CN110234735B - 双模态生物成像用探针 - Google Patents

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Abstract

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特性，并且能够在拉曼细胞沉默区域(1800cm‑1至2800cm‑1)产生拉曼信号的化合物。该化合物可用于通过荧光显微镜和拉曼显微镜的双模态细胞成像。

Description

双模态生物成像用探针
技术领域
本主题大体上涉及在拉曼细胞沉默区域(即，1800cm-1至2800 cm-1)中具有聚集诱导发光特征和拉曼信号的一系列化合物及其在使用荧光和拉曼显微成像的双模态生物成像中的应用。
背景技术
为了阐明荧光探针或药物的生物学性能，获得它们在细胞内的分布(局部浓度)和它们随时间演变的详细图像是极其重要的。荧光法因其灵敏度高、特异性高和时空分辨率强而适用于这一目的。通常使用诸如罗丹明123和JC-1之类的荧光探针标记一种或多种目的细胞靶标(例如，目的分子或细胞器)。然而，由于细胞的异质性，在细胞器(特别是线粒体)中累积的染料浓度可能非常高。例如，基于由高线粒体膜电位(～180mV)驱动的电泳效应，预计线粒体基质中阳离子亲脂性分子的浓度高至细胞质中阳离子亲脂性分子浓度的1000倍。在使用罗丹明123的情况下，如此高的浓度导致荧光猝灭，而在使用JC-1的情况下则可形成具有更红的发光颜色的J-聚集体，这会导致成像对比度降低以及荧光强度和染料浓度之间的线性关系变形。在这些情况下，通常获得不可靠的结果。
具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光探针可以避免当传统荧光染料(诸如荧光素和罗丹明123之类的)处于聚集状态时造成的荧光猝灭效应。与传统的荧光染料不同，AIE荧光探针通常在溶液中发光较弱，而当聚集或结合到靶标时表现出“开启”特征。AIE荧光探针具有超高的成像对比度、良好的光稳定性和生物相容性。
近期，拉曼显微成像已经成为对细胞化学成分进行评估和成像的强大的非侵入性方法。拉曼显微成像通常被用作荧光方法的补充，并且在生物化学和生物医学研究中越来越普遍。拉曼显微成像具有无需标记的性能，并且提供通过分子振动光谱而获得的丰富化学信息。相比于自发拉曼成像，相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)成像已经成为用于活细胞的快速拉曼成像的新开发的技术。具体而言，SRS具有(i)拉曼信号大幅提升，速度比自发拉曼显微成像的速度快～1000倍，(ii)优异的稳定性和再现性，(iii)无非共振背景，(iv)线性浓度依赖性(v)与自发拉曼光谱的光谱的高相似性。
然而，无需标记拉曼成像过程中的图像通常表现出低对比度。因此，通过在细胞沉默区域(即1800cm-1至2800cm-1)中具有拉曼信号的小双正交的成像标签(诸如C-D(碳-氘)、三键(炔烃C≡C、氰基C≡N)等)可被用于小生物分子(诸如DNA、脂质、氨基酸、糖和药物等)的特异性追踪。与传统荧光标签相比，这些标签的小体积可以最小限度的干扰靶标小分子的行为。最近，炔烃标记分子的受激拉曼散射(SRS)成像已经被报道，其检出限低至31μM水平，这使得其有望被用于活细胞中靶标分子在细胞内分布的非侵入性和高时空的可视化。
传统上，荧光与拉曼显微成像不兼容，因为荧光会大大增加拉曼信号的背景。然而最近，荧光显微成像已成功地与SRS显微成像相结合。
因此，能够在活细胞中同时定位两种类型信号(拉曼和荧光) 的双模态探针非常值得期待。
发明内容
本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征并且能够在拉曼细胞沉默区域(即，1800cm-1至2800cm-1)中产生拉曼信号的化合物。因此，该化合物能够用于通过荧光和拉曼显微镜二者而进行的双模态细胞成像中。例如，该化合物能够被用作标记生物医学研究中的目的靶标的标签。特别地，该化合物能够被用作线粒体的靶向探针。
在一个实施方案中，该化合物具有选自由下式组成的组中的骨架结构式：
Figure BDA0002150674450000031
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由以下基团组成的组中：H、
Figure BDA0002150674450000032
(氘)、
Figure BDA0002150674450000033
Figure BDA0002150674450000034
Figure BDA0002150674450000041
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一者不为H，
并且其中R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地选自由以下基团组成的组中：H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
在进一步的实施方案中，化合物具有以下骨架结构式：
Figure BDA0002150674450000042
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由以下基团组成的组中：H、
Figure BDA0002150674450000043
Figure BDA0002150674450000044
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一者不为H，
并且其中R7、R8、R9、R10、R11和R12、R13和R14独立地选自由以下基团组成的组中：H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
在一个实施方案中，化合物选自：
Figure BDA0002150674450000051
附图说明
现在将用参考附图详细描述各种实施方案。
图1A示出了在DMSO中AIE-SRS-Mito及其前体(AIE-SRS-1 和AIE-SRS-2)的紫外可见吸收光谱。
图1B示出了在DMSO中不同浓度的AIE-SRS-Mito的荧光(FL) 光谱。激发波长＝380nm。
图1C示出了在具有不同含水率的DMSO-水混合物中 AIE-SRS-Mito的PL光谱。
图1D示出了在DMSO-水混合物中的AIE-SRS-Mito的峰值波长和峰强度与含水率(染料浓度＝10μM；激发波长＝400nm)的关系图。
图2A示出了在B3LYP/6-31G**的基础水平下通过DFT计算的 AIE-SRS-Mito的优化结构。
图2B示出了在B3LYP/6-31G*的基础水平下通过DFT计算的 AIE-SRS-Mito的前沿轨道HOMO。
图2C示出了在B3LYP/6-31G*的基础水平下通过DFT计算的AIE-SRS-Mito的前沿轨道LUMO。
图3A示出了在培养基中用5μM的AIE-SRS-1染色20分钟(激发波长为330nm至385nm)的HeLa细胞的明场图像。
图3B示出了在培养基中用5μM的AIE-SRS-2染色20分钟(激发波长为330nm至385nm)的HeLa细胞的明场图像。
图3C示出了在培养基中用5μM的AIE-SRS-Mito染色20分钟 (激发波长330nm至385nm)的HeLa细胞的明场图像。
图3D示出了在培养基中用5μM的AIE-SRS-1染色20分钟(激发波长为330nm至385nm)的HeLa细胞的荧光图像。
图3E示出了在培养基中用5μM的AIE-SRS-2染色20分钟(激发波长为330nm至385nm)的HeLa细胞的荧光图像。
图3F示出了在培养基中用5μM的AIESRS-Mito染色20分钟 (激发波长为330nm至385nm)的HeLa细胞的荧光图像。
图4A示出了在培养基中用AIE-SRS-Mito(5μM)和Mitotracker Red FM(MTR，100nM)共同染色20分钟的HeLa细胞的明场图像。
图4B示出了在培养基中用AIE-SRS-Mito(5μM)染色20分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图4C示出了在培养基中用Mitotracker Red FM(MTR，100nM) 染色20分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图4D示出了图4B和图4C的合并图像。
图4E示出了通过MTT测定以评估细胞毒性的图。
图5A示出了在细胞沉默区域中EDU(PBS中5mM)或 AIE-SRS-Mito(DMSO中5mM)的SRS光谱。
图5B示出了不同浓度的AIE-SRS-Mito的SRS强度ISRS的变化 (减去DMSO的背景，ISRS＝ION-IOFF)。
图5C示出了不同浓度(0mM至10mM)的罗丹明123和 AIE-SRS-Mito的双光子激发荧光(TPEF)强度的变化。
图5D示出了在具有不同含水率的DMSO-水混合物中 AIE-SRS-Mito(1mM)的TPEF和SRS。
图6是通过使用具有钛蓝宝石激光器(激光功率＝5mW)的双光子显微镜在活细胞中测定的TPEF强度与激发波长关系的图。
图7A示出了活HeLa细胞中2950cm-1处蛋白质的SRS图像。
图7B示出了活HeLa细胞中2845cm-1处脂质的SRS图像。
图7C示出了活HeLa细胞中752cm-1处的细胞色素c的SRS图像。
图7D示出了活HeLa细胞中2125cm-1处的DNA的SRS图像。
图8A示出了活HeLa细胞中AIE-SRS-Mito的SRS图像。
图8B示出了活HeLa细胞中EdU的SRS图像。
图8C示出了活HeLa细胞中AIE-SRS-Mito的SRS图像。
图8D示出了活HeLa细胞中EdU的SRS图像。
图9A示出了用20μM的AIE-SRS-Mito染色的HeLa细胞的 TPEF图像，荧光强度(FL强度)用皇家色条编码。
图9B示出了用20μM的AIE-SRS-Mito染色的HeLa细胞的SRS 图像，FL强度用皇家色条编码。
图9C示出了图9A和图9B的合并成像。
图10A示出了用20μM的AIE-SRS-Mito染色的HeLa细胞的 TPEF图像。
图10B示出了用20μM的AIE-SRS-Mito染色的HeLa细胞的 SRS图像。
图10C示出了细胞1的FL强度和SRS强度的相关性的图。
图10D示出了细胞1的FL强度和SRS强度的相关性的柱状图 (通过ISRS＝0.1567c的等式将SRS强度ISRS理解为染料浓度c)。
图11A是用20μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图11B是用20μM的AIE-SRS-Mito染色60分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图11C是用20μM的AIE-SRS-Mito染色105分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图11D是用20μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的SRS图像。
图11E是用20μM的AIE-SRS-Mito染色60分钟的HeLa细胞的SRS图像。
图11F是用20μM的AIE-SRS-Mito染色105分钟的HeLa细胞的SRS图像。
图12A是用10μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图12B是用20μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图12C是用40μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的荧光图像。
图12D是用10μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的SRS图像。
图12E是用20μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的SRS图像。
图12F是用40μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的SRS图像。
具体实施方式
定义
提供以下定义旨在理解本主题并且构建所附专利权利要求。
应注意，如本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代。
本文使用的术语“λex”是指激发波长。
本文使用的短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指这样的现象：π-共轭荧光分子的聚集使荧光团的荧光强度显著降低。这种聚集体形成被称为“猝灭”荧光团的光发射。
本文使用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指在无定形或结晶(固态)状态下聚集时表现出显著的发光增强的化合物所表现出的现象，而它们在稀溶液中则表现为弱或几乎没有发光。
本文使用的“发光强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测定获得的荧光/磷光的光度；本文使用的“荧光团”或“荧光素”是指显示荧光的分子；本文使用的“发光原”或“发光团”是指显示发光的分子；以及本文使用的“AIEgen”是指具有AIE特性的分子。
本文使用的“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
本文使用的“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1 个至40个碳原子(即，C1-40烷基)(例如，1个至30个碳原子(即， C1-30烷基))。在一些实施方案中，烷基可具有1个至6个碳原子，并且可指“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)和丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。
本文使用的“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可为内部的(如在2-丁烯中)或端部的(如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，链烯基可具有2个至40个碳原子(即，C2-40链烯基) (例如，2个至20个碳原子(即C2-20链烯基))。在一些实施方案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、烷基或炔基取代。
本文使用的“杂原子”是指除碳或氢之外的任意元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。
本文使用的“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统，即两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环系统中可具有6个至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8个至24个碳原子。芳基的任意的合适的环位置可与定义的化学结构共价连接。仅具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环系统的实例包括(尤其为)环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为 5,6-双环环烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即，四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即，苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物 (即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二恶烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可被称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤芳基，即所有氢原子均被卤素原子(例如，-C6F5)取代的芳基。在一些实施方案中，芳基被另一个芳基取代，并且可被称为联芳基。联芳基中的各个芳基可如本文公开所述被取代。
如本文使用的“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)，硫(S)、硅(Si)和硒(Se)环杂原子的芳族单环的环系统或多环的环系统，该多环的环系统的环系统中存在的至少一个环是芳族的并含有至少一个环杂原子。多环杂芳基包括那些具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的，以及那些与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的具有至少一个单环杂芳基环的。杂芳基作为整体可具有(例如)5个至24个环原子并含有1个至5个环杂原子(即，5元至20元杂芳基)。杂芳基可以在任意杂原子或碳原子上与定义的化学结构连接，从而实现稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S 原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)，以下所示的5-或6-元单环和5-6双环的环系统：其中T为O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、喹啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻唑并噻唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的进一步的实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本主题适用的本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比例范围)，应该理解，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且这样的实施方案也包括在本发明内，受限于该规定范围内的任意特别排除极限值。在该规定范围包括两个极限值中的一者或两者的情况下，排除两个极限值的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可使用语言“基本上由......组成”或“由......组成”来替代性地描述实施方案。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，该近似值可根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
双模态生物成像探针
本主题考虑了用于双模态生物成像的探针。此类探针可包括用作拉曼和荧光成像探针两者的化合物。该化合物表现出聚集诱导发光 (AIE)特性并在细胞沉默区域(即，1800cm-1至2800cm-1)中产生拉曼信号。在荧光显微镜和受激拉曼显微镜二者中的任一种或两种下，该化合物可用于具有高对比度的线粒体靶向成像。该化合物可在生物成像中成功实现超高成像对比度、良好的光稳定性和生物相容性。
根据一个实施方案，该化合物具有选自由下式组成的组中的骨架结构式：
Figure BDA0002150674450000121
Figure BDA0002150674450000131
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由以下基团组成的组中：H、
Figure BDA0002150674450000132
Figure BDA0002150674450000133
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一者不为H，
并且其中R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地选自由以下基团组成的组中：H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
根据一个实施方案，该化合物包含以下结构式：
Figure BDA0002150674450000134
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由以下基团组成的组中：H、
Figure BDA0002150674450000135
Figure BDA0002150674450000141
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一者不为H，
并且其中R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地选自由以下基团组成的组中：H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
在一个实施方案中，化合物选自：
Figure BDA0002150674450000142
示例性反应方案如下所示：
Figure BDA0002150674450000151
此处所示的方法与以上使用ASCP的合成方法相似，不同之处在于，用市售4-(苯乙炔基)苯甲醛替代了所述4-(二甲氨基)苯甲醛。如可选择的反应方案中所示，本发明的化合物的制备方法可包括如下的相继步骤：Knoevenagel缩合、Suzuki偶联和烷基化。通过1HNMR、 13C NMR和高分辨率质谱确认了AIE-SRS-Mito及其合成前体 (AIE-SRS-1和AIE-SRS-2)的结构，结果令人满意。
鉴定目的靶标
根据一个实施方案，可使一种或多种本发明的化合物与靶细胞接触以鉴定靶细胞中的目的靶标，例如，检测是否存在目的靶标。可通过诸如荧光显微成像和/或拉曼显微成像之类的成像方法鉴定目的靶标。目的靶标可包括靶细胞的生物分子、药物、蛋白质和细胞器中的至少一种。根据一个实施方案，目的靶标为细胞器。根据一个实施方案，目的靶标为靶细胞中的线粒体。
根据一个实施方案，成像方法可包括荧光显微成像和拉曼显微成像两者，或者二者之中的一种单独使用。根据一个实施方案，拉曼显微成像可包括自发拉曼散射显微成像、受激拉曼散射显微成像和相干反斯托克斯拉曼散射显微成像中的至少一种。根据一个实施方案，荧光显微成像可包括荧光显微成像、共聚焦显微成像和双光子激发显微成像中的至少一种。根据一个实施方案，可由荧光强度定性地确定化合物的细胞内浓度。根据一个实施方案，可由受激拉曼散射信号强度定量地确定化合物的细胞内浓度。
根据一个实施方案，本发明的化合物可被用作双模态生物成像的探针。根据一个实施方案，本发明的化合物可在荧光和受激拉曼显微镜二者的情况下被用于具有高对比度的线粒体靶向成像。本发明的化合物具有AIE特征并且能够产生生物双正交拉曼信号。本发明的化合物在生物成像中可成功实现超高成像对比度、良好的光稳定性和生物相容性。例如，靶细胞可以与浓度高达40μM的本发明的化合物一起培养长达40分钟，以提供线粒体选择性染色，具有低细胞毒性和良好的生物相容性。
通过下面的实施例说明本发明的教导。
实施例
材料与仪器
极限必需培养基(MEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素以及Mitotracker RedFM购自Invitrogen。3-(4,5-二甲基噻唑-2- 基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)、其他化学品和溶剂全部购自 Sigma-Aldrich，并且不经进一步纯化直接使用。Milli-Q水由Milli-QPlus System(Millipore Corporation，Breford，美国)供应。使用Milli-Q 水(18.2MΩ)制备缓冲溶液。1×PBS含有NaCl(137mM)、KCl (2.7mM)、Na2HPO4(10mM)和KH2PO4(1.8mM)。使用d6-DMSO 和CDCl3作为溶剂并且使用四甲基硅烷(TMS)作为内参照，在Bruker ARX 400NMR光谱仪上测定1H和13C NMR光谱。在以MALDI-TOF 模式操作的Finnigan MAT TSQ 7000质谱仪系统上记录高分辨率质谱(HR-MS)。在Milton Ray Spectronic 3000阵列分光光度计上获取紫外吸收光谱。在Perkin-Elmer荧光分光光度计LS 55上记录光致发光(PL)光谱。以B3LYP/6-31G**理论的水平进行了理论计算用于
Figure BDA0002150674450000161
程序的几何优化、HOMO和LUMO。
对于细胞培养，将HeLa细胞置于湿度培养箱(37℃，5％CO2气氛)中含有10％FBS和抗生素(100单位/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)的MEM中进行培养，并且每2天至3天进行传代培养。
对于细胞成像，将HeLa细胞置于具有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。盖玻片安装在具有观察窗的铁片上。通过将染料原液(10 mM在DMSO中)加入到2mL细胞培养基中制备染色溶液。在成像之前，将细胞用2mL染料溶液染色一定时间，然后在FL显微镜 (BX41正置显微镜)下使用对每种染料的不同组合的激发和发光滤光器进行成像。
对于通过MTT评估的细胞活性，将细胞以每孔10000个细胞的密度接种在96孔板中。孵育24小时后，用含有不同AIE-SRS-Mito 浓度的100μL新鲜培养基替换每个孔中的培养基。处理24小时后，向各个孔中加入10μL MTT溶液(PBS中5mg/mL)。孵育4小时后，轻轻取出含MTT的溶液并用100μL DMSO替换。震动后，通过酶标仪(Perkin-Elmer Victor3TM)记录各个孔在490nm处的吸光度。各个实验平行进行6个孔。减去空白的背景，并且将对照组的细胞存活率设定为1。
实施例1
AIE-SRS-1的合成
在100mL圆底烧瓶中，将4-(苯基乙炔基)苯甲醛(206mg，1 mmol)和4-溴苯基乙腈(196mg，1mmol)溶解在40mL乙醇溶液中，以形成混合物。向混合物中添加氢氧化钠(100mg)。以50℃搅拌5小时后，过滤得到的浅黄色沉淀物并用冷乙醇洗涤。将产物干燥并称重。产率：95％。1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ(ppm)8.13 (s,1H),8.00(d,2H,J＝8.0Hz),7.74-7.71(m,6H),7.60-7.58(m,2H), 7.46-7.45(m,3H)。13C NMR(100MHz,d6-DMSO)δ(ppm)142.4,133.6,133.0,132.1,131.9,131.5,129.5,129.2,128.8,127.9,124.4, 122.8,121.9,117.5,109.8,91.8,89.0。MS(MALDI-TOF)：AIE-SRS-1 (C23H14BrN)的计算值：383.0310，实测值：383.0309。
实施例2
AIE-SRS-2的合成
在氮气中，将化合物1(192mg，0.5mmol)、4-吡啶基硼酸(74 mg，0.6mmol)、碳酸钾(172mg，1.25mmol)和Pd(PPh3)4(10mg，0.01mmol)共10mL水溶液和3mL的水加入到100mL装有冷凝器的双颈圆底烧瓶中，以形成混合物。搅拌混合物并且加热回流过夜。冷却至室温并蒸发THF后，将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取三次。收集有机相，用水洗涤并用无水硫酸镁干燥。在溶剂蒸发后，使用 DCM/MeOH作为洗脱剂，将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化。产率：99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.71(d,2H,J＝4.4Hz),7.93 (d,2H,J＝8.4Hz),7.82(d,2H,J＝8.4Hz),7.74(d,2H,J＝8.4Hz), 7.63(d,2H,J＝8.4Hz),7.60-7.54(m,5H),7.39-7.36(m,3H)。13C NMR(100MHz；CDCl3)δ(ppm)150.7,147.3,141.9,139.2,135.3,133.3,132.3,132.0,129.6,129.0,128.7,127.9,127.0,126.1,123.0 121.7,117.9,111.4。MS(MALDI-TOF)：AIE-SRS-2(C28H18N2) 的计算值：382.1470，实测值：382.1467。
实施例3
AIE-SRS-Mito(AIE-SRS-3)的合成
在100mL双颈圆底烧瓶中，将化合物2(100mg，0.26mmol) 溶解于10ml乙腈中。随后添加碘乙烷(0.1ml，1.25mmol)，并且将混合物加热回流过夜。冷却至室温后，按部分加入20mL乙醚。将形成的黄色沉淀物过滤并且用乙醚洗涤。将沉淀物重新溶解在丙酮中并且与饱和NaPF6溶液(5mL)混合。搅拌1小时后，蒸发丙酮。将得到的淡黄色沉淀物再次过滤，用水洗涤，减压干燥。产率：70％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ(ppm)10.35(s,1H),8.75(d,1H,J＝8.8Hz),8.30-8.26(m,2H),7.73(d,1H,J＝8.0Hz),7.60-7.42(m,9H), 7.30-7.24(m,5H),7.10(d,1H,J＝8.0Hz),4.43(t,2H,J＝7.2Hz), 4.01(s,3H)1.89-1.84(m,2H),0.82(t,3H,J＝7.2Hz)。13C NMR(100 MHz,d6-DMSO)δ(ppm)153.3,144.6,143.6,137.0,134.0,133.5,131.9,131.5,129.7,128.9,126.9,124.7,124.5,121.8,117.5,109.7, 92.1,89.0,55.6,16.3.31P-NMR(162MHz,d6-DMSO)δ(ppm)-131.0, 135.4,139.8,144.2,148.6,153.0,157.4。19F-NMR(376MHz, d6-DMSO)δ(ppm)-69.2,71.0。MS(MALDI-TOF)：AIE-SRS-3(C30H23N2 +)的阳离子计算值：411.1856，实测值：411.1860。MS (MALDI-TOF)：AIE-SRS-3(PF6 -)的阴离子计算值：144.9647，实测值：144.9639。
实施例4
光物理特性
通过1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱确认结构，结果令人满意后，研究了AIE-SRS-Mito的光物理性质。一方面，如图1A所示，AIE-SRS-Mito在约380nm处显示出吸收带，其合成前体红移。红移可归因于π-共轭的延伸以及吡啶盐的电子接受性质增强。另一方面，AIE-SRS-Mito的荧光发射带位于约500nm处，具有120nm 的大斯托克斯位移(图1B)，表明这种供体-π-受体分子的分子内电荷转移(TICT)发生扭曲。由于如此大的斯托克斯位移，随着浓度从31.25μM增加至2mM，仅观察到轻微的内滤效果，因为峰值波长几乎没有变化，并且强度在480nm以下略微降低。
然后研究了在具有不同含水率的DMSO-水混合物中的 AIE-SRS-Mito。如图1C至图1D所示，由于高极性水的淬灭作用，发射峰强度随着含水率从0体积％至70体积％的增加而降低。由于 AIE-SRS-Mito在水中的溶解性差，含水率的进一步增加导致染料分子的聚集/沉淀和荧光强度的增加。这是典型的AIE现象，因为在聚集时受激分子的自由分子内旋转受到限制，从而阻挡了非辐射衰变并且有利于辐射衰变。仅观察到峰值波长的轻微红移，而这应归因于含水率增加引起的溶液极性增加。通过理论计算进一步验证在激发时的 AIE特征和TICT效应(图2A至图2C)。结果显示在其优化的结构中AIE-SRS-Mito的扭曲构象与其他AIEgens一样，并且电子云从 HOMO向LUMO大量移位，表明TICT的发生的可能性很大。
实施例5
线粒体选择性染色
为了验证AIE-SRS-Mito的线粒体特异性，首先通过将HeLa细胞与5μM AIE-SRS-Mito孵育20分钟来进行细胞成像。与其合成前体相比，AIE-SRS-Mito前体表现出良好的细胞渗透性，其具有强烈的蓝色荧光(图3A至图3F)。
然后使用AIE-SRS-Mito和市售线粒体探针(Mitotacker Red (MTR)FM)进行共定位实验。AIE-SRS-Mito的激发波长为330nm 至385nm，MTR的激发波长为540nm至580nm。如图4A至4D所示，在具有高对比度的细胞中AIE-SRS-Mito将线性网状结构染色。 AIE-SRS-Mito的荧光与线粒体探针(Mitotacker Red FM)的荧光完全重叠，揭示了AIE-SRS-Mito的良好线粒体选择性。
通过MTT测定评估细胞细胞毒性(图4E)。将HeLa细胞与不同浓度的AIE-SRS-Mito一起孵育24小时。例如，将HeLa细胞与不同浓度的AIE-SRS-Mito孵育20分钟或40分钟，然后用新鲜培养基替代培养基，随后进一步培养24小时。如图4E所示，在与 AIE-SRS-Mito孵育24小时后，随着浓度从0μM增加至40μM，细胞存活率降低，半抑制浓度(IC50)约为7μM。然而，结果还示出了，用小于40μM的AIE-SRS-Mito处理少于40分钟后，细胞存活率保持在70％以上，表明AIE-SRS-Mito可在这种条件下用作线粒体选择性染色探针，细胞毒性低并且生物相容性好。
实施例6
SRS和TPEF
本发明人构建的FL-SRS显微镜用于在确认AIE特性和 AIE-SRS-Mito的线粒体选择性后，对AIE-SRS-Mito的拉曼散射信号进行实验。类似于其自身的自发拉曼光谱，AIE-SRS-Mito在细胞沉默区域中示出的拉曼峰在2223cm-1处，峰值强度为RIE＝6.0(图5A)。如此高的RIE值可归因于二苯乙炔(C≡C，2225cm-1，RIE＝3.2)和氰芪(cyanostilbene)(C≡N，2206cm-1，RIE＝1.3)的信号的协同作用。以下提供了EdU、二苯基乙炔和氰芪的化学结构。
Figure 2
为了消除光反射和散射对基线的影响，使用2223cm-1处的SRS 强度ION(谐振开启)和2160cm-1处的IOFF(谐振关闭)计算SRS 信号强度ISRS＝ION-IOFF。在纯DMSO(背景)中减去固有的ISRS＝0.042 V后，在图5B中所示的图中，获得SRS强度ISRS和染料浓度c之间的线性关系，ISRS＝0.1567c，R2＝0.99944。计算分析检出限和定量限分别为8.5μM和28.4μM，表明SRS系统的高灵敏度。此外，在DMSO 中以不同浓度收集AIE-SRS-Mito的SRS光谱，并且未发现峰位置的明显偏移，表明拉曼信号对浓度变化的惰性。由于SRS信号对环境变化的惰性响应，ISRS＝0.1567c的线性图可通过保持相同的信号收集条件进一步作为细胞内染料浓度的校准。
为了加深对SRS信号惰性的理解，与荧光的高灵敏度相比，检查了两个因素：浓度和极性。由于新建FL-SRS系统的可行性，双光子激发荧光(TPEF)用于该演示。使用具有钛蓝宝石激光(激光功率＝5mW)的双光子显微镜，并且用5μM的AIE-SRS-Mito将HeLa 细胞染色30分钟。将780nm处的图像强度设定为1。作为新合成的化合物，AIE-SRS-Mito的双光子激发峰波长被确定为780nm(图6)。
如图5C所示，对于AIE-SRS-Mito和罗丹明123两者，均在范围为0mM至10mM时观察到FL强度与浓度的关系非线性。发现罗丹明123的荧光猝灭的发生低于1mM，这可能是由于自吸收、受激分子的碰撞、非荧光受激准分子的形成等引起的。同时，发现了 AIE-SRS-Mito在高浓度下更能抵抗荧光猝灭。就极性效应而言，在 DMSO-水混合物中以1mM的浓度同时研究TPEF和SRS信号(图 5D)。随着含水率从0％增加至40％，SRS强度几乎没有显示出变化，而TPEF强度增加了约70％。此外，含水率的增加导致沉淀。荧光强度的变化与先前的结果相反。这种现象可归因于不同浓度的使用和激发方式。然而，详细的光物理机制仍不清楚。总体而言，结果表明荧光强度和SRS强度的惰性对浓度和周围环境的变化具有高灵敏度，表明在异质细胞内环境中的浓度校准，SRS优于荧光。
实施例7
活细胞中的SRS成像
用活的HeLa细胞进行SRS成像以验证新建的SRS成像系统。通过与100μM的EdU在培养基中孵育22小时，用EdU预标记HeLa 细胞的DNA，以确保足够的细胞摄取。图7A至图7D分别示出了 HeLa细胞中蛋白质、脂质、细胞色素c和DNA在2950cm-1、2845 cm-1、752cm-1和2125cm-1处的分布。
由于高拉曼信号(RIE＝6)和AIE-SRS-Mito的线粒体靶向， AIE-SRS-Mito可以作为拉曼显微成像的线粒体探针。在先前的报道中，细胞色素c(一种在线粒体膜中丰富的内源蛋白质)用于线粒体的可视化。然而，与细胞色素c(752cm-1，图7C)不清晰且低对比度的线粒体图像相比，在与5μM AIE-SRS-Mito孵育60分钟后(图 8A和图8C)，在2223cm-1处获得的HeLa细胞中线粒体的SRS图像具有更清晰的网状结构。同时，用EdU预标记Hela细胞的细胞核，并且在2125cm-1处成像(图8B和图8D)。两个信号的总差异证明了AIE-SRS-Mito与EdU在双色成像中的兼容性。与细胞间EdU的不均匀分布相比，AIE-SRS-Mito表现出均匀的分布，具有相似的信号强度。由于良好的细胞渗透性，对于标记而言，AIE-SRS-Mito的染色比EdU的染色时间短得多。总体而言，AIE-SRS-Mito作为具有快速的染色和良好的成像对比度的SRS成像用优质线粒体探针。
实施例8
FL-SRS成像
由于AIE-SRS-Mito通过TPEF和SRS显示双模态成像，研究了用20μM的AIE-SRS-Mito染色30分钟的HeLa细胞的荧光强度和 SRS信号强度的相关性。首先，如图9A至图9C所示，分别通过TPEF 和SRS信号收集HeLa细胞的图像，并且合并的图像表明荧光和SRS 信号的细胞内分布的完美共定位，证实了探针的双模态。如通过TPEF 强度和SRS信号的正相关性(解释为染料浓度)证实的(图10A至图10B)，统计分析示出了具有高荧光强度的区域通常具有高SRS 强度。由于SRS信号的惰性和线性关系(ISRS＝0.1567c)，进一步分析了单个细胞内染料浓度的分布。如图10D所示，细胞内的局部浓度可高达1.5mM，这是孵育浓度(20μM)的75倍。
为了观察AIE-SRS-MITO的细胞内浓度对细胞的影响，尝试通过延长培养时间来提高细胞中染料的含量。如图11A至11F所示，随着孵育时间的延长，TPEF和SRS强度两者均随着线粒体选择性的降低而增加。对细胞图像的仔细观察发现，线粒体的线状网状形态缩小为颗粒，表明线粒体处于不健康状态。这可以归因于这样的事实：线粒体基质中高浓度的阳离子染料将会造成去极化并且增加线粒体的渗透压，从而导致细胞死亡，如MTT测试的结果所示(图4E)。当提高染料浓度时发现了类似的结果(图12A至图12F)。
为了进一步研究细胞中染料分子的可接受的细胞内浓度，绘制了对于细胞的染料浓度的分布。对于与20μM的AIE-SRS-Mito孵育 30分钟、60分钟和105分钟的细胞，高浓度区域(>0.5mM)的百分率分别计算为16.7％、23.9％和30.0％。细胞内覆盖>99.5％的细胞区域的最终高浓度分别估计为1.5mM、2.0mM、3.0mM。结果表明，考虑到细胞的健康状态，HeLa细胞能够耐受线粒体基质中高达3.0 mM的高染料浓度而具有中等细胞存活率。如此高的浓度足以造成在细胞中罗丹明123的猝灭。
在所有观察到的细胞中，AIE-SRS-Mito的TPEF强度显示为与 SRS信号(染料浓度)呈正相关。据信，AIE-SRS-Mito的TPEF强度可用于定性比较细胞内浓度而不用担心ACQ问题。这也适用于其他AIE分子。本教导提出了一种用于确定具有高空间分辨率和非侵入性的AIEgens的细胞内浓度的方法。
对本主题进行这样的描述，很明显这一点可以以多种方式修改或改变。此类修改和改变不得视为违背本主题的精神和范围，并且所有此类修改和改变均旨在包括在以下权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种双模态生物成像用探针，该探针包含这样的化合物，所述化合物具有选自由下式组成的组中的结构式：
Figure FDA0003855857140000011
2.根据权利要求1所述的双模态生物成像用探针，其中所述化合物为：
Figure FDA0003855857140000012
3.一种细胞成像方法，包括：
用这样的化合物与靶细胞进行接触，所述化合物具有选自由下式组成的组中的结构式：
Figure FDA0003855857140000013
Figure FDA0003855857140000021
以及
使用包括荧光显微成像和拉曼显微成像中的至少一种的成像方法鉴定所述靶细胞中的目的靶标。
4.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述化合物为：
Figure FDA0003855857140000022
5.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述成像方法包括荧光显微成像和拉曼显微成像这两者。
6.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述拉曼显微成像选自由以下显微成像方法组成的组中：自发拉曼散射显微成像、受激拉曼散射显微成像和相干反斯托克斯拉曼散射显微成像。
7.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述荧光显微成像包括双光子激发显微成像。
8.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述荧光显微成像包括单光子激发显微成像。
9.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述化合物的细胞内浓度能够根据荧光强度定量确定。
10.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述化合物的细胞内浓度能够根据受激拉曼散射信号强度定量确定。
11.根据权利要求3所述的细胞成像方法，其中所述靶细胞中所述目的靶标包括所述靶细胞内的生物分子、药物、蛋白和细胞器中的至少一者。
12.根据权利要求11所述的细胞成像方法，其中所述细胞器包括线粒体。
13.根据权利要求4所述的细胞成像方法，其中所述成像方法包括荧光显微成像和拉曼显微成像这两者。
14.根据权利要求4所述的细胞成像方法，其中所述拉曼显微成像选自由以下显微成像方法组成的组中：自发拉曼散射显微成像、受激拉曼散射显微成像和相干反斯托克斯拉曼散射显微成像。
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