CN113454067B - 用于单线态氧生成与癌症消融的荧光探针 - Google Patents

Abstract

一种荧光探针可包括具有近红外(NIR)聚集诱导发光(AIE)的化合物。该探针可用于选择性成像和杀死癌细胞。这种探针可以对线粒体进行特异性染色，并选择性地靶向癌细胞而不是正常细胞。该探针具有较强的近红外(NIR)双光子吸收(2PA)、明亮的NIR发射和高效的单重态氧(¹O₂)生成。该探针可用于癌细胞选择性消融和使用图像引导的PDT在体内治疗黑色素瘤。

Description

用于单线态氧生成与癌症消融的荧光探针

交叉引用

本申请要求于2019年2月12日递交的美国临时专利申请No. 62/918,750的优先权，该美国临时专利申请由本发明人递交并且将其 全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本主题主要涉及荧光探针，这种荧光探针具有较强的近红外 (NIR)发射、优异的NIR双光子吸收、大的斯托克斯位移、优越的 线粒体特异性，因而是光动力疗法中的高效光敏剂。

背景技术

癌症是公认的重大公共卫生问题，并且在未来几十年里，癌症 甚至可能成为全球发病和死亡的主要原因。作为一个典型的例子，由 黑素细胞产生的恶性黑色素瘤是最危险的皮肤癌，其发病率急剧上升 并且晚期预后不良，这主要是因为其具有较大的转移倾向。一旦黑色 素瘤扩散到原来的位置以外，通过手术治疗就变得极其困难，而且它 对传统的化疗和放疗通常具有较高的耐药性。

光动力疗法(PDT)作为替代化疗和放疗的一种很有前途的方 法，由于其无侵入性、副作用少、耐药性低、毒性低，正在成为一种 有效的癌症治疗方式。PDT依靠光敏剂(PS)和光在有氧的情况下 产生具有细胞毒性的活性氧(ROS)，特别是单线态氧(¹O₂)，从 而对选定的细胞造成破坏。因此，PDT已经在许多国家被批准用于 肺癌、食道癌、膀胱癌、皮肤癌和头颈部癌的治疗。

尽管PDT有了很大的进展，但由于使用强激光而引起的过度发 热，以及会对健康组织产生有害副作用的常规PS的光毒性和无选择 性，导致PDT的临床应用远未达到理想的效果。虽然使用低照射功 率的光源可以避免过度加热，但常规PS在低照射功率光源下不具有 高效的治疗效果(高效的¹O₂生成)。

PDT的选择性可以通过使用相比于健康组织，更完全地富集在 肿瘤组织中的PS来实现。此外，靶向特定细胞器(如线粒体)的PS 更加有效，这是因为单线态氧的寿命很短(＜40ns)，并且作用半径 较小(＜20nm)。线粒体因其能有效地产生能量并介导细胞凋亡而 被认为是治疗应用的理想靶细胞器。因此，PS具有高效的¹O₂生成、 癌细胞选择性和线粒体特异性染色能力是提高PDT疗效的关键。

此外，在众多生物成像技术中，荧光成像已成为高空间分辨率、 高灵敏度、无创实时可视化生物结构和过程的有力工具。因此，对于 PS来说，有效的¹O₂生成与高亮度发光的联合已用于图像引导的PDT。 理想的用于图像引导的PDT的PS应具有高亮度近红外(NIR)发射 (>700nm)、高效的¹O₂生成、较小的暗毒性、良好的光稳定性和 生物相容性。

虽然一些有机NIR荧光团，如卟啉、二氢卟酚、酞菁和BODIPY 衍生物已经被作为PS以用于图像引导的PDT，但这些PS往往存在 一些固有的缺陷，包括斯托克斯位移小、荧光量子产率低、¹O₂产量 不高、非特异性靶向能力，光稳定性差和生物相容性不佳等。此外， 这些常规PS大多具有刚性平面的π共轭结构，因此容易在水性介质 中聚集，这会导致发射猝灭或聚集所致的猝灭(ACQ)和¹O₂产量不 足。因此，在图像引导的PDT中使用常规PS是有问题的。

聚集诱导发光(Aggregation-induced emission,AIE)概念最早由 唐本忠教授课题组于2001年提出，AIE现象背后的主要工作机制为 分子内运动限制(restriction ofmolecular motion,RIM)。AIE分子 (AIEgen)由于其在聚集体中具有更高的发射亮度、更大的斯托克 斯位移、优越的光稳定性以及作为“无洗”和“点亮”探针的巨大潜 力，是传统ACQ分子的很有前途的替代品。

更令人印象深刻的是，最近的研究表明，AIEgen也可以有效地 在聚集体中产生¹O₂，这是用于图像引导的PDT的重要特征。然而， 许多常规AIE PS显示较短的吸收和发射波长。开发在NIR区域同时 具有吸收和发射的AIE PS对于生物应用是非常有益的，因为它们的 光损伤更小，散射更低，光穿透更深，并且更好地区别于组织的自荧 光。此外，AIE PS的一个关键参数是有效的¹O₂生成。因此，具有 NIR激发、高亮度NIR发射、高效的¹O₂生成、癌细胞选择性和线粒 体特异性染色能力的AIE PS对于图像引导的光动力抗癌治疗是非常 理想的。

发明内容

本主题涉及一种可用于选择性成像和杀死癌细胞的荧光探针。 这种探针可以对线粒体进行特异性染色，并选择性地靶向癌细胞而不 是正常细胞。探针具有较强的近红外(NIR)双光子吸收(2PA)、 高亮度NIR发射和高效的单线态氧(¹O₂)生成。这种探针可以用于癌细胞选择性消融和使用图像引导的PDT治疗体内黑色素瘤。

在一个实施方案中，荧光探针包括具有以下骨架结构式的化合 物：

其中各R和R₃独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、 环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组；

X^-选自由PF₆ ^-、BF₄ ^-、SbF₅ ^-、CH₃COO^-、CF₃COO^-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-、 SO₃ ^2-、CF₃SO₂ ^-、TsO^-、ClO₄ ^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、(F₃CSO₂)N^-和PO₄ ^3-组成的组；

D选自由下列组成的组：

并且

各R₁独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、 杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组。

在一个实施方案中，骨架结构式选自由下列组成的组：

其中各R₁和R₂独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、 环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组。

在一个实施方案中，化合物为：

附图说明

现在将参照附图详细描述各种实施方案。

图1A至图1E描述了1(A)DCQu在DMSO中的吸收光谱和 DCQu在结晶粉末状态下的PL光谱(插图：DCQu晶体在荧光显微 镜下的荧光照片)；1(B)DCQu在具有不同的甲苯分数的DMSO/ 甲苯混合溶剂中的PL光谱；λ_激发＝500nm；1(C)DCQu的相对PL 强度(I/I₀)与DMSO/甲苯混合溶剂的组成的关系图；1(D)DCQu (c＝1×10^-4M)在二

烷中的双光子吸收截面；以及1(E)(i) DCQu的单晶结构、(ii)沿分子长轴的分子堆积结构和(iii)沿分 子短轴的分子堆积结构。

图2描述了基于单晶结构利用B3LYP/6-31G机组计算的DCQu 分子轨道HOMO和LUMO能级图。

图3描述了DCQu在固体状态下的荧光衰减曲线。

图4A至图4C描述了4(A)900nm的不同输入功率下DCQu 结晶粉末的PL光谱；4(B)输出荧光强度与输入激光功率的平方(W²) 之间相应的线性关系；以及4(C)DCQu结晶粉末的双光子激发窗 口。

图5A至图5D描述了经过5(A)0.1μM浓度的DCQu；5(B) 0.5μM浓度的DCQu；5(C)1μM浓度的DCQu；和5(D)5μM 浓度的DCQu染色的HeLa细胞的荧光图像(其中：1表示培养15 分钟，2表示培养30分钟，并且3表示培养60分钟；曝光时间：500 ms。比例尺：20μm)。

图6A至图6C描述了6(A)细胞的染色荧光图(i)DCQu、(ii) MitoTracker Green、(iii)i和ii的重叠图、(iv)表示i与ii之间的 相关系数的散点图；6(B)经过DCQu(1μM)染色30分钟的不同 正常细胞(HLF和LX2)和癌细胞(HepG2、B16、A549和HeLa) 的荧光图像；6(C)不同细胞在用DCQu(1μM)培养30分钟后的 相对荧光强度，这些图像的荧光强度用Image J测得。

图7为描述了随着激光照射的连续扫描次数的增加，经过DCQu 和MitoTrackerGreen染色的HeLa细胞的荧光损失程度的图(发射信 号在照射开始时归一化到最大强度)。

图8A至图8B描述了经过DCQu(5μm)染色30分钟的HeLa 细胞的8(A)双光子激发荧光图像(双光子激发波长：900nm)和 (8B)亮视野图像。

图9A至图9F描述了9(A)在DCQu的存在下，ABDA在白光 (4.2mW cm^-2)照射下的吸收光谱；[DCQu]：5×10^-6M，[ABDA]： 5×10^-5M，UV测试时间间隔：20s；9(B)在不同的PS的存在下， ABDA在白光照射下的分解速率；其中A₀和A分别是ABDA在光 照前和光照后在378nm的吸光度；[PS]：5×10^-6M，[ABDA]：5×10^-5 M，UV测试时间间隔：20s；9(C)图像示出了使用H2DCF-DA检 测的用DCQu培养并随后用白光照射不同时间的HeLa细胞内的ROS 生成；9(D)经过DCQu(5μM)染色并随后通过不同的双光子(900 nm，fs Ti：蓝宝石激光器)扫描次数得到的HeLa细胞的双光子激发 荧光(上行)和亮视野(下行)图像；9(E)示出了在无白光照射或有白光照射下，用不同浓度DCQu染色的HeLa癌细胞和HLF正 常细胞的细胞存活率的图；以及9(F)示出了在无白光照射或有白 光照射下，用不同浓度DCQu或Ce6染色的黑色素瘤B16细胞的细 胞存活率的图。

图10描述了，使用H2DCF-DA检测的未用DCQu培养并随后 用白光照射不同时间的HeLa细胞内的ROS生成(激发波长：488nm； 发射波长：580nm至740nm)。

图11A至图11G描述了11(A)白光照射(4.2mW cm^-2)下， 对患有B16黑色素瘤的小鼠进行体内PDT治疗的示意图；11(B) 完成不同治疗方案组的小鼠肿瘤组织的典型图像；11(C)不同治疗 方案组的患有B16黑色素瘤的小鼠的肿瘤生长曲线；11(D)示出了 每个治疗组的肿瘤抑制率的图；11(E)示出了不同的治疗后的小鼠 存活率的曲线图；11(F)示出了不同组的患有B16黑色素瘤的小鼠 在整个治疗期间的体重的曲线图；以及11(G)用苏木精和伊红染色 的肿瘤组织的组织学切片。

图12示出了不同组的患有B16黑色素瘤的小鼠在治疗过程中的 代表性图像。

图13示出了光照、Ce6、DCQu、Ce6+光照和DCQu+光照处理 后小鼠主要器官的H&E染色图像(包括心、肝、脾、肺、肾在内的 主要脏器未见明显异常)。

图14示出了DCQu的晶体结构精修图。

具体实施方式

提供以下定义是为了理解本主题并用于构造所附专利权利要求。

定义

应该理解，上面或下面描述的附图仅用于说明目的。附图不一 定按比例绘制，重点通常在于说明本教导的原理。附图不旨在以任何 方式限制本教导的范围。

在整个申请中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分 时，或者当方法被描述为具有、包括或包含特定的方法步骤时，预期 本教导的组合物也可以基本上由所述成分组成或者由所述组分组成， 并且本教导的方法也可以基本上由所述方法步骤组成或由所述方法 步骤组成。

在本申请中，当元件或组件被称为包括在所列举的元件或组件 的列表中和/或从所列举的元件或组件的列表中选择时，应当理解， 该元件或组件可以是所述元件或组件中的任何一个，或者该元件或组 件可选自由两种或更多种所述元件或组件组成的组。此外，应当理解， 本文描述的组合物、装置或方法的元件和/或特征可以以各种方式组 合而不脱离本教导的精神和范围，无论是明确的还是隐含的。

除非另外特别说明，否则术语“包括(include，includes，including)” 或“具有(have，has，having)”的使用通常应理解为开放式和非限 制性的。

除非另外特别说明，否则本文中单数的使用包括复数(反之亦 然)。另外，除非另外特别说明，否则在术语“约”的使用位于定量 值之前的情况下，本教导也包括特定的定量值本身。如本文所用，除 非另外指出或推断，否则术语“约”是指与标称值相差±10％。

应当理解，只要本教导仍然可操作，步骤的顺序或执行某些动 作的顺序是不重要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

如本文所用，“杂芳基”是指包含选自氧(O)、氮(N)、硫 (S)、硅(Si)和硒(Se)中的至少一个环杂原子的芳族单环系统 或以下多环系统，在该多环系统中，存在于该环系统中的至少一个环 是芳族的并且包含至少一个环杂原子。多环杂芳基包括两个或更多个 稠合在一起的杂芳基环以及与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/ 或非芳族环杂烷基环稠合的单环杂芳基环。整体上，杂芳基可具有例 如5至22个环原子并且含有1至5个环杂原子(即5元至20元杂芳 基)。杂芳基可在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至定义 的化学结构。通常，杂芳基环不包含O-O键、S-S键或S-O键。然 而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧 化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例 如)如下所示的5元或6元单环和5-6双环系统：

其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如， N-苄基)、SiH₂、SiH(烷基)、Si(烷基)₂、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷 基)₂或Si(烷基)(芳基烷基)。此类杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃 基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、 吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、 噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、 2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑基、苯并三唑基、苯并咪 唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、 苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲哚基、2H-吲哚基、吲哚啉嗪基、异苯 并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑 并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、 噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢 喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案 中，杂芳基可如本文所述被取代。

如本文所用，“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实 例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、 丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正 戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1 至40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即，C1-30 烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子，并且可称 为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在 一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷 基、链烯基或炔基取代。

如本文所用，“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链 或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、 己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键 可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。 在各种实施方案中，链烯基可具有2至40个碳原子(即C2-40链烯 基)，例如，2至20个碳原子(即C2-20链烯基)。在一些实施方 案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、 烷基或炔基取代。

如本文所用，“稠合环”或“稠合环部分”是指具有至少两个 环的多环系统，其中至少一个环是芳族的并且该芳族环(碳环或杂环) 与至少一个其他环具有共同的键，该至少一个其他环可以是芳族或非 芳族的环以及碳环或杂环。这些多环系统可以是高度p-共轭的并且 任选地如本文所述被取代。

如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢以外的任何元素的原子， 并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。

如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统， 其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少 一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基 在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可 包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳 原子。芳基的任何合适的环位置可以与限定的化学结构共价连接。仅 具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双 环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中 至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环 体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环 烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双 环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即苯并咪唑啉基，其 为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物(即，色烯基， 其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二噁 烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一 些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基 可具有一个或多个卤素取代基，并且可称为“卤代芳基”。全卤芳基， 即所有氢原子被卤素原子取代的芳基(例如-C₆F₅)包括在“卤代芳 基”的定义内。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以 称为联芳基。如本文公开的那样，联芳基中的每个芳基可以被取代。

如本文所用，“诊疗剂”是指具有诊断和治疗能力的有机材料。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当 前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比 率范围)，应理解的是，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的 上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何 其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些 较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这些实施 方案也包括在所描述的主题内，受所述范围内的任何特别排除的极限 值的限制。在所述范围包括一个或两个极限值的情况下，排除所包括 的极限值中的任一者或两者的范围也包括在所描述的主题中。

在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而， 本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，可以使用“基本上由...... 组成”或“由......组成”的语言来替代性地描述实施方案。

为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有 说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以 及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因 此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出 的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少， 每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的 舍入技术来解释。

荧光探针

本主题涉及一种荧光探针，其包括具有近红外(NIR)聚集诱导 发光(AIE)的化合物。化合物可以显示明亮的NIR固态荧光(发光 在约736nm，量子产率为约6％)、大的斯托克斯位移(为约218nm) 和大的2PA截面(高达约795GM)。化合物具有特异性线粒体靶向 能力、良好的生物相容性、高亮度以及优异的光稳定性。该化合物可 以在光动力疗法(PDT)中产生活性氧(ROS)，用于体外癌细胞选 择性消融和体内黑色素瘤治疗。例如，该化合物可以作为光敏剂在 PDT中高效地生成单线态氧(¹O₂)。

在一个实施方案中，化合物可以具有下列骨架结构式：

其中各R和R₃独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、 环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组；

X^-选自由PF₆ ^-、BF₄ ^-、SbF₅ ^-、CH₃COO^-、CF₃COO^-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-、 SO₃ ^2-、CF₃SO₂ ^-、TsO^-、ClO₄ ^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、(F₃CSO₂)N^-和PO₄ ^3-组成的组；

D选自由下列组成的组：

并且

各R₁独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、 杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组。

在另一个实施方案中，骨架结构式选自由下列组成的组：

其中各R₁和R₂独立地选自由H、烷基、不饱和烷基、杂烷基、 环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂组成的组。

在一个实施方案中，化合物为：

选择性识别癌细胞并阻止细胞生长

如本文中详细说明的，成像研究表明，本发明的化合物可以作 为一种有效的探针来选择性地识别癌细胞。本发明的化合物可以选择 性地靶向癌细胞而不是正常细胞。特别是，本发明的化合物可以以高 亮度和高信噪比染色癌细胞线粒体。

一旦癌细胞被识别出来，这些化合物就可以暴露在白光下，使 化合物发挥光敏剂的作用。本发明的化合物在暴露于白光照射时可提 供极高的活性氧(如单线态氧)生成效率。因此，本发明的化合物可 以对癌细胞提供选择性的细胞毒性。在一个实施方案中，本发明的化 合物可用于体外癌细胞选择性消融。本发明的化合物可在图像引导的 PDT中作为高效光敏剂。在一个实施方案中，本发明的化合物可用 于体内黑色素瘤PDT的光敏剂。

在一个实施方案中，细胞成像方法可包括使目标细胞与荧光化 合物接触并使用成像方法识别细胞目的靶标。该成像方法可包括荧光 显微术和共聚焦激光扫描显微检查法中的至少一种。该荧光显微检查 法可以包括单光子荧光显微检查法和双光子荧光显微检查法中的至 少一种。在一个实施方案中，目的靶标可包括靶细胞的线粒体。

在一个实施方案中，杀死癌细胞的方法可以包括用荧光化合物 接触靶癌细胞、当化合物接触靶癌细胞时使用成像方法对靶癌细胞进 行成像和当化合物接触靶癌细胞时，将靶癌细胞置于白光照射下，以 杀死靶癌细胞。在一个实施方案中，将靶癌细胞置于白光照射下可包 括使用照射功率为约4.2mW cm^-2的超低功率灯。在一个实施方案中， 靶癌细胞在活的动物体内。在一个实施方案中，靶癌细胞为黑色素瘤 癌细胞。

由于本发明的化合物是纯有机的，因此这些化合物表现出良好 的生物相容性，并且未检测到毒副作用。这些化合物具有超高的稳定 性和良好的光动力学性能，从而使其具有很好的诊断和治疗应用前景。

通过以下实施例说明本教导。

实施例

材料和仪器

所有的化学品和试剂都是市售可得的，并且无需进一步纯化即 可直接使用。中间体1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉鎓碘化物和7-(二苯氨 基)-9-乙基-9H-咔唑-2-甲醛是按照已知合成路线合成的。9,10-蒽基- 双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (H2DCF-DA)和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT) 购自Sigma-Aldrich并直接使用。关于细胞培养，最低必需培养基 (MEM)、胎牛血清(FBS)、青链霉素溶液、MitoTracker Green FM 购自Invitrogen公司。

表征

在Bruker ARX 400NMR谱仪上，以CDCl₃和DMSO-d₆为溶剂， 并选择四甲基硅烷(TMS；δ＝0ppm)作为内标测定¹H和¹³C NMR 谱。在Finnigan MAT TSQ 7000质谱仪系统MALDI-TOF模式下测得 高分辨率质谱(HR-MS)。吸收光谱是在Milton Roy Spectronic3000 阵列分光光度计上测量的。稳态光致发光(PL)光谱在Perkin-Elmer 荧光光谱仪LS55上进行测定。用经校准的积分球(Labsphere)测 定绝对荧光量子产率。在SuperNova，Dual，Cu，0，Atlas衍射仪上 收集单晶数据。在数据收集期间，晶体保持在100.01(10)K。使用 Olex2，通过使用电荷翻转的Superflip结构解决方案程序对结构进行 解析，并使用最小二乘法(Least Squares minimisation)以ShelXL精 修软件包对其进行精修。以罗丹明B为参照，用双光子激发荧光法 测量双光子激发荧光截面。用于双光子激发的激发源是飞秒光学参量 放大器(Coherent OPerA Solo)，由放大的Ti：蓝宝石系统(Coherent LegendElite系统)泵浦，然后用偶联至CCD的光谱仪(Acton SpectraPro-500i)进行检测。利用Gaussian 09软件包进行模拟。利用 Zeiss激光扫描共聚焦显微镜(LSM710)采集激光共聚焦扫描显微镜 图像，并用ZEN 2009软件(Carl Zeiss)进行分析。

细胞培养

将细胞系在含有10％胎牛血清和抗生素(100单位/mL青霉素和 100μg/mL链霉素)的MEM中培养，置于37℃、5％CO₂湿度培养 箱中。

光照下DCQu对细胞的细胞毒性

细胞毒性是利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT)根据操作手册进行评估。将细胞接种于96孔板(Costar， IL，USA)，密度为每孔6000至8000个细胞。隔夜培养后，将每孔 的培养基替换为含有不同浓度的DCQu或Ce6的100μL新鲜培养基。DMSO的体积分数低于0.2％。孵育30分钟后，将含有新鲜培养基的 细胞的板暴露在白光(4.2mW/cm^-2)下90分钟，而另一组含有细胞 的板置于黑暗中作为对照。然后，对这些板进行与生物相容性试验相 同的处理。24h后，每孔添加10μL的MTT溶液(5mg/mL的PBS 溶液)。孵育4小时后，在每个孔中添加DMSO，并轻轻摇动板以 溶解所有形成的沉淀物。最后，通过酶标仪(Perkin-Elmer Victor3TM) 记录每个孔在570nm处的吸光度。每次试验都在5个孔中平行进行。

细胞成像

细胞在35-mm的有盖培养皿中培养。用一定浓度的染料(将2μL DMSO母液加入2mLDMSO<0.1体积％的MEM中)染色30分钟。 为了与MitoTracker Green共染，首先用DCQu和MitoTracker Green (0.5μM)在37℃孵育细胞30分钟。用染料孵育后，用PBS洗涤细 胞三次。将细胞在共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显 微镜)下成像，对每种染料使用适当的激发和发射滤光片(对于DCQu， 激发滤光片＝488nm，并且发射滤光片＝600-740nm；对于 MitoTracker Green，激发滤光片＝488nm，并且发射滤光片＝500-530 nm)。

细胞中的双光子荧光成像

根据关于共聚焦荧光成像所述的步骤，对HeLa细胞进行DCQu (5μM)染色以用于双光子成像。使用装配有多光子激光器(相干 Chameleon Ultra II多光子激光器)的受激发射损耗显微镜(STED) (莱卡受激发射损耗显微镜)收集HeLa细胞的双光子荧光图像。激 发波长＝900nm；发射滤光片＝600-740nm。

双光子PDT

将HeLa细胞接种于2×10⁵/共聚焦成像培养皿中，在培养皿中加 入2mL DMEM培养基(含10％胎牛血清和1％PLS)。24小时后， 用5μM DCQu在37℃下将细胞染色30分钟，然后用新鲜培养基保 存。在配有900nm激发、2500W(67％增益)的双光子激光器的STED 显微镜下，对细胞成像。在1、2、4、8、16、32次扫描后进行成像。

光稳定性

用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显微镜)对标 记了特定染料的HeLa细胞进行成像。用488nm的激光激发染料进 行单光子成像。对每种染料分别设置成像参数以获得最佳图像。进行 连续扫描(每次扫描11秒)。在每个扫描序列中，限定了三个具有 线粒体的目标区域(ROI)。每个ROI的第一次扫描设置为100％。 然后将每个ROI的像素强度值取平均值，并绘制其与扫描次数的关 系图。所得到的曲线代表了实验者会遇到的漂白速率。

实施例1

DCQu的合成

为了开始合成DCQu，首先通过两步得到前体7-(二苯基氨基)-9- 乙基-9H-咔唑-2-甲醛，这两步开始于2,7-二溴-9-乙基-9H-咔唑的乙基 化，随后是酸性条件下的甲酰化反应。得到中间体醛的单晶并用X 射线晶体学方法进行了分析。晶体数据如表1所示。

前体醛与活性甲基喹啉鎓盐在乙醇中发生Knoevenagel缩合反 应，然后用六氟磷酸阴离子取代碘阴离子，得到了79％的优异收率 的DCQu。下面提供了制备DCQu化合物的示例性反应方案：

将7-(二苯基氨基)-9-乙基-9H-咔唑-2-甲醛(0.5g，1.28mmol) 和1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉鎓碘化物(0.37g，1.16mmol)溶于无水 乙醇(15mL)中。添加2滴哌啶并将溶液在氮气下回流3h。冷却 至室温后，将沉淀的固体过滤，用冷乙醇洗涤并干燥，以得到为紫色固体的碘化物盐产物(0.62g，收率：78％)。然后，将碘化物溶解 在丙酮(20mL)中，并添加KPF₆的饱和水溶液(20mL)。搅拌三 十分钟后，将溶液蒸发至干。将粗产物经过快速硅胶柱层析，用二氯 甲烷/甲醇洗脱，从而得到为紫色晶态固体的DCQu(0.63g，收率： 99％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ9.20(d,J＝6.6Hz,1H), 9.11(d,J＝8.4Hz,1H),8.55(d,J＝9.0Hz,1H),8.51(d,J＝6.6Hz, 1H),8.45(d,J＝15.9Hz,1H),8.35(d,J＝15.8Hz,1H),8.25-8.22(m, 2H),8.17(d,J＝8.1Hz,1H),8.10-8.03(m,2H),7.81(d,J＝7.8Hz, 1H),7.33-7.29(m,4H),7.18(s,1H),7.08-7.03(m,6H),6.87(dd,J＝ 8.4Hz,1.7Hz,1H),5.19(t,J＝5.6Hz,1H),5.04(t,J＝4.5Hz,2H), 4.36(q,J＝6.2Hz,2H),3.93(q,J＝4.8Hz,2H),1.27(t,J＝7.1Hz, 3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm):δ152.96,147.91,147.35,146.67,144.61,141.77,140.12,137.99,134.70,132.12,129.36,128.83, 126.59,126.54,124.51,123.63,122.83,121.86,120.76,120.32,120.02, 118.22,117.59,116.68,115.30,109.03,104.03,58.79,58.64,36.84, 13.55.HRMS(MALDI-TOF):C₃₉H₃₄N₃O[M-PF₆]⁺m/z计算值： 560.2696，实测值：560.2714。

实施例2

DCQu的光物理性质

通过NMR、高分辨质谱和单晶X射线衍射分析对目标化合物进 行了全面的表征(表2)。所得的数据与所提出的分子结构非常一致。

随后利用UV-vis吸收光谱和光致发光(PL)光谱研究了DCQu 的光物理性质。如图1A所示，DCQu在二甲基亚砜(DMSO)中具 有较宽的吸收，最大吸收峰位于507nm处，这是由于分子内电荷转 移(ICT)从供电子的二苯胺基转移到拉电子的喹啉鎓基。为了更好 地理解分子内部的ICT转移，我们利用由X射线分析确定的单晶结 构对DCQu进行密度泛函理论(DFT)计算(图2)。HOMO的电子 云主要位于二苯胺基和中央咔唑环上，而LUMO的电子云主要位于 受体结构上，表明荧光团内部有很强的电荷转移特性。

然后研究了DCQu在具有不同甲苯分数的DMSO/甲苯混合溶剂 中的AIE性能(图1B和图1C)。在纯DMSO中，DCQu的发光很 弱，这主要是由于溶液状态中强的分子旋转，引起激发态通过非辐射 途径消耗能量所致。随着甲苯分数的增大，混合溶剂中化合物的荧光 强度逐渐增强，增强了243倍，这是由于聚集体形成后引起旋转运动 受限。这些结果表明，DCQu在NIR区域具有AIE活性，最大发射 位于725nm。由于AIE特性，DCQu表现出明亮的NIR固态荧光， 峰值位于736nm，用积分球测定的荧光量子产率(Φ_f)为6％。固态 DCQu的时间分辨荧光测试显示其寿命为1.34ns(图3)。此外，DCQu 显示出非常大的斯托克斯位移(218nm)，说明激发和发射之间的干 扰小，有利于生物成像应用。

DCQu的强推拉偶极特性和大共轭结构有可能使分子具有2PA 性质。因此，首次用双光子激发荧光(TPEF)方法记录了DCQu在 二

烷中的双光子激发光谱。在800nm至1040nm(每间隔40nm) 的激发下收集发射信号，化合物在这个区域没有线性吸收。如图1D 所示，DCQu在800nm至1040nm的范围内表现出良好的2PA活性， 在1000nm处的最大2PA截面(σ_2P)为795GM。此外，与之前报 道的苯桥基AIEgen和其他荧光团相比，所合成的咔唑桥基推拉荧光团的σ_2P值有了很大的提高。

考虑到强固态荧光，我们还研究了DCQu在固态下的双光子激 发荧光(图4A至图4C)。在900nm激光激发下，DCQu在固态下 的上转换PL光谱显示出与单光子测量结果相似的发射最大值，这说 明从单光子和双光子激发态到基态的发射过程是相同的。当激发源功率增加时，双光子激发的荧光强度与入射能量呈平方关系，表明上转 换发射源于双光子吸收过程。与DCQu溶液类似，DCQu在固态下也 具有800nm和1040nm之间的宽双光子激发窗口。这些结果有力地 证明了所设计的共轭偶极发色团具有良好的2PA活性，并且其具有 位于700nm至1000nm的范围内的生物透明窗口。

实施例3

晶体结构

观察到DCQu的AIE效应和明亮的NIR固态荧光后，我们研究 了DCQu的分子构象和晶体结构中的分子排列。利用乙醇/CH₂Cl₂混 合溶液缓慢蒸发，得到了适合于单晶X射线分析的晶体。晶体数据 和采集参数总结于上述表2中。DCQu晶体属于单斜P2₁/c空间群， 晶胞内包含4个分子。单晶X射线衍射分析为DCQu的绝对结构、 特别是反式构象提供了直接证据。晶体结构表明，咔唑和喹啉鎓分布 基本上是平面共轭的，其二面角较小，为1.65°，从而使π电子在整 个分子上具有良好的离域性。

因此，强推拉电子特性与荧光分子内的大π共轭结构联合，不 仅可以有效地将发射波长红移到NIR波段，而且可以显著提高分子 的非线性光学性质，这与其NIR发射和优异的双光子性质完全一致。 如图1E所示，平面分子沿分子长轴进一步排列成滑移角为45.8°的反 平行二聚体偏移柱状堆叠体，通过紧密的分子间π-π堆积呈现J型堆 积。DCQu的晶体排列图显示，分子间和分子内存在多种相互作用， 如P-F···H、C-H···π和π···π相互作用，这有助于分子构象的固化和 分子内旋转的锁定。因此，在固态下，由分子内旋转消耗的激发态能 量大大减少，从而使分子能够发出具有AIE特征的强烈的NIR荧光。

实施例4

单光子和双光子生物成像

强NIR 2PA、NIR AIE特性和大的斯托克斯位移的优势使DCQu 成为很有前途的生物应用候选物。首先进行了细胞成像实验，用不同 浓度的DCQu孵育HeLa细胞15分钟、30分钟和60分钟，然后在 488nm激发光下观察。如图5A至图5D所示，浓度和孵育时间对细 胞成像都有明显影响。在相同孵育时间下，随着DCQu浓度的增加， 荧光信号逐渐增大。在相同DCQu浓度下，随着培养时间的延长， 从15分钟增加到30分钟，荧光信号增强。再增加培养时间到60分 钟，荧光信号没有明显变化。值得注意的是，在低至0.1μM的DCQu 浓度孵育的细胞中仍然可以观察到DCQu的荧光，这表明在细胞成 像中DCQu的亮度很高。

为了进一步了解AIEgen对细胞成像的特异性，我们将HeLa细 胞与DCQu一起孵育，随后与MitoTracker Green一起孵育，从而进 行共定位实验，其中MitoTracker Green是一种市售可得的线粒体探 针。如图6A(iii)所示，用DCQu染色的图像(i)与用MitoTrackerGreen染色的图像(ii)完全重叠，从而得到高的皮尔逊相关系数， 为0.95(iv)，因此说明DCQu对线粒体染色具有优越的特异性。

阳离子亲脂性DCQu的线粒体特异性靶向能力主要依赖于跨越 线粒体膜的约180mV的非常大的膜电位的驱动力。随后用连续激光 激发和共聚焦显微镜连续扫描的方法检测了DCQu的光稳定性，光 稳定性是评价荧光生物探针的重要标准。如图7所示，在60次扫描 中，MitoTracker Green的荧光强度减弱到其初始值的89％。相比之 下，DCQu的荧光信号在相同的处理过程中略有下降至其初始值的 92％，从而表明与商品化染料相比，DCQu具有更好的光稳定性。

还对DCQu在线粒体双光子成像中的适用性进行了研究。如图 8A至图8B所示，DCQu在900nm双光子激发下清晰地染色HeLa 细胞内的线粒体，揭示了其能够作为一种实现活细胞内线粒体的NIR 至NIR成像的双光子成像探针的有前途的候选物。

癌细胞通常比正常细胞具有更带负电荷的表面，因为癌细胞表 面的正离子可以被分泌的乳酸阴离子所清除，而乳酸阴离子是癌细胞 内糖酵解过程中乳酸分泌水平升高所产生的。此外，代谢更活跃的癌 细胞表现出比正常细胞更高的线粒体膜电位(MMP)，差异为至少 60mV。癌细胞膜和线粒体膜上的这种独特的静电模式已被证明是一 种强大的驱动力，以用于通过与带正电荷的物体的强静电相互作用来 区分癌细胞与正常细胞。

在测定DCQu的内在正电荷和线粒体特异性能力后，进一步研 究了DCQu对癌细胞和正常细胞的区分能力。将各种癌细胞和正常 细胞在相同条件下用DCQu孵育，然后在共聚焦荧光显微镜下观察。 如图6B和图6C所示，DCQu更容易在癌细胞(包括HepG2、B16、 A5496B和HeLa)中积累，并以高亮度和高信噪比染色线粒体。相 比之下，正常细胞(如HLF和LX2)显示的荧光要弱得多。这些结 果证明了在不使用任何分子生物标志物的情况下，DCQu具有选择性 靶向癌细胞的良好能力。

实施例5

光动力疗法

随后研究了DCQu的PDT应用。考虑到DCQu在可见光区域有 很强的吸收，因此采用超低功率白光照射(400nm至700nm，4.2mW cm^-2)对DCQu的¹O₂生成能力进行了初步评价。使用商品化¹O₂指 示剂9,10-蒽基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)。ABDA可被¹O₂氧 化以生成内过氧化物，这导致ABDA吸收减少。在白光照射下，随 着照射时间的延长，含有DCQu的ABDA溶液的吸光度显著降低， 并且ABDA在6分钟内完全被消耗(图9A)。从ABDA的吸收变化 可以计算出初始20s的光照消耗了16.99nmol的ABDA。相比之下， Ce6、TPPS和玫瑰红(RoseBengal)这三种已知且最常用的具有高 的¹O₂生成效率的PS在相同条件下仅分别消耗了1.67nmol、2.69 nmol和3.04nmol的ABDA。DCQu的¹O₂生成能力分别是Ce6、TPPS 和玫瑰红的10.17倍、6.32倍和5.59倍(图9B)。我们认为DCQu 的¹O₂生成能力优于先前报道的AIE PS。

在研究将DCQu作为PS以用于活细胞的PDT时，我们研究了 在HeLa细胞内由白光照射触发的DCQu的ROS生成。将HeLa细胞 同时用H2DCF-DA和DCQu孵育或单独用H2DCF-DA孵育。如图 9C所示，随着照射时间的延长，H2DCF-DA和DCQu共同孵育的细 胞中的荧光信号明显增加，从而表明DCQu在光照过程中产生了有 效的ROS。相比之下，在没有DCQu的情况下，没有观察到明显的 荧光增加(图10)。为了评价DCQu在双光子激发下的治疗效果， 将HeLa细胞与DCQu一起孵育，并以900nm双光子fs-激光扫描照 射。如图9D所示，随着扫描次数的增加，双光子扫描引起了细胞形 态的逐渐显著的变化。这些变化与细胞坏死有关，并且显然是由 DCQu在双光子激发下产生的¹O₂引起的，从而揭示了DCQu在双光 子PDT中的巨大潜力。

采用标准MTT法研究了DCQu对HeLa癌细胞治疗效果的定量 评价(图9E)。用DCQu在黑暗中孵育HeLa细胞后，无论使用何种浓 度的DCQu(高达10μM)，细胞存活率仍高于89％，从而表明DCQu 在黑暗条件下具有较低的细胞毒性。然而，在白光照射下，DCQu表 现出显著的剂量依赖性毒性，细胞存活率逐渐下降(浓度为10×10^-6M 时下降至9％)，从而表明DCQu在通过光动力学过程的癌细胞消融 中具有良好的应用潜力。

为了进一步验证DCQu在杀死癌细胞而不是正常细胞中的选择 性，我们在相同条件下，以HLF细胞作为正常细胞模型，进行了剂 量依赖的细胞毒性评估。作为结果，我们发现DCQu对HLF细胞具 有与HeLa细胞相似的可忽略的暗细胞毒性。然而，在白光照射下，DCQu浓度为10×10^-6M时，HLF细胞存活率略有下降至68％，从 而说明DCQu对正常细胞的破坏程度低于癌细胞，这是因为DCQu 在癌细胞中的积累相对较多。这些结果表明，DCQu具有癌细胞特异 性染色和随后的杀伤能力，有很大的潜力作为癌症治疗的PS。

DCQu具有较高的¹O₂生成效率、优异的光稳定性和生物相容性， 以及高效的体外PDT效应，这些都使DCQu有希望成为一种很有前 途的用于体内PDT应用的PS。由于黑色素瘤是皮肤癌和眼部癌症中 的最危险的形式，也是最适合采用PDT治疗的癌症，因此我们用黑色素瘤的小鼠肿瘤模型来评估PDT在体内的应用。在进行体内实验 之前，我们评估了DCQu对B16黑色素瘤细胞的体外治疗效果，并 进一步与Ce6进行比较。如图9F，在白光照射时，DCQu具有优异 的治疗效果，反映在DCQu浓度为5×10^-6M时，细胞存活率逐渐降 低至18％，而Ce6在该浓度时的细胞存活率为24％，从而说明DCQu 比Ce6具有更好的治疗效果。

对于体内PDT，我们研究了DCQu对肿瘤生长的抑制效应，用 以评价DCQu的治疗效果(图11A)。如图11B和图11C所示，与 对照组相比，用光、Ce6或DCQu单独处理的小鼠的肿瘤生长抑制作 用可以忽略，说明纯光照射或PS不具有任何抗肿瘤作用。显然，与 30天内肿瘤快速生长的对照组相比，市售Ce6在光照射下、在连续 30天的治疗下可以逐渐抑制肿瘤生长，但肿瘤相对体积仍在增加。 与此形成鲜明对比的是，仅用DCQu联合光照连续三次治疗就有效 地阻止了肿瘤的生长趋势，并且进一步的治疗使肿瘤尺寸从第24天 开始明显缩小到最小值，甚至比第0天更小。值得注意的是，DCQu 联合光照的肿瘤抑制率高达85.51％，远高于Ce6的62.31％(图11D)。 令人印象深刻的是，在三个平行的“DCQu+光”组中，其中两个显 示了小鼠肿瘤的完全消融，从而表明B16黑色素瘤在体内完全被治 愈(图12)。这些结果表明，DCQu通过PDT过程抑制肿瘤生长的 效果优于Ce6，即使在4.2mW cm^-2的超低照射功率的情况下也是如 此。

PDT治疗后小鼠的存活率示于图11E中。对照组和单独用光、 Ce6或DCQu处理的小鼠的存活率在9天后迅速下降，并且24天后 小鼠全部死亡。相比之下，“Ce6+光”或“DCQu+光”处理的小鼠 45天后的存活率分别保持在60％和80％，这表明使用DCQu作为PS 的PDT显著延长了患肿瘤的小鼠的生存时间，并且抑制了肿瘤生长 (图11E)。为了进一步明确DCQu的肿瘤抑制性能，在治疗结束时 处死所有组的小鼠，然后将肿瘤组织切片，并用苏木精和伊红(H&E) 染色，以进行组织病理学分析(图11G)。观察到对照组的肿瘤组织 呈现致密的肿瘤细胞，结构完整。对照组、光照组和PS组之间未检 测到显著差异，从而表明肿瘤组织不受纯光或PS的影响。在“DCQu +光”组中，肿瘤组织结构不再完整，并且有坏死区域和大量核碎 片，这两种情况在用Ce6治疗的组中都没有那么严重。值得注意的 是，在整个PDT治疗过程中，与对照组的小鼠相比，施用DCQu的 小鼠没有明显的体重变化(图11F)和H&E染色后主要器官的病理 异常(图13)，进一步证实了DCQu的毒性效应可以忽略不计并且 具有良好的生物相容性，以及其在PDT治疗中的有效应用。

如此描述了本主题，将显而易见的是，可以许多方式修改或改 变该主题。这样的修改和变型不应被认为脱离本主题的精神和范围， 并且所有这样的修改和变型旨在被包括在所附权利要求的范围内。

Claims (16)

1.一种荧光探针，包括以下化合物：

2.权利要求1所述的化合物在制备用于细胞成像方法的试剂中的用途，其中所述成像方法用于识别细胞目的靶标。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述成像方法选自由荧光显微检查法和共聚焦激光扫描显微检查法组成的组。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述荧光显微检查法包括双光子激发显微检查法。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述荧光显微检查法包括单光子激发显微检查法。

6.根据权利要求2所述的用途，其中所述目的靶标包括线粒体。

7.一种体外产生单线态氧的方法，包括用白光照射根据权利要求1所述的化合物，其中所述方法用于非治疗的目的。

8.一种体外杀死癌细胞的方法，该方法用于非治疗的目的，包括：

用根据权利要求1所述的化合物接触靶癌细胞；

当所述化合物接触所述靶癌细胞时，使用成像方法对所述靶癌细胞进行成像；和

当所述化合物接触所述靶癌细胞时，将所述靶癌细胞置于白光照射下，以杀死所述靶癌细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述靶癌细胞置于白光照射下，包括使用照射功率为4.2mW cm^-2的超低功率灯。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述靶癌细胞是黑色素瘤癌细胞。

11.一种包含化合物的荧光探针，该化合物为：

12.权利要求11所述的化合物在制备用于细胞成像方法的试剂中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述成像方法选自由荧光显微检查法和共聚焦激光扫描显微检查法组成的组。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述荧光显微检查法包括双光子激发显微检查法。

15.根据权利要求13所述的用途，其中所述荧光显微检查法包括单光子激发显微检查法。

16.一种体外杀死癌细胞的方法,该方法用于非治疗的目的，包括：

用根据权利要求11所述的化合物接触靶癌细胞；

当所述化合物接触所述靶癌细胞时，使用成像方法对所述靶癌细胞进行成像；和

当所述化合物接触所述靶癌细胞时，将所述靶癌细胞置于白光照射下，以杀死所述靶癌细胞。

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