KR20080108563A - 과립구 항체 검출용 패널세포 - Google Patents

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리카 후루타
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요시타카 코지마
토루 미야자키
히사미 이케다
요시히사 와타나베
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니혼 세키쥬지샤
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Abstract

항-HNA를 검출하기 위한 패널세포가 개시되었다. 패널세포는 항-HNA 항원에 대응하는 HNA 항체를 코드화하는 DNA를 검출과정에서 사용하는 조건하에 DNA의 발현이 가능하도록 세포에 도입하여 얻어지고, 상기 DNA를 도입한 세포는 검출과정에서 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA-DP 항체, 항-HNA-1 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체, 항-HNA-5 항체 및 건강한 피험자의 혈청과 검출반응을 나타내지 않는다. 패널세포는 과립구 항체의 정확하고 신속한 검출이 가능하게 한다.
Figure P1020087025846
패널세포, 과립구, 항체, 항원

Description

과립구 항체 검출용 패널세포{PANEL CELL USED FOR GRANULOCYTE ANTIBODY DETECTION}
관련출원의 참조
본 특허출원은 선행 일본 특허출원 제2006-81236호(출원일: 2006년 3월 23일)을 기초로 우선권을 주장하는 출원이다. 일본 특허출원 제2006-81236호의 전체 내용은 본 명세서에서 참조로 통합된다.
기술분야
본 발명은 임상시험 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과립구(호중구) 감소증 및 수혈 부작용의 원인 중 하나라고 생각되는 혈청에서 과립구 항원에 대한 항체(과립구 항체)를 정확하고 신속하게 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용되는 패널세포(panel cell)에 관한 것이다.
최근 몇년 동안, 여러 가지 임상 상황에서 과립구(호중구) 항체가 관여하는 질환이 보고되고 있다. 동종(isoantibody) 항체가 관여하는 질환은 동종면역성 신생아 호중구 감소증, 조혈 모세포 이식후 동종면역성 호중구 감소증, 과립구 수혈 불응화, 수혈-관련 급성 폐 손상, 비용혈성 수혈 부작용 등을 포함한다. 또한, 자기 항체(autoantibody)가 관여하는 질환은 원발성 자기면역성 호중구 감소증, 2차 성 자기면역성 호중구 감소증 등을 포함한다. 이러한 질환 중에는, 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체가 과립구 항체에 수반하여 나타날 수 있으므로, 이러한 항체를 정확하고 신속하게 판별하고 동정하는 검사방법이 요구된다.
과립구 항체의 검사는 일반적으로: 혈액 과립구를 패널세포(검출용 세포)로 사용하는 유세포분석기(flow cytometer)에 의해 과립구 항체를 검출하는 방법(GIFT); 과립구의 응집을 지표로 사용하는 방법(GAT); 최종 항원-항체 복합체를 판정하기 위하여 혈청 및 마우스 단일클론성 항체를 과립구와 반응시키는 방법(MAIGA); 그 위에 고정화된 과립구(또는 과립구 추출 항원)를 가지는 플레이트를 사용하고, 결합된 항체와 항-인간 IgG 감작(sensitive) 혈구의 응집을 지표로 판정하기 위하여 플레이트를 시료에 반응시키는 방법(MPHA); MPHA에 포함된 검출 단계를 표지-항체를 사용하여 수행하는 방법(EIA) 등을 이용한다. 인간 과립구를 사용하는 방법에서, 혈액 제공자로부터 혈액을 추출하여 모든 검사에서 얻은 혈액으로부터 과립구를 분리하기 때문에, 과립구 항체와의 반응성은 개체 차이가 발생한다. 또한, 인간 과립구를 패널세포로 사용하는 방법에서, 유세포분석기 등을 통한 측정결과는 높은 백그라운드(background)를 나타내고 그 백그라운드의 높이도 각각의 과립구에 따라 다르기 때문에 안정되고 정확한 검사 결과를 얻은 것은 어렵다. 따라서, 안정되고 정확한 검사 결과를 얻을 수 있는 과립구 항체 검출용 패널세포 균주의 개발이 요구된다.
지금까지, 많은 국내외 연구자들이 과립구 항체 검출용 패널세포 균주의 개발을 시도해 왔다. Justus Liebig University의 J.Bux 등은 과립구 항원으로서 HNA-1a, HNA-1b 및 HNA-SH를 코팅하는 유전자를 CHO 세포(Chinese hamster ovary cell line)에 감염시킴으로서, 이들 항원을 발현하는 패널세포 균주를 제조하였다(Blood, vo1.93, N0.1, 1999: pp357-362). 또한, Hokkaido Red Cross Blood Center의 Miyazaki 등은 HNA-2a를 발현하는 293T 세포(Human kidney cell line)(Japanese Journal of Transfusion Medicine51, 2, 2005: pp188)뿐만 아니라, HNA-la 및 HNA-1b를 발현하는 CHO 세포 및 COS-7 세포(African green monkey kidney cell line)(Japanese Journal of Transfusion Medicine 50, 2, 2004: pp297)도 제조하였다.
발명의 요약
본 발명자들은 HNA 항원을 코드화하는 DNA를 발현가능한 형태로 항-HLA 항체, 항-HNA 항체 및 정상 피험자의 혈청과 반응하지 않는 세포에 결합(incorporate)시킨 패널세포를 이용하여 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 혈청 과립구 항체를 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초한 것이다.
따라서. 본 발명의 목적은 과립구 항체를 정확하고 신속하게 검출 할 수 있는 패널세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 패널세포는 검출 과정에서 사용하는 조건하에 DNA의 발현이 가능하도록 상기 항-HNA 항체에 대응하는 HNA 항원을 코드하는 상기 DNA를 세포에 도입하여 얻어지는 상기 항-HNA 항체를 검출하는 패널세포로서, 상기 DNA 도입용 세포는 검출 과정에서 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA-DP 항체, 항-HNA-1 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체, 항-HNA-5 항체 및 정상 피험자의 혈청과 검출 반응을 나타내지 않는다.
본 발명에 따르면, 낮은 백그라운드 수준을 갖는 과립구 항체의 검출에서 안정되고 정확한 검사 결과를 얻을 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서 유전자 도입의 대상이 되는 세포는 검출 과정에서 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA-DP 항체, 항-HNA-1 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체, 항-HNA-5 항체 및 건강한 피험자의 혈청과 검출 반응을 나타내지 않는 세포이다. 본 명세서에서 사용된 표현 "검출 과정에서 검출 반응을 나타내지 않는다" 란 항-HNA 항체를 검출하는데 사용되는 과정에서 각 항체 또는 혈청과 반응하지 않거나 검출 한계 이하의 반응을 나타내는 세포를 의미한다. 이와 같은 조건을 만족시키는 세포는 상기 기재된 항체 및 혈청과의 반응성을 검사함으로써 결정될 수 있다. 그러한 세포는 바람직하기는 포유동물 세포, 보다 바람직하기는 비접착성 세포로부터 선택된다. 상기 조건을 만족시키는 세포는 골수성 백혈병 세포인 K562 세포(ATCC No. CCL-243, RCB No. of Cell Bank in Riken Bioresource Center: RCB0027)를 포함한다.
본 발명에 따른 패널세포는 검출 과정에서 사용하는 조건하에 DNA의 발현이 가능하도록, 검출될 항-HNA 항체에 대응하는 HNA 항원을 코드하는 상기 DNA를 상기 기재된 세포에 도입시킴으로써 제조된다.
인간 과립구 항원은 각각 항-HNA-1a 항체, 항-HNA-1b 항체, 항-HNA-1SH 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4a 항체 및 항-HNA 5a 항체에 대응하는 HNA-1a 항원, HNA-1b 항원, HNA-1SH 항원, HNA-2a 항원, HNA-3a 항원, HNA-4a 항원 및 HNA-5a 항원을 포함하고, 검출될 항체에 따라 선택된다. 또한, 항-HNA-4b 항체 또는 항-HNA-5b 항체에 대응하는 HNA-4b 항원 또는 HNA-5b 항원과 같은 인간 과립구 항원을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-1a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-1a 항원이다. HNA-1a 항원을 코드하는 DNA로서, HNA-1a 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게는 이용될 수 있다. HNA-1a 항원 유전자의 cDNA는 DNA는 SEQ ID NO:2로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:1로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. HNA-1a 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:1의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-1b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-1b 항원이다. HNA-1b 항원을 코드하는 DNA로서 HNA-1b 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. HNA-1b 항원 유전자의 cDNA는 SEQ ID NO:4로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:3으로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. HNA-1b 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:3의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-2a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-2a 항원이다. HNA-2a 항원을 코드하는 DNA로서 HNA-2a 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. HNA-2a 항원 유전자의 cDNA는 SEQ ID NO:6으로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:5로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. HNA-2a 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:5의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-4a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4a 항원이다. HNA-4a 항원은 CD11bMart(+) 항원과 CD18 항원과의 복합체이다. HNA-4a 항원을 코드하는 DNA로서 CD11bMart(+) 항원 유전자 및 CD18 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. CD11bMart(+) 항원 유전자의 cDNA는 SEQ ID NO:8로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:7로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. CD18 항원 유전자의 cDNA의 뉴크레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOS:15 및 16으로 표현된다. HNA-4a 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:15의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-4b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4b 항원이다. HNA-4b 항원은 CD11bMart(-) 항원과 CD18 항원의 복합체이다. HNA-4b 항원을 코드하는 DNA로서, CDllbMart(-) 항원 유전자 및 CD18 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. CD11bMart(-) 항원 유전자의 cDNA는 SEQ ID NO:10으로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:9로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함되는 DNA를 포함한다. CD18 항원 유전자의 cDNA의 뉴크레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOS:15 및 16로 표현된다. HNA-4b 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:15의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-5a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5a 항원이다. HNA-5a 항원은 CD11aOnd(+) 항원과 CD18 항원의 복합체이다. HNA-5a 항원을 코드하는 DNA로서, CD11aOnd(+) 항원 유전자 및 CD18 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. CD11aOnd(+) 항원 유전자의 cDNA는 DNA는 SEQ ID NO:12로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:11로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. CD18 항원 유전자의 cDNA의 뉴크레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOS:15 및 16으로 표현된다. HNA-5a 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:15의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 검출될 항-HNA 항체는 항-HNA-5b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5b 항원이다. HNA-5b 항원은 CD11aOnd(-) 항원과 CD18 항원의 복합체이다. HNA-5b 항원을 코드하는 DNA로서, CD11aOnd(-) 항원 유전자 및 CD18 항원 유전자의 게놈 DNA 또는 cDNA가 바람직하게 이용될 수 있다. CD11aOnd(-) 항원 유전자의 cDNA는 SEQ ID NO:14로 표현되는 아미노산 서열을 코드화하는 SEQ ID NO:13로 표현되는 뉴크레오티드 서열을 포함한다. CD18 항원 유전자의 cDNA의 뉴크레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOS:15 및 16으로 표현된다. HNA-5b 항원 유전자의 cDNA는 예를 들면, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:15의 5'-말단 및 3'-말단 부분의 서열을 기초로 하여 설계된 프라이머를 이용하고 항원을 발현하는 세포로부터 얻은 mRNA를 주형으로 사용하는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다.
상기 DNA를 발현가능한 형태로 세포에 도입시키는 방법은 당해 기술분야에서 주지된 표준 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포에서 작용하는 프로모터를 가지는 벡터에 목적 DNA를 결합시키고, 이에 따라 얻어진 발현벡터을 이용해서 세포를 형질변환시킬 수 있다. 프로모터로서, 구성 프로모터, 유도 프로모터 등과 같은 어느 종류의 프로모터가 사용될 수 있고, 포유동물 세포에서 강력한 활성을 나타내는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터가 바람직하게 사용될 수 있다. 벡터로서 세포에서 DNA를 발현시킬 수 있는 여러 가지 발현벡터가 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에서 HNA 항원을 코드하는 DNA는 바람직하게 세포의 게놈에 결합되고, 본 목적을 위해 아데노(adeno)-관련 바이러스 벡터 및 레트로바이러스(retrovirus) 벡터가 적합하게 사용된다. 예를 들면, IRES 유전자를 통해 상기 DNA 하류에 약제 내성 유전자(예를 들면, 퓨로마이신(puromycin) 내성 유전자) 단편을 레트로바이러스 벡터에 결합시킬 수 있다. 재조합 바이러스 형태인 최종 벡터는 세포를 감염시키는데 사용될 수 있기 때문에, 상기 DNA의 발현이 가능하도록 세포에 도입시킬 수 있다. 이 방법에 따르면, 레트로바이러스 벡터를 이용하여 목적 유전자를 안전하게 세포 염색체에 도입할 수 있고, 또한 IRES 유전자를 통해 목적 유전자를 안전하게 약물에 존재하는 살아있는 세포에서 발현시킬 수 있다.
본 발명에 따른 패널세포는 시료 중 항-HNA 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 하기의 단계로 이루어진 시료 중 항-HNA 항체의 검출 방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계 (b) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 준비하는 단계 (c) 상기 시료를 상기 패널세포에 접촉시키고, 상기 항-HNA 항체와 상기 패널세포의 결합을 검출하는 단계. 시료로서 항체를 함유하는 시료, 특히 혈액 또는 혈청 시료가 적절하게 사용된다.
패널세포와 항-HNA 항체의 결합은 예를 들면, 유세포분석기를 이용하는 방법(GIFT), 패널세포의 응집을 지표로 사용하는 방법(GAT), 혈청과 마우스 단일클론성 항체를 과립구와 반응시고, 최종 항원-항체 복합체를 결정하는 방법(MAIGA), 거기에 고정화한 과립구(또는 과립구 추출 항원)를 가지는 플레이트를 이용하고 결합된 항체 및 항-인간 IgG 감작 혈구(또는 감작 비드)의 응집을 지표로 판단하여 시료를 플레이트와 반응시키는 방법(MPHA), MPHA에 포함된 검출 단계를 표지된 항체로 수행하는 방법(EIA)등을 포함하는 당해 기술분야에서 공지된 방법으로 검출된 수 있다. 패널세포와 항-HNA 항체와의 결합은 바람직하기는 유세포분석기를 통해 검출된다.
상기 기재된 항-HNA 항체의 검출법에서, 본 발명에 따른 패널세포는 담체에 고정화된 형태로 사용될 수 있다. 담체는 폴리스틸렌과 같은 열가소성 합성수지로 된 플레이트나 비드(bead)가 바람직하나 니트로셀룰로스 및 나일론 필터, 유리 섬유, 유리 비드, 자성 비드, 유기 고분자 비드, 미생물, 혈구, 세포막 단편 등도 사용될 수 있다. 유기 고분자 비드는 예를 들면, 불용성 아가로스, 셀룰로스 및 불용성 덱스트란과 같은 천연 고분자 입자 및 폴리스틸렌과 같은 열가소성 합성수지 비드를 포함한다. 열가소성 합성수지는 폴리스틸렌 이외에도 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴/스틸렌 수지, 아크릴로니트릴/부타디엔/스틸렌 수지, 메타크릴 수지, 염화비닐 등을 포함한다.
세포는 전처리 없이 혼합하여 물리화학적 변형 또는 결합제의 사용에 의해, 공유결합, 이온결합, 반데르발스(van der Waals) 결합, 수소결합, 금속결합, 기계적 결합 및 자력 결합과 같은 물리화학적 결합 또는 항원-항체 결합, 수용체-리간드 결합, 수용체-리간드 결합, 효소-기질 결합 및 핵산의 상보적인 결합과 같은 생물학적 결합을 통하여 담체상에 고정화될 수 있다.
항-HNA 항체의 검출 방법에서, 본 발명에 따른 패널세포는 항-HNA 항체를 검출하는 시약 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 패널세포를 포함하는 항-HNA 항체를 검출하는 시약을 제공한다. 본 발명에 따른 시약에서, 패널세포는 상기 기재된 담채에 고정화되는 것일 수 있다.
또한, 항-HNA 항체가 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 또한 하기의 단계로 이루어진 피험자, 특히 인간 피험자의 항-HNA 항체가 관여하는 질환을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다: (a) 상기 피험자로부터 유래된 혈청 시료를 준비하는 단계; (b) 본 발명에 따른 패널세포를 준비하는 단계, 그리고 (c) 상기 혈청 시료를 상기 패널세포에 접촉시키고, 상기 항-HNA 항체와 상기 패널세포의 결합을 검출하는 단계. 항-HNA 항체와 패널세포의 결합의 검출은 상기 기재된 바와 같다. 항-HNA 항체가 관여하는 질환은 동종면역성 신생아 호중구 감소증, 조혈 모세포 이식후 동종면역성 호중구 감소증, 과립구 수혈 불응화, 수혈-관련 급성폐 손상, 원발성 자기면역성 호중구 감소증, 이차성 자기면역성 호중구 감소증 및 비용혈성 수혈 부작용을 포함한다. 또한, 상기 기재된 본 발명에 따른 시약은 이들 질환을 검출 또는 진단하는 시약 역할을 한다.
게다가. 본 발명에 따른 패널세포는 각종 HNA 항원의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 패널세포를 배양하고 배양물로부터 HNA를 단리하는 단계를 포함하는 HNA 항원의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 패널세포는 상기 기재한 바와 같이 시료 중 항-HNA 항체를 검출하고 피험자(특히 인간 피험자)의 항-HNA 항체가 관여하는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 시료 중 항-HNA 항체를 검출하기 위한 본 발명에 따른 패널세포의 용도 및 항-HNA 항체를 검출하기 위한 시약의 제조에서 본 발명에 따른 패널세포의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자(특히 인간 피험자)의 항-HNA 항체가 관여하는 질환을 진단하기 위한 시약의 제조에서 본 발명에 따른 패널세포의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는바 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 HNA 유전자를 세포에 도입하는 벡터의 구조를 나타낸다.
도 2는 KY-la 세포 및 KY-1b 세포의 HNA 발현을 분석하기 위한 유세포분석기의 결과를 나타낸다.
도 3은 KY-la 세포를 패널세포로 사용하는 유세포분석기에 의한 인간혈청에서 항-HNA 항체의 검출을 나타낸다.
도 4는 KY-1b 세포를 패널세포로 사용하는 유세포분석기에 의한 인간혈청에서 항-HNA 항체의 검출을 나타낸다.
도 5는 KY-2a 세포의 HNA 발현을 분석하기 위한 유세포분석기의 결과를 나타낸다.
도 6은 KY-2a 세포를 패널세포로 사용하는 유세포분석기에 의한 인간혈청에서 항-HNA 항체의 검출을 나타낸다.
도 7은 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포의 HNA 발현을 분석하기 위한 유세포분석기의 결과를 나타낸다.
도 8은 CD11a 유전자 및 CD11b 유전자의 다형성(polymorphism)을 나타낸다.
도 9는 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포, KY-5b 세포 및 KY-mock pn 세포에서 도입유전자의 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포, KY-5b 세포 및 KY-mock pn 세포에서 대조(control) 유전자(G3PDH)의 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.
참고예 1: 세포의 선택
패널세포의 제조에 사용되는 세포균주를 선택하기 위하여 5개의 접착성 세포(Hela 세포, 293T 세포, COS-7 세포, 3T3 세포 및 CHO 세포)뿐 아니라 6개의 비접착성 세포(K562 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, Namalwa 세포, CMK 세포 및 L 세포)에 대해서도 다음의 시험을 실시하였다. 먼저, 각 세포의 백그라운드 증가를 확인하기 위하여 각 세포와 3개의 건강한 인간 혈청(정상 혈청)의 반응성을 유세포분석기로 측정하였다. 다음에, 각 세포의 백그라운드 증가를 확인하기 위하여 각 세포와 항-HLA 항체(항-HLA-ABC 항체 및 항-HLA-DR 항체) 또는 항-HNA 항체(항-HNA-1 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체 및 항-HNA-5 항체)의 반응성을 플루오레세인(FITC) 및 피코에리트린(PE)와 같은 항체 표지를 지표로 사용하는 유세포분석기로 측정하여 였다. 또한, K562 세포에 대해서는 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체 및 항-HLA-DP 항체 혼합물과 반응성을 확인하였다. 상기 시험에서, 항-HNA-3a 항체와 세포의 반응성은 항-HNA-3a 혈청을 이용해서 확인하고, 다른 항체와의 반응성은 각 단일클론성 항체를 이용하여 확인하였다. 이 결과를 표 1에 나타냈다.
Figure 112008073375096-PCT00001
표 1에 나타낸 바와 같이, L 세포, Hela 세포, 293T 세포, 3T3 세포 및 CHO 세포는 정상 혈청과 높은 반응성을 나타냈다. 한편, 5개의 비접착성 세포(K562 세포, Jurkat 세포, THP-l 세포, Namalwa 세포 및 CMK 세포) 및 하나의 접착성 세포(COS-7 세포)는 거의 정상 혈청과 반응성을 나타내지 않았다. 또한, 정상 혈청과 반응성을 나타내지 않는 세포 중, K562 세포는 항-HLA 항체 또는 항-HNA 항체 어느 것에 대해서도 반응성을 나타내지 않았다. 따라서, HNA 유전자가 도입될 세포로서 K562 세포를 선택하였다.
실시예 1: HNA-1a, HNA-1b 및 HNA-2a의 각 항원을 발현하는 세포의 제조
HNA-la 항원, HNA-1b 항원 및 HNA-2a 항원의 각 cDNA를 HNA-1a/a, HNA-lb/b 또는 HNA-2a/a 유전자형을 가지는 건강한 피험자로부터 얻은 말초 단핵구로부터 각각 제조하였다. 구체적으로, RT-PCR에 의해 cDNA를 합성하기 위하여 각각의 세포로부터 전 RNA를 추출하였다. HNA-1a 유전자, HNA-1b 유전자 또는 HNA-2a 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위하여 얻어진 cDNA를 시판중인 플라스미드 pCR2.1-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 크로닝하였다. HNA-1a의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2로 나타냈다. HNA-1b의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로 나타냈다. HNA-2a의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 나타냈다.
그 다음, 각각의 cDNA를 시판중인 레트로바이러스 벡터 pQCXIP(Becton Dickinson, SanJose, CA)의 BamHI 부위와 NotI 부위 사이에 서브크로닝하였다. HNA-la, HNA-1b 및 HNA-2a의 cDNA를 함유하는 벡터를 각각 pQCXIP-1a, pQCXIP-1b 및 pQCXIP-2a로 명명하였다. 이들 벡터의 구조를 도 1에 나타냈다.
그 다음, Lipofetamine Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 그것의 표준 프로토콜(protocol)에 따라, pVSV-G(Becton Dickinson)뿐 아니라 pQCXIP-1a, pQCXIP-1b 또는 pQCXIP-2a를 gp-293T 패키지 세포균주(Becton Dickinson)에 감염시켰다. 또한, HNA 유전자를 함유하지 않은 pQCXIP만 도입한 다른 세포 균주도 유사한 과정으로 제조하였다.
105입자/ml의 재조합 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 얻기 위하여 상기 감염된 gp-293T 세포를 48시간 배양하였다. 0.9ml의 감염용 배지(8㎍/ml의 최종 농도에서 폴리브렌(polybrene)을 첨가한 10% FBS-함유 RPMI1640 배지)에서 현탁된 1 x 106개의 K562 세포를 상청액 0.1ml에 첨가하고, 그 혼합물을 2시간 배양한 후, R10 배지(10% FBS-함유 RPMI1640 배지)에서 2회 세정하고, 그 후 R10 배지에서 2일간 배양하였다. 그 다음, 벡터만이 도입된 KY-mock 세포뿐 아니라 HNA-la, HNA-1b 및 HNA-2a를 각각 발현하는 KY-1a 세포, KY-lb 세포 및 KY-2a 세포를 얻기 위하여 재조합 바이러스로 감염된 세포 중 퓨로마이신-내성 세포를 한계희석(limiting dilution)법으로 크로닝하였다.
실시예 2: HNA-4a, HNA-4b, HNA-5a 및 HNA-5b의 각 항원을 발현하는 세포의 제조
HNA-4a 항원, HNA-4b 항원, HNA-5a 항원 및 HNA-5b 항원의 각 cDNA를 HNA-4a/a, HNA-4b/b, HNA-5a/a 또는 HNA-5b/b 유전자형을 가지는 건강한 피험자로부터 얻은 말초 단핵구로부터 각각 제조하였다. 구체적으로, RT-PCR에 의해 cDNA를 합성하기 위하여 각각의 세포로부터 전 RNA를 추출하였다. CD11bMart(+) 유전자(HNA-4a의 다형성을 결정함), CD11bMart(-) 유전자(HNA-4b의 다형성을 결정함), CD11aOnd(+) 유전자(HNA-5a의 다형성을 결정함), CD11aOnd(-) 유전자(HNA-5b의 다형성을 결정함) 및 CD18 유전자(HNA-4 및 HNA-5에서 공통적으로 발현됨)의 DNA 서열을 확인하기 위하여 얻어진 cDNA를 시판중인 플라스미드 pCR2.1-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 크로닝하였다. CD11bMart(+)의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 나타냈다. CD11bMart(-)의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로 나타냈다. CD11aOnd(+)의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12로 나타냈다. CD11aOnd(-)의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 나타냈다. CD18의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16로 나타냈다.
그 다음, CD11bMart(+), CDllbMart(-), CDllaOnd(+) 및 CDllaOnd(-)의 cDNA를 pQCXIP의 PadI 부위와 NotI 부위 사이에 서브크로닝하였다. 벡터를 각각 pQCXIP-CD11bMart(+), pQCXIP-CD11bMart(-), pQCXIP-CDl1aOnd(+) 및 pQCXIP-CD11aOnd(-)로 명명하였다. 또한, CD18의 cDNA를 시판중인 레트로바이러스 벡터 pQCXIN(pQCXIP의 퓨로마이신 내성 유전자를 네오마이신(neomycin) 내성 유전자와 치환한 pQCXIP와는 구별됨, Becton Dickinson, SanJose, CA)의 PacI 부위와 NotI 부위 사이에 서브크로닝하고, 벡터를 pQCXIN-CD18로 명명하였다. 이들 벡터의 구조 를 도 1에 나타냈다.
그 다음, pQCXIN-CD18 및 pVSV-G(Becton Dickinson)뿐 아니라 pQCXIP-CD11bMart(+), pQCXIP-CD11bMart(-), pQCXIP-CD11aOnd(+) 또는 pQCXIP-CD11aOnd(-)를 Lipofetamine Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 그것의 표준 프로토콜에 따라 gp-293T 패키지 세포균주(Becton Dickinson)에 감염시켰다. 또한, HNA 유전자를 함유하고 있지 않은 pQCXIP 또는 pQCXIN만 도입된 세포 균주도 유사한 과정으로 제조하였다.
105입자/ml의 재조합 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 얻기 위하여 감염된 gp-293T 세포를 48시간 배양하였다. pQCXIP-CD11bMart(+), pQCXIP-CD 11bMart(-), pQCXIP-CDllaOnd(+) 또는 pQCXIP-CDl1aOnd(-)를 감염시킨 gp-293T 세포의 배양 상청액 0.1ml에 pQCXIN-CD18를 유전자를 감염시킨 gp-293T 세포의 배양 상청액 0.1ml를 첨가하고, 0.8ml의 감염용 배지(최종 농도 8㎍/ml에서 폴리브렌이 첨가된 10% FBS-함유 RPM11640 배지)에서 현탁된 1 x 106개의 K562 세포를 가하여, 그 혼합물을 2시간 동안 혼합한 다음 R10 배지(lO% FBS-함유 RPM 11640 배지)에서 두회 세정하고, R10 배지에서 2일간 배양하였다. 그 다음, HNA-4a, HNA-4b, HNA-5a 및 HNA-5b를 발현하는 각각의 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포를 얻기 위하여 재조합 바이러스를 감염시킨 세포 중 퓨로마이신-내성 및 네오마이신-내성 세포를 한계희석법으로 크로닝하였다. 벡터(pQCXIP 및 pQCXIN)만 도입한 KY-mock pn도 제조하였다.
실시예 3: 유세포분석기(FCM)에 의한 분석
(1) KY-1a 세포 및 KY-1b 세포의 HNA 발현 조사
KY-1a 세포, KY-1b 세포 및 KY-mock 세포를 플루오레세인(FITC)로 표지된 FITC-TAG1(HNA-1a 항원에 대한 단일클론성 항체) 또는 FITC-TAG2(HNA-1b 항원에 대한 단일클론성 항체)와 함께 4℃에서 15분간 배양하였다. 그 후, 각 세포와 각 항체의 결합을 유세포분석기(FCM)로 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타나 있는 각 패널에서는, 좌측에 나타낸 항체를 이용해서 얻은 그래프 및 대조군으로서 동일한 아이소타입(isotype)을 갖는 마우스 IgG을 이용해서 얻은 그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 죄측의 그래프가 마우스 IgG을 이용해서 얻어진 것이다. 도 2는 거기에 도입된 HNA-1a 유전자를 가지는 KY-1a 세포가 항-HNA-1a하고만 반응하며, 따라서 HNA-la 항원을 특이적으로 발현한다는 것을 나타낸다. 또한, HNA-1b 유전자가 도입된 KY-1b 세포는 항-HNA-1b하고만 반응하며, 따라서 HNA-1b 항원을 특이적으로 발현한다는 것을 나타낸다. 대조군으로서 KY-mock 세포에서는 비-특이적 반응을 나타내지 않았다.
(2) KY-1a 세포 및 KY-1b 세포를 패널세포로 이용하여 인간 혈청에서의 항-HNA 항체 검출
10개의 항-HLA 항체 양성 혈청 및 20개의 정상 혈청과 KY-1a 세포, KY-1b 세포 및 KY-mock 세포의 반응성을 유세포분석기(FCM)를 통해 조사하였다. 그 결과, 어느 세포도 이들 혈청과 반응하지 않았다.
그 다음, 항-HNA-1a 항체를 함유하는 2개의 혈청(항-HNA-la 혈청) 또는 항- HNA-1b 항체를 함유하는 3개의 혈청(세개의 혈청 중 한개는 항-HLA 등급(class) I 항체를 함유함)(항-HNA-1b 혈청)과 KY-1a 세포, KY-1b 세포 및 KY-mock 세포의 반응성을 유세포분석기(FCM)를 통해 조사하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타냈다.
도 3은 KY-1a 세포에 대한 결과를 나타낸다. 도 3에 나타나 있는 각 패널에서는, KY-1a 세포를 이용해서 얻어진 그래프 및 대조군으로서 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 왼쪽의 그래프가 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 것이다. 도 3은 KY-1a 세포가 항-HNA-1a 혈청하고만 반응하고 또한 그 반응 강도는 혈청 중 항-HNA-1a 항체의 농도에 의존한다는 것을 나타낸다.
도 4는 KY-1b 세포에 대한 결과를 나타낸다. 도 4에 나타나 있는 각 패널에서는, KY-1b 세포를 이용해서 얻어진 그래프 및 대조군으로서 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 왼쪽의 그래프가 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 것이다. 도 4는 KY-1b 세포가 항-HNA-1b 혈청하고만 반응하고 또한 그 반응 강도는 혈청 중 항-HNA-1b 항체의 농도에 의존한다는 것을 나타낸다.
(3) KY-2a 세포에서 HNA 발현의 검사
KY-2a 세포를 플루오레세인(FITC)으로 표지된 FITC-TAG1, FITC-TAG2, FITC-TAG3(HNA-1 항원에 대한 단일클론성 항체), FITC-TAG 4(HNA-2a 항원에 대한 단일클론성 항체)와 함께 4℃에서 15분간 배양하였다. 그 후, KY-2a 세포 및 각 항체의 결합을 유세포분석기(FCM)를 통하여 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타나 있는 각 패널에서는, 상측 칼럼에 나타낸 항체를 이용해서 얻어진 그래프 및 대조군으로서 동일한 아이소타입을 갖는 마우스 IgG을 이용해서 얻어진 그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 왼쪽 그래프가 마우스 IgG을 이용해서 얻어진 것이다. 도 5는 HNA-2a 유전자가 도입된 KY-2a 세포가 항-HNA-2a하고만 반응하고 따라서 HNA-2a 항원을 특이적으로 발현하는 것을 나타낸다.
(4) KY-2a 세포를 패널세포로서 이용하여 인간 혈청 중 항-HNA 항체의 검출
10개의 항-HLA 항체 양성 혈청 및 20개의 정상 혈청과 KY-2a 세포의 반응성을 유세포분석기(FCM)를 통하여 조사하였다. 그 결과, KY-2a 세포는 이들 혈청과 반응하지 않았다.
그 다음, 2개의 항-HNA-1a 혈청, 3개의 항-HNA-1b 혈청 또는 2개의 항-HNA-2a 항체-함유 혈청(항-HNA-2a 혈청)과 KY-2a 세포 및 KY-moc k 세포의 반응성을 유세포분석기(FCM)를 통하여 조사하였다. 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타나 있는 각 패널에서는, KY-2a 세포를 이용해서 얻어진 그래프 및 대조군으로서 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 왼쪽의 그래프가 KY-mock 세포를 이용해서 얻어진 것이다. 도 6은 KY-2a 세포가 항-HNA-2a 혈청하고만 반응하고 또한 그 반응 강도는 혈청 중 항-HNA-2a 항체의 농도에 의존하는 것을 나타낸다.
(5) KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포에서의 HNA 발현 조 사
KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포를 플루오레세인 이소시아네이트(FITC)로 표지된 FITC-CD11a 항체(HNA-5 항원에 대한 단일클론성 항체) 또는 FITC-CD11b 항체(HNA-4 항원에 대한 단일클론성 항체) 및 피코에리드린(PE)으로 표지된 CD18 항체(HNA-4 항원은 CDllb와 CD18의 복합체이고, HNA-5 항원은 CDlla와 CD18의 복합체임. CD18 항체는 HNA-4 항원과 HNA-5 항원의 공통 CD18에 대한 단일클론성 항체임)와 함께 4℃에서 15분간 배양하였다. 그 후, 각 세포와 각 항체의 결합을 유세포분석기(FCM)를 통해 검사하였다. 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타나 있는 각 패널에서는, 왼쪽에 나타낸 항체를 이용해서 얻어진 막대그래프(histogram) 및 대조군으로서 동일한 아이소타입을 갖는 마우스 IgG을 이용해서 얻어진 막대그래프를 나타낸다. 이들 2개의 그래프가 겹쳐지지 않은 경우, 왼쪽의 막대그래프가 마우스 IgG을 이용해서 얻어진 것이다. 도 7은 HNA-4a 유전자가 도입된 KY-4a 세포 또는 HNA-4b 유전자가 도입된 KY-4b 세포가 nHNA-4 항체(CD11b)하고만 반응하며 따라서 HNA-4a 항원 또는 HNA-4b 항원을 특이적으로 발현한다는 것을 나타낸다. 또한, HNA-5a 유전자가 도입된 KY-5a 세포 또는 HNA-5b 유전자가 도입된 KY-5b 세포는 항-HNA-5 항체(CD11a)하고만 반응하고 따라서 HNA-5a 항원 또는 HNA-5b 항원을 특이적으로 발현한다는 것을 나타낸다. 또한, HNA-4 항원 및 HNA-5 항원의 공통 CD18 분자의 발현도 CD18 항체를 통해 확인하였다.
실시예 4: KY-1a 세포, KY-1b 세포 및 KY-2a 세포의 항원 발현의 안정성
실시예 1에서 제조된 KY-1a 세포, KY-1b 세포 및 KY-2a 세포의 유전자 발현 (항원 발현)의 안정성을 검사하였다. 구체적으로, 최종 농도 0.5㎍/ml에서 퓨로마이신을 첨가한 R10 배지에 상기 3종류의 세포를 배양하고, 이들 세포에서의 항원 발현을 각 항원에 대한 단일클론성 항체(FITC-TAG1, FITC-TAG2 및 FITC-TAG4)를 이용하는 유세포분석기(FCM)를 통해 시간대비속력(function of time)으로 측정하였다. 제조 후 O, 1, 3, 6개월에서 KY-la 세포 및 KY-1b 세포의 항원 발현에 대한 변화는 없고 높은 안정성을 나타냈다. 또한, KY-2a 세포도 제조 후 3개월까지 안정적으로 항원을 발현하고 있었다.
실시예 5: RT-PCR을 이용하는 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포에서의 도입 유전자 발현의 확인
실시예 2에서 제조된 KY-4a 세포, KY-4b 세포, KY-5a 세포 및 KY-5b 세포에서의 도입 유전자 발현을 RT-PCR을 통해 조사하였다. 즉, 각각의 세포로부터 전 RNA를 추출하고, RT-PCR을 통해 cDNA를 합성하고, HNA-4(CD11b 항원에 존재) 또는 HNA-5(CD11a 항원에 존재)의 다형성을 결정하는 부위를 함유하는 뉴크레오티드 서열을 특이적 프라이머로 증폭시키고, 다형성에 의한 뉴크레오티드 서열의 차이를 제한효소의 절단으로 얻어진 단편화 패턴을 통해 판별하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, HNA-4 항원을 코드화하는 유전자(CD11b)는 제한효소 AciI의 2개의 절단부위를 가지는 HNA-4a 유전자 및 동일한 절단부위를 1개 밖에 갖지 않는 HNA-4b 유전자의 다형성을 나타낸다. 또한, HNA-5 항원을 코드화하는 유전자(CD11a)는 제한효소 Bsp1286I의 2개의 절단부위를 가지는 HNA-5a 유전자 및 동일한 절단부위를 1개 밖에 갖지 않는 HNA-5b 유전자의 다형성을 나타낸다. 각 세포 로부터 제조한 RT-PCR 증폭산물을 제한효소로 절단한 후 전기영동을 수행하였다. 그 결과를 도 9에 나타냈다.
도 9에 나타낸 바와 같이, HNA-4a 유전자 또는 HNA-4b 유전자가 도입된 KY-4a 세포 또는 KY-4b 세포로부터 합성된 cDNA를 주형로 해서 다형성 부위를 특이적으로 증폭시키는 프라이머로 PCR를 수행하였다. 그 결과, 특이적인 증폭산물이 관찰되었다(CD11b, RT+, enzyme-). 이 증폭산물은 KY-mock pn의 cDNA를 갖는 PCR에서는 관찰되지 않았다. 또한, 이 증폭산물을 제한효소 AciI로 절단하면, HNA-4a 유전자를 도입한 KY-4a 세포에서 각각 272bp, 208bp 및 124bp에 대응하는 3개의 밴드(2개의 절단부위)가 관찰되었고, KY-4b 세포에서는 각각 480bp 및 124bp에 대응하는 2개의 밴드(1개의 절단부위가)가 관찰되었다. 이것은, HNA-4a 유전자 및 HNA-4b 유전자의 mRNA가 KY-4a 세포 및 KY-4b 세포에서 각각 특이적으로 발현한다는 것을 나타낸다. 마찬가지의 조사를 KY-5a 세포 및 KY-5b 세포에서도 실행하여, HNA-5a 유전자 및 HNA-5b 유전자의 mRNA가 각각 특이적으로 발현한다는 것이 관찰되었다. 또한, G3PDH의 발현량을 검사함으로써 전 RNA의 양(cDNA의 양)이 세포마다 다르지 않다는 것을 확인하였다(도 10).
SEQUENCE LISTING <110> Japanese Red Cross Society Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Panel Cell Useful for Detection of Anti-granulocyte Antibody <130> 163768 <150> JP 2006-81236 <151> 2006-03-23 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 887 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (34)..(732) <223> <400> 1 tctttggtga cttgtccact ccagtgtggc atc atg tgg cag ctg ctc ctc cca 54 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro 1 5 act gct ctg cta ctt cta gtt tca gct ggc atg cgg act gaa gat ctc 102 Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu 10 15 20 cca aag gct gtg gtg ttc ctg gag cct caa tgg tac agg gtg ctc gag 150 Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu 25 30 35 aag gac agt gtg act ctg aag tgc cag gga gcc tac tcc cct gag gac 198 Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp 40 45 50 55 aat tcc aca cag tgg ttt cac aat gag aac ctc atc tca agc cag gcc 246 Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala 60 65 70 tcg agc tac ttc att gac gct gcc aca gtc gac gac agt gga gag tac 294 Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr 75 80 85 agg tgc cag aca aac ctc tcc acc ctc agt gac ccg gtg cag cta gaa 342 Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu 90 95 100 gtc cat gtc ggc tgg ctg ttg ctc cag gcc cct cgg tgg gtg ttc aag 390 Val His Val Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys 105 110 115 gag gaa gac cct att cac ctg agg tgt cac agc tgg aag aac act gct 438 Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala 120 125 130 135 ctg cat aag gtc aca tat tta cag aat ggc aaa gac agg aag tat ttt 486 Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe 140 145 150 cat cat aat tct gac ttc cac att cca aaa gcc aca ctc aaa gat agc 534 His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser 155 160 165 ggc tcc tac ttc tgc agg ggg ctt gtt ggg agt aaa aat gtg tct tca 582 Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser 170 175 180 gag act gtg aac atc acc atc act caa ggt ttg gca gtg tca acc atc 630 Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile 185 190 195 tca tca ttc tct cca cct ggg tac caa gtc tct ttc tgc ttg gtg atg 678 Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met 200 205 210 215 gta ctc ctt ttt gca gtg gac aca gga cta tat ttc tct gtg aag aca 726 Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr 220 225 230 aac att tgaagctcaa caagagactg gaaggaccat aaacttaaat ggagaaagga 782 Asn Ile ccctcaagac aaatgacccc catcccatgg gagtaataag agcagtggca gcagcatctc 842 tgaacatttc tctggatttg caaccccatc atcctcaggc ctctc 887 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Asn Leu 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ctg cta ctt cta gtt tca gct ggc atg cgg act gaa gat ctc 102 Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu 10 15 20 cca aag gct gtg gtg ttc ctg gag cct caa tgg tac agc gtg ctt gag 150 Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu 25 30 35 aag gac agt gtg act ctg aag tgc cag gga gcc tac tcc cct gag gac 198 Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp 40 45 50 55 aat tcc aca cag tgg ttt cac aat gag agc ctc atc tca agc cag gcc 246 Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala 60 65 70 tcg agc tac ttc att gac gct gcc aca gtc aac gac agt gga gag tac 294 Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr 75 80 85 agg tgc cag aca aac ctc tcc acc ctc agt gac ccg gtg cag cta gaa 342 Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu 90 95 100 gtc cat atc ggc tgg ctg ttg ctc cag gcc cct cgg tgg gtg ttc aag 390 Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys 105 110 115 gag gaa gac cct att cac ctg agg tgt cac agc tgg aag aac act gct 438 Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala 120 125 130 135 ctg cat aag gtc aca tat tta cag aat ggc aaa gac agg aag tat ttt 486 Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe 140 145 150 cat cat aat tct gac ttc cac att cca aaa gcc aca ctc aaa gat agc 534 His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser 155 160 165 ggc tcc tac ttc tgc agg ggg ctt gtt ggg agt aaa aat gtg tct tca 582 Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser 170 175 180 gag act gtg aac atc acc atc act caa ggt ttg gca gtg tca acc atc 630 Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile 185 190 195 tca tca ttc tct cca cct ggg tac caa gtc tct ttc tgc ttg gtg atg 678 Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met 200 205 210 215 gta ctc ctt ttt gca gtg gac aca gga cta tat ttc tct gtg aag aca 726 Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr 220 225 230 aac att tgaagctcaa caagagactg gaaggaccat aaacttaaat ggagaaagga 782 Asn Ile ccctcaagac aaatgacccc catcccatgg gagtaataag agcagtggca gcagcatctc 842 tgaacatttc tctggatttg caaccccatc atcctcaggc ctctc 887 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230 <210> 5 <211> 1630 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (36)..(1346) <223> <400> 5 aaaagcagaa agagattacc agccacagac gggtc atg agc gcg gta tta ctg 53 Met Ser Ala Val Leu Leu 1 5 ctg gcc ctc ctg ggg ttc atc ctc cca ctg cca gga gtg cag gcg ctg 101 Leu Ala Leu Leu Gly Phe Ile Leu Pro Leu Pro Gly Val Gln Ala Leu 10 15 20 ctc tgc cag ttt ggg aca gtt cag cat gtg tgg aag gtg tcc gac ctg 149 Leu Cys Gln Phe Gly Thr Val Gln His Val Trp Lys Val Ser Asp Leu 25 30 35 ccc cgg caa tgg acc cct aag aac acc agc tgc gac agc ggc ttg ggg 197 Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn Thr Ser Cys Asp Ser Gly Leu Gly 40 45 50 tgc cag gac acg ttg atg ctc att gag agc gga ccc caa gtg agc ctg 245 Cys Gln Asp Thr Leu Met Leu Ile Glu Ser Gly Pro Gln Val Ser Leu 55 60 65 70 gtg ctc tcc aag ggc tgc acg gag gcc aag gac cag gag ccc cgc gtc 293 Val Leu Ser Lys Gly Cys Thr Glu Ala Lys Asp Gln Glu Pro Arg Val 75 80 85 act gag cac cgg atg ggc ccc ggc ctc tcc ctg atc tcc tac acc ttc 341 Thr Glu His Arg Met Gly Pro Gly Leu Ser Leu Ile Ser Tyr Thr Phe 90 95 100 gtg tgc cgc cag gag gac ttc tgc aac aac ctc gtt aac tcc ctc ccg 389 Val Cys Arg Gln Glu Asp Phe Cys Asn Asn Leu Val Asn Ser Leu Pro 105 110 115 ctt tgg gcc cca cag ccc cca gca gac cca gga tcc ttg agg tgc cca 437 Leu Trp Ala Pro Gln Pro Pro Ala Asp Pro Gly Ser Leu Arg Cys Pro 120 125 130 gtc tgc ttg tct atg gaa ggc tgt ctg gag ggg aca aca gaa gag atc 485 Val Cys Leu Ser Met Glu Gly Cys Leu Glu Gly Thr Thr Glu Glu Ile 135 140 145 150 tgc ccc aag ggg acc aca cac tgt tat gat ggc ctc ctc agg ctc agg 533 Cys Pro Lys Gly Thr Thr His Cys Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Leu Arg 155 160 165 gga gga ggc atc ttc tcc aat ctg aga gtc cag gga tgc atg ccc cag 581 Gly Gly Gly Ile Phe Ser Asn Leu Arg Val Gln Gly Cys Met Pro Gln 170 175 180 cca ggt tgc aac ctg ctc aat ggg aca cag gaa att ggg ccc gtg ggt 629 Pro Gly Cys Asn Leu Leu Asn Gly Thr Gln Glu Ile Gly Pro Val Gly 185 190 195 atg act gag aac tgc aat agg aaa gat ttt ctg acc tgt cat cgg ggg 677 Met Thr Glu Asn Cys Asn Arg Lys Asp Phe Leu Thr Cys His Arg Gly 200 205 210 acc acc att atg aca cac gga aac ttg gct caa gaa ccc act gat tgg 725 Thr Thr Ile Met Thr His Gly Asn Leu Ala Gln Glu Pro Thr Asp Trp 215 220 225 230 acc aca tcg aat acc gag atg tgc gag gtg ggg cag gtg tgt cag gag 773 Thr Thr Ser Asn Thr Glu Met Cys Glu Val Gly Gln Val Cys Gln Glu 235 240 245 acg ctg ctg ctc ata gat gta gga ctc aca tca acc ctg gtg ggg aca 821 Thr Leu Leu Leu Ile Asp Val Gly Leu Thr Ser Thr Leu Val Gly Thr 250 255 260 aaa ggc tgc agc act gtt ggg gct caa aat tcc cag aag acc acc atc 869 Lys Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala Gln Asn Ser Gln Lys Thr Thr Ile 265 270 275 cac tca gcc cct cct ggg gtg ctt gtg gcc tcc tat acc cac ttc tgc 917 His Ser Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ala Ser Tyr Thr His Phe Cys 280 285 290 tcc tcg gac ctg tgc aat agt gcc agc agc agc agc gtt ctg ctg aac 965 Ser Ser Asp Leu Cys Asn Ser Ala Ser Ser Ser Ser Val Leu Leu Asn 295 300 305 310 tcc ctc cct cct caa gct gcc cct gtc cca gga gac cgg cag tgt cct 1013 Ser Leu Pro Pro Gln Ala Ala Pro Val Pro Gly Asp Arg Gln Cys Pro 315 320 325 acc tgt gtg cag ccc ctt gga acc tgt tca agt ggc tcc ccc cga atg 1061 Thr Cys Val Gln Pro Leu Gly Thr Cys Ser Ser Gly Ser Pro Arg Met 330 335 340 acc tgc ccc agg ggc gcc act cat tgt tat gat ggg tac att cat ctc 1109 Thr Cys Pro Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr Asp Gly Tyr Ile His Leu 345 350 355 tca gga ggt ggg ctg tcc acc aaa atg agc att cag ggc tgc gtg gcc 1157 Ser Gly Gly Gly Leu Ser Thr Lys Met Ser Ile Gln Gly Cys Val Ala 360 365 370 caa cct tcc agc ttc ttg ttg aac cac acc aga caa atc ggg atc ttc 1205 Gln Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr Arg Gln Ile Gly Ile Phe 375 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Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys Asn Thr Ser 35 40 45 Cys Asp Ser Gly Leu Gly Cys Gln Asp Thr Leu Met Leu Ile Glu Ser 50 55 60 Gly Pro Gln Val Ser Leu Val Leu Ser Lys Gly Cys Thr Glu Ala Lys 65 70 75 80 Asp Gln Glu Pro Arg Val Thr Glu His Arg Met Gly Pro Gly Leu Ser 85 90 95 Leu Ile Ser Tyr Thr Phe Val Cys Arg Gln Glu Asp Phe Cys Asn Asn 100 105 110 Leu Val Asn Ser Leu Pro Leu Trp Ala Pro Gln Pro Pro Ala Asp Pro 115 120 125 Gly Ser Leu Arg Cys Pro Val Cys Leu Ser Met Glu Gly Cys Leu Glu 130 135 140 Gly Thr Thr Glu Glu Ile Cys Pro Lys Gly Thr Thr His Cys Tyr Asp 145 150 155 160 Gly Leu Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Ile Phe Ser Asn Leu Arg Val 165 170 175 Gln Gly Cys Met Pro Gln Pro Gly Cys Asn Leu Leu Asn Gly Thr Gln 180 185 190 Glu Ile Gly Pro Val Gly Met Thr Glu Asn Cys Asn Arg Lys Asp Phe 195 200 205 Leu Thr Cys His Arg Gly Thr Thr Ile Met Thr His Gly Asn Leu Ala 210 215 220 Gln Glu Pro Thr Asp Trp Thr Thr Ser Asn Thr Glu Met Cys Glu Val 225 230 235 240 Gly Gln Val Cys Gln Glu Thr Leu Leu Leu Ile Asp Val Gly Leu Thr 245 250 255 Ser Thr Leu Val Gly Thr Lys Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala Gln Asn 260 265 270 Ser Gln Lys Thr Thr Ile His Ser Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ala 275 280 285 Ser Tyr Thr His Phe Cys Ser Ser Asp Leu Cys Asn Ser Ala Ser Ser 290 295 300 Ser Ser Val Leu Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gln Ala Ala Pro Val Pro 305 310 315 320 Gly Asp Arg Gln Cys Pro Thr Cys Val Gln Pro Leu Gly Thr Cys Ser 325 330 335 Ser Gly Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr 340 345 350 Asp Gly Tyr Ile His Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Thr Lys Met Ser 355 360 365 Ile Gln Gly Cys Val Ala Gln Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr 370 375 380 Arg Gln Ile Gly Ile Phe Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro 385 390 395 400 Pro Ala Ser Gln His Glu Gly Gly Gly Ala Glu Gly Leu Glu Ser Leu 405 410 415 Thr Trp Gly Val Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Trp Trp Gly Val 420 425 430 Val Cys Pro Ser Cys 435 <210> 7 <211> 3833 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (94)..(3603) <223> 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Phe Ser Asp Tyr Val Lys Arg Lys 200 205 210 215 gac cct gat gct ctg ctg aag cat gta aag cac atg ttg ctg ttg acc 786 Asp Pro Asp Ala Leu Leu Lys His Val Lys His Met Leu Leu Leu Thr 220 225 230 aat acc ttt ggt gcc atc aat tat gtc gcg aca gag gtg ttc cgg gag 834 Asn Thr Phe Gly Ala Ile Asn Tyr Val Ala Thr Glu Val Phe Arg Glu 235 240 245 gag ctg ggg gcc cgg cca gat gcc acc aaa gtg ctt atc atc atc acg 882 Glu Leu Gly Ala Arg Pro Asp Ala Thr Lys Val Leu Ile Ile Ile Thr 250 255 260 gat ggg gag gcc act gac agt ggc aac atc gat gcg gcc aaa gac atc 930 Asp Gly Glu Ala Thr Asp Ser Gly Asn Ile Asp Ala Ala Lys Asp Ile 265 270 275 atc cgc tac atc atc ggg att gga aag cat ttt cag acc aag gag agt 978 Ile Arg Tyr Ile Ile Gly Ile Gly Lys His Phe Gln Thr Lys Glu Ser 280 285 290 295 cag gag acc ctc cac aaa ttt gca tca aaa ccc gcg agc gag ttt gtg 1026 Gln Glu Thr Leu His Lys Phe Ala Ser Lys Pro Ala Ser Glu Phe Val 300 305 310 aaa att ctg gac aca ttt gag aag ctg aaa gat cta ttc act gag ctg 1074 Lys Ile Leu Asp Thr Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Phe Thr Glu Leu 315 320 325 cag aag aag atc tat gtc att gag ggc aca agc aaa cag gac ctg act 1122 Gln Lys Lys Ile Tyr Val Ile Glu Gly Thr Ser Lys Gln Asp Leu Thr 330 335 340 tcc ttc aac atg gag ctg tcc tcc agc ggc atc agt gct gac ctc agc 1170 Ser Phe Asn Met Glu Leu Ser Ser Ser Gly Ile Ser Ala Asp Leu Ser 345 350 355 agg ggc cat gca gtc gtg ggg gca gta gga gcc aag gac tgg gct ggg 1218 Arg Gly His Ala Val Val Gly Ala Val Gly Ala Lys Asp Trp Ala Gly 360 365 370 375 ggc ttt ctt gac ctg aag gca gac ctg cag gat gac aca ttt att ggg 1266 Gly Phe Leu Asp Leu Lys Ala Asp Leu Gln Asp Asp Thr Phe Ile Gly 380 385 390 aat gaa cca ttg aca cca gaa gtg aga gca ggc tat ttg ggt tac acc 1314 Asn Glu Pro Leu Thr Pro Glu Val Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Tyr Thr 395 400 405 gtg acc tgg ctg ccc tcc cgg caa aag act tcg ttg ctg gcc tcg gga 1362 Val Thr Trp Leu Pro Ser Arg Gln Lys Thr Ser Leu Leu Ala Ser Gly 410 415 420 gcc cct cga tac cag cac atg ggc cga gtg ctg ctg ttc caa gag cca 1410 Ala Pro Arg Tyr Gln His Met Gly Arg Val Leu Leu Phe Gln Glu Pro 425 430 435 cag ggc gga gga cac tgg agc cag gtc cag aca atc cat ggg acc cag 1458 Gln Gly Gly Gly His Trp Ser Gln Val Gln Thr Ile His Gly Thr Gln 440 445 450 455 att ggc tct tat ttc ggt ggg gag ctg tgt ggc gtc gac gtg gac caa 1506 Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Glu Leu Cys Gly Val Asp Val Asp Gln 460 465 470 gat ggg gag aca gag ctg ctg ctg att ggt gcc cca ctg ttc tat ggg 1554 Asp Gly Glu Thr Glu Leu Leu Leu Ile Gly Ala Pro Leu Phe Tyr Gly 475 480 485 gag cag aga gga ggc cgg gtg ttt atc tac cag aga aga cag ttg ggg 1602 Glu Gln Arg Gly Gly Arg Val Phe Ile Tyr Gln Arg Arg Gln Leu Gly 490 495 500 ttt gaa gaa gtc tca gag ctg cag ggg gac ccc ggc tac cca ctc ggg 1650 Phe Glu Glu Val Ser Glu Leu Gln Gly Asp Pro Gly Tyr Pro Leu Gly 505 510 515 cgg ttt gga gaa gcc atc act gct ctg aca gac atc aac ggc gat ggg 1698 Arg Phe Gly Glu Ala Ile Thr Ala Leu Thr Asp Ile Asn Gly Asp Gly 520 525 530 535 ctg gta gac gtg gct gtg ggg gcc cct ctg gag gag cag ggg gct gtg 1746 Leu Val Asp Val Ala Val Gly Ala Pro Leu Glu Glu Gln Gly Ala Val 540 545 550 tac atc ttc aat ggg agg cac ggg ggg ctt agt ccc cag cca agt cag 1794 Tyr Ile Phe Asn Gly Arg His Gly Gly Leu Ser Pro Gln Pro Ser Gln 555 560 565 cgg ata gaa ggg acc caa gtg ctc tca gga att cag tgg ttt gga cgc 1842 Arg Ile Glu Gly Thr Gln Val Leu Ser Gly Ile Gln Trp Phe Gly Arg 570 575 580 tcc atc cat ggg gtg aag gac ctt gaa ggg gat ggc ttg gca gat gtg 1890 Ser Ile His Gly Val Lys Asp Leu Glu Gly Asp Gly Leu Ala Asp Val 585 590 595 gct gtg ggg gct gag agc cag atg atc gtg ctg agc tcc cgg ccc gtg 1938 Ala Val Gly Ala Glu Ser Gln Met Ile Val Leu Ser Ser Arg Pro Val 600 605 610 615 gtg gat atg gtc acc ctg atg tcc ttc tct cca gct gag atc cca gtg 1986 Val Asp Met Val Thr Leu Met Ser Phe Ser Pro Ala Glu Ile Pro Val 620 625 630 cat gaa gtg gag tgc tcc tat tca acc agt aac aag atg aaa gaa gga 2034 His Glu Val Glu Cys Ser Tyr Ser Thr Ser Asn Lys Met Lys Glu Gly 635 640 645 gtt aat atc aca atc tgt ttc cag atc aag tct ctc atc ccc cag ttc 2082 Val Asn Ile Thr Ile Cys Phe Gln Ile Lys Ser Leu Ile Pro Gln Phe 650 655 660 caa ggc cgc ctg gtt gcc aat ctc act tac act ctg cag ctg gat ggc 2130 Gln Gly Arg Leu Val Ala Asn Leu Thr Tyr Thr Leu Gln Leu Asp Gly 665 670 675 cac cgg acc aga aga cgg ggg ttg ttc cca gga ggg aga cat gaa ctc 2178 His Arg Thr Arg Arg Arg Gly Leu Phe Pro Gly Gly Arg His Glu Leu 680 685 690 695 aga agg aat ata gct gtc acc acc agc atg tca tgc act gac ttc tca 2226 Arg Arg Asn Ile Ala Val Thr Thr Ser Met Ser Cys Thr Asp Phe Ser 700 705 710 ttt cat ttc ccg gta tgt gtt caa gac ctc atc tcc ccc atc aat gtt 2274 Phe His Phe Pro Val Cys Val Gln Asp Leu Ile Ser Pro Ile Asn Val 715 720 725 tcc ctg aat ttc tct ctt tgg gag gag gaa ggg aca ccg agg gac caa 2322 Ser Leu Asn Phe Ser Leu Trp Glu Glu Glu Gly Thr Pro Arg Asp Gln 730 735 740 agg gcg cag ggc aag gac ata ccg ccc atc ctg aga ccc tcc ctg cac 2370 Arg Ala Gln Gly Lys Asp Ile Pro Pro Ile Leu Arg Pro Ser Leu His 745 750 755 tcg gaa acc tgg gag atc cct ttt gag aag aac tgt ggg gag gac aag 2418 Ser Glu Thr Trp Glu Ile Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Glu Asp Lys 760 765 770 775 aag tgt gag gca aac ttg aga gtg tcc ttc tct cct gca aga tcc aga 2466 Lys Cys Glu Ala Asn Leu Arg Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg 780 785 790 gcc ctg cgt cta act gct ttt gcc agc ctc tct gtg gag ctg agc ctg 2514 Ala Leu Arg Leu Thr Ala Phe Ala Ser Leu Ser Val Glu Leu Ser Leu 795 800 805 agt aac ttg gaa gaa gat gct tac tgg gtc cag ctg gac ctg cac ttc 2562 Ser Asn Leu Glu Glu Asp Ala Tyr Trp Val Gln Leu Asp Leu His Phe 810 815 820 ccc ccg gga ctc tcc ttc cgc aag gtg gag atg ctg aag ccc cat agc 2610 Pro Pro Gly Leu Ser Phe Arg Lys Val Glu Met Leu Lys Pro His Ser 825 830 835 cag ata cct gtg agc tgc gag gag ctt cct gaa gag tcc agg ctt ctg 2658 Gln Ile Pro Val Ser Cys Glu Glu Leu Pro Glu Glu Ser Arg Leu Leu 840 845 850 855 tcc agg gca tta tct tgc aat gtg agc tct ccc atc ttc aaa gca ggc 2706 Ser Arg Ala Leu Ser Cys Asn Val Ser Ser Pro Ile Phe Lys Ala Gly 860 865 870 cac tcg gtt gct ctg cag atg atg ttt aat aca ctg gta aac agc tcc 2754 His Ser Val Ala Leu Gln Met Met Phe Asn Thr Leu Val Asn Ser Ser 875 880 885 tgg ggg gac tcg gtt gaa ttg cac gcc aat gtg acc tgt aac aat gag 2802 Trp Gly Asp Ser Val Glu Leu His Ala Asn Val Thr Cys Asn Asn Glu 890 895 900 gac tca gac ctc ctg gag gac aac tca gcc act acc atc atc ccc atc 2850 Asp Ser Asp Leu Leu Glu Asp Asn Ser Ala Thr Thr Ile Ile Pro Ile 905 910 915 ctg tac ccc atc aac atc ctc atc cag gac caa gaa gac tcc aca ctc 2898 Leu Tyr Pro Ile Asn Ile Leu Ile Gln Asp Gln Glu Asp Ser Thr Leu 920 925 930 935 tat gtc agt ttc acc ccc aaa ggc ccc aag atc cac caa gtc aag cac 2946 Tyr Val Ser Phe Thr Pro Lys Gly Pro Lys Ile His Gln Val Lys His 940 945 950 atg tac cag gtg agg atc cag cct tcc atc cac gac cac aac ata ccc 2994 Met Tyr Gln Val Arg Ile Gln Pro Ser Ile His Asp His Asn Ile Pro 955 960 965 acc ctg gag gct gtg gtt ggg gtg cca cag cct ccc agc gag ggg ccc 3042 Thr Leu Glu Ala Val Val Gly 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ctggctaact 60 agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 120 gctggctagt taagctatca acaagtttgt acaaaaaagc aggctccgcg gccgccccct 180 tcacc atg aag gat tcc tgc atc act gtg atg gcc atg gcg ctg ctg tct 230 Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 ggg ttc ttt ttc ttc gcg ccg gcc tcg agc tac aac ctg gac gtg cgg 278 Gly Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser Tyr Asn Leu Asp Val Arg 20 25 30 ggc gcg cgg agc ttc tcc cca ccg cgc gcc ggg agg cac ttt gga tac 326 Gly Ala Arg Ser Phe Ser Pro Pro Arg Ala Gly Arg His Phe Gly Tyr 35 40 45 cgc gtc ctg cag gtc gga aac ggg gtc atc gtg gga gct cca ggg gag 374 Arg Val Leu Gln Val Gly Asn Gly Val Ile Val Gly Ala Pro Gly Glu 50 55 60 ggg aac agc aca gga agc ctc tat cag tgc cag tcg ggc aca gga cac 422 Gly Asn Ser Thr Gly Ser Leu Tyr Gln Cys Gln Ser Gly Thr Gly His 65 70 75 tgc ctg cca gtc acc ctg aga ggt tcc aac tat acc tcc aag tac ttg 470 Cys Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Ser Asn Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu 80 85 90 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Asp Thr Phe Glu Lys 305 310 315 ctg aaa gat cta ttc act gag ctg cag aag aag atc tat gtc att gag 1190 Leu Lys Asp Leu Phe Thr Glu Leu Gln Lys Lys Ile Tyr Val Ile Glu 320 325 330 335 ggc aca agc aaa cag gac ctg act tcc ttc aac atg gag ctg tcc tcc 1238 Gly Thr Ser Lys Gln Asp Leu Thr Ser Phe Asn Met Glu Leu Ser Ser 340 345 350 agc ggc atc agt gct gac ctc agc agg ggc cat gca gtc gtg ggg gca 1286 Ser Gly Ile Ser Ala Asp Leu Ser Arg Gly His Ala Val Val Gly Ala 355 360 365 gta gga gcc aag gac tgg gct ggg ggc ttt ctt gac ctg aag gca gac 1334 Val Gly Ala Lys Asp Trp Ala Gly Gly Phe Leu Asp Leu Lys Ala Asp 370 375 380 ctg cag gat gac aca ttt att ggg aat gaa cca ttg aca cca gaa gtg 1382 Leu Gln Asp Asp Thr Phe Ile Gly Asn Glu Pro Leu Thr Pro Glu Val 385 390 395 aga gca ggc tat ttg ggt tac acc gtg acc tgg ctg ccc tcc cgg caa 1430 Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Tyr Thr Val Thr Trp Leu Pro Ser Arg Gln 400 405 410 415 aag act tcg ttg ctg gcc tcg gga gcc cct cga tac cag cac atg ggc 1478 Lys Thr Ser Leu Leu Ala Ser Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Met Gly 420 425 430 cga gtg ctg ctg ttc caa gag cca cag ggc gga gga cac tgg agc cag 1526 Arg Val Leu Leu Phe Gln Glu Pro Gln Gly Gly Gly His Trp Ser Gln 435 440 445 gtc cag aca atc cat ggg acc cag att ggc tct tat ttc ggt ggg gag 1574 Val Gln Thr Ile His Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Glu 450 455 460 ctg tgt ggc gtc gac gtg gac caa gat ggg gag aca gag ctg ctg ctg 1622 Leu Cys Gly Val Asp Val Asp Gln Asp Gly Glu Thr Glu Leu Leu Leu 465 470 475 att ggt gcc cca ctg ttc tat ggg gag cag aga gga ggc cgg gtg ttt 1670 Ile Gly Ala Pro Leu Phe Tyr Gly Glu Gln Arg Gly Gly Arg Val Phe 480 485 490 495 atc tac cag aga aga cag ttg ggg ttt gaa gaa gtc tca gag ctg cag 1718 Ile Tyr Gln Arg Arg Gln Leu Gly Phe Glu Glu Val Ser Glu Leu Gln 500 505 510 ggg gac ccc ggc tac cca ctc ggg cgg ttt gga gaa gcc atc act gct 1766 Gly Asp Pro Gly Tyr Pro Leu Gly Arg Phe Gly Glu Ala Ile Thr Ala 515 520 525 ctg aca gac atc aac ggc gat ggg ctg gta gac gtg gct gtg ggg gcc 1814 Leu Thr Asp Ile Asn Gly Asp Gly Leu Val Asp Val Ala Val Gly Ala 530 535 540 cct ctg gag gag cag ggg gct gtg tac atc ttc aat ggg agg cac ggg 1862 Pro Leu Glu Glu Gln Gly Ala Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg His Gly 545 550 555 ggg ctt agt ccc cag cca agt cag cgg ata gaa ggg acc caa gtg ctc 1910 Gly Leu Ser Pro Gln Pro Ser Gln Arg Ile Glu Gly Thr Gln Val Leu 560 565 570 575 tca gga att cag tgg ttt gga cgc tcc atc cat ggg gtg aag gac ctt 1958 Ser Gly Ile Gln Trp Phe Gly Arg Ser Ile His Gly Val Lys Asp Leu 580 585 590 gaa ggg gat ggc ttg gca gat gtg gct gtg ggg gct gag agc cag atg 2006 Glu Gly Asp Gly Leu Ala Asp Val Ala Val Gly Ala Glu Ser Gln Met 595 600 605 atc gtg ctg agc tcc cgg ccc gtg gtg gat atg gtc acc ctg atg tcc 2054 Ile Val Leu Ser Ser Arg Pro Val Val Asp Met Val Thr Leu Met Ser 610 615 620 ttc tct cca gct gag atc cca gtg cat gaa gtg gag tgc tcc tat tca 2102 Phe Ser Pro Ala Glu Ile Pro Val His Glu Val Glu Cys Ser Tyr Ser 625 630 635 acc agt aac aag atg aaa gaa gga gtt aat atc aca atc tgt ttc cag 2150 Thr Ser Asn Lys Met Lys Glu Gly Val Asn Ile Thr Ile Cys Phe Gln 640 645 650 655 atc aag tct ctc atc ccc cag ttc caa ggc cgc ctg gtt gcc aat ctc 2198 Ile Lys Ser Leu Ile Pro Gln Phe Gln Gly Arg Leu Val Ala Asn Leu 660 665 670 act tac act ctg cag ctg gat ggc cac cgg acc aga aga cgg ggg ttg 2246 Thr Tyr Thr Leu Gln Leu Asp Gly His Arg Thr Arg Arg Arg Gly Leu 675 680 685 ttc cca gga ggg aga cat gaa ctc aga agg aat ata gct gtc acc acc 2294 Phe Pro Gly Gly Arg His Glu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Val Thr Thr 690 695 700 agc atg tca tgc act gac ttc tca ttt cat ttc ccg gta tgt gtt caa 2342 Ser Met Ser Cys Thr Asp Phe Ser Phe His Phe Pro Val Cys Val Gln 705 710 715 gac ctc atc tcc ccc atc aat gtt tcc ctg aat ttc tct ctt tgg gag 2390 Asp Leu Ile Ser Pro Ile Asn Val Ser Leu Asn Phe Ser Leu Trp Glu 720 725 730 735 gag gaa ggg aca ccg agg gac caa agg gcg cag ggc aag gac ata ccg 2438 Glu Glu Gly Thr Pro Arg Asp Gln Arg Ala Gln Gly Lys Asp Ile Pro 740 745 750 ccc atc ctg aga ccc tcc ctg cac tcg gaa acc tgg gag atc cct ttt 2486 Pro Ile Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Glu Thr Trp Glu Ile Pro Phe 755 760 765 gag aag aac tgt ggg gag gac aag aag tgt gag gca aac ttg aga gtg 2534 Glu Lys Asn Cys Gly Glu Asp Lys Lys Cys Glu Ala Asn Leu Arg Val 770 775 780 tcc ttc tct cct gca aga tcc aca gcc ctg cgt cta act gct ttt gcc 2582 Ser Phe Ser Pro Ala Arg Ser Thr Ala Leu Arg Leu Thr Ala Phe Ala 785 790 795 agc ctc tct gtg gag ctg agc ctg agt aac ttg gaa gaa gat gct tac 2630 Ser Leu Ser Val Glu Leu Ser Leu Ser Asn Leu Glu Glu Asp Ala Tyr 800 805 810 815 tgg gtc cag ctg gac ctg cac ttc ccc ccg gga ctc tcc ttc cgc aag 2678 Trp Val Gln Leu Asp Leu His Phe Pro Pro Gly Leu Ser Phe Arg Lys 820 825 830 gtg gag atg ctg aag ccc cat agc cag ata cct gtg agc tgc gag gag 2726 Val Glu Met Leu Lys Pro His Ser Gln Ile Pro Val Ser Cys Glu Glu 835 840 845 ctt cct gaa gag tcc agg ctt ctg tcc agg gca tta tct tgc aat gtg 2774 Leu Pro Glu Glu Ser Arg Leu Leu Ser Arg Ala Leu Ser Cys Asn Val 850 855 860 agc tct ccc atc ttc aaa gca ggc cac tcg gtt gct ctg cag atg atg 2822 Ser Ser Pro Ile Phe Lys Ala Gly His Ser Val Ala Leu Gln Met Met 865 870 875 ttt aat aca ctg gta aac agc tcc tgg ggg gac tcg gtt gaa ttg cac 2870 Phe Asn Thr Leu Val Asn Ser Ser Trp Gly Asp Ser Val Glu Leu His 880 885 890 895 gcc aat gtg acc tgt aac aat gag gac tca gac ctc ctg gag gac aac 2918 Ala Asn Val Thr Cys Asn Asn Glu Asp Ser Asp Leu Leu Glu Asp Asn 900 905 910 tca gcc act acc atc atc ccc atc ctg tac ccc atc aac atc ctc atc 2966 Ser Ala Thr Thr Ile Ile Pro Ile Leu Tyr Pro Ile Asn Ile Leu Ile 915 920 925 cag gac caa gaa gac tcc aca ctc tat gtc agt ttc acc ccc aaa ggc 3014 Gln Asp Gln Glu Asp Ser Thr Leu Tyr Val Ser Phe Thr Pro Lys Gly 930 935 940 ccc aag atc cac caa gtc aag cac atg tac cag gtg agg atc cag cct 3062 Pro Lys Ile His Gln Val Lys His Met Tyr Gln Val Arg Ile Gln Pro 945 950 955 tcc atc cac gac cac aac ata ccc acc ctg gag gct gtg gtt ggg gtg 3110 Ser Ile His Asp His Asn Ile Pro Thr Leu Glu Ala Val Val Gly 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Asp Gly Ser Ile Leu Ala Cys Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ser Arg Thr Cys Asp Gln Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Leu 115 120 125 Cys Tyr Leu Phe Arg Gln Asn Leu Gln Gly Pro Met Leu Gln Gly Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gln Glu Cys Ile Lys Gly Asn Val Asp Leu Val Phe Leu 145 150 155 160 Phe Asp Gly Ser Met Ser Leu Gln Pro Asp Glu Phe Gln Lys Ile Leu 165 170 175 Asp Phe Met Lys Asp Val Met Lys Lys Leu Ser Asn Thr Ser Tyr Gln 180 185 190 Phe Ala Ala Val Gln Phe Ser Thr Ser Tyr Lys Thr Glu Phe Asp Phe 195 200 205 Ser Asp Tyr Val Lys Arg Lys Asp Pro Asp Ala Leu Leu Lys His Val 210 215 220 Lys His Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Asn Tyr Val 225 230 235 240 Ala Thr Glu Val Phe Arg Glu Glu Leu Gly Ala Arg Pro Asp Ala Thr 245 250 255 Lys Val Leu Ile Ile Ile Thr Asp Gly Glu Ala Thr Asp Ser Gly Asn 260 265 270 Ile Asp Ala Ala Lys Asp Ile Ile Arg Tyr Ile Ile Gly Ile Gly Lys 275 280 285 His Phe Gln Thr Lys Glu Ser Gln Glu Thr Leu His Lys Phe Ala Ser 290 295 300 Lys Pro Ala Ser Glu Phe Val Lys Ile 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tgc gag ccc atc cgc ctg cag gtc ccc gtg gag gcc gtg aac atg 354 Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gln Val Pro Val Glu Ala Val Asn Met 75 80 85 tcc ctg ggc ctg tcc ctg gca gcc acc acc agc ccc cct cag ctg ctg 402 Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Thr Thr Ser Pro Pro Gln Leu Leu 90 95 100 gcc tgt ggt ccc acc gtg cac cag act tgc agt gag aac acg tat gtg 450 Ala Cys Gly Pro Thr Val His Gln Thr Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val 105 110 115 aaa ggg ctc tgc ttc ctg ttt gga tcc aac cta cgg cag cag ccc cag 498 Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser Asn Leu Arg Gln Gln Pro Gln 120 125 130 135 aag ttc cca gag gcc ctc cga ggg tgt cct caa gag gat agt gac att 546 Lys Phe Pro Glu Ala Leu Arg Gly Cys Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile 140 145 150 gcc ttc ttg att gat ggc tct ggt agc atc atc cca cat gac ttt cgg 594 Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ile Pro His Asp Phe Arg 155 160 165 cgg atg aag gag ttt gtc tca act gtg atg gag caa tta aaa aag tcc 642 Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser 170 175 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Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala 395 400 405 gcc gcc atc atc tta cgg aac cgg gtg caa agc ctg gtt ctg ggg gca 1362 Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg Val Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala 410 415 420 cct cga tat cag cac atc ggc ctg gta gcg atg ttc agg cag aac act 1410 Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Leu Val Ala Met Phe Arg Gln Asn Thr 425 430 435 ggc atg tgg gag tcc aac gct aat gtc aag ggc acc cag atc ggc gcc 1458 Gly Met Trp Glu Ser Asn Ala Asn Val Lys Gly Thr Gln Ile Gly Ala 440 445 450 455 tac ttc ggg gcc tcc ctc tgc tcc gtg gac gtg gac agc aac ggc agc 1506 Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Ser Asn Gly Ser 460 465 470 acc gac ctg gtc ctc atc ggg gcc ccc cat tac tac gag cag acc cga 1554 Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg 475 480 485 ggg ggc cag gtg tcc gtg tgc ccc ttg ccc agg ggg agg gct cgg tgg 1602 Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu Pro Arg Gly Arg Ala Arg Trp 490 495 500 cag tgt gat gct gtt ctc tac ggg gag cag ggc caa ccc tgg ggc cgc 1650 Gln Cys Asp Ala 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gtg 1986 Pro Val Leu Arg Val Lys Ala Ile Met Glu Phe Asn Pro Arg Glu Val 620 625 630 gca agg aat gta ttt gag tgt aat gat cag gtg gtg aaa ggc aag gaa 2034 Ala Arg Asn Val Phe Glu Cys Asn Asp Gln Val Val Lys Gly Lys Glu 635 640 645 gcc gga gag gtc aga gtc tgc ctc cat gtc cag aag agc aca cgg gat 2082 Ala Gly Glu Val Arg Val Cys Leu His Val Gln Lys Ser Thr Arg Asp 650 655 660 cgg cta aga gaa gga cag atc cag agt gtt gtg act tat gac ctg gct 2130 Arg Leu Arg Glu Gly Gln Ile Gln Ser Val Val Thr Tyr Asp Leu Ala 665 670 675 ctg gac tcc ggc cgc cca cat tcc cgc gcc gtc ttc aat gag aca aag 2178 Leu Asp Ser Gly Arg Pro His Ser Arg Ala Val Phe Asn Glu Thr Lys 680 685 690 695 aac agc aca cgc aga cag aca cag gtc ttg ggg ctg acc cag act tgt 2226 Asn Ser Thr Arg Arg Gln Thr Gln Val Leu Gly Leu Thr Gln Thr Cys 700 705 710 gag acc ctg aaa cta cag ttg ccg aat tgc atc gag gac cca gtg agc 2274 Glu Thr Leu Lys Leu Gln Leu Pro Asn Cys Ile Glu Asp Pro Val Ser 715 720 725 ccc att gtg ctg cgc ctg aac ttc tct ctg gtg gga acg cca ttg tct 2322 Pro Ile Val Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Gly Thr Pro Leu Ser 730 735 740 gct ttc ggg aac ctc cgg cca gtg ctg gcg gag gat gct cag aga ctc 2370 Ala Phe Gly Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Glu Asp Ala Gln Arg Leu 745 750 755 ttc aca gcc ttg ttt ccc ttt gag aag aat tgt ggc aat gac aac atc 2418 Phe Thr Ala Leu Phe Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Asn Asp Asn Ile 760 765 770 775 tgc cag gat gac ctc agc atc acc ttc agt ttc atg agc ctg gac tgc 2466 Cys Gln Asp Asp Leu Ser Ile Thr Phe Ser Phe Met Ser Leu Asp Cys 780 785 790 ctc gtg gtg ggt ggg ccc cgg gag ttc aac gtg aca gtg act gtg aga 2514 Leu Val Val Gly Gly Pro Arg Glu Phe Asn Val Thr Val Thr Val Arg 795 800 805 aat gat ggt gag gac tcc tac agg aca cag gtc acc ttc ttc ttc ccg 2562 Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Thr Gln Val Thr Phe Phe Phe Pro 810 815 820 ctt gac ctg tcc tac cgg aag gtg tcc aca ctc cag aac cag cgc tca 2610 Leu Asp Leu Ser Tyr Arg Lys Val Ser Thr Leu Gln Asn Gln Arg Ser 825 830 835 cag cga tcc tgg cgc ctg gcc tgt gag tct gcc tcc tcc acc gaa gtg 2658 Gln Arg Ser Trp Arg Leu Ala Cys Glu Ser Ala Ser Ser Thr Glu Val 840 845 850 855 tct ggg gcc ttg aag agc acc agc tgc agc ata aac cac ccc atc ttc 2706 Ser Gly Ala Leu Lys Ser Thr Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe 860 865 870 ccg gaa aac tca gag gtc acc ttt aat atc acg ttt gat gta gac tct 2754 Pro Glu Asn Ser Glu Val Thr Phe Asn Ile Thr Phe Asp Val Asp Ser 875 880 885 aag gct tcc ctt gga aac aaa ctg ctc ctc aag gcc aat gtg acc agt 2802 Lys Ala Ser Leu Gly Asn Lys Leu Leu Leu Lys Ala Asn Val Thr Ser 890 895 900 gag aac aac atg ccc aga acc aac aaa acc gaa ttc caa ctg gag ctg 2850 Glu Asn Asn Met Pro Arg Thr Asn Lys Thr Glu Phe Gln Leu Glu Leu 905 910 915 ccg gtg aaa tat gct gtc tac atg gtg gtc acc agc cat ggg gtc tcc 2898 Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met Val Val Thr Ser His Gly Val Ser 920 925 930 935 act aaa tat ctc aac ttc acg gcc tca gag aat acc agt cgg gtc atg 2946 Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Thr Ala Ser Glu Asn Thr Ser Arg Val Met 940 945 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tcg cat aac cac ctc ctg atc gtg agc aca gct gag atc ttg ttt 3315 Ser His Asn His Leu Leu Ile Val Ser Thr Ala Glu Ile Leu Phe 1060 1065 1070 aac gat tcc gtg ttc acc ctg ctg ccg gga cag ggg gcg ttt gtg 3360 Asn Asp Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Gly Gln Gly Ala Phe Val 1075 1080 1085 agg tcc cag acg gag acc aaa gtg gag ccg ttc gag gtc ccc aac 3405 Arg Ser Gln Thr Glu Thr Lys Val Glu Pro Phe Glu Val Pro Asn 1090 1095 1100 ccc ctg ccg ctc atc gtg ggc agc tct gtc ggg gga ctg ctg ctc 3450 Pro Leu Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu 1105 1110 1115 ctg gcc ctc atc acc gcc gcg ctg tac aag ctc ggc ttc ttc aag 3495 Leu Ala Leu Ile Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys 1120 1125 1130 cgg caa tac aag gac atg atg agt gaa ggg ggt ccc ccg ggg gcc 3540 Arg Gln Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala 1135 1140 1145 gaa ccc cag tagcggctcc ttcccgacag agctgcctct cggtggccag 3589 Glu Pro Gln 1150 caggactctg cccagaccac acgagccccc aggctgcttt aattaaaagg gtgggcgcgc 3649 cgacccagct ttcttgtaca aagtggttga tctagagggc ccgcggttcg aaggtaagcc 3709 tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc tacgcgtacc ggttagtaat gagtttaaac 3769 gggggaggct aactgaaaca cggaag 3795 <210> 12 <211> 1152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr Ala Leu Thr Leu Cys His Gly 1 5 10 15 Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg 20 25 30 Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Leu Gln Gly Ser Arg Val Val Val 35 40 45 Gly Ala Pro Gln Glu Ile Val Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Gln Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gln Val 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Thr 85 90 95 Thr Ser Pro Pro Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Gln Thr 100 105 110 Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser 115 120 125 Asn Leu Arg Gln Gln Pro Gln Lys Phe Pro Glu Ala Leu Arg Gly Cys 130 135 140 Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ile Ile Pro His Asp Phe Arg 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atc ttt gcg atc 1190 Ala Leu Lys Thr Ile Gln Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Phe Ala Ile 320 325 330 335 gag ggt act cag aca gga agt agc agc tcc ttt gag cat gag atg tct 1238 Glu Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Glu Met Ser 340 345 350 cag gaa ggc ttc agc gct gcc atc acc tct aat ggc ccc ttg ctg agc 1286 Gln Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser 355 360 365 act gtg ggg agc tat gac tgg gct ggt gga gtc ttt cta tat aca tca 1334 Thr Val Gly Ser Tyr Asp Trp Ala Gly Gly Val Phe Leu Tyr Thr Ser 370 375 380 aag gag aaa agc acc ttc atc aac atg acc aga gtg gat tca gac atg 1382 Lys Glu Lys Ser Thr Phe Ile Asn Met Thr Arg Val Asp Ser Asp Met 385 390 395 aat gat gct tac ttg ggt tat gct gcc gcc atc atc tta cgg aac cgg 1430 Asn Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg 400 405 410 415 gtg caa agc ctg gtt ctg ggg gca cct cga tat cag cac atc ggc ctg 1478 Val Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Leu 420 425 430 gta gcg atg ttc agg cag 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aag ctg aac ttc aca ggg ccg ggg 258 Gly Pro Gly Cys Thr Trp Cys Gln Lys Leu Asn Phe Thr Gly Pro Gly 40 45 50 55 gat cct gac tcc att cgc tgc gac acc cgg cca cag ctg ctc atg agg 306 Asp Pro Asp Ser Ile Arg Cys Asp Thr Arg Pro Gln Leu Leu Met Arg 60 65 70 ggc tgt gcg gct gac gac atc atg gac ccc aca agc ctc gct gaa acc 354 Gly Cys Ala Ala Asp Asp Ile Met Asp Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr 75 80 85 cag gaa gac cac aat ggg ggc cag aag cag ctg tcc cca caa aaa gtg 402 Gln Glu Asp His Asn Gly Gly Gln Lys Gln Leu Ser Pro Gln Lys Val 90 95 100 acg ctt tac ctg cga cca ggc cag gca gca gcg ttc aac gtg acc ttc 450 Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Gly Gln Ala Ala Ala Phe Asn Val Thr Phe 105 110 115 cgg cgg gcc aag ggc tac ccc atc gac ctg tac tat ctg atg gac ctc 498 Arg Arg Ala Lys Gly Tyr Pro Ile Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu 120 125 130 135 tcc tac tcc atg ctt gat gac ctc agg aat gtc aag aag cta ggt ggc 546 Ser Tyr Ser Met Leu Asp Asp Leu Arg Asn Val Lys Lys Leu Gly Gly 140 145 150 gac ctg ctc cgg gcc ctc aac 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cat ttc gcg ggc gac ggg aag ctg ggc gcc atc ctg 930 Asp Asp Gly Phe His Phe Ala Gly Asp Gly Lys Leu Gly Ala Ile Leu 265 270 275 acc ccc aac gac ggc cgc tgt cac ctg gag gac aac ttg tac aag agg 978 Thr Pro Asn Asp Gly Arg Cys His Leu Glu Asp Asn Leu Tyr Lys Arg 280 285 290 295 agc aac gaa ttc gac tac cca tcg gtg ggc cag ctg gcg cac aag ctg 1026 Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val Gly Gln Leu Ala His Lys Leu 300 305 310 gct gaa aac aac atc cag ccc atc ttc gcg gtg acc agt agg atg gtg 1074 Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe Ala Val Thr Ser Arg Met Val 315 320 325 aag acc tac gag aaa ctc acc gag atc atc ccc aag tca gcc gtg ggg 1122 Lys Thr Tyr Glu Lys Leu Thr Glu Ile Ile Pro Lys Ser Ala Val Gly 330 335 340 gag ctg tct gag gac tcc agc aat gtg gtc cat ctc att aag aat gct 1170 Glu Leu Ser Glu Asp Ser Ser Asn Val Val His Leu Ile Lys Asn Ala 345 350 355 tac aat aaa ctc tcc tcc agg gtc ttc ctg gat cac aac gcc ctc ccc 1218 Tyr Asn Lys Leu Ser Ser Arg Val Phe Leu Asp His Asn Ala Leu Pro 360 365 370 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Gly Pro Asn Ile Ala Ala Ile Val Gly Gly Thr Val Ala Gly 700 705 710 atc gtg ctg atc ggc att ctc ctg ctg gtc atc tgg aag gct ctg atc 2274 Ile Val Leu Ile Gly Ile Leu Leu Leu Val Ile Trp Lys Ala Leu Ile 715 720 725 cac ctg agc gac ctc cgg gag tac agg cgc ttt gag aag gag aag ctc 2322 His Leu Ser Asp Leu Arg Glu Tyr Arg Arg Phe Glu Lys Glu Lys Leu 730 735 740 aag tcc cag tgg aac aat gat aat ccc ctt ttc aag agc gcc acc acg 2370 Lys Ser Gln Trp Asn Asn Asp Asn Pro Leu Phe Lys Ser Ala Thr Thr 745 750 755 acg gtc atg aac ccc aag ttt gct gag agt taggagcact tggtgaagac 2420 Thr Val Met Asn Pro Lys Phe Ala Glu Ser 760 765 aaggccgtca ggacccacca tgttaattaa aagggtgggc gcgccgaccc agctttcttg 2480 tacaaagtgg ttgatctaga gggcccgcgg ttcgaaggta agcctatccc taaccctctc 2540 ctcggtctcg attctacgcg taccggttag taatgagttt aaacggggga ggctaactga 2600 aacacggaag 2610 <210> 16 <211> 769 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Leu Gly Leu Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu Val Gly Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Cys Val Leu 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Gly Gly Leu Asp Ala Met 225 230 235 240 Met Gln Val Ala Ala Cys Pro Glu Glu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr 245 250 255 Arg Leu Leu Val Phe Ala Thr Asp Asp Gly Phe His Phe Ala Gly Asp 260 265 270 Gly Lys Leu Gly Ala Ile Leu Thr Pro Asn Asp Gly Arg Cys His Leu 275 280 285 Glu Asp Asn Leu Tyr Lys Arg Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val 290 295 300 Gly Gln Leu Ala His Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe 305 310 315 320 Ala Val Thr Ser Arg Met Val Lys Thr Tyr Glu Lys Leu Thr Glu Ile 325 330 335 Ile Pro Lys Ser Ala Val Gly Glu Leu Ser Glu Asp Ser Ser Asn Val 340 345 350 Val His Leu Ile Lys Asn Ala Tyr Asn Lys Leu Ser Ser Arg Val Phe 355 360 365 Leu Asp His Asn Ala Leu Pro Asp Thr Leu Lys Val Thr Tyr Asp Ser 370 375 380 Phe Cys Ser Asn Gly Val Thr His Arg Asn Gln Pro Arg Gly Asp Cys 385 390 395 400 Asp Gly Val Gln Ile Asn Val Pro Ile Thr Phe Gln Val Lys Val Thr 405 410 415 Ala Thr Glu Cys Ile Gln Glu Gln Ser Phe Val Ile Arg Ala Leu Gly 420 425 430 Phe Thr Asp Ile Val Thr Val Gln Val Leu Pro Gln Cys Glu Cys Arg 435 440 445 Cys Arg Asp Gln Ser Arg Asp Arg Ser Leu Cys His Gly Lys Gly Phe 450 455 460 Leu Glu Cys Gly Ile Cys Arg Cys Asp Thr Gly Tyr Ile Gly Lys Asn 465 470 475 480 Cys Glu Cys Gln Thr Gln Gly Arg Ser Ser Gln Glu Leu Glu Gly Ser 485 490 495 Cys Arg Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Cys Ser Gly Leu Gly Asp Cys 500 505 510 Val Cys Gly Gln Cys Leu Cys His Thr Ser Asp Val Pro Gly Lys Leu 515 520 525 Ile Tyr Gly Gln Tyr Cys Glu Cys Asp Thr Ile Asn Cys Glu Arg Tyr 530 535 540 Asn Gly Gln Val Cys Gly Gly Pro Gly Arg Gly Leu Cys Phe Cys Gly 545 550 555 560 Lys Cys Arg Cys His Pro Gly Phe Glu Gly Ser Ala Cys Gln Cys Glu 565 570 575 Arg Thr Thr Glu Gly Cys Leu Asn Pro Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly 580 585 590 Arg Gly Arg Cys Arg Cys Asn Val Cys Glu Cys His Ser Gly Tyr Gln 595 600 605 Leu Pro Leu Cys Gln Glu Cys Pro Gly Cys Pro Ser Pro Cys Gly Lys 610 615 620 Tyr Ile Ser Cys Ala Glu Cys Leu Lys Phe Glu Lys Gly Pro Phe Gly 625 630 635 640 Lys Asn Cys Ser Ala Ala Cys Pro Gly Leu 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Claims (37)

  1. 항-HNA 항체에 대응하는 HNA 항원을 코드하는 DNA를 검출 과정에서 사용하는 조건하에 상기 DNA의 발현이 가능하도록 세포에 도입하여 얻어지는, 항-HNA 항체를 검출하기 위한 패널세포로서, 상기 DNA 도입용 세포는 검출 과정에서 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA-DP 항체, 항-HNA-l 항체, 항-HNA-2a 항체, HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체, 항-HNA-5 항체 및 건강한 피험자의 혈청과 검출 반응을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 패널세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 도입용 세포는 포유동물 세포인 패널세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 비접착성 세포인 패널세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비접착성 세포는 K562 세포인 패널세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-la 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-la 항원인 패널세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-lb 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-lb 항원인 패널세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-2a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-2a 항원인 패널세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-4a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4a 항원인 패널세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-4b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4b 항원인 패널세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-5a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5a 항원인 패널세포.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-5b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5b 항원인 패널세포.
  12. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 세포가 상기 세포의 게놈에 결합된 패널세포.
  13. 항-HNA 항체를 검출하기 위한 패널세포의 제조방법으로서, 상기 방법은:
    검출 과정에서 항-HLA-ABC 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA- DP 항체, 항-HNA-1 항체, 항-HNA-2a 항체, 항-HNA-3a 항체, 항-HNA-4 항체, 항-H NA-5 항체, 및 건강한 피험자의 혈청과 검출 반응을 나타내지 않는 세포를 준비하는 단계;
    상기 항-HNA 항체에 대응하는 HNA 항원을 코드하는 DNA를 검출 과정에서 사용하는 조건하에 상기 DNA의 발현이 가능하도록 세포에 도입하는 단계를 포함하는 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 도입용 세포는 포유동물 세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 비접착성 세포인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 비접착성 세포는 K562 세포인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-1a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-1a 항원인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-1b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-1b 항원인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-2a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-2a 항원인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-4a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4a 항원인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-4b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-4b 항원인 방법.
  22. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-5a 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5a 항원인 방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 항-HNA 항체는 항-HNA-5b 항체이고, 그것에 대응하는 HNA 항원은 HNA-5b 항원인 방법.
  24. 제13항에 있어서, 상기 DNA가 상기 세포의 게놈에 결합하는 방법.
  25. 시료에서 항-HNA 항체를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 시료를 준비하는 단계;
    (b) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 준비하는 단계; 및
    (c) 상기 시료를 상기 패널세포와 접촉시키고 상기 패널세포와 상기 항-HNA 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 패널세포는 담체에 고정된 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 패널세포와 상기 항-HNA 항체의 결합을 유세포분석기를 통해 검출하는 방법.
  28. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 포함하는 항-HNA 항체를 검출하는 시약.
  29. 제28항에 있어서, 상기 패널세포는 담체에 고정된 시약.
  30. 피험자의 항-HNA 항체가 관여하는 질환을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 상기 피험자의 혈청 시료를 준비하는 단계;
    (b) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 준비하는 단계; 및
    (c) 상기 혈청 시료를 상기 패널세포와 접촉시키고 상기 패널세포와 상기 항-HNA 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항-HNA 항체가 관여하는 질환은 동종면역성 신생아 호중구 감소증, 조혈 모세포 이식후 동종면역성 호중구 감소증, 과립구 수혈 불응화, 수혈 관련 급성 폐 손상, 원발성 자기면역성 호중구 감소증, 이차성 자기면역성 호중구 감소증 및 비용혈성 수혈 부작용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 패널세포는 담체에 고정된 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 패널세포와 상기 항-HNA 항체의 결합을 유세포분석기를 통해 검출하는 방법.
  34. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 포함하는 항-HNA 항체가 관여하는 질환용 진단 시약.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항-HNA 항체가 관여하는 질환은 동종면역성 신생아 호중구 감소증, 조혈 모세포 이식후 동종면역성 호중구 감소증, 과립구 수혈 불응화, 수혈 관련 급성 폐 손상, 원발성 자기면역성 호중구 감소증, 이차성 자기면역성 호중구 감소증 및 비용혈성 수혈 부작용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 시약.
  36. 제34항에 있어서, 상기 패널세포가 담체에 고정된 진단 시약.
  37. HNA 항원을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 패널세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 HNA 항원을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
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