CN108558967B

CN108558967B - 一种细胞膜成像荧光探针及其应用

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Publication number: CN108558967B
Application number: CN201810273391.2A
Authority: CN
Inventors: 黄永伟; 刘中华; 刘芳; 李晓; 王俊超
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: CN108558967A

Abstract

本发明具体涉及一种细胞膜成像荧光探针，具体为一种糖基取代的苝酰亚胺衍生物细胞膜成像染料。该衍生物一端引入烷基链，一端引入吡喃糖。可在体外自组装成纳米颗粒，进入细胞后，重分布于细胞膜，经激发后可对胞膜特异性成像。该染料与传统胞膜荧光染料相比，具有较好的生物相容性，长效的光和酸稳定性，且制备方法简单，经济，可广泛应用于细胞膜成像研究，特别是弱酸性环境下的肿瘤细胞的细胞膜的成像。

Description

一种细胞膜成像荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种细胞膜成像荧光探针及其应用。

背景技术

细胞膜又称细胞质膜，是真核细胞中围绕在细胞表面的一层厚度约7.5 nm的双层膜。细胞膜不仅在结构上构成了细胞的边界，使细胞形成了稳定的内环境，而且它在细胞与外环境之间的物质运输以及信息、能量交换过程中发挥着重要功能。此外，细胞膜还与细胞贴壁、伸展、分裂、增殖、胞吞、外排、凋亡以及坏死等重要的细胞生物学行为密切相关。而研究人员对细胞膜功能进行研究时，需借助相关工具，其中最常用、最方便、最直观的莫过于细胞膜荧光标记技术。通过使用合适的荧光染料不仅可以确定胞膜位置所在，还可通过荧光变化追踪细胞膜的动态形貌变化，为观察细胞生命过程中的囊泡运输、细胞贴壁、分裂、凋亡和坏死等重要的生命活动提供有效、有力的工具，并对细胞组织工程研究具有极为重要的意义。

目前，常用的商品化细胞膜荧光染料根据作用方式可分为以下两种：（1）基于疏水相互作用的荧光探针；（2）基于特异性识别相互作用的荧光探针。基于特异性识别相互作用的荧光探针（如麦胚凝集素分子），可以识别细胞膜表面糖分子的唾液酸残基。由于不同细胞表面的糖分子经常发生变化，以及不同细胞间的唾液酸含量差异，这类染料具有细胞种类依赖性，限制了其广泛应用。基于疏水相互作用的荧光探针（如碳菁类DiO，DiD，DiI和DiA）使用较为广泛，这类荧光探针中含有可以锚定细胞膜的疏水链段，可通过疏水作用与细胞膜结合从而定位于细胞膜。然而这类有机小分子水溶性较差，成像效率低，容易发生光漂白及易被细胞内吞。因而，研究人员开始关注开发两亲性的细胞膜荧光探针，通过同时修饰亲水和疏水基团，可以延长荧光探针在胞膜的驻留时长，提高了其细胞膜成像能力，但合成复杂、稳定性较差、成本较高等限制了其应用。

苝酰亚胺衍生物具有光热性能稳定、荧光产率高、不易光漂白及易于修饰等特性，在光电和生物材料方面有着广泛应用。研究人员曾利用表面正负静电作用开发了基于苝酰亚胺衍生物的细胞膜成像试剂，但过多的正电荷易对生物体产生毒害限制了其应用。而且，大多数肿瘤细胞的弱酸微环境也对表面带有正电荷的苝酰亚胺衍生物荧光探针的使用提出了挑战。因此，进一步发展具有高荧光强度和酸稳定性的苝酰亚胺衍生物细胞膜荧光探针对于细胞膜的研究，尤其是肿瘤微环境下细胞膜研究具有非常重要的意义。

四川大学兰静波课题组制备酰胺氮原子处含有1,4,7,10-四氮杂环十二烷取代基团的苝酰亚胺衍生物，该化合物可以特异性与Pb²⁺结合，渗透细胞膜，应用于生物细胞成像技术。其中使用Pb²⁺与化合物络合可以增加在细胞显像时的荧光强度，但是该络合物在酸性条件稳定较差，易于解离导致其荧光淬灭。由此可以看出，细胞探针在酸性条件下稳定的成像是一个巨大的挑战。

发明内容

本发明提供了一种细胞膜成像荧光探针，可特异性对细胞膜成像，经连续激发，荧光性能稳定，并且能够在酸性条件下稳定的成像。

本发明采取的详细技术方案如下：

一种细胞膜成像荧光探针，所述探针为一种含有吡喃糖苷的苝酰亚胺衍生物，其具有如下式（I）所示结构：

式（I）。

进一步地，所述R基团为正辛基，所述荧光探针的化学名称为：N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺；其具有以下式（II）所示结构：

式（II）。

所述细胞荧光探针N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺的制备方法，具体步骤如下：

将0.5 g（0.99 mmol）N-辛烷基-3,4:9,10-苝四甲酸-3,4-酐-9,10-亚胺加入到100 mL的圆底烧瓶中，依次加入0.35 g（4-氨基苯基)- β-D-吡喃葡萄糖苷，1.09 g醋酸锌，15.0 g 咪唑，氮气保护，于160 ℃下反应2.5 h。反应停止后，冷却至室温，将反应物转移至480 mL的乙醇和80 mL水混合溶液中，搅拌，静置过夜，抽滤，得到红色固体，将其真空干燥，随后用CH₂Cl2和少量DMF洗涤，得N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺。

本发明所述荧光探针应用于在细胞成像中：所述探针附着于细胞膜表面或进入细胞后分布于细胞膜上，以使细胞膜显像。

进一步地，应用于pH 6.0-7.4环境下肿瘤细胞膜的成像。所述肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞。

利用所述荧光探针的细胞成像方法，具体包括如下步骤：

1）分别准备含有所述荧光探针的工作液和预培养细胞，其中所述含有荧光探针的工作液用磷酸盐缓冲溶液配置；

2）将含有所述荧光探针的工作液与细胞共同孵育25-35 min，与细胞共同孵育时荧光探针的浓度为5-20μM；

3）经过激发形成细胞图像、并进行观察，其中激发光的波长为605nm。

进一步地，所述肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞。

本发明有益效果：

1）本发明使用苝酰亚胺衍生物，即在苝四羧酸二酐的一端引入烷基链，用于和细胞膜脂质双分子层通过疏水作用相结合，另外一端引入吡喃糖基增加该衍生物的水溶性，并赋予化合物双亲性，可在PBS溶液中自组装为纳米颗粒，待细胞内吞后，可在胞质中解聚为单体，重分布于细胞膜表面以及抑制化合物的团聚改善胞膜成像效果。

本发明所述N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺可特异性对细胞膜成像，经连续激发，荧光性能稳定，连续照射9 min可保持初始荧光强度。

2）本发明中，N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺具有较强的荧光强度，由于化合物自身具有稠环共轭结构，并使之具有良好的耐酸性，因此，在酸性环境下仍可以保持稳定的荧光成像能力。尤其在pH = 6的弱酸环境中，本申请所述N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺荧光成像性能稳定，具有良好的耐酸性和光稳定性。

附图说明

图1为（A）PDI-OBAG在SH-SY5Y细胞的荧光成像与共DiO共定位图和（B）空白试验组；

图2为（A）PDI-OBAG细胞荧光成像阳性率与（B）平均荧光图；

图3为PDI-OBAG在（A）pH = 7.4 和（B）pH = 6.0时细胞荧光成像图；

图4为（A）PDI-OBAG 和（B）DiI连续激光照射荧光成像图和（C）相应荧光强度；

图5为PDI-OBAG和（A）DiI和（B）DiO生物兼容性对照图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该理解为对本发明请求保护范围的限制。

主要试剂：

cck-8试剂盒、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）、DMEM（Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium）、血清均为市售产品；

常用培养基和溶液：

75%的酒精（75%体积分数的乙醇水溶液）、0.05%胰酶（trypsin-EDTA-D-Hanks，含有体积分数为0.05%胰酶的PBS）、DiO（10 μM）；DiI（10 μM）；Hoechst33258（10 μM）；完全培养基（包括以下体积分数物质：89%的DMEM， 10%的血清， 1%的双抗）均按照现有技术制备即可，不再详细描述；

主要仪器：

酶标仪，型号TECAN-Spark，购买自TECAN；

激光共聚焦显微镜，型号（LEXT OLS5000），购买自奥林巴斯；

倒置荧光显微镜，型号（麦克奥迪-AE2000），购买自麦克奥迪；

透射电子显微镜，型号（JEM-2010），购买自日本电子光学公司。

生物材料：

神经母细胞瘤细胞（Human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y），购买自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection, ATCC）。

实施例1

本实施例提出一种含有吡喃糖苷苝酰亚胺衍生物的细胞膜荧光探针，N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺，简称：PDI-OBAG，具有以下分子结构式：

荧光探针的制备方法如下：

将0.5 g（0.99 mmol）N-辛烷基-3,4:9,10-苝四甲酸-3,4-酐-9,10-亚胺加入到100 mL的圆底烧瓶中，依次加入0.35 g（4-氨基苯基)- β-D-吡喃葡萄糖苷，1.09 g醋酸锌，15.0 g 咪唑，氮气保护，于160 ℃下反应2.5 h。反应停止后，冷却至室温，将反应物转移至480 mL的乙醇和80 mL水混合溶液中，搅拌，静置过夜，抽滤，得到红色固体，将其真空干燥，随后用CH₂Cl2和少量DMF洗涤，得N-正辛基-N’-((4-氨基苯基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)-3,4:9,10-苝酰亚胺（0.55 g，产率73.4%）。¹H NMR (400MHz, CF₃COOD): δ = 0.88-1.67 (m,15 H), 3.33-3.71 (m, 6 H), 4.57 (s, 1 H), 4.82 (t, 2 H, J = 7.6 Hz), 5.03 (m,2 H), 5.11 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.45 (s, 1 H), 7.26 (d, 4 H, J = 7.2 Hz),8.11 (d, 8 H, J = 26.9 Hz). MS (MALDI-TOF): calcd for C₄₄H₄₀N₂O₁₀, 756.27 m/z,found 756.10. Anal. Calcd for C₄₀H₄₀N₂O₁₀: C, 69.83; H, 5.53; N, 3.70. Found:C, 69.73; H, 5.96; N, 3.58。

实施例2

基于实施例1中所述苝酰亚胺衍生物的细胞膜荧光成像的应用：

1）将PDI-OBAG溶解于PBS中得到含有荧光探针的工作液，所述工作液荧光探针的浓度为10μM；

2）使用步骤1）中所述的工作液与SH-SY5Y细胞共同孵育25-35 min，经激发形成细胞图像；所述激发光的波长为605 nm。

具体步骤如下：

一、所述SH-SY5Y细胞的培养过程：

1. SH-SY5Y细胞的复苏

（1）将SH-SY5Y细胞的冻存管迅速置于37 ℃温水中，轻轻摇动令其尽快融化，水浴30秒后，取出冻存管；

（2）使用75%酒精对冻存管外表面消毒后，使用吸管吸出冻存管中的细胞悬液并注入离心管，在离心管中加入细胞悬液体积8倍的DMEM，1000 rpm下离心5 分钟，弃上清液，再加入上述体积的DMEM制备成细胞悬液后再重复离心1次；

（3）在离心管中加入完全培养基，将稀释后得到的细胞悬液接种至培养瓶，放入37℃、5% CO₂环境的培养箱中培养，一天后更换1次培养基。

（4）在培养过程中每3天更换一次完全培养基，细胞的生长每6天需要传代1次。

2. SH-SY5Y细胞的传代

（1）待细胞长满培养瓶底部后，弃去培养瓶中的培养液，用5 mL的PBS溶液洗涤细胞两次，以除去含有蛋白酶抑制剂的血清；

（2）清洗后在培养瓶中加入1 mL 0.05%胰酶，并置于37 ℃，5% CO₂的恒温培养箱培养中孵育2分钟，然后在倒置显微镜下观察细胞是否分离。（为避免细胞成团，切勿在等待细胞分离过程中摇摆培养瓶。如果细胞很难分离扩散，可再放入37 ℃，5% CO₂的恒温培养箱继续孵育1-2分钟，以加速细胞扩散分离）；

（3）加2 mL的完全培养基（完全培养基中的血清含有蛋白酶抑制剂可使胰酶失活）并用移液器轻轻吹打，充分吹散细胞，以使细胞均匀的分散于完全培养基中；

（4）使用移液器将其移入15 mL离心管中，1000 rpm离心3分钟，弃去上清液。用1mL无菌1×PBS将细胞悬起，并吹打均匀；

（5）培养瓶中加入5 mL完全培养基，再加入0.2 mL步骤（4）中适量细胞悬液入培养瓶中。（传代比例在1:10至1:5之间）。将不同培养时期的细胞培养物置于倒置显微镜下直接观察拍照，或通过间接免疫荧光细胞化学法，在荧光显微镜下直接观察拍照细胞生长情况。

二、PDI-OBAG与SH-SY5Y细胞共同孵育

（1）收集对数生长期的SH-SY5Y细胞，于6孔板内培养，每孔以2.0×10⁵个细胞接种，其中每孔加入1 mL完全培养基。染色时细胞融合度达到80%以上；

（2）将PDI-OBAG溶解于50 μL PBS中，轻轻混匀，得到含有荧光探针的工作液；

（3）在76 μL的DMEM中加入24 μL步骤(2)中所得工作液，轻轻摇匀后加入6孔板中，混匀，PDI-OBAG终浓度为10 μM。在培养箱中共同孵育30 min。

（4）使用DiO（10 μM）和Hoechst33258（10 μM）使用常规方法分别进行荧光染色，然后与倒置荧光显微镜下观察。

三、SH-SY5Y细胞膜荧光成像试验

1．流式细胞仪观察

将经过PDI-OBAG共同孵育后的SH-SY5Y细胞，使用PBS冲洗细胞、胰酶消化、1000转/分钟离心3分钟得到的细胞按照10000个细胞加500 μL的PBS重悬浮细胞，使用流式细胞仪分析。得出的数据经软件分析。

2．共聚焦显微镜监测

1）将经过PDI-OBAG共同孵育后的SH-SY5Y细胞使用DiO（10 μM）和Hoechst33258（10 μM）分别进行染色。使用激光共聚焦显微镜观察细胞，结果如图2所示，DiO的绿色荧光和PDI-OBAG的红色荧光都可以对细胞膜成像，merge图的荧光证明存在明显的共定位，证明PDI-OBAG具有细胞膜成像能力。

2）在进行酸稳定性检测时，除使用1 M HCl调整完全培养基的pH至6.0，其他条件不变。使用激光共聚焦显微镜观察细胞，结果如图4所示，在pH = 6.0，PDI-OBAG依然可以对细胞膜清晰成像，在肿瘤的微酸环境中具有良好的应用前景。

3）进行荧光稳定性实验时，将经过PDI-OBAG共同孵育后的SH-SY5Y细胞使用DiI（10 μM）和Hoechst33258（10 μM）分别进行染色。使用激光共聚焦显微镜连续照射细胞，分别在0 min、3 min、6 min、9 min进行拍照观察，结果如图5所示，DiI在激光连续照射3 min后荧光已经明显减弱，而PDI-OBAG经连续照射9 min后，荧光强度依然保持原始强度的95%以上，证明PDI-OBAG具有优异的光稳定性。PDI-OBAG能够在激光激发下连续照射时间可达到30min。

3．PDI-OBAG生物兼容性实验

使用CCK-8法测定PDI-OBAG对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。

1）待SH-SY5Y细胞生长到80%的融合时用PBS冲洗、0.05%胰酶消化，然后将SH-SY5Y细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板；

2）待96孔板中的细胞贴壁后，每孔加入100 μL PDI-OBAG浓度分别为1, 10, 20,30 μM的完全培养基，继续培养24小时；

3）去除96孔板中的培养基，再加入含10 μL CCK-8的完全培养基100 μL，充分震荡后使用酶标仪于450 nm波长检测溶液吸光值，根据实验结果绘制细胞存活率图，如图5所示，在不同浓度作用下, PDI-OBAG与细胞孵育后24小时，生存率即使30μM浓度作用下，细胞增殖率依然保持在90%以上，而DiO和DiI在10 μM工作液浓度下，细胞增值率仅为89%和67%，说明PDI-OBAG具有良好的生物兼容性。

本发明成功设计和合成了PDI-OBAG，其生物兼容性好，有利于在生物体检测的应用。最重要的是PDI-OBAG具有良好的酸稳定性和光稳定性，并能特异性对细胞膜进行荧光成像，适合生物体细胞膜的长时间荧光监测，尤其适合在肿瘤的弱酸环境下利用荧光监测细胞膜的活动。

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

Claims

1.一种荧光探针在制备细胞膜成像剂中的应用，其特征在于，所述探针附着于细胞膜表面或进入细胞后分布于细胞膜上，以使细胞膜显像，所述探针结构如下：

。

2.如权利要求1所述荧光探针在制备细胞膜成像剂中的应用，其特征在于，应用于pH6.0-7.4环境下肿瘤细胞膜的成像。

3.如权利要求2所述荧光探针在制备细胞膜成像剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞。