CN112250678B - 一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用，其结构如式Ⅰ所示：
Figure DDA0002774578960000011
其中：R1为氟、氯、溴、碘中的一种；R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种；R3为甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苯甲基及其衍生物中的一种。本发明提供的诊断脑胶质瘤的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有聚集诱导发光效应，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。该探针在实际检测中，具有完全免洗的优势，操作大幅简化，荧光背景信号低，信噪比高，响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于样本中脑胶质瘤具有高选择性。

Description

一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于有机合成与分析检测技术领域，具体涉及一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质瘤是一组异质性的原发性脑肿瘤，是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤。根据世界卫生组织的分类，可进一步将其分为四级，第一、二级为低级胶质瘤(LGG)，第三、四级为高级胶质瘤(HGG)。一般来说，相对较高的级别与较差的预后有关，其中，低级胶质瘤的中位生存时间为11.6年，而最常见的第四级胶质瘤——胶质母细胞瘤的中位生存时间仅有14个月。由于胶质瘤细胞呈浸润性生长，几乎不可能完全切除所有肿瘤区域，故导致胶质瘤恶性程度高、预后不良、复发率高。因此，在手术中准确区分胶质瘤边界以实现精准切除，对治疗脑胶质瘤至关重要。而这往往需要借助于影像学的帮助。目前，脑胶质瘤的初步诊断主要依靠电子计算机断层扫描(CT)及磁共振(MRI)等方法，最终诊断还需要通过肿瘤切除术或活检术获取标本，进行病理学诊断，以进一步确证。如申请号为201310447503.9“一种对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂”中报道了一种氧化锰纳米粒，其上连接了脑胶质瘤特异性靶向分子，以得到一种有效的用于脑胶质瘤早期诊断和边界界定的T1造影剂。与这些技术相比，荧光探针具有高灵敏度和实时可视化的成像能力，能更容易地从视觉上准确区分胶质瘤和正常脑组织。例如专利201910374313.6“一种脑胶质瘤示踪的近红外量子点探针”中报道了一种与脑胶质瘤细胞中过表达的整合素αvβ3特异性结合的近红外量子点探针，可以实现高效且特异性的脑胶质瘤示踪。但这类荧光量子点的毒性较大，故开发了许多其他类型的更低毒性的荧光探针。如专利201510032689.0“用于生物成像和脑胶质瘤靶向的纳米粒子及制备方法和应用”中报道了一种由马来酰亚胺-聚乙二醇-氨基琥珀酰亚胺琥珀酸酯将肿瘤穿透肽和荧光碳点连接而成的探针，以实现脑胶质瘤的靶向成像。又如申请号201711440558.1“脑胶质瘤影像纳米探针及其制备方法和应用”中报道了一种由羧基化改性脂质体、造影剂和乳铁蛋白制备的纳米探针，可以穿透血脑屏障，主动靶向脑胶质瘤细胞，准确识别肿瘤边界。然而，为了获得高的信号背景比，细胞与探针共孵育后通常需要洗涤以降低背景荧光，这不利于胶质瘤的原位监测。此外，由于聚集荧光淬灭效应(ACQ)，使得大多数常规荧光团在高浓度溶液或聚集状态下，弱发光或不发光。因此，构建新型免洗型高水溶性的聚集诱导发光(AIE)的脑胶质瘤荧光探针非常具有实际应用前景。
发明内容
本发明提供了一种发现和示踪脑胶质瘤的免洗型荧光分子探针及其制备方法与应用，本发明的荧光探针具有高靶向性、高灵敏度、强抗干扰能力、宽检测范围、可反复使用等优点。
本发明这种诊断脑胶质瘤的荧光分子探针，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002774578940000021
其中：R1为氢、氟、氯、溴、碘、甲基中的一种；R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种；R3为甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苯甲基及其衍生物中的一种。
优选的，所述示踪脑胶质瘤的荧光分子探针，其结构是如式Ⅱ所示：
Figure BDA0002774578940000022
本发明这种示踪脑胶质瘤的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)向圆底烧瓶中加入化合物1和溶剂，室温搅拌条件下向反应溶液中滴加入化合物2和化合物3，接着在设定温度和搅拌条件下进行回流反应，反应完全后，调节反应溶液的pH至中性，接着进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到化合物4，其合成路线如下：
Figure BDA0002774578940000031
(2)向圆底烧瓶中加入步骤(1)制备的化合物4、化合物5和溶剂，氮气保护、无水条件下滴加1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，然后再移至设定温度下进行反应，回流；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物6，其合成路线如下：
Figure BDA0002774578940000032
(3)圆底烧瓶中加入步骤(2)制备的化合物6、化合物7和溶剂，氮气保护，加热回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到诊断脑胶质瘤的荧光分子探针式I；其合成路线如下：
Figure BDA0002774578940000033
所述步骤(1)中，溶剂为冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物1与溶剂的摩尔体积比为(1～3):10mmol/mL；化合物1、化合物2和化合物3的投料摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；设定温度为115～125℃，回流反应时间为2～12h。
所述步骤(2)中，溶剂为甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯中的一种或多种，化合物4与溶剂的摩尔体积比为(1～4):10mmol/mL；化合物4、化合物5和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯的投料摩尔比为1:(1～1.5):(0.01～0.05)；反应的设定温度为85～95℃，反应时间为2～24h。
所述步骤(3)中，溶剂为乙腈、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种；化合物6与溶剂的摩尔体积比为(0.5～1.5):20mmol/mL；化合物6与化合物7的投料摩尔比为(1～1.5):(1～1.5)；加热回流反应的温度为85～95℃，反应时间为2～24h。
所述步骤(1)中，纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
所述步骤(2)中，纯化过程为：柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)。
所述步骤(2)中，纯化过程为：柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)。
一种免洗型脑胶质瘤成像的荧光探针试剂盒，该探针试剂盒中包括所述的荧光分子探针I。
本发明的有益效果：本发明提供的诊断脑胶质瘤的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有聚集诱导发光效应，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。此外，该探针在实际检测中，具有完全免洗的优势，操作大幅简化，荧光背景信号低，信噪比高。本荧光探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于样本中脑胶质瘤具有高选择性。本发明的探针在脑胶质瘤的早期发现和示踪、识别、成像方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1实施例1中荧光探针II的化学合成路线。
图2实施例2中荧光探针III的化学合成路线。
图3实施例3中荧光探针IV的化学合成路线。
图4实施例4中荧光探针的AIE效应光谱图。
图5实施例5中荧光探针II的细胞活力测试图。
图6实施例6中荧光探针II的HCT-116细胞荧光发射光谱图。
图7实施例7中荧光探针II的脑胶质瘤和脑上皮细胞荧光图。
图8实施例8中荧光探针II对不同细胞电位靶向图。
图9实施例9中荧光探针II的3D脑胶质瘤染色图。
图10实施例10中荧光探针II的脑胶质瘤组织染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
荧光探针II的合成
本实施例制备的荧光探针结构式中的R1＝OCH3，R2＝H，R3＝CH3。
本实施例的合成技术路线如图1所示，具体包括以下步骤：
化合物4-1的合成
称取化合物1-1茴香偶酰(2.70g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2-1苯胺(0.93g，10mmol)和化合物3(1.8g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的绿色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末化合物4-14.59g，产率90.0％。
化合物6-1的合成
称取化合物4-1(0.51g，1mmol)和化合物5(0.15g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入2mL无水甲醇；将1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)溶于2ml甲苯中，氮气保护、无水条件下将其加入体系，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行反应，回流12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末化合物6-1 0.47g，产率87.0％。
荧光分子探针II的合成
称取化合物6-1(0.54g，1mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护、无水的条件下加入化合物7-1(0.11g，1mmol)，90℃搅拌12h；加入后反应溶液由黄色变为橘红色，待反应完全后反应溶液又变为黄色；TLC监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)，得到白色固体粉末0.48g，即为该例中的荧光分子探针Ⅱ，其结构式如合成路线图1中所示，产率76.3％。
实施例2
荧光探针III的合成
本实施例制备的荧光探针结构式中的R1＝H，R2＝H，R3＝CH3。
本实施例的合成技术路线如图2所示，具体包括以下步骤：
化合物4-2的合成
称取化合物1-2苯偶酰(2.10g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2苯胺(0.93g，10mmol)和化合物3(1.8g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的蓝色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后，使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末化合物4-2 3.96g，产率88.0％。
化合物6-2的合成
称取化合物4-2(0.45g，1mmol)和化合物5(0.15g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入2mL无水甲醇；将1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)溶于2ml甲苯中，氮气保护、无水条件下将其加入体系，滴加完毕后，然后再移至90℃下进行反应，回流12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末化合物6-2 0.41g，产率85.0％
荧光分子探针III的合成
称取化合物6-2(0.48g，1mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护、无水的条件下加入化合物7-1(0.11g，1mmol)，90℃搅拌12h；加入后反应溶液由黄色变为橘红色，待反应完全后反应溶液又变为黄色；TLC监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)，得到白色固体粉末0.45g，即为该例中的荧光分子探针III，其结构式如合成路线图2中所示，产率78.6％。
实施例3
荧光探针III的合成
本实施例制备的荧光探针结构式中的R1＝OCH3，R2＝CH3，R3＝CH2CH3。
本实施例的合成技术路线如图3所示，具体包括以下步骤：
化合物4-3的合成
称取化合物1-1茴香偶酰(2.70g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2-2对甲基苯胺(1.07g，10mmol)和化合物3(1.8g，10mmol)，120℃搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的绿色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用浓度为1M氢氧化钠溶液调节体系至中性后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末化合物4-3 4.62g，产率88.3％。
化合物6-3的合成
称取化合物4-3(0.52g，1mmol)和化合物5(0.15g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入2mL无水甲醇；将1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)溶于2ml甲苯中，氮气保护、无水条件下将其加入体系，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行反应，回流12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末化合物6-3 0.49g，产率88.6％
荧光分子探针IV的合成
称取化合物6-3(0.55g，1mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护、无水的条件下加入化合物7-2(0.12g，1mmol)，90℃搅拌12h；加入后反应溶液由黄色变为橘红色，待反应完全后反应溶液又变为黄色；TLC监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5/1,v/v)，得到白色固体粉末0.52g，即为该例中的荧光分子探针IV，其结构式如合成路线图1中所示，产率78.3％。
实施例4
荧光探针的AIE效应验证
精密称取实施例1制备的荧光分子探针II 63mg，加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为2mM的探针储备液。
配置二甲基亚砜：水不同比例的溶液(100:0,90：10，80:20,70:30，60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90,5:95)，将探针母液加入这些溶液中，准确配置成10um的探针溶液。在430nm的荧光分光光度计下测定其在535nm处荧光强度，绘制曲线如图4。
从图4中可以看出，随着溶剂中水含量的增加，探针II在535nm处荧光强度呈现先降低后增加的过程，其中在水含量70％处，荧光强度存在突变点，说明探针具有明显的AIE效应。
实施例5
荧光探针的MTT实验
我们选择了HBMEC,HCT-116,U87,T98,U251,HS683，这六种细胞。分别代表了正常脑细胞，结肠癌肿瘤细胞和脑胶质瘤细胞。不同浓度的探针II与这六种细胞共同孵育4h，再通过MTT法检测细胞增殖情况，得到结果如图5所示。
从图5中可以看出，探针II对这六种细胞均没有显著的细胞毒性，说明探针具有较好的生物安全性。
实施例6
荧光探针对肿瘤细胞的染色实验
首先将探针II与人结肠癌细胞(HCT-116细胞)和人胶质母细胞瘤细胞(U87细胞)共同孵育2h，选择人结肠癌细胞(HCT-116细胞)和人胶质母细胞瘤细胞(U87细胞)检测探针对体细胞和脑胶质瘤细胞的染色成像。与HCT-116细胞相比，用10μm探针II孵育2h后，使用荧光显微镜观察细胞的染色情况，结果如图6。
从图6荧光图像中可以看出，U87细胞出现明显的黄绿色荧光信号，而人结肠癌细胞则没有明显的荧光信号，指示探针II可以选择性染色脑胶质瘤细胞。
实施例7
荧光探针的脑胶质瘤和脑上皮细胞荧光图：
由于脑胶质瘤的浸润性，目前很难精确地在视觉上区分胶质瘤的边界。为了研究探针II在区分胶质瘤细胞和正常脑细胞方面的潜力，我们用10μM的探针II处理人脑微血管内皮细胞(HBMEC)和人胶质母细胞瘤细胞(HS683细胞)2小时，使用荧光显微镜观察细胞的染色情况，结果如图7。
如图7所示，在365nm激发时，HBMEC中几乎没有信号，HS683细胞呈明显的黄绿色荧光。指示探针II可以将脑胶质瘤细胞和正常脑细胞区分染色。
实施例8
荧光探针对不同细胞电位靶向图：
考虑到细胞染色和流式细胞术检测的结果，我们研究了脑细胞在荧光成像差异中的重要作用。如图8所示，HBMEC具有较低的。而胶质瘤细胞(U87、T98、U251、HS683)具有更高的细胞电位。这些结果提示胶质瘤中较高的静电吸引可诱导探针II的高选择性成像。
实施例9
荧光探针的3D脑胶质肿瘤球染色图：
由于350～500μm三维多细胞球体(MCSs)中存在氧浓度梯度，因此，它使MCSs模型成为早期模拟实体瘤的理想模型。本研究以10μM探针II作为培养基，对U87，T98，U251，HS683细胞的MCSs进行了研究，进一步评价探针的穿透效果。培养2h后，从U87，T98，U251，HS683中检测到强黄绿色荧光信号，表明探针II能很容易地穿透球内。由于细胞外基质成分的增加阻碍了探针的细胞外流动，因此球体外层的荧光更明亮，而从核心部位采集的信号较低。这些结果证实探针II在胶质瘤的影像学中具有巨大的应用前景。
实施例10
荧光探针的脑胶质瘤组织染色图：
首先进行裸鼠颅内种植肿瘤，对其其体内肿瘤细胞的荧光成像研究。脑组织切片显示，肿瘤内有较强的探针II荧光信号，但正常脑组织中不存在，突出显示清晰的肿瘤边缘(图10)，与4'检测到的正常脑组织和胶质瘤之间的清晰边界一致，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色由于肿瘤细胞的强烈增殖。结果表明，探针II不仅能够显示微小的胶质瘤，而且能够检测肿瘤边缘。

Claims (10)

1.一种免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针，其特征在于，其结构如式Ⅰ所示：
Figure 268185DEST_PATH_IMAGE001
其中：R1为氢、甲基中的一种；R2为氢、烷氧基中的一种；R3为甲基、乙基中的一种。
2.根据权利要求1所述免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针，其特征在于，其结构是如式Ⅱ所示：
Figure 716484DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求1或2所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）向圆底烧瓶中加入化合物1和溶剂，室温搅拌条件下向反应溶液中滴加入化合物2和化合物3，接着在设定温度和搅拌条件下进行回流反应，反应完全后，调节反应溶液的pH至中性，接着进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到化合物4，其合成路线如下：
Figure 512533DEST_PATH_IMAGE004
；
（2）向圆底烧瓶中加入步骤（1）制备的化合物4、化合物5和溶剂，氮气保护、无水条件下滴加1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，然后再移至设定温度下进行反应，回流；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物6，其合成路线如下：
Figure 173321DEST_PATH_IMAGE005
；
（3）圆底烧瓶中加入步骤（2）制备的化合物6、化合物7和溶剂，氮气保护，加热回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针Ⅰ；其合成路线如下：
Figure 518852DEST_PATH_IMAGE006
。
4.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，溶剂为冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物1与溶剂的摩尔体积比为(1~3) mmol:10 mL；化合物1、化合物2和化合物3的投料摩尔比为1:(1~1.5):(1~1.5)；设定温度为115~125 ℃，回流反应时间为2~12 h。
5.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，溶剂为甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯中的一种或多种，化合物4与溶剂的摩尔体积比为(1~4) mmol:10 mL；化合物4、化合物5和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯的投料摩尔比为1:(1~1.5):(0.01~0.05)；反应的设定温度为85~95 ℃，反应时间为2~24h。
6.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，溶剂为乙腈、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种；化合物6与溶剂的摩尔体积比为(0.5~1.5) mmol:20mL；化合物6与化合物7的投料摩尔比为(1~1.5):(1~1.5)；加热回流反应的温度为85~95 ℃，反应时间为2~24h。
7.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
8.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，纯化过程为：柱层析：石油醚/乙酸乙酯 = 5/1, v/v。
9.根据权利要求3所述的免洗型脑胶质瘤影像荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，纯化过程为：柱层析：石油醚/乙酸乙酯 = 5/1, v/v。
10.一种免洗型脑胶质瘤成像的荧光探针试剂盒，其特征在于，该探针试剂盒中包括权利要求1所述的荧光分子探针I。
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