CN111263751B - 具有聚集诱导发光特性的水溶性化合物 - Google Patents

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Abstract

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特性，并呈现出近红外(NIR)吸收的水溶性荧光化合物。这些化合物可以通过免洗和快速染色程序在细胞成像中用作质膜特异性生物探针。此外，当用可见光照射时，这些化合物可以在体内有效地生成活性氧簇(ROS)。因此，这些化合物可以通过图像引导的光动力疗法(PDT)过程有效地杀死癌细胞。

Description

具有聚集诱导发光特性的水溶性化合物
交叉引用
本申请要求于2017年10月24日提交的美国临时专利申请No. 62/707,135的优先权，该申请由本申请的发明人提出，并且该申请的全部内容以引用方式并入文本。
技术领域
本主题大体上涉及一系列具有聚集诱导发光特性和近红外吸收的荧光化合物，以及它们在生物成像和光学诊疗中的应用。
背景技术
因为荧光生物成像使生物物种可视化、提供快速响应、优异的时间分辨率、极高的灵敏性、原位可操作性、操作简便以及良好的重现性，所以其是一种功能强大的非侵入性分析工具。作为荧光材料的主要分支，小分子有机荧光团、尤其是具有近红外(NIR)发光(>700nm) 的荧光团，具有明显的优势，例如高穿透深度、低生物自发荧光干扰、对生物结构的损伤最小以及减小了光散射。然而，由于π-π堆叠和其他的非辐射途径，传统的NIR荧光团通常在高浓度或者聚集状态下产生微弱发光或者不发光这两者中的一者。
由于有机分子的发光中心的高疏水性，因此其在生物介质中自然聚集。将这种现象称作聚集诱导淬灭(ACQ)，这在生物成像和治疗的领域中是十分常见的并且仍然是实施许多常规NIR荧光团的实用性应用的主要障碍。有趣的是，具有聚集诱导发光(AIE)特性的新类别NIR荧光团的出现，解决了ACQ的问题。当分子溶解在溶剂中时，AIE发光体(AIEgens)不发光，但是在聚集时会被诱导以强烈地发荧光。该聚集诱导发光(AIE)特征允许荧光团在任何浓度下使用，并且能够开发用于生物传感和生物成像应用的荧光“照亮”探针。
到现在为止，仅开发了极少数的呈现高性能NIR发光的AIE发光体并且将其用于生物学研究。尽管已经制备了一些具有短波长发光的水溶性AIE发光体，并将其用作强大的生物探针，但是这些发光体不是NIR AIE发光体。
体外细胞成像是荧光生物成像的应用中使用的最广泛的一种。作为重要的细胞器，质膜具有磷脂双层，该磷脂双层是活细胞和活细胞的周围环境之间的保护性二维边界。质膜已经参与了各种细胞过程和生物功能，例如细胞信号传导、细胞粘附、内吞、胞吐和物质的选择性渗透。细胞中质膜的异常是细胞状态和许多疾病的关键性生物标志物。因此，通过荧光生物探针使质膜可视化是重要和有用的。然而，以前开发的质膜特异性荧光团(例如DiO、DiI和CellMask)都具有各自和共同的缺点，包括发光波长短、斯托克斯位移(Stokesshift) 小、制备储备溶液时需要有害有机溶剂、细胞染色后培育期长以及洗涤过程繁琐。特别地，细胞染色后培育期长以及洗涤过程繁琐长期以来一直是细胞荧光成像中的关键问题。长时间培育非常耗时，并且通常导致细胞组分的非特异性发光。为了提高细胞成像的信噪比(S/N)，通常需要在细胞染色后进行洗涤过程，以消除游离染料的强烈残留信号。快速洗涤过程可能导致一些问题，例如，由于改变细胞环境和细胞的损失这两者，延迟了显微镜成像数据的采集，并且降低了细胞成像结果的准确性。此外，洗涤过程与生物过程的连续传感或监测不相容。迫切需要一种克服了上述缺陷的新荧光质膜探针。
同时成像和治疗的双重应用已经引起了重大的科学兴趣。作为用于癌症治疗的适当并且温和的方法，光动力疗法(PDT)因用最小侵袭和精准操作消除恶性肿瘤已经得到了临床认可。因为质膜与各种生物功能和细胞过程紧密相关，所以认为质膜是实施PDT的绝佳细胞靶向部位。另外，质膜是细胞的最外保护层，其中质膜遭破坏对细胞是致命的，并且可以最大程度地利用光能。然而，几乎所有先前报道的质膜染色荧光团都只能用作成像探针，而不是在同时成像和治疗中具有双重应用。具有高活性氧簇(ROS)生成效率的光敏剂对于PDT应用至关重要。可以促进荧光和ROS生成这两者的AIE发光体可以实现同时成像和PDT的双重应用。
因此，迫切需要可以用作质膜特异性探针和癌症的光学治疗诊断这两者的具有良好水溶性的NIR AIE发光体。
发明内容
本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征，并呈现出近红外 (NIR)吸收的水溶性荧光化合物。这些化合物可以通过免洗和快速染色程序在细胞成像中用作质膜特异性生物探针。此外，当用可见光照射时，这些化合物可以在体内有效地生成活性氧簇(ROS)。因此，这些化合物可以通过图像引导的光动力疗法(PDT)过程有效地杀死癌细胞。
在一个实施方案中，这些化合物的骨架结构式选自由以下组成的组：
Figure BDA0002386187460000031
Figure BDA0002386187460000041
Figure BDA0002386187460000042
以及
Figure BDA0002386187460000043
其中，各R独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-NCS、烷基-N3和烷基-NH2组成的组；并且
其中X选自由苯基、杂芳基和C＝C组成的组。
在另一个实施方案中，化合物为：
Figure BDA0002386187460000051
附图说明
现在将参考附图详细说明各种实施方案。
图1A示出了TTVP在具有不同的THF分数(fT)的水/THF混合物(浓度：10μM；激发波长：515nm)中的PL光谱。图1B示出了TTVP的PL强度与水/THF混合物的组成的曲线图(插图：在365nm UV照射下，TTVP的水溶液和在具有90％THF分数的水/THF混合物中的TTVP的荧光照片)。图1C示出了在具有90％THF分数的 THF/水混合物中的TTVP聚集体的粒径分布(浓度：10μM。插图：在具有90％THF分数的THF/水混合物中的TTVP聚集体的TEM光谱)
图2示出了TTVP的水溶液的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱。
图3A示出了通过DFT计算优化的TTVP的分子几何学。图3B 示出了优化的分子几何学的侧视图。图3C示出了TTVP的HOMO 和LUMO能级的分子轨道振幅图(Eg(能隙)＝LUMO–HOMO)。
图4示出了TTVP在固态时的PL光谱。
图5示出了TTVP在固态时的荧光衰减曲线。
图6A示出了在用TTVP(500nM)活性对HeLa细胞进行10 分钟的孵育，孵育后使用洗涤程序之后的活HeLa细胞的共聚焦图像。图6B示出了在用TTVP(500nM)对活HeLa细胞进行10分钟的孵育，孵育后使用免洗程序之后的活HeLa细胞的共聚焦图像。图6C 示出了在用TTVP(500nM)对活HeLa细胞进行5分钟的孵育，孵育后使用免洗程序之后的活HeLa细胞的共聚焦图像。图6D示出了在用TTVP(500nM)对活HeLa细胞进行2分钟的孵育，孵育后使用免洗程序之后的活HeLa细胞的共聚焦图像。图6E示出了在用TTVP(500nM)对活HeLa细胞进行30秒的孵育，孵育后使用免洗程序的活HeLa细胞的共聚焦图像。图6F示出了在用TTVP(500nM)对活HeLa细胞进行极短时间(约3秒)的孵育，孵育后使用免洗程序的活HeLa细胞的共聚焦图像(λex:488nm(1％激光强度，0.05μW))。图6G示出了用TTVP进行质膜特异性成像的示意图(比例尺＝20 μm)。图6H示出了用TTVP染色的活HeLa细胞的质膜的荧光光谱，以及TTVP纳米聚集物的荧光光谱。
图7A示出了TTVP在不同极性溶剂中的PL光谱(浓度：0.5μM；激发波长：515nm)。图7B示出了在图7A中的发光最大值的数据。
图8A至8D示出了用TTVP进行不同时间的染色的HeLa细胞的共聚焦图像(浓度：500nM。比例尺＝20μm。激发波长λex：488nm (1％激光强度，0.05μW))。
图9A示出了用TTVP染色的HeLa细胞的共聚焦图像。
图9B示出了用DiO染色的HeLa细胞的共聚焦图像。
图9C示出了在图9A和图9B中的平面融合图像。
图9D示出了HeLa细胞的明场图像。
图9E示出了用TTVP染色的HeLa细胞在激光照射之前的共聚焦图像。
图9F示出了用TTVP染色的HeLa细胞在激光照射15分钟之后的共聚焦图像(照射光波长λex：488nm(1％激光强度，0.05μW；比例尺＝20μm))。
图9G示出了用DiO染色的HeLa细胞的共聚焦图像。
图9H示出了用DiO染色的HeLa细胞在激光照射15分钟之后的共聚焦图像(照射光波长λex：488nm(1％激光强度，0.05μW)；比例尺＝20μm)。
图10A、10B、10C和10D分别示出了在用TTVP(500nM)对活293T细胞、HCC827细胞、HCT116细胞和MDCK2细胞进行极短时间(约3秒)的孵育之后的共聚焦图像(照射光λex：488nm(1％激光强度，0.05μW)。
图11A为示出了H2DCF-DA、TTVP以及H2DCF-DA和TTVP 的混合物在PBS中经白光照射不同时间时，在534nm处的荧光强度(I/I0-1)的相对变化。浓度：10μM(TTVP)和5μM(H2DCF-DA) (照射光功率:10mW)。图11B为示出了用不同浓度TTVP染色的 HeLa细胞，在不经白光照射或经白光照射10分钟之后的细胞存活率的图(照射光功率：10MW)。图11C示出了在不同处理之后使用膜联蛋白V-FITC/PI双重染色流式细胞仪进行的细胞凋亡和坏死分析(TTVP浓度：500nM)。图11D示出了在图11C中的流式细胞仪数据的统计学分析的图。图11E、11F、11G、11H和11I示出了用TTVP染色的活HeLa细胞经连续激光照射的共聚焦图像。λex：488nm(20％激光强度，0.925μW)。
图12A、12B、12C、12D和12E示出了用TTVP染色的HeLa 细胞在照射时间延长时的明场共聚焦图像。λex：488nm(20％激光强度，0.925μW)。
具体实施方式
提供以下定义是为了理解本主发明和构建所附权利要求。
定义
应该理解，上面或下面描述的附图仅用于说明目的。附图不一定按比例绘制，重点通常在于说明本教导的原理。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
在整个申请中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当方法被描述为具有、包括或包含特定的方法步骤时，预期本教导的组合物也可以基本上由所述成分组成或者由所述组分组成，并且本教导的方法也可以基本上由所述方法步骤组成或由所述方法步骤组成。
在本申请中，当元件或组件被称为包括在所列举的元件或组件的列表中和/或从所列举的元件或组件的列表中选择时，应当理解，该元件或组件可以是所述元件或组件中的任何一个，或者该元件或组件可选自由两种或更多种所述元件或组件组成的组。此外，应当理解，本文描述的组合物、装置或方法的元件和/或特征可以以各种方式组合而不脱离本教导的精神和范围，无论是明确的还是隐含的。
除非另外特别说明，否则术语“包括(include，includes，including)”或“具有(have，has，having)”的使用通常应理解为开放式和非限制性的。
除非另外特别说明，否则本文中单数的使用包括复数(反之亦然)。
应当理解，只要本教导仍然可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
本文所用的术语“λex”是指激发波长。
本文所用的短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指其中π-共轭荧光团的聚集显著降低荧光团的荧光强度的现象。这种聚集体形成被称为“猝灭”荧光团的光发射。
本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指在无定形或结晶(固态)状态下聚集时表现出显著的发光增强的化合物所表现出的现象，而它们在稀溶液中表现出弱或几乎没有发光。
如本文所用，“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的大小；如本文所用，“荧光团”或“荧光体”是指显示荧光的分子；如本文所用的“发光体”或“发光团”是指显示发光的分子；本文所用的“AIEgen”是指具有AIE特征的分子。
如本文所用，“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1 至40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即，C1-30 烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子，并且可称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。
如本文所用，“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，链烯基可具有2至40个碳原子(即C2-40链烯基)，例如，2至20个碳原子(即C2-20链烯基)。在一些实施方案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、烷基或炔基取代。
如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。
如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以与限定的化学结构共价连接。仅具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物(即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可称为“卤代芳基”。全卤芳基，即所有氢原子被卤素原子取代的芳基(例如-C6F5)包括在“卤代芳基”的定义内。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以称为联芳基。如本文公开的那样，联芳基中的每个芳基可以被取代。
如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)环杂原子的芳族单环的环系统或多环的环系统，该多环的环系统中存在的至少一个环是芳族的并含有至少一个环杂原子。多环杂芳基包括那些具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的，以及那些与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的具有至少一个单环杂芳基环的。杂芳基作为整体可具有(例如)5至24个环原子并含有1至5个环杂原子(即5 元至20元杂芳基)。杂芳基可以在任何杂原子或碳原子上与所定义的化学结构连接，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、 S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化 (例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)如下所示的5-或6-元单环和5-6双环系统：
Figure BDA0002386187460000101
其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N- 苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2 或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2- 甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑晽基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。
如本文所用，“供体”材料是指具有作为主要电流或电荷载体的空穴的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
如本文所用，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载体的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
如本文所用，“治疗剂”是指有机材料，例如，具有诊断和治疗这两种功能的有机纳米颗粒材料。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)，应理解的是，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这些实施方案也包括在所描述的主题内，受所述范围内的任何特别排除的极限值的限制。在所述范围包括一个或两个极限值的情况下，排除所包括的极限值中的任一者或两者的范围也包括在所描述的主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，可以使用“基本上由...... 组成”或“由......组成”的语言来替代性地描述实施方案。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。另外，在术语“约”的使用在定量值之前的情况下，除非另外特别说明，否则本教导还包括具体的定量值本身。如本文所用，术语“约”是指与标称值相差±10％，除非另有说明或推断。
荧光化合物
本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征并且呈现出近红外 (NIR)吸收的水溶性荧光化合物。本发明化合物在诊断和光学治疗诊断这两者的应用中均可为有益的，特别是对于检测细胞的质膜异常和光动力癌症治疗方面。
在一个实施方案中，化合物具有的骨架结构式选自由以下组成的组：
Figure BDA0002386187460000121
Figure BDA0002386187460000131
Figure BDA0002386187460000132
以及
Figure BDA0002386187460000133
其中，各R独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-NCS、烷基-N3和烷基-NH2组成的组；并且
其中X选自由苯基、杂芳基和C＝C组成的组。
在另一个实施方案中，化合物为：
Figure BDA0002386187460000141
用于制备TTVP的示例性反应方案如下：
Figure BDA0002386187460000142
细胞成像
本发明化合物可以有效地用作在细胞成像中的质膜特异性生物探针。如本文中详细描述的，无论是否在细胞染色后洗涤细胞，都可以以与细胞背景极好的图像对比度清楚地观察到用一种或多种本发明化合物染色的细胞的质膜。另外，当对细胞进行非常短的时间的染色(例如，约30秒)时，甚至可以实现最佳的荧光成像质量。在一个实施方案中，可以在范围为约30秒至约6小时的时间段内用一种或多种本发明化合物对细胞进行染色。例如，可以在范围为约30秒至约10分钟的时间段内对细胞进行染色。据信，本发明化合物的质膜特异性可以归因于化合物的亲水性。例如，化合物的亲水性可阻止化合物经质膜的磷脂双层的疏水区的渗透。本发明化合物对极性呈现出高敏感性，并且可以用于指示环境极性。据信本发明化合物的发光部位可以包埋在具有低极性的质膜的疏水区中。
将一种或多种荧光化合物与细胞接触，并且随后可以将成像方法用于使目标的细胞靶标可视化。目标的靶标可(例如)为细胞的质膜。使靶细胞与一种或多种本发明化合物接触可包括将一种或多种本发明化合物包埋在质膜的疏水区中。疏水区可以具有低极性。成像方法可包括(例如)荧光显微法或共聚焦激光扫描显微法。
癌症治疗
当用可见光照射时，本发明化合物可以在体内有效地生成活性氧簇(ROS)。因此，这些化合物可通过图像引导的光动力疗法(PDT) 过程有效地杀死癌细胞。PDT由于其提供的精确的可控性、最小的侵入性和较高的时空准确性而成为一种有前途的癌症治疗方法。
杀死癌细胞的方法可包括使靶癌细胞与一种或多种本发明化合物接触，在一种或多种化合物与靶癌细胞接触的同时使靶癌细胞成像，并且当使所述一种或多种化合物与靶癌细胞接触的同时，使靶癌细胞经白光照射。成像方法可以选自荧光显微法和共聚焦激光扫描显微法。
如本文所述，荧光化合物可以在白光照射下有效地生成ROS以杀死癌细胞。然而，在黑暗条件下，荧光化合物显示出低细胞毒性。因此，荧光化合物可以成功地用作在光动力疗法(PDT)应用中的光敏剂。
本教导将通过以下实施例进行说明。
实施例
材料和仪器
Dulbecco’s改良型基本培养基(DMEM)和RPMI-1640购自Gibco (LifeTechnologies)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和DiO购自ThermoFisher Scientific。H2DCF-DA购自Sigma-Aldrich。Pd(dppf)Cl2、哌啶、4-溴-N,N-二苯胺、(5-甲酰噻吩-2-基)硼酸、3-溴-N,N,N-三甲基丙烷-1-溴化铵以及4-甲基吡啶购自 Sigma-Aldrich、J&K或MERYER。所有化学品均按原样使用，无需进一步纯化。根据文献方法合成1-(3-三甲基胺丙基)-4-甲基吡啶鎓二溴化物和5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-甲醛。
使用CD3OD作为氘代溶剂，在Bruker ARX 400NMR光谱仪测定1H光谱。在以MALDI-TOF模式运行的Finnegan MAT TSQ 7000 质谱仪系统中记录高分辨质谱(HRMS)。在MiltonRay Spectronic 3000阵列分光光度计上截取UV吸收光谱。在Perkin Elmer LS 55分光仪上记录稳态荧光光谱。在Olympus BX 41荧光显微镜上收集荧光图像。在Zeiss激光扫描共聚显微镜(LSM7DUO)上收集激光共聚焦扫描显微镜图像，并且使用ZEN 2009软件(CarlZeiss)进行分析。
为了进行细胞培养，在5％CO2湿度孵育器中，在37℃将HeLa 细胞在包含10％FBS和抗体(100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素)的MEM中培养。
为了进行细胞成像，在带有盖玻片的35mm皮氏培养皿中，在 37℃使细胞生长。用一定浓度的某种染料对活细胞间一定时间的孵育。在添加TTVP(500nM)之后，将皮氏培养皿在室温振荡数秒，之后移走盖玻片。安置TTVP标记的细胞，并且使用激光扫描共聚焦显微镜(LSM7DUO)在512nm，5％激光强度(扫描速度为22.4秒/帧) 对TTVP标记的细胞进行成像。发光滤光片为600nm至744nm。
对于共聚焦共定位，用DiO在37℃培养HeLa细胞10分钟之后，将TTVP添加到培养物中，然后将其在室温振荡数秒。然后移去培养基，并且将细胞用PBS冲洗三次，然后在共聚焦显微镜下成像。
对于光稳定性研究，通过使用ZEN 2009软件(Carl Zeiss)的共聚焦显微镜(Zeiss激光扫描共聚焦显微镜LSM7DUO)对TTVP 标记的HeLa细胞进行成像。条件：对于TTVP，激发波长：488nm；对于DiO，激发波长：488nm(5％激光强度)。
对于涉及本发明化合物与Hela细胞的生物相容性的细胞毒性研究，MTT分析用于评估在本文中的AIE发光体的细胞毒性。细胞以6000个细胞/孔至8000个细胞/孔的密度接种在96-孔板(Costar,IL, USA)中。培养过夜后，用100μL包含不同浓度的TTVP的新鲜培养基替换在各孔中的培养基。24小时后，向各孔中添加10μL MTT溶液(在PBS中的浓度为5mg/mL)。孵育4小时后，经读板器 (Perkin-Elmer Victor3TM)记录各孔在595nm处的吸光度。平行的在6个孔中进行各试验。
对于涉及在光照射下的本发明化合物与癌细胞的生物相容性的细胞毒性研究，HeLa细胞以6000个细胞/孔至8000个细胞/孔的密度接种在96-孔板(Costar,IL,USA)中。培养过夜后，用100μL包含不同浓度的TTVP的新鲜培养基替换在各孔中的培养基。孵育3 秒后，将包含HeLa细胞的板暴露在白光中(约10mW)10分钟，并且将另一组具有保存在黑暗中的细胞的板作为对照。然后，对所述板进行与生物相容性测试相同的处理。
将定量数据表示为平均值±标准偏差。通过ANOVA分析和 Student’s t-检验进行统计学比较。认为P值＜0.05具有统计学意义。
实施例1
TTVP的合成
5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-甲醛(71mg,0.2mmol)和1-(3-三甲基胺丙基)-4-甲基吡啶鎓二溴化物(71mg,0.2mmol)的溶液在通过添加数滴的哌啶过夜催化的干乙醇中在氮气气氛下回流。冷却至室温后，通过减压蒸馏除去溶剂。通过中性氧化铝色谱柱分离，使用 DCM和甲醇(98:2v/v)作为洗脱液纯化残留物，从而得到为红棕色粉末的TTVP(98mg,产率71％)。1H NMR(400MHz,CD3OD),δ (ppm):8.78(d,J＝6.8Hz,2H),8.13-8.17(m,3H),7.58-7.60(m,2H), 7.48(d,J＝4.0Hz,1H),7.40(d,J＝4.0Hz,1H),7.30-7.34(m,4H),7.02-7.12(m,9H),4.60(t,J＝7.8Hz,2H),3.52-3.56(m,2H),3.20(s, 9H),2.51-2.59(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):155.99, 150.81,150.19,148.72,145.26,140.33,136.72,135.83,130.81,128.12, 126.40,125.16,125.04,124.90,123.80,121.71,64.04,58.04,54.13, 26.27.ESI HRMS:对于C35H37Br2N3S[M-Br]+计算值：610.1886,实测值：610.1874。
实施例2
光物理性质
TTVP具有良好的水溶性。TTVP受益于其带正电荷的胺和吡啶盐的亲水性特性，以及疏水部分的小尺寸。TTVP的水溶液在515nm 处表现出最大吸收带峰值，摩尔消光系数为33517M-1cm-1(图2)。相对较长的吸收波长可以归因于其HOMO-LOMO能隙较小，这是由于发光中心的强电子供给-接受的相互作用引起的(图3A至3C)。
对在具有不同THF分数(fT)的水/THF混合物中的TTVP的AIE特性的研究表明，TTVP是典型的AIE活性分子(图1A)。TTVP 在水溶液中的单分子状态几乎不发光，并且当THF的分数增加时，由于聚集物的形成，光致发光(PL)强度逐渐增加(图1C)。在聚集状态下，THF的分数为90％时，观察到最大发光强度，其中PL强度增加至在水溶液中的PL强度的约97.3倍(图1B)。如表1所示， TTVP在聚集状态下的最大发光位于708nm处，表明它具有NIR-发光特性和较大的斯托克斯位移。
表1.AIE发光体TTVP的光学性质。
Figure BDA0002386187460000181
a在水溶液中的最大吸收。b在固态时的最大发光。c通过校准积分球确定的荧光量子产率。d在环境条件下测定的荧光寿命。
进行动态光散射分析(DLS)和透射电子显微镜(TEM)测定以证实在THF添加到TTVP水溶液中时形成的聚集物。DLS揭示了在包含的THF的分数为90％的悬浮液中形成的这些纳米聚集物的平均流体动力直径为约43nm，多分散系数为0.13，同时通过TEM分析观察到了这些纳米聚集物的球形形态。固态时，TTVP在705nm 处发光，量子产率为2.7％，荧光寿命为0.92ns(图4至5，表1)。
溶剂化显色研究示出了，随着溶剂极性的增加，TTVP的最大发光波长大幅度红移，而发光强度显著降低(图7A至7B)，表明强烈扭曲的分子内电荷转移(TICT)效应。
实施例3
细胞成像
作为水溶性NIR-发光AIE发光体，TTVP在水溶液环境中维持“关闭”状态。因此，TTVP可以作为“点亮”探针用于生物成像，受到游离染料和生物底物自发荧光这两者的最小背景干扰。在初步的生物成像实验中，使用HeLa细胞作为细胞模型，并且在500nM的 TTVP中孵育10分钟进行细胞成像研究。观察到无论细胞染色后是否洗涤，细胞的质膜都可以清晰地可视化，并且与细胞背景具有优异的图像对比度(图6A至6B)。然后通过使用具有不同染色时间的免洗程序研究对孵育周期的影响。结果表明，染色时间从10分钟缩短到30秒，在荧光强度和特异性这两个方面都没有荧光成像质量的明显变化(图6A至6E)。出人意料的是，当染色过程包括在添加 TTVP后以室温简单振荡培养物与细胞数秒钟时，质膜会显著亮起(图6F)，意味着超快染色(仅需几秒钟即可染色)特征。另一方面，当染色时间增加到4小时时，质膜仍然可以清晰地可视化。染色 6小时后，大多数的TTVP进入细胞，导致细胞内的强烈发光(图8A 至8D)。TTVP的质膜染色能力主要归因于其良好的亲水性，这阻碍了TTVP穿过磷脂双层的疏水区的渗透。据信TTVP的发光部分嵌入在具有低极性的疏水区内，显然根据AIE过程的分子内运动限制 (RIM)的机理，在照射时荧光发光(图6G)。实际上，用TTVP 染色的活HeLa细胞的最大发光位于623nm处(图6H)；从708nm 至623nm的蓝移发光可能是由于在活细胞中的TTVP的周围环境的低极性造成的，这充分证实了TTVP嵌入到质膜的疏水区的假设。此外，TTVP在细胞的培养基中的优异单分散性可导致超快染色。
TTVP对质膜的特异性是通过用DiO的共同染色来评估的，DiO 是一种市售的质膜生物探针。在此共定位实验中，用DiO孵育HeLa 细胞10分钟后，将TTVP添加到培养物中，然后在室温下振荡培养物数秒。为了适应DiO的染色方案，在细胞染色后进行了快速洗涤。如图9A至9H所示，TTVP可以选择性地积聚在质膜中并且发射强的红色荧光。TTVP和DiO的良好融合图像表明该化合物对质膜具有高度特异性，并且将皮尔逊相关系数确定为89％。为了评估TTVP 和DiO的光稳定性，使用共聚焦显微镜进行了持续激发和连续性扫描。结果表明，TTVP在15分钟照射(图9E和9F)内的发光强度略有下降，并且在相同条件下(图9G和9H)照射时，SiO的荧光损失非常明显，证明了TTVP的光稳定性优于DiO的光稳定性。
在TTVP对于膜特异性成像的独特优势的鼓舞下，将这种超快染色和免洗细胞成像方案进一步用于染色其他细胞系，包括293T、 HCC827、HCT116和MDCK2。在所有测试案例中，细胞成像的高 S/N比和强红外发光清晰地可视化(图10A至10D)，表明TTVP对细胞类型的耐受性高。
实施例4
活性氧生成
TTVP在可见光区域中的强吸收使可见光用作用于PDT程序的激发光源。可见光对生物系统的伤害要比紫外线小。TTVP的ROS 生成效率最初通过使用H2DCF-DA作为指示剂来确定，该指示剂通过ROS触发具有“点亮”过程而发射荧光。如图11A所示，单独的TTVP或H2DCF-DA是非发光或发光极弱的，并且各荧光强度在白光照射60秒内几乎保持不变。相反，在TTVP的存在下，H2DCF-DA 的发光强度随着白光的暴露时间的增加而逐渐增强，在60秒内达到 87倍(图11B至11I)。TTVP的高效ROS生成可归因于其小的单线态和三线态的能隙(0.47eV)和优异的单分散性这两者。小的单线态和三线态的能隙有利于提高三线态的激发态的产率，优异的单分散性可扩大TTVP和氧之间的接触面积。
实施例5
光动力疗法
在PDT应用中的本发明化合物的有效ROS生成通过标准MTT 分析对HeLa细胞进行了定量评估。在白光照射的缺失和存在这两种情况下，确定了剂量依赖性毒性。结果表明，TTVP在黑暗条件下呈现出低细胞毒性，这是光敏剂在PDT应用中的基本特征之一。在白光照射下，TTVP浓度为500nM时，HeLa细胞的存活率迅速下降到 15％，而1μM的TTVP几乎导致全部细胞死亡(图11B)，表明TTVP 通过PDT途径对癌细胞消融的显著效率。相比之下，当在黑暗条件下用1μM的TTVP孵育HeLa细胞时，HeLa细胞保持了90％的存活率。此外，将使用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色的流式细胞分析来确定细胞凋亡(图11C和11D)。观察到光照射在短时间内引起癌细胞坏死，并且坏死细胞的比例随着照射时间的延长而显著增加，这表明TTVP在光动力消融的癌细胞中的高效性。值得注意的是，用强功率的连续光照射(为图6A至6H和图8A至8D中描述的细胞成像的约18.5倍)导致细胞的某些变化，例如，TTVP可以逐渐进入细胞(图11E至11I)；细胞膜形态改变，并且清晰地观察到在质膜上出现球状物，这是细胞死亡的标志。这些变化可归因于由 TTVP生成的ROS显著地干扰了质膜的刚度和渗透性，并且诱导癌细胞死亡。图12A、12B、12C、12D和12E示出了在照射时间增加时用TTVP染色的HeLa细胞的明亮场共聚焦图像。λex：488nm(20％激光强度，0.925μW)。
对本主题如此进行描述，将显而易见的是，可以以许多方式修 改或改变该主题。不将此类修改和改变视为背离本主题事项的精神和 范围，并且所有此类修改和改变均旨在包含在所附权利要求的范围内。

Claims (17)

1.一种荧光化合物，该化合物呈现聚集诱导发光特性和近红外吸收，所述化合物具有的骨架结构式选自由以下组成的组：
Figure FDA0003882435330000011
Figure FDA0003882435330000021
Figure FDA0003882435330000022
以及
Figure FDA0003882435330000023
其中，各R独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-NCS、烷基-N3和烷基-NH2组成的组；并且
其中X选自由苯基、杂芳基和C＝C组成的组。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为水溶性的。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为：
Figure FDA0003882435330000024
4.一种细胞成像的方法，包括：
用权利要求1所述的化合物接触靶细胞；以及
使用成像方法识别目标的细胞靶标。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述目标的细胞靶标包含所述靶细胞的质膜。
6.根据权利要求5所述的方法，其中用所述化合物接触所述靶细胞，包括将所述化合物嵌入到所述质膜的疏水区中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述疏水区嵌入的所述化合物具有低极性。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述成像方法选自由荧光显微法和共聚焦激光扫描显微法组成的组。
9.一种细胞成像的方法，包括：
用权利要求3所述的化合物接触靶细胞；以及
使用成像方法识别目标的细胞靶标。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述目标的细胞靶标包括所述靶细胞的质膜。
11.根据权利要求10所述的方法，其中用所述化合物接触所述靶细胞，包括将所述化合物嵌入到所述质膜的疏水区中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述疏水区嵌入的所述化合物具有低极性。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述成像方法选自由荧光显微术和共聚焦激光扫描显微术组成的组。
14.一种生成活性氧簇的方法，包括用白光照射权利要求1或3所述的化合物。
15.权利要求1所述的化合物在权利要求4所述的细胞成像的方法以及权利要求14所述的生成 活性氧簇的方法中的用途。
16.权利要求3所述的化合物在权利要求9所述的细胞成像的方法以及权利要求14所述的生成 活性氧簇的方法中的用途。
17.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述成像方法选自由荧光显微术和共聚焦激光扫描显微术组成的组。
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