CN113329997A

CN113329997A - 用于活细胞和深部组织中细胞器成像的光稳定的荧光化合物

Info

Publication number: CN113329997A
Application number: CN202080009227.6A
Authority: CN
Inventors: 唐本忠; 牛广乐
Original assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-08-31
Also published as: WO2020147653A1

Abstract

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光化合物。这些化合物表现出近红外固态发射、大斯托克斯位移(>180nm)、高荧光量子产率(12.8％至13.7％)和良好的双光子吸收截面(高达88GM)。这些化合物可以在活细胞和深部组织中提供膜和特定细胞器的染色。本发明的化合物还显示出高生物相容性以及在单光子和双光子持续照射下的高光稳定性。

Description

用于活细胞和深部组织中细胞器成像的光稳定的荧光化合物

技术领域

本主题大体上涉及使用一系列具有聚集诱导发光(AIE)特性的光稳定的荧光化合物进行特异性细胞器染色，特别是进行活细胞和深部组织中的细胞器成像。

背景技术

荧光成像技术由于其出色的灵敏度、高选择性、能够快速采集且易于操作，因此在实时跟踪、动态变化的可视化以及活体样本的成像引导的治疗中受到了广泛的关注。荧光成像的性能高度依赖于所用的荧光团。为了长期跟踪与生物事件有关的动态变化，作为荧光团的一个特别重要的参数，需要慎重考虑光稳定性。但是，光稳定性是传统荧光团特别是商业染料(如MitoTracker Green FM)普遍关注的问题。常规荧光团的这一缺点通常使得难以捕获最佳荧光图像，从而导致效率低下和错误的生物学信号。另外，由于光致漂白而产生的一些光氧化产物会严重破坏活体样本。这些荧光团的不稳定的抗光致漂白性通常可以归因于这些荧光团的低浓度。但是，增加这些荧光团的浓度通常会导致聚集引起的猝灭(ACQ)。因此，开发具有增强的光稳定性以及抑制ACQ作用的新型荧光团是特别重要的。

唐本忠院士和他的同事发现了独特的有机荧光团，这些有机荧光团在有机溶剂中没有发射或有微弱的发射，但在聚集形式或固态形式时发射显著增强。这种现象被首先称为聚集诱导发光(AIE)。他们提出了限制分子内运动(RIM)的概念以解释这种独特现象。基于RIM，聚集诱导发光团(AIEgen)可以以更高的浓度用于生物医学成像应用，从而带来高的光稳定性以及明亮的发射。实际上，许多AIEgen在生物成像中均表现出高的抗光致漂白性。

与短波长发射荧光团相比，长波长发射AIEgen，尤其是近红外(NIR)AIEgen，由于在活体生物样本中的组织穿透力强、光损伤小、信噪比高，因此在生物成像方面具有巨大优势。到目前为止，大多数NIR AIEgen是有机纳米颗粒(NP)，并且通常使用两亲性表面活性剂来实现这些NIR AIEgen NP在活体样本中的内在化。但是，制备这些NIR AIEgen NP既复杂又费时，并且使用商业两亲性表面活性剂(例如DSPE-PEG)非常昂贵。因此，需要在活细胞和组织中具有优异穿透性的固有NIR AIEgen。

氰基茋因其合成简便且易于纯化而被广泛研究并应用于许多领域，例如自组装、化学传感器和生物成像。先前的研究表明，引入强吸电子基团(如-F和-CN)可以提高荧光团的抗光致漂白性。尽管在开发NIR氰基茋方面取得了一些成就，但这些AIEgen基本上显示出极低的细胞穿透性。

发明内容

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光化合物。这些化合物表现出近红外固态发射、大斯托克斯位移(>180nm)、高荧光量子产率(12.8％至13.7％)和良好的双光子吸收截面(高达88GM)。这些化合物可以在活细胞中提供膜和特异性细胞器染色。本发明的化合物还显示出高生物相容性以及在单光子和双光子持续照射下的高光稳定性。

在一个实施方案中，荧光化合物可以包括具有以下骨架结构式的化合物：

其中，各R₁、R₂、R₃和R₄是取代或未取代的，并且独立地选自由C_nH_2n+1、C₆H₅、C₇H₇、C₁₀H₇、C_nH_2nSO₃ ^-、C_nH_2nCOOH、C_nH_2nNCS、C_nH_2nN₃、C_nH_2nNH₂、C_nH_2nCl、C_nH_2nBr和C_nH_2nI组成的组；

其中，各X是取代或未取代的，并且独立地选自由Cl、Br、I、NO₃、ClO₄、BF₄、PF₆、CF₃CO₂和CF₃SO₃组成的组；并且

其中，各n独立地为在0至16范围内的整数。

在一个实施方案中，化合物选自由下列组成的组：

在一个实施方案中，考虑了细胞成像的方法，包括使靶细胞与本发明的化合物接触并使用成像方法识别靶细胞中的目的靶标。成像方法可以包括单光子荧光显微镜检查法或双光子荧光显微镜检查法。在一个实施方案中，成像方法包括照射化合物约310秒。在一个实施方案中，识别目的靶标可以包括可视化活细胞中与细胞器相关的变化。

在一个实施方案中，目的靶标选自由细胞膜和细胞器组成的组。在一个实施方案中，细胞器是线粒体。在一个实施方案中，靶细胞是活细胞。在一个实施方案中，靶细胞在活组织中。在一个实施方案中，靶细胞在活组织中的深度为约50μm至约100μm。

附图说明

现在将参考附图详细说明各种实施方案。

图1示出了化合物2在CDCl₃中的¹H NMR谱图。

图2示出了化合物2在CDCl₃中的¹³C NMR谱图。

图3示出了化合物3在CDCl₃中的¹H NMR谱图。

图4示出了化合物3在CDCl₃中的¹³C NMR谱图。

图5示出了化合物4在CDCl₃中的¹H NMR谱图。

图6示出了化合物4在CDCl₃中的¹³C NMR谱图。

图7示出了CS-Py⁺SO₃ ^-在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图。

图8示出了CS-Py⁺SO₃ ^-在CDCl₃/CD₃OD＝2:1溶液中的¹³C NMR谱图。

图9示出了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图。

图10示出了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹³C NMR谱图。

图11示出了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹⁹F NMR谱图。

图12示出了CS-Py⁺SO₃ ^-的HRMS谱图。

图13示出了CS-Py⁺的HRMS谱图。

图14示出了(A)CS-Py⁺SO₃ ^-的单晶结构；(B)CS-Py⁺的单晶结构；(C)CS-Py⁺SO₃ ^-晶体中的分子堆积；以及(D)CS-Py⁺晶体中的分子堆积(距离单位：

)。

图15示出了(A)CS-Py⁺SO₃ ^-的主要的分子间堆积相互作用；以及(B)CS-Py⁺的主要的分子间堆积相互作用(距离单位：

)。

图16示出了(A)CS-Py⁺SO₃ ^-(5μM)和CS-Py⁺(5μM)在DMSO中归一化的吸收光谱；(B)CS-Py⁺SO₃ ^-(5μM)在DMSO和具有不同含水率的DMSO/水混合物中的荧光光谱；(C)CS-Py⁺(5μM)在DMSO和具有不同含水率的DMSO/水混合物中的荧光光谱；(D)CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的α_AIE(荧光强度I/I₀)与DMSO/水混合物的组成之间的关系图；(E)CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在含有5％DMSO的水中的动态光散射数据；(F)CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在固态的归一化的荧光光谱(插图：CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的固体在手持UV灯的365nm UV照射下的荧光图)；(G)CS-Py⁺SO₃ ^-在不同极性溶剂中的荧光光谱；(H)CS-Py⁺在不同极性溶剂中的荧光光谱；以及(I)CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在THF中的双光子吸收(TPA)截面。1GM≡10^-50cm⁴ s/光子。

图17示出了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在HeLa细胞中的毒性。

图18示出了与CS-Py⁺SO₃ ^-(1μM)和CS-Py⁺(1μM)一同孵育的HeLa细胞的激光共聚焦显微图像(标尺：20μm)。

图19示出了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在HeLa细胞中的原位荧光(PL)光谱。

图20示出了(A)与CS-Py⁺SO₃ ^-(1μM)和DiI(0.2μM)一同孵育的活HeLa细胞的激光共聚焦显微图像；以及(B)与CS-Py⁺(1μM)和MTDR(0.2μM)一同孵育的活HeLa细胞的激光共聚焦显微图像(标尺：20μm)。

图21示出了(A)仅与CS-Py⁺(1μM)一同孵育的大鼠骨骼肌组织的单光子荧光显微图像；(B)与CS-Py⁺(1μM)和MTDR(0.5μM)一同孵育的大鼠骨骼肌组织的单光子荧光显微图像；以及(C)与CS-Py⁺(1μM)一同孵育的大鼠骨骼肌组织的单光子(λ_ex＝488nm)和双光子(λ_ex＝900nm)荧光显微图像(标尺：20μm)。

图22示出了(A)用CS-Py⁺(1μM)染色的小鼠骨骼肌组织中沿z轴的不同穿透深度处的单光子(λ_ex＝488nm)荧光显微图像(标尺：20μm)；(B)用CS-Py⁺(1μM)染色的小鼠骨骼肌组织的重建3D单光子荧光显微图像；(C)用CS-Py⁺(1μM)染色的小鼠骨骼肌组织中沿z轴的不同穿透深度处的双光子(λ_ex＝900nm)荧光显微图像(标尺：20μm)；(D)用CS-Py⁺(1μM)染色的在小鼠骨骼肌组织的重建3D双光子荧光显微图像。

图23示出了(A)用共聚焦激光进行持续照射下，CS-Py⁺SO₃ ^-、CS-Py⁺、DiI和MTDR在HeLa细胞中的归一化的荧光强度(照射条件：对于CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺，488nm激光，激光功率12％；对于DiI，543nm激光，激光功率12％；对于MTDR，635nm激光，激光功率12％；大约每2.1s扫描一次图像)；(B)用双光子NIR脉冲激光(900nm，强度为2476mW)进行持续照射下，CS-Py⁺在不同扫描次数的双光子荧光图像(大约每5.2s扫描一次图像，标尺：20μm)；以及(C)用双光子NIR脉冲激光(900nm，强度为2476mW)进行持续照射下，CS-Py⁺在不同扫描次数的归一化的荧光强度(大约每5.2s扫一次图像，标尺：20μm)。

具体实施方式

定义

提供以下定义是为了理解本发明和构建所附权利要求。

应注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。

本文所用的术语“λ_ex”是指激发波长。

本文所用的短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指其中π-共轭荧光团的聚集显著降低荧光团的荧光强度的现象。这种聚集体形成被称为“猝灭”荧光团的光发射。

本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指在无定形或结晶(固态)状态下聚集时表现出显著的发光增强的化合物所表现出的现象，而它们在稀溶液中表现出弱或几乎没有发光。

如本文所用，“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的大小；如本文所用，“荧光团”或“荧光体”是指显示荧光的分子；如本文所用的“发光体”或“发光团”是指显示发光的分子；以及如本文所用的“AIEgen”是指具有AIE特征的分子。

如本文所用，“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1至40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即，C1-30烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子，并且可称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。

如本文所用，“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，链烯基可具有2至40个碳原子(即C2-40链烯基)，例如，2至20个碳原子(即C2-20链烯基)。在一些实施方案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、烷基或炔基取代。

如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。

如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以与限定的化学结构共价连接。仅具有一个或多个芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物(即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤芳基，即所有氢原子均被卤素原子取代的芳基(例如-C₆F₅)。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以被称为联芳基。如本文公开的那样，联芳基中的每个芳基可以被取代。

如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)环杂原子的芳族单环的环系统或多环的环系统，该多环的环系统中存在的至少一个环是芳族的并含有至少一个环杂原子。多环杂芳基包括那些具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的，以及那些与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的具有至少一个单环杂芳基环的。杂芳基作为整体可具有(例如)5至24个环原子并含有1至5个环杂原子(即5元至20元杂芳基)。杂芳基可以在任何杂原子或碳原子上与所定义的化学结构连接，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)如下所示的5-或6-元单环和5-6双环系统：其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH₂、SiH(烷基)、Si(烷基)₂、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)₂或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑晽基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。

如本文所用，“供体”材料是指具有作为主要电流或电荷载体的空穴的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。

如本文所用，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载体的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)，应理解的是，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这样的实施方案也包括在所描述的主题内，受所述范围内的任何特别排除的极限值的限制。在所述范围包括一个或两个极限值的情况下，排除所包括的极限值中的任一者或两者的范围也包括在所描述的主题中。

在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来替代性地描述实施方案。

为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。

荧光化合物

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光化合物。本发明的化合物包括基于氰基茋的AIEgen(CS AIEgen)。这些化合物可包括长烷基链取代基和给体-π-受体(D-π-A)结构。本发明的AIEgen可以表现出近红外(NIR)固态发射、大的斯托克斯位移(例如，>180nm)、高荧光量子产率(例如，约12.8％至约13.7％)和良好的双光子吸收横截面(例如，高达约88GM)。一种或多种化合物可以在活细胞的细胞膜上提供特异性染色。一种或多种化合物可以在活细胞的细胞器，例如线粒体中提供特异性染色。本发明的化合物可以表现出高生物相容性以及在单光子和双光子持续照射下的高光稳定性。

其中，各n独立地为在0至16范围内的整数。

在一个实施方案中，化合物选自由下列组成的组：

生物成像应用

本发明的化合物可用于体外和离体细胞成像。在一个实施方案中，细胞成像的方法可以包括使靶细胞与一种或多种本发明的化合物接触，并使用成像方法识别靶细胞中的目的靶标。在一个实施方案中，目的靶标包括细胞膜。在一个实施方案中，目的靶标包括细胞器。在一个实施方案中，细胞器包括线粒体。靶细胞可以是活细胞。在一个实施方案中，活细胞在活组织中。靶细胞在活组织中的深度可以为约50μm至约100μm。

成像方法可以包括单光子荧光显微镜检查法(共聚焦激光扫描显微镜检查法)或双光子荧光显微镜检查法。单光子荧光显微镜检查法使用单个光子通过使用主要可见的激发波长(390nm至700nm)来激发荧光染料。双光子荧光成像技术因其具有近红外(NIR)激发的高穿透深度、高空间分辨率和信噪比以及低的光致漂白趋势而被广泛用于生物成像应用。双光子吸收(2PA)截面(δ_2PA)用于预测发光剂是否适合2PM。

在一个实施方案中，成像方法可包括持续照射化合物或照射化合物约310秒。在一个实施方案中，成像方法可以提供活细胞中细胞器相关变化的长期跟踪。例如，成像方法可用于跟踪与线粒体相关疾病(例如线粒体肌病)相关的线粒体变化。

通常，扩展AIEgen骨架的π共轭是构建NIR AIEgen的有效方法。但是，随着π共轭的增加，这种AIEgen的细胞穿透会大大降低。构建给体-π-受体(D-π-A)结构是开发NIRAIEgen的另一种有效方法，但是强的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应有时会导致AIEgen的荧光量子产率非常低。本发明的化合物的合成成功地整合了这两种策略，从而实现了最佳的穿透和荧光。因此，所得的改性的氰基茋是固有的光稳定的AIEgen。在基于D-π-A的氰基茋中，吸电子基团如吡啶鎓的存在增强了TICT效应，从而产生了窄的能隙和NIR发射AIEgen。由于强的D-π-A效应，本发明的化合物可表现出固态NIR发射和TICT效应。

本发明的化合物表现出具有高生物相容性的特异性细胞膜和细胞器染色。由于真核细胞包括细胞膜和许多膜密闭的细胞器(例如线粒体和高尔基体)，因此认为化合物的电荷可以与细胞膜的两亲性磷脂相互作用，从而提高了穿透性和在活细胞中特定细胞器中的定位。本发明的化合物平衡了疏水性和电荷分布。在一个实施方案中，一种或多种本发明的化合物可用于染色活细胞的细胞膜。在一个实施方案中，CS-Py⁺SO₃ ^-可用于染色活细胞的细胞膜。在一个实施方案中，一种或多种本发明的化合物可用于染色活细胞的线粒体。在一个实施方案中，CS-Py⁺可用于染色线粒体。

在一个实施方案中，本发明的化合物可以以深部组织穿透的方式使活组织中的细胞器染色。深部组织穿透可包括活组织中约50μm至约100μm范围的深度。例如，CS-Py⁺已成功地用于在双光子激发成像模式下以深部组织穿透(例如，深度为100μm)的方式对活的大鼠骨骼肌组织中的线粒体进行染色。本发明的化合物在用单光子和双光子激光器持续照射下表现出显著的抗光致漂白性。

本教导将通过以下实施例进行说明。

实施例1

合成

在合成本发明的化合物时，采用具有长烷基链取代基的氰基茋作为AIEgen核，并且在氰基茋骨架中进一步引入D-π-A结构以使荧光红移并增强TICT效应。下面提供了用于合成CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的示例性反应方案：

图1提供了化合物2在CDCl₃中的¹H NMR谱图。图2提供了化合物2在CDCl₃中的¹³CNMR谱图。图3提供了化合物3在CDCl₃中的¹H NMR谱图。图4提供了化合物3在CDCl₃中的¹³CNMR谱图。图5提供了化合物4在CDCl₃中的¹H NMR谱图。图6提供了化合物4在CDCl₃中的¹³CNMR谱图。图7提供了CS-Py⁺SO₃ ^-在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图。图8提供了CS-Py⁺SO₃ ^-在CDCl₃/CD₃OD＝2:1溶液中的¹³C NMR谱图。图9提供了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹H NMR谱图。图10提供了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹³C NMR谱图。图11提供了CS-Py⁺在DMSO-d₆中的¹⁹F NMR谱图。图12提供了CS-Py⁺SO₃的HRMS谱图。图13提供了CS-Py⁺的HRMS谱图。

实施例2

晶体结构分析

X射线晶体结构分析进一步证实了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的结构(图14A至图14C和图15A至图15B)。通过在环境温度下缓慢蒸发CH₂Cl₂和MeOH的混合溶剂(CH₂Cl₂/MeOH＝2:1，v/v)，获得适用于X射线结构分析的CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺单晶。CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺表现出分子内π-π相互作用和C–H··π相互作用(图14C和图14D)。晶格中CS-Py⁺SO₃ ^-的分子以头对尾的反平行排列方式排列，从而产生强烈的分子间给体-受体相互作用，而晶格中CS-Py⁺的分子呈头对头的排列方式。据信存在多种分子内相互作用，例如C–H…O、C–H…N、C–H…π、C–H…F和P–F…π相互作用，稳定了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的这些不同堆积模式(图15A至图15B)，这可能有助于限制分子内运动(RIM)并抑制聚集状态下的非辐射过程。

实施例3

吸收和荧光

表1总结了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的吸收和荧光(FL)数据，并且图16A至图16I提供了相应的光谱。

表1.CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的光物理性质

λ_abs ^max＝最大吸收峰；λ_em ^max＝最大发射峰；Φ_F,S＝溶液中的荧光量子产率，并且Φ_F,P＝固体粉末的荧光量子产率；α_AIE＝Φ_F,S/Φ_F,P。

如图16A所示，AIEgen CS-Py⁺SO₃ ^-(5μm)和CS-Py⁺(5μm)表现出非常相似的吸收，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的吸收峰(λ_abs ^max)分别在478nm和477nm。CS-Py⁺SO₃ ^-在稀释的DMSO中显示出非常低的近红外(NIR)荧光(NIR发射峰λ_em ^max为约658nm)。随着DMSO/水混合物中含水率(f_w)的提高，CS-Py⁺SO₃ ^-的发射强度显示出缓慢的增加，而波长峰值显示出非常微小的变化(图16B)。CS-Py⁺也显示出典型的聚集增强发射(AEE)特性。但是要注意的是，CS-Py⁺的聚集体(在DMSO/水混合物中，f_w＝95％)显示出增强的蓝移发射(图16C)，这可能是化合物的扭曲结构和分子内电荷转移(TICT)造成的。值得注意的是，在高含水率(f_w＝95％)时，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的FL仅比DMSO中的FL增加了几倍(图16D)，这可能是由于形成了松散堆积的聚集体。另外，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的水合直径分别为148nm和156nm，该动态光散射数据证实了在含5％DMSO的水溶液中存在聚集体(图16E)。对于CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的固体FL分别显示679nm和685nm的NIR发射(图16F)。CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的绝对FL量子产率分别测定为12.8％和13.7％，这对于生物成像尤其是体内成像是有利的。CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的最大发射波长基本上从甲苯、THF、丙酮、MeOH到DMSO有所红移(图16G和图16H)，表明出现了正溶致变色现象。但是，由于CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的TICT特性，与低极性溶剂相比，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在高极性溶剂中的荧光强度大大降低。这些数据证明CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺是典型的给体-受体分子。此外，使用飞秒脉冲激光作为激发源(800nm至980nm)在THF中研究了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的双光子激发的荧光。使用罗丹明的甲醇溶液作为标准，在不同的激发波长下计算出这些AIEgen的双光子吸收截面(图16I)。CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺表现出良好的双光子吸收截面(在860nm至900nm处约30GM至88GM)，与标准罗丹明B的双光子吸收截面相当。

实施例4

细胞毒性

通过标准MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物)测定检测了CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的细胞毒性。在HeLa细胞中孵育24小时后，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的细胞存活率通常超过85％(图17)。在所示浓度范围内，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺表现出可忽略的细胞毒性。

实施例5

生物成像

为了证明AIEgen CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的生物学应用，通过共聚焦激光扫描显微镜检查法对活HeLa细胞进行了荧光成像。在成像实验中使用了1μM的低浓度。孵育20分钟后，可以观察到HeLa细胞中CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的明亮荧光(图18)，表明CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺具有出色的细胞染色特性。据信，AIEgen CS-Py⁺SO₃ ^-染色了细胞膜，而CS-Py⁺则染色了细胞质中的亚细胞器。使用Lambda模式获取HeLa细胞中CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的原位荧光光谱(图19)。与在THF中相比，活细胞中的CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的原位荧光数据显示出蓝移特征，这可能是由于CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的TICT效应。考虑到CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的AIE特性和TICT效应，可以预料到CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在低孵育浓度(1μM)下会由于分子运动而显示出非常微弱的发射，但是这些化合物在低极性(TICT效应)和受限制的环境中可以增加其蓝移发射，从而产生“免洗”成像性能。

然后，进行共染色成像实验以确认CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺在活HeLa细胞中的位置。如预料的那样，CS-Py⁺SO₃ ^-与市售膜染料DiI重叠良好(皮尔逊系数为0.82)(图20A)，表明CS-Py⁺SO₃ ^-主要是染色细胞膜。通常，由于线粒体的高负膜电位，带正电荷的染料主要染色线粒体。因此，CS-Py⁺在HeLa细胞中的分布与商业线粒体染料MitoTracker Deep Red FM(MTDR)非常相似(图20B)，并且相应的皮尔逊系数为0.84，这表明AIEgen CS-Py⁺主要位于线粒体中。

为了测试这些AIEgen是否可以在活组织中显示特异性成像，使用CS-Py⁺在活大鼠骨骼肌组织中进行了离体成像。荧光成像数据表明线粒体在肌肉中规则排列并形成网状结构，具有很高的信噪比(图21A)，而肾小管形态可在横切面上显示。该观察结果与先前通过扫描电子显微镜(SEM)获得的骨骼肌组织中的数据非常吻合。此外，进行了与商业线粒体染料MTDR共同染色成像实验，以确认在活组织中的位置。如图21B所示，CS-Py⁺的染色模式与MTDR的染色模式重叠良好，并且相应的皮尔逊系数为0.84，进一步证明了CS-Py⁺在活组织中优异的线粒体染色。

考虑到CS-Py⁺的良好的双光子吸收截面、高双光子激发荧光以及CS-Py⁺令人印象深刻的活组织染色模式，进行了进一步的成像实验以评估CS-Py⁺的双光子成像能力。在活组织中孵育1小时后，使用NIR脉冲激光(900nm)进行双光子成像。可以捕获来自线粒体的明亮荧光，并且该双光子激发的荧光与单光子激发所观察到的荧光几乎相同(图21C)，表明了CS-Py⁺在双光子荧光成像中具有巨大潜力。与单光子成像相比，双光子成像表现出更好的性能，尤其是在深部组织成像中。为了验证这一点，扫描了沿z轴不同深度处的荧光图像。对于单光子成像，可以在50μm的深度以满意的信噪比捕获规则排列的线粒体的荧光图像，并成功地重建了3D单光子荧光图像(图22A和图22B)。但是，甚至可以在约100μm的深度的肌肉组织中获得CS-Py⁺的双光子激发荧光信号(图22C)。同样地，也实现了重建的3D双光子荧光图像(图22D)。有趣的是，这种通过双光子激发获得的深度比其他双光子探针更深。综上所述，出色的离体双光子成像性能使CS-Py⁺成为活体深部组织线粒体生物医学成像的出色候选探针。

实施例6

光稳定性

CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的光稳定性是其出色的活细胞染色特性的关键参数。首先通过用共聚焦激光持续照射来评估光稳定性。如图23A所示，在180次扫描后，CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺的荧光强度显示出微弱的信号损失，而DiI和MTDR的荧光信号明显下降。鉴于在活组织中双光子荧光成像的出色表现，通过用双光子NIR脉冲激光(900nm，输出强度为2476mW)持续照射，进一步研究了CS-Py⁺的光稳定性。大约每5.2s扫描一次荧光图像。扫描60次后，清楚地获得了具有良好信噪比的双光子荧光图像(图23B)。此外，图23C中的归一化双光子荧光强度数据表明，CS-Py⁺在暴露于强双光子NIR脉冲激光时仅经历了低程度的发射下降，并且在第60次扫描(约310秒)后仍保留了超过70％的初始强度。这些数据表明CS-Py⁺SO₃ ^-和CS-Py⁺表现出高的耐光致漂白性，并且CS-Py⁺可用于长期的单光子和双光子线粒体跟踪。

对本主题如此进行描述，将显而易见的是，可以以许多方式修改或改变该主题。不将此类修改和改变视为背离本主题的精神和范围，并且所有此类修改和改变均旨在包含在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种荧光化合物，其表现出聚集诱导发光特性，所述化合物具有以下骨架结构式：

其中，各n独立地为在0至16范围内的整数。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：

3.一种细胞成像的方法，包括：

使靶细胞与根据权利要求1所述的化合物接触；和

使用成像方法识别所述靶细胞中的目的靶标。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述目的靶标选自由细胞膜和细胞器组成的组。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述目的靶标是细胞器，并且所述细胞器包括线粒体。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述靶细胞是活细胞。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述靶细胞在活组织中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶细胞在所述活组织中的深度为约50μm至约100μm。

9.根据权利要求3所述的方法，其中所述成像方法选自由单光子荧光显微镜检查法和双光子荧光显微镜检查法组成的组。

10.根据权利要求3所述的方法，其中识别所述目的靶标包括可视化活细胞中与细胞器相关的变化。

11.根据权利要求3所述的方法，其中所述成像方法包括照射所述化合物约310秒。

12.一种荧光化合物，其表现出聚集诱导发光特性，所述化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：

13.一种细胞成像的方法，包括：

使靶细胞与根据权利要求12所述的化合物接触；和

使用成像方法识别所述靶细胞中的目的靶标。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述目的靶标选自由细胞膜和细胞器组成的组。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述目的靶标包括细胞器，并且所述细胞器包括线粒体。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶细胞是活细胞。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶细胞在活组织中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶细胞在所述活组织中的深度为约50μm至约100μm。

19.根据权利要求13所述的方法，其中所述成像方法选自由单光子荧光显微镜检查法和双光子荧光显微镜检查法组成的组。

20.根据权利要求13所述的方法，其中识别所述目的靶标包括可视化活细胞中与细胞器相关的变化。