiada fazie zarodkowania. Odlewanie próbki lizozymu ogrzewanego w temperaturze 65°C przez cztery dni wykazało wzrost progu wzmocnienia światła w mieszaninie z tioflawiną T do 1,1 mJ/cm². Jest to etap przejściowy między fazą zarodkowania a fazą wydłużania, w której oligomery zaczynają tworzyć protofibryle. Podczas fazy wydłużania odnotowano dalszy wzrost progu ASE, który osiąga wartość 1,5 mJ/cm² dla dojrzałych fibryli utworzonych po 10 dniach. Efekt ten można wyjaśnić silniejszym rozpraszaniem światła przez dojrzałe fibryle, które wprowadzają większe straty światła propagującego się w badanej warstwie. W związku z powyższym wartości progów ASE w zakresie 0,3-0,7 mJ/cm² świadczą o obecności oligomerów, natomiast wartości w zakresie 1,2-1,8 mJ/cm² świadczą o obecności fibryli lizozymu. Podobny trend obserwowano również dla pozostałych białek.

Na Fig. 2 (b) przedstawiono schemat prezentujący wpływ stopnia agregacji białka na zjawisko wzmocnienia emisji spontanicznej, gdzie górny schemat przedstawia wyniki dla tioflawiny T z białkiem niezagregowanym, środkowy odpowiada tioflawinie T z oligomerami, a dolny - z fibrylami. Skala po prawej stronie wykresów przedstawia umownie stopień rozpraszania światła przez różne typy agregatów wysuszonych w postaci warstw. Figura ilustruje fakt, że rozpraszanie jest najsłabsze w obecności monomerów i najsilniejsze w obecności fibryli. Na podstawie tego można wyciągnąć wniosek, że inwersja obsadzeń, indukowana w związanych cząsteczkach tioflawiny T powoduje wzmocnienie światła, natomiast przeciwdziała temu rozpraszanie wywołane agregacją białka. Konkurencja tych dwóch efektów optycznych powoduje zmianę progów ASE odpowiadającą etapowi agregacji. Fakt, że ASE odzwierciedla wzajemne oddziaływanie emisji i rozpraszania, czyni z niej potężne narzędzie analityczne do badania fazy zarodkowania amyloidów.

Podsumowując, wzmocniona emisja spontaniczna tioflawiny T wykazuje niezwykłą wrażliwość na białka we wszystkich postaciach: monomery, oligomery, zagregowane oligomery i fibryle. Próg ASE przedstawiono jako nowy parametr, który można z powodzeniem zastosować do wykrywania powyżej wymienionych postaci białka agregującego. Jak wykazano, jest to parametr, który zależy zarówno od czasu życia barwnika w stanie wzbudzonym, jak i stopnia rozpraszania światła przez struktury białka.

Przeprowadzono również badania nad właściwościami ASE tioflawiny T osadzonej w poli (alkoholu winylowym) (PVA) (ang. Polyvinyl alcohol). W tym celu wytworzono wodne roztwory PVA o stężeniu 10% (wag./obj.) i dodawano do nich 1 mM wodny roztwór tioflawiny T w ilości koniecznej do uzyskania stężeń tioflawiny T w końcowych mieszaninach wynoszących 1,08 μM, 2,15 μM, 3,2 μM, 4,4 μM oraz 8,5 μΜ. Tak otrzymane mieszaniny wylewano i równomiernie rozprowadzano na szkiełkach mikroskopowych i suszono w temperaturze otoczenia przez 30 minut w wyniku czego uzyskiwano warstwy o grubości 300 μm. Wytworzone warstwy naświetlano wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 0,31 do 3,25 mJ/cm². Z przeprowadzonych pomiarów wynika, że osadzenie tioflawiny T w sztywnym środowisku, takim jak matryca polimerowa PVA, hamuje wzajemną rotację segmentów cząsteczkowych i przejście do stanu z przeniesieniem ładunku (ang. charge transfer, CT). W ten sposób tworzy się klasyczny czteropoziomowy układ energetyczny, który umożliwia wzmocnienie światła w barwnikach laserowych (Fig. 3 (a)). W tioflawinie T inwersję obsadzeń można osiągnąć w stanie lokalnie wzbudzonym (ang. locally excited, LE) przez wzbudzenie optyczne. W wyniku tego procesu następuje wzmocnienie światła poprzez przejście do gorącego stanu podstawowego w procesie emisji wymuszonej. Na Fig. 3 (b) przedstawiono widma absorpcji (linia ciągła), emisji (linia kropkowana) i wzmocnionej emisji spontanicznej (linia przerywana) tioflawiny T w matrycy PVA. W tej konfiguracji eksperymentalnej ASE rozwija się od spontanicznej emisji przy względnie niskiej gęstości energii wiązki impulsów laserowych (energii pompowania) wynoszącej około 0,30 mJ/cm² (Fig. 2 (c)). Przy naświetlaniu wiązką impulsów laserowych o gęstości energii powyżej tego progu zachodzi charakterystyczne zawężenie spektralne, które odzwierciedla przejście od emisji spontanicznej do ASE. Próg ASE zależy od stężenia tioflawiny T w PVA. Obniża się on wykładniczo wraz ze wzrostem zawartości tioflawiny T w matrycy polimerowej (Fig. 3 (d)). Najniższy próg, 0,2 mJ/cm², odnotowano przy stężeniu 8,5 μΜ, a najwyższy, 0,95 mJ/cm², dla stężenia 1,08 μM tioflawiny T w roztworze przed odlewaniem. W przypadku niższej zawartości barwnika w PVA nie zaobserwowano ASE. Monowykładniczo zanikająca fluorescencja obserwowana w PVA z czasem życia niezależnym od stężenia w badanym zakresie stężeń tioflawiny T od 1 μM do 8,5 μΜ wyklucza dimeryzację barwnika lub samowygaszanie, które mogą pojawić się podczas odparowywania rozpuszczalnika, sprzyjając oddziaływaniom barwnik - barwnik w zatłoczonym środowisku.

PL 241 595 B1

Eksperyment odniesienia przeprowadzono przez odlewanie roztworu tioflawiny T na szkiełku, umożliwiając krystalizację barwnika. W tym przypadku zarejestrowano dwuwykładniczy zanik fluorescencji dla krystalicznej tioflawiny T. Jego główny składnik był krótszy niż rozdzielczość czasowa układu eksperymentalnego (<100 ps), a składnik o dłuższym czasie życia miał czas życia 2 ns. Porównując zaniki fluorescencji tioflawiny T w PVA i w kryształach barwnika, można wyciągnąć wniosek, że cząsteczki tioflawiny T są homogenicznie rozproszone w PVA i nie zachodzi krystalizacja w matrycy polimerowej.

Znając czasy życia fluorescencji dla dwóch skrajnych przypadków: całkowicie rozpuszczonej tioflawiny T w PVA i wykrystalizowanej tioflawiny T, można ustalić, czy barwnik jest związany z białkiem lub czy tworzy kryształy w cienkich warstwach. Figura 4 pokazuje zaniki fluorescencji tioflawin y T w różnych stężeniach (1,08 μM, 2,15 μM, 3,20 μM, 8,51 μM), które zmieszano z monomerem lizozymu (1,5 mM), wylano na szkiełku i wysuszono w warunkach otoczenia. Zaniki są znacznie wolniejsze niż w przypadku kryształów tioflawiny T, co wskazuje, że znaczna część cząsteczek barwnika oddziałuje z monomerami lizozymu. Najdłuższy zanik fluorescencji odpowiada warstwie o najniższym stężeniu tioflawiny T. Wzrost stężenia barwnika w stosunku do monomeru doprowadził do skrócenia czasu życia fluorescencji z powodu rosnącej ilości kryształów tioflawiny T w cienkiej warstwie 110 μm. Na figurze, można zaobserwować coraz szybsze zaniki fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia tioflawiny T. Zatem na podstawie tych wyników, można wyciągnąć wniosek, że dwuwykładniczy charakter zaników odpowiada mieszaninie tioflawiny T związanej z monomerami białka i wolnymi kryształami tioflawiny T. Badania zależne od stężenia wykazały, że istnieje ograniczona liczba miejsc wiązania w monomerze lizozymu, a nadmiar barwnika ma tendencję do krystalizacji.

Podsumowując, na podstawie wyników pomiarów czasowo-rozdzielczej fluorescencji przedstawionych na Fig. 4, można przyjąć, że w sposobie wykrywania agregatów białka według wynalazku optymalnym stężeniem barwnika jest około 2 μM. Takie stężenie pozwala uniknąć absorpcji światła wzbudzającego przez niezwiązane krystaliczne cząsteczki barwnika. Przy tak niskim stężeniu tioflawina T wiąże się głównie z białkiem i w warstwach znajduje się stosunkowo niewielka ilość kryształów. Test kontrolny lizozymu domieszkowanego nadmiarem tioflawiny T w stężeniu wynoszącym 40 μM nie wykazał ASE, co potwierdza, że mikrokryształy tioflawiny T nie wzmacniają światła i mogą nawet doprowadzić do wygaszania fluorescencji i ASE.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty dowodzą, że stałe cienkie warstwy tworzą korzystne warunki dla zjawiska zwanego wzmocnioną emisją spontaniczną (ASE) w tioflawinie T. W zjawisku ASE fotony emitowane spontanicznie przez wzbudzone cząsteczki są zwielokrotniane w procesie emisji wymuszonej, gdy wchodzą w interakcje z innymi wzbudzonymi cząsteczkami podczas ich propagacji przez środowisko. Rezultatem jest kierunkowa emisja światła o widmie znacznie węższym niż widmo naturalnej fluorescencji cząsteczek wzmacniających światło. Co ważne, warunkiem wstępnym dla ASE jest inwersja obsadzeń w ośrodku wzmacniającym światło. Zatem ASE jest niewrażliwa na niezwiązane cząsteczki tioflawiny T, których czas życia w stanie wzbudzonym jest zbyt krótki, aby umożliwić inwersję obsadzeń. W przeciwieństwie do detekcji opartej na fluorescencji, ASE pojawia się tylko wtedy, gdy intensywność światła wzbudzającego przekracza pewien próg, który zależy zarówno od wzmocnienia, jak i strat, na przykład z powodu rozproszenia, w ośrodku wzmacniającym. Dlatego parametry ASE są wrażliwe na organizację białka i mogą dostarczyć nowych informacji na temat struktury amyloidu. Ponadto badania przesiewowe oparte na ASE mogą zapewnić bardziej kompleksowy zestaw danych dotyczących agregacji białek niż standardowa fluorescencja. Trzy parametry ASE obserwowane w układzie tioflawina T - białko, tj. intensywność, próg dla wzmocnienia światła oraz długość fali, tworzą wielokierunkowy obraz agregacji białek od najwcześniejszych etapów nieprawidłowego fałdowania. Godne uwagi jest to, że wszystkie parametry są rejestrowane jednocześnie co zmniejsza ilość próbki potrzebnej do przeprowadzenia eksperymentu. W praktyce każdy parametr może dostarczyć pewną informację na temat agregacji, ale informacje uzyskane przez połączenie wszystkich trzech parametrów mogą utworzyć pełny obraz agregatów tworzonych podczas fazy zarodkowania.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania monomerów i agregatów białka, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) doprowadzenie do kontaktu tioflawiny T i białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, z wytworzeniem mieszaniny tioflawina T - białko;

PL 241 595 B1

b) wylanie i równomierne rozprowadzenie mieszaniny wytworzonej w etapie a) na stałym podłożu oraz wysuszenie z uzyskaniem stałej warstwy;

c) naświetlanie stałej warstwy uzyskanej w etapie b) wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm² do 10 mJ/cm² z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej;

d) wyznaczenie parametrów wzmocnionej emisji spontanicznej, takich jak próg wzmocnienia światła, szerokość widma, intensywność oraz długość fali i

e) określenie postaci białka na podstawie parametrów wyznaczonych w etapie d).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywa się monomer lub agregat białka wybranego z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wykrywa się monomer lub agregat β-amyloidu.
4. Sposób według zastrz. 1-3, znamienny tym, że etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μM.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.
6. Sposób według zastrz. 4-5, znamienny tym, że stosuje się roztwór białka w buforze fosforanowym, wodzie, w tym wodzie destylowanej lub wodzie o pH 2.
7. Sposób według zastrz. 4-6, znamienny tym, że wytwarza się mieszaninę o stężeniu białka w zakresie od 1 mM do 1,5 mM.
8. Sposób według zastrz. 4-7, znamienny tym, że roztwór białka inkubuje się w temperaturze w zakresie od 30°C do 65°C przez okres czasu od 24 godzin do 13 dni przed zmieszaniem z roztworem tioflawiny T.
9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako roztwór tioflawiny T stosuje się bufor reakcyjny do zastosowania w metodzie RT-QuIC, zawierający rekombinowane białko pochodzenia ludzkiego, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, w stężeniu w zakresie od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml.
10. Sposób według zastrz. 4 i 9, znamienny tym, że jako roztwór białka stosuje się płyn mózgowordzeniowy.
11. Sposób według zastrz. 1-10, znamienny tym, że jako stałe podłoże w etapie b) stosuje się podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.
12. Sposób według zastrz. 1-11, znamienny tym, że suszenie w etapie b) przeprowadza się na powietrzu bądź na płycie grzewczej w temperaturze w zakresie od 27°C do 65°C, przez okres czasu od 5 minut do 1 godziny.
13. Sposób według zastrz. 1-12, znamienny tym, że uzyskuje się stałą warstwę o grubości w zakresie od 50 μm do 300 μm.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że uzyskuje się stałą warstwę o grubości w zakresie od 90 μm do 110 μm.
15. Sposób według zastrz. 1-14, znamienny tym, że stałą warstwę uzyskaną w etapie b) naświetla się wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 0,3 mJ/cm² do 3,3 mJ/cm².
16. Sposób według zastrz. 1-15, znamienny tym, że etapy a) do e) powtarza się w różnych punktach czasowych od momentu przygotowania roztworu białka do kilkunastu dni.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że odstępy pomiędzy różnymi punktami czasowymi wynoszą od kilkunastu minut do kilku dni.
18. Sposób według zastrz. 1-17, znamienny tym, że monomery i agregaty białka wykrywa się w próbkach krwi, próbkach płynu mózgowordzeniowego lub w próbkach tkanek pośmiertnych ssaka in vitro.
19. Sposób według zastrz. 1-18, znamienny tym, że wykrywa się takie postacie agregatów białka jak oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.
20. Sposób według zastrz. 1-19, znamienny tym, że stosuje się go do diagnozowania choroby związanej z agregacją białek.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się go do diagnozowania choroby związanej z agregacją β-amyloidu.

PL 241 595 B1
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się go do diagnozowania choroby wybranej z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, Parkinsona lub Creutzfeldta - Jakoba.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się go do diagnozowania choroby Alzheimera.
24. Zastosowanie tioflawiny T unieruchomionej w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do wykrywania monomerów i agregatów białka, przy czym tioflawina T jest unieruchomiona razem z białkiem, którego monomer lub agregat ma być wykrywany.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 50 μm do 300 μm.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 90 μm do 110 μm.
27. Zastosowanie według zastrz. 24-26, znamienne tym, że stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.
28. Zastosowanie według zastrz. 24-27, znamienne tym, że tioflawinę T stosuje się do wykrywania monomerów i agregatów białka w próbkach krwi, próbkach płynu mózgowordzeniowego lub w próbkach tkanek pośmiertnych ssaka in vitro.
29. Zastosowanie według zastrz. 24-28, znamienne tym, że agregaty białka są wybrane z grupy obejmującej oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.
30. Zastosowanie według zastrz, 24-29, znamienne tym, że białko jest wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że białkiem jest β-amyloid.
32. Tioflawina T unieruchomiona w postaci stałej warstwy na stałym podłożu do zastosowania w diagnozowaniu choroby związanej z agregacją białek, przy czym tioflawina T jest unieruchomiona razem z białkiem, którego agregacja jest związana z diagnozowaną chorobą.
33. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 32, znamienna tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 50 μm do 300 μm.
34. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 33, znamienna tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 90 μm do 110 μm.
35. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 32-34, znamienna tym, że stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.
36. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 32-35, znamienna tym, że diagnozowaną chorobą jest choroba związana z agregacją białka β-amyloidu.
37. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 36, znamienna tym, że diagnozowana choroba jest wybrana z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, Parkinsona lub Creutzfeldta - Jakoba.
38. Tioflawina T do zastosowania według zastrz. 37, znamienna tym, że diagnozowaną chorobą jest choroba Alzheimera.
39. Zestaw do wykrywania monomerów i agregatów białka, zawierający podłoże stałe oraz mieszaninę tioflawiny T i białka, którego monomer lub agregat ma być wykrywany, znamienny tym, że mieszanina jest w postaci warstwy stałej unieruchomionej na stałym podłożu.
40. Zestaw według zastrz. 39, znamienny tym, że białko jest wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe.
41. Zestaw według zastrz. 40, znamienny tym, że białkiem jest β-amyloid.
42. Zestaw według zastrz. 39-41, znamienny tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 50 μm do 300 μm.
43. Zestaw według zastrz. 42, znamienny tym, że stała warstwa ma grubość w zakresie od 90 μm do 110 μm.
44. Zestaw według zastrz. 39-43, znamienny tym, że stałym podłożem jest podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.
45. Zestaw według zastrz. 39-44, znamienny tym, że wykrywane agregaty są wybrane z grupy obejmującej oligomery, zagregowane oligomery i fibryle.
46. Sposób generacji wzmocnionej emisji spontanicznej tioflawiny T, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) unieruchomienie tioflawiny T na stałym podłożu, oraz

b) naświetlanie tioflawiny T unieruchomionej na stałym podłożu wiązką impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 1 mJ/cm² do 10 mJ/cm² z rejestrowaniem wzmocnionej emisji spontanicznej.

PL 241 595 B1
47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem polimeru, z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μM.
48. Sposób według zastrz. 47, znamienny tym, że jako roztwór polimeru stosuje się wodny roztwór poli(alkoholu winylowego) o stężeniu w zakresie od 5% (wag./obj.) do 10% (wag./obj.).
49. Sposób według zastrz. 47-48, znamienny tym, że stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.
50. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że etap a) przeprowadza się poprzez zmieszanie roztworu tioflawiny T z roztworem białka z wytworzeniem mieszaniny o stężeniu tioflawiny T w zakresie od 1 μM do 35 μM.
51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że stosuje się roztwór białka w buforze fosforanowym, wodzie, w tym wodzie destylowanej lub wodzie o pH 2.
52. Sposób według zastrz. 50-51, znamienny tym, że stosuje się roztwór tioflawiny T w wodzie destylowanej.
53. Sposób według zastrz. 50-52, znamienny tym, że wytwarza się mieszaninę o stężeniu białka w zakresie od 1 mM do 1,5 mM.
54. Sposób według zastrz. 50-53, znamienny tym, że roztwór białka inkubuje się w temperaturze w zakresie od 30°C do 65°C przez okres czasu od 24 godzin do 13 dni, przed zmieszaniem z roztworem tioflawiny T.
55. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że jako roztwór tioflawiny T stosuje się bufor reakcyjny do zastosowania w metodzie RT-QuIC, zawierający rekombinowane białko pochodzenia ludzkiego w stężeniu w zakresie od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml.
56. Sposób według zastrz. 50 i 55, znamienny tym, że jako roztwór białka stosuje się płyn mózgowordzeniowy.
57. Sposób według zastrz. 50-56, znamienny tym, że stosuje się białko wybrane z grupy obejmującej β-laktoglobulinę, insulinę, lizozym, β-amyloid, α-synukleinę lub białka prionowe.
58. Sposób według zastrz. 47-57, znamienny tym, że wytworzoną mieszaninę tioflawiny T wylewa się i równomiernie rozprowadza na stałym podłożu oraz suszy się z uzyskaniem stałej warstwy.
59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że suszenie przeprowadza się na powietrzu lub na płycie grzewczej w temperaturze w zakresie od 27°C do 65°C, przez okres czasu od 5 minut do 1 godziny.
60. Sposób według zastrz. 58-59, znamienny tym, że uzyskuje się stałą warstwę o grubości w zakresie od 50 μm do 300 μm.
61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że uzyskuje się stałą warstwę o grubości w zakresie od 90 μm do 110 μm.
62. Sposób według zastrz. 46-61, znamienny tym, że jako stałe podłoże w etapie a) stosuje się podłoże szklane lub podłoże kwarcowe.
63. Sposób według zastrz. 46-62, znamienny tym, że etap b) przeprowadza się z zastosowaniem wiązki impulsów laserowych o gęstości energii w zakresie od 0,3 mJ/cm² do 3,3 mJ/cm².