CN112939935B - 一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用 - Google Patents

一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用。该类荧光探针以萘酰亚胺为母体，4位引入一个氮杂环酮类取代基，N位引入一个N‑(2‑胺乙基)吗啉取代基，能够对溶酶体快速、准确标记，如下式(1)所示，其中R为氮杂环酮类取代基，氮杂环包括四元氮杂环、五元氮杂环、六元氮杂环等。该类探针发射荧光需要的激发能量较低，能够在低浓度下，对活细胞内的溶酶体进行标记并双光子荧光成像。且该类荧光探针在双光子荧光成像中可以对深层组织进行穿透，这使得该类探针将成为研究溶酶体运输等生命过程强有力工具。

Description

一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用。
背景技术
溶酶体是直径约500nm、单层膜围绕、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器，能够参与许多生理过程，例如骨骼和组织重塑，质膜修复，胆固醇稳态，以及细胞死亡和细胞信号传导等。此外，肿瘤侵袭和转移在很大程度上与溶酶体运输的改变，溶酶体酶的表达和活性有关。因此，活细胞内溶酶体的荧光标记对于研究溶酶体的运输模式及其在肿瘤侵袭中的作用具有重大意义。
然而，目前大多数商业探针采用可见光或紫外光激发，存在穿透深度低、pH敏感性、水溶性差和光稳定性差等缺点，严重限制了
其在组织成像中的应用。双光子荧光探针由于激发光波长较长(700-1000nm)，对双光子吸收的激光强度二次依赖性，从而有了诸如高度局部激发、延长观察时间、深层组织穿透、高空间分辨率、低背景信号之类的优势。因此，溶酶体靶向的双光子荧光探针也将成为研究溶酶体运输等生命过程的强有力工具。
发明内容
本发明的目的是提供一类用于溶酶体靶向荧光探针的合成及基于细胞的双光子荧光成像研究。
本发明提供了一类用于溶酶体标记的荧光探针，该荧光探针以萘酰亚胺为母体，在其4位引入一个氮杂环酮类取代基，N位引入一个N-(2-胺乙基)吗啉取代基，设计并合成了一类能够对溶酶体快速、准确标记的双光子荧光探针。该荧光探针满足了深层组织穿透、高空间分辨率、低背景信号之类的要求，使得其将成为研究溶酶体运输等生命过程的强有力工具。
一类用于溶酶体靶向荧光探针，结构如下：
Figure BDA0002310812580000021
其中R为氮杂环酮类取代基，氮杂环包括四元氮杂环、五元氮杂环、六元氮杂环等。
该类探针结构式(1)为下列中的一种，
Figure BDA0002310812580000022
一类用于溶酶体标记的荧光探针的合成方法，其合成路线，如下：
Figure BDA0002310812580000031
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)的合成
将4-溴-1,8-萘酐溶于乙醇中，而后向该反应液中加入N-(2-胺基乙基)吗啉。将该反应液加热至60-140℃，搅拌0.5-4h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得中间产物N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺。
(2)荧光探针的合成
Figure BDA0002310812580000032
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺，RH，Cs2CO3,，G3-Xantphos(XantPhos Pd G395％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入干燥的二氧六环，并加热至60-130℃。4-10h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得固体(荧光探针)。
所述氮杂环酮RH为
Figure BDA0002310812580000033
步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐：N-(2-胺基乙基)吗啉的质量比为1：0.1-0.5；4-溴-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:50-110g/mL。
步骤(2)中，中间体Lyso-Br：氮杂环酮(RH)的质量比为1:0.3-1；Cs2CO3与氮杂环酮(RH)的摩尔比为1:1；G3-Xantphos(XantPhos Pd G3 95％)为Lyso-Br的1mol％；中间体Lyso-Br的质量与二氧六环的体积比为1:60-100g/mL。
上述一类溶酶体探针对活细胞内的溶酶体具有高度选择性，能够对溶酶体进行特异性识别。
一类新型溶酶体靶向的荧光探针在细胞、组织样本进行双光子荧光成像。
一类新型溶酶体靶向的荧光探针在双光子荧光成像中的应用。
本发明优点与有益效果：
该类探针在合成方面有以下优点：原料廉价易得，合成方法简单等优点。
该类探针的荧光激发波长、发射波长偏长，能够在低浓度下，对活细胞内的溶酶体进行标记并双光子荧光成像。本发明中的探针满足了深层组织穿透、高空间分辨率、低背景信号之类的要求，使得其将成为研究溶酶体运输等生命过程的强有力工具。
附图说明
图1为实施例1制备的Lyso-405的核磁共振氢谱。
图2为实施例1制备的Lyso-405的核磁共振碳谱。
图3为实施例1制备的溶酶体探针Lyso-405在水中的激发光谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图4为实施例1制备的溶酶体探针Lyso-405在甲醇中加酸和不加酸两种情况下的荧光成像图。
图5为实施例1制备的探针Lyso-405在Hela细胞中的单光子荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图6为实施例1制备的探针Lyso-405在Hela细胞中的双光子荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
本发明提供了一类溶酶体靶向的荧光探针及其制备方法和在荧光方面的应用。
下面将对本发明实施例中的方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面三个实施(实施例1-3)例为Lyso-405的制备，其反应式如下所示：
Figure BDA0002310812580000051
实施例1.
溶酶体探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成方法。
中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)的合成：
Figure BDA0002310812580000052
将4-溴-1,8-萘酐(277.07mg,1.00mmol)溶于13.85mL乙醇中，而后向该反应液中加入0.03mL(0.21mmol)N-(2-胺基乙基)吗啉。将反应液加热至60℃，搅拌0.5h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺56.40mg，产率69％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),4.34(t,J＝7.2Hz,2H),3.68(br,4H),2.72(br,2H),2.60(br,4H).
探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成
Figure BDA0002310812580000061
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(50.60mg，0.13mmol)，2-氮杂环丁酮(15.18mg，0.21mmol)，Cs2CO3(68.42mg，0.21mmol)，G3-Xantphos(XantPhos Pd G3 95％)(1mol％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入3.04mL干燥的二氧六环，并加热至60℃。4h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝200:1-50:1)得白色固体N-(2-吗啉基)乙基-4-氮杂环丁酮基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)37.98mg，产率77％。
其核磁谱图氢谱、碳谱如图1、2所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86–8.76(m,1H),8.61(d,J＝7.2Hz,1H),8.53(d,J＝8.1Hz,1H),7.75(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),4.32(t,J＝7.0Hz,2H),4.06(t,J＝4.8Hz,2H),3.70–3.61(m,4H),3.32(t,J＝4.8Hz,2H),2.70(t,J＝7.0Hz,2H),2.59(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.31,164.13,163.54,140.84,131.85,131.73,131.30,129.43,126.31,123.77,122.63,119.11,116.05,67.06,56.10,53.82,41.08,37.22,36.22.
经测试，其结构如上式Lyso-405所示，它的荧光性能如下：将该探针Lyso-405溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的Lyso-405母液，取20μL母液，加入4mL去离子水中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。
Lyso-405在水中的荧光激发与发射归一化谱图如图3所示：在水中的荧光激发波长为375nm，荧光发射波长为467nm，且荧光具有很好的稳定性。
实施例2
溶酶体探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成方法。
中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)的合成：
Figure BDA0002310812580000071
将4-溴-1,8-萘酐(277.07mg,1.00mmol)溶于22.17mL乙醇中，而后向该反应液中加入0.084mL(0.64mmol)N-(2-胺基乙基)吗啉。将反应液加热至100℃，搅拌2h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺164.41mg，产率66％。
探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成
Figure BDA0002310812580000072
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(50.60mg，0.13mmol)，2-氮杂环丁酮(35.42mg,0.50mmol)，Cs2CO3(162.91mg,0.50mmol),G3-Xantphos(XantPhos Pd G3 95％)(1mol％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入4.05mL干燥的二氧六环，并加热至95℃。7h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝200:1-50:1)得白色固体N-(2-吗啉基)乙基-4-氮杂环丁酮基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)38.97mg，产率79％。
经检测，其结构如上式Lyso-405所示。它的荧光性能如下：荧光探针Lyso-405的浓度为10μM，在去离子水中的荧光激发波长为375nm，荧光发射波长为467nm，且荧光具有很好的稳定性。
实施例3
溶酶体探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成方法。
中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)：
Figure BDA0002310812580000081
将4-溴-1,8-萘酐(277.07mg,1.00mmol)溶于30.48mL乙醇中，而后向该反应液中加入0.14mL(1.06mmol)N-(2-胺基乙基)吗啉。将反应液加热至140℃,搅拌4h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺284.15mg，产率73％。
探针N-2-吗啉基乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)的合成
Figure BDA0002310812580000091
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(50.60mg，0.13mmol)，2-氮杂环丁酮(50.60mg,0.71mmol)，Cs2CO3(231.33mg，0.71mmol),G3-Xantphos(XantPhos Pd G3 95％)(1mol％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入5.06mL干燥的二氧六环，并加热至130℃。10h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝200:1-50:1)得白色固体N-(2-吗啉基)乙基-4-氮杂环丁酮基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-405)42.51mg，产率84％。
经检测，其结构如上式Lyso-405所示。它的荧光性能如下：荧光探针Lyso-405的浓度为10μM，在去离子水中的荧光激发波长为375nm，荧光发射波长为467nm，且荧光具有很好的稳定性。
实施例4
本实施例进行荧光探针Lyso-52的制备，其反应式如下所示：
Figure BDA0002310812580000092
中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)：
Figure BDA0002310812580000101
将4-溴-1,8-萘酐(277.07mg,1.00mmol)溶于22.17mL乙醇中，而后向该反应液中加入0.084mL(0.64mmol)N-(2-胺基乙基)吗啉。将反应液加热至100℃，搅拌2h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺164.41mg，产率66％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),4.34(t,J＝7.2Hz,2H),3.68(br,4H),2.72(br,2H),2.60(br,4H).
探针Lyso-52的合成
Figure BDA0002310812580000102
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(50.60mg，0.13mmol)，2-吡咯烷酮(35.42mg,0.42mmol)，Cs2CO3(136.84mg，0.42mmol)，G3-Xantphos(XantPhos Pd G395％)(1mol％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入4.05mL干燥的二氧六环，并加热至95℃。7h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得固体(Lyso-52)41.43mg，产率81％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85–8.75(m,1H),8.60(d,J＝7.2Hz,1H),8.53(d,J＝8.1Hz,1H),7.75(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),4.06(t,J＝4.8Hz,2H),3.70–3.61(m,4H),3.32(t,J＝4.8Hz,2H),2.70(t,J＝7.0Hz,2H),2.59(s,4H),2.49(t,J＝6.8Hz,2H),2.25-2.19(m,2H).
经检测，其结构如上式Lyso-52所示。
实施例5
本实施例进行荧光探针Lyso-62的制备，其反应式如下所示：
Figure BDA0002310812580000111
中间体N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(Lyso-Br)：
Figure BDA0002310812580000112
将4-溴-1,8-萘酐(277.07mg,1.00mmol)溶于22.17mL乙醇中，而后向该反应液中加入0.084mL(0.64mmol)N-(2-胺基乙基)吗啉。将反应液加热至100℃，搅拌2h。冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺164.41mg，产率66％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),4.34(t,J＝7.2Hz,2H),3.68(br,4H),2.72(br,2H),2.60(br,4H).
探针Lyso-62的合成
Figure BDA0002310812580000121
N-(2-吗啉基)乙基-1,8-萘酰亚胺(50.60mg,0.13mmol)，2-氮己环酮(35.42mg,0.36mmol)，Cs2CO3(117.30mg,0.36mmol),G3-Xantphos(XantPhos Pd G395％)(1mol％)置于双口瓶中并用氮气置换3-4次。向反应体系中加入4.05mL干燥的二氧六环，并加热至95℃。7h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得固体Lyso-62 41.32mg，产率78％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.87–8.77(m,1H),8.62(d,J＝7.2Hz,1H),8.55(d,J＝8.1Hz,1H),7.76(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,1H),4.59(t,J＝6.9Hz,2H),4.08(t,J＝4.8Hz,2H),3.71–3.62(m,4H),2.71(t,J＝7.0Hz,2H),2.61(s,4H),2.24(t,J＝6.8Hz,2H),1.94-1.85(m,2H),1.52-1.44(m,2H).
经检测，其结构如上式Lyso-62所示。
实施例6
荧光探针Lyso对活细胞染色后的双光子荧光成像图。取0.5μL荧光探针Lyso母液溶于1mL细胞培养液中，在37℃下，5％CO2下孵育10分钟后分别进行单光子、双光子荧光成像。
Lyso-405对活细胞染色后单光子荧光成像如图5所示。
Lyso-405对活细胞染色后双光子荧光成像如图6所示。
Lyso标记的溶酶体清晰可见，实现了荧光探针Lyso对活细胞内的溶酶体进行特异性荧光标记。

Claims (6)

1.一类用于溶酶体靶向荧光探针，其特征在于：
该类探针结构式（1）为下列中的一种，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种如权利要求1所述用于溶酶体靶向荧光探针的合成方法，其特征在于，该方法包含以下合成步骤：
（1）中间体4-溴-N-（2-吗啉基）乙基-1,8-萘酰亚胺（Lyso-Br）的合成
将4-溴-1,8-萘酐溶于乙醇中，而后向该反应液中加入N-（2-胺基乙基）吗啉；将该反应液加热至60-140 oC，搅拌0.5-4 h；冷却降温后，抽滤并用乙醇洗涤后的灰白色固体，真空干燥得中间产物4-溴-N-（2-吗啉基）乙基-1,8-萘酰亚胺；
（2）荧光探针的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，
4-溴-N-（2-吗啉基）乙基-1,8-萘酰亚胺，氮杂环酮RH，Cs2CO3，G3-Xantphos为XantPhosPd G3 95%置于双口瓶中并用氮气置换3-4次；向反应体系中加入干燥的二氧六环，并加热至60-130oC；4-10 h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得固体（荧光探针）。
3.根据权利要求2所述的用于溶酶体靶向荧光探针的合成方法，其特征在于，氮杂环酮RH为
Figure DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure DEST_PATH_IMAGE016
或
Figure DEST_PATH_IMAGE018
。
4.根据权利要求2所述的用于溶酶体靶向荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，4-溴-1,8-萘酐：N-（2-胺基乙基）吗啉的质量比为1：0.1-0.5；
4-溴-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:50-110 g/mL。
5.根据权利要求2所述的用于溶酶体靶向荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，中间体Lyso-Br：氮杂环酮（RH）的质量比为1:0.3-1；Cs2CO3与氮杂环酮（RH）的摩尔比为1:1；G3-Xantphos为XantPhos Pd G3 95%为Lyso-Br的1 mol%；中间体Lyso-Br的质量与二氧六环的体积比为1:60-100 g/mL。
6.一种以非疾病诊断和治疗方法为目的的如权利要求1所述的用于溶酶体靶向荧光探针在活细胞内对溶酶体中的双光子荧光成像领域的应用。
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