CN111630371B - 用于银离子检测的荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于银离子检测的荧光探针包括具有聚集诱导发光(AIE)特性的水溶性有机化合物。探针可以通过银离子和诱导荧光的有机化合物之间的聚集或沉淀反应感测或检测银离子。该化合物呈酸性，可溶于水相，并在水溶液中提供低背景荧光。

Description

用于银离子检测的荧光探针
技术领域
本主题大体上涉及用于荧光银金属离子检测的一系列化合物，以及该化合物在生物荧光银染色中的应用，包括凝胶内蛋白质检测。
背景技术
银材料用于多种应用。银因其优异的导热和导电性用于电触头和导体。银还用于特制镜子、窗户涂层和化学反应的催化中。作为光敏感材料，银化合物可用于照相和X射线胶片。将银盐和银纳米材料用作抗菌材料，并已经掺入食品包装、化妆品和医疗设备(例如绷带和伤口敷料)中。涉及含银材料的生产过程导致了包含银离子的废水。因为银离子对生物体有毒性，所以监测工业废水中存在的银离子的量对于可持续发展至关重要。
银离子在环境中的分布值得关注。通常，银离子最多以低浓度存在于环境中，因为银离子对一系列化学结构都具有很高的亲和力，并且易于以盐、氧化物或金属物质的形式存在。在环境中，通常很大程度上将离子态银固定为难溶的盐，例如AgCl或Ag2S。此外，天然水中的平均银浓度通常为0.2μg/L至0.3μg/L。但是每年，诸如电子、摄影、镜子和制药等行业产生的工业废水都会向环境中释放大量的银。
银及其复合物对微生物、藻类和真菌具有高毒性。银的毒性主要归因于银离子，银离子与一系列生物分子(DNA/蛋白质)结合并使其失活。微生物的毒性浓度和抑制浓度的范围通常为0.1mg/L至20mg/L。因此，在生产过程中处理含银废水至关重要。含银抗菌产品可以将大量的银释放到环境中，从而对环境微生物构成高度威胁。
在某些情况下，银离子对人类也具有毒性。虽然长期以来一直认为银材料对人类无毒，但是高含量的银离子可能会威胁人类健康。实际上，许多含银产品可以释放银离子，包括高度耐腐蚀的金属银。在一项毒性研究中发现，小鼠的LD50值大约为可溶性银盐的50mg/kg至100mg/kg，这远低于其他重金属离子，但仍然值得注意。在一份世界卫生组织的报告中，据报道大多数食品中包含的痕量银的范围为10μg/kg至100μg/kg。从长远来看，体内银的积累导致了负面影响，包括血银和尿银排泄、心脏增大、生长迟缓和退行性改变。此外，不溶性Ag+沉淀物可能损害皮肤和眼睛。据报道，离子态银可置换骨骼中的必需金属离子，包括Ca2+和Zn2+。此外，人体内积累的银也可以破坏人体的微生物体系。
银离子浓度的检测也是评价药物功效的重要方面。近年来，已经将银产品广泛用作抗菌材料，这在很大程度上归因于银离子的作用。银离子不可逆地与病原体的细胞膜中的关键酶体系结合。然而，银离子的抗菌效果的详细作用过程尚不清楚。可溶性银化合物可用作外部防腐剂(15μg/L至50μg/L)、用作抑菌剂(高达100μg/L)并且用作消毒剂(>150μg/L)。银离子溶液直接用作医疗。例如，硝酸银溶液在绷带、伤口敷料和其他医疗器械中用作消毒剂和杀菌剂。磺胺嘧啶银(silvadene)广泛用作烧伤的局部乳膏。
监测从抗菌含银材料中释放的银离子对其质量控制至关重要。近来，还提出了银纳米材料作为具有广谱的新型抗菌剂。银纳米材料充当长期释放银离子的库。在所有这些应用中，用于检测银离子浓度的方式不仅需要用于质量控制，而且还需要用于跟踪环境保护。当金属银、纳米银颗粒和微溶的银盐与水接触时，金属银、纳米银颗粒和微溶的银盐释放出银离子。释放动力学取决于纳米粒子的尺寸、纳米颗粒的表面功能化、温度以及周围培养基的组成。
近年来，已经将银纳米材料和涂层用作具有广泛抗菌谱的有效抗菌剂，例如保健产品(化妆品)、医疗产品(绷带)、新鲜食品(食品包装)的抗污染。先前的研究表明，抗菌功效主要归因于从金属银材料释放的银离子。此外，这些含银产品最终进入环境，对生物体造成潜在的负面影响。就这个意义而言，监测从含银产品中时间依赖性释放可溶性Ag+可用于抗菌银材料的质量控制、在环境中银的毒性研究并且用于抗菌过程。
近年来，银抗菌材料的广泛使用引起了公众对(含银)抗药性病原体的关注，尽管银抗菌材料比其他抗生素诱导的抗药性小得多。因此，监测从这些材料中释放银离子已变得越来越重要。生物银染色是用于此目的的一种方法。
银盐通常用于生化样品的分析。在生物医学实验室中，银染色已成为凝胶电泳中蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖的精确、日常并且廉价的染色方案。在这些方案中，首先将银离子浸渍到生物样品中，然后将银离子还原为金属银以进行可视化。发色过程是由于形成了>10nm的银纳米颗粒。因此，这些银染色方案通常可重复性较低。
使用多种仪器技术中的一者也可以进行银物质的检测，例如火焰原子吸收光谱法(FAAS)、石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和电化学分析。例如，原子吸收光谱法(石墨炉)的检出限为2μg/L，并且中子活化分析的检出限为2ng/L。然而，这些方案通常较为复杂，且经常需要昂贵且专用的仪器。
光学光谱法由于其简单性而具有优势。光学光谱法涉及包含银离子结合单元和用于检测的光学活性单元的分子探针。例如，使用双硫腙的分光光度法和比色法的检出限为10μg/L。
通过荧光的检测通常具有高敏感性和选择性。先前已经报道了许多用于银检测的荧光探针。但是，传统的有机发光体的使用受到聚集引起猝灭(ACQ)效应的极大限制。传统的有机发光体在稀溶液中高度发光，但在聚集或处于固态时在高浓度溶液中变为弱发光或不发光。
因此，非常需要用于感测银离子的有机发光体。
发明内容
用于银离子检测的荧光探针包括具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机水溶性化合物。探针可以通过银离子和诱导荧光的有机化合物之间的聚集或沉淀反应感测或检测银离子。该化合物呈酸性，可溶于水相，并在水溶液中提供低背景荧光。
在一个实施方案中，该化合物的骨架结构式选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000041
Figure BDA0002453678700000051
其中R、R'、R”或R”'中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000052
并且其中R、R'、R”和R”'的所有其他基团选自由H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基组成的组。
在另一实施方案中，化合物的骨架结构式为：
Figure BDA0002453678700000061
其中R、R'、R”或R”'中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000062
并且其中R、R'、R”和R”'的所有其他基团选自由H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基组成的组。
在一个实施方案中，该化合物选自：
Figure BDA0002453678700000063
附图说明
现在将参考附图详细描述各种实施方案。
图1A为示出了螺旋桨状发光四苯乙烯(TPE)的图。
图1B为示出了银离子传感器的设计以及通过金属离子调制探针的聚集状态的图。
图2A为示出了银配位聚合物形成均匀分布的纳米颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图2B为示出了通过强电子束照射从配位聚合物中还原的黑色的小点(金属银点)的透射电子显微镜(TEM)图像。
图3A至3D为示出了TPE-4TTZ的银感测性质(激发波长：345nm)的图；图3A示出了紫外可见光谱，表明化合物(5μM)与Ag+(100μM)在水中的复合；图3B示出了在有或没有Ag+(100μM)的水中的化合物(5μM)的发光；图3C示出了在具有不同的Ag+的增加当量的水中的化合物(5μM)的发光；图3D示出了在506nm处的发光强度与Ag+和化合物(5μM)的比率，数据获取自图3C。
图4A至4C为示出了TPE-2TTZ的银感测性质(激发波长：345nm)的图；图4A示出了在有或没有Ag+(100μM)的水中的化合物(5μM)的发光；图4B示出了在具有不同的Ag+的增加当量的水中的化合物(5μM)的发光；图4C示出了在489nm处的发光强度与Ag+和化合物(5μM)比率，数据来自图4B。
图5A至5C为示出了TPE-1TTZ的银感测性质(激发波长：345nm)的图；图5A示出了在有或没有Ag+(100μM)的水中的化合物(5μM)的发光；图5B示出了在具有不同的Ag+增加当量的水中的化合物(5μM)的发光；图5C示出了在490nm处的发光强度与Ag+和化合物(5μM)的比率，数据来自图5B。
图6A至6B为示出了TPE-4TTZ的选择性响应的图。图6A示出了在有或没有金属离子(10μM)的磷酸盐水溶液(10mM，pH 7.4)中的TPE-4TTZ的荧光发光光谱；图6B示出了在存在4.0当量的各种金属离子时，化合物TPE-4TTZ在502nm(I502nm)处的荧光强度的变化。
图7为示出了在不同pH的磷酸盐缓冲水溶液(10mM)中，在存在和不存在Ag+(10当量)和Hg2+(10当量)时，TPE-4TTZ(10μM)的荧光发光响应(502nm)的图(激发：350nm；过滤器缝隙：1nm/1nm)。
图8为示出了可以捕获附着在银结合剂(例如，Asp、His、Glu、Lys)上的银离子，并引发荧光开启的探针的图；黑色柱表示TPE-4TTZ(5μM)与不同阴离子(100当量)的混合不会产生强荧光；灰色柱示出了将TPE-4TTZ添加到预混合的阴离子-Ag+溶液(10当量)中的荧光响应；Y值(I502)相对于磷酸盐水溶液(pH 7.4)中TPE-4TTZ的强度是标准化的，因此接近增强比率。
图9A示出了在SM7培养基中的不同时间点(从0h到96h)的银纳米线(AgNWs，500μg/L)存在时，TPE-4TTZ的荧光光谱，激发：365nm。图9B示出了可溶性Ag+浓度的曲线，该浓度示出了从SM7培养基的AgNWs中的释放动力学，通过具有ICP-MS的常规超滤以及图9A中TPE-4TTZ的AIE技术进行检测。
图10A至10C示出了通过TPE-4TTZ荧光检测和超滤后常规ICP-MS检测，银离子从不同尺寸的银纳米材料(500μg L-1)中释放并且使用不同的封端剂的时间过程图(图10A：SM7培养基中的Ag纳米颗粒；图10B：20nm柠檬酸盐涂覆的AgNPs；图10C：60nm AgNPs吐温-20涂覆的AgNPs)。
图11示出了根据本教导，用于蛋白质的凝胶内检测的荧光银染色的流程图。
图12A为示出了用于蛋白质的凝胶内检测的荧光染色步骤，以及使用市售荧光蛋白染料通过还原提供银离子可视化的经典银染色步骤的图；图12B示出了通过市售荧光染料获得的荧光染色结果；图12C示出了使用AIE活性银探针TPE-4TTZ的蛋白质的凝胶内检测的荧光染色结果。
具体实施方式
定义
提供以下定义是为了理解本主题并用于构建所附专利权利要求。注意，除非上下文另外特别说明，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”包括复数引用。
如本文所用，术语“λex”是指激发波长。
如本文所用，短语“聚集导致猝灭”或“ACQ”是指其中π-共轭荧光团的聚集显著降低荧光团的荧光强度的现象。这种聚集体形成被称为“猝灭”荧光团的光发射。
如本文所用，短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指在无定形或结晶(固态)状态下聚集时表现出显著的发光增强的化合物所表现出的现象，而它们在稀溶液中表现出弱或几乎没有发光。
如本文所用，“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的大小；如本文所用，“荧光团”或“荧光体”是指显示荧光的分子；如本文所用的“发光体”或“发光团”是指显示发光的分子；并且本文所用的“AIEgen”是指具有AIE特征的分子。
如本文所用，“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1至40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即，C1-30烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子，并且可称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。
如本文所用，“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，链烯基可具有2至40个碳原子(即C2-40链烯基)，例如，2至20个碳原子(即C2-20链烯基)。在一些实施方案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、烷基或炔基取代。
如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。
如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以与限定的化学结构共价连接。仅具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物(即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可称为“卤代芳基”。全卤芳基，即所有氢原子被卤素原子取代的芳基(例如-C6F5)包括在“卤代芳基”的定义内。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以称为联芳基。如本文公开的那样，联芳基中的每个芳基可以被取代。
如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)环杂原子的芳族单环的环系统或多环的环系统，该多环的环系统中存在的至少一个环是芳族的并含有至少一个环杂原子。多环杂芳基包括那些具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的，以及那些与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的具有至少一个单环杂芳基环的。杂芳基作为整体可具有(例如)5至24个环原子并含有1至5个环杂原子(即5元至20元杂芳基)。杂芳基可以在任何杂原子或碳原子上与所定义的化学结构连接，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)如下所示的5-或6-元单环和5-6双环系统：其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑晽基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。
如本文所用，“供体”材料是指具有作为主要电流或电荷载体的空穴的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
如本文所用，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载体的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)，应理解的是，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这些实施方案也包括在所描述的主题内，受所述范围内的任何特别排除的极限值的限制。在所述范围包括一个或两个极限值的情况下，排除所包括的极限值中的任一者或两者的范围也包括在所描述的主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来替代性地描述实施方案。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
化合物
聚集诱导发光(AIE)是响应荧光的一个相对较新的概念。与常规发光团不同，诸如四苯乙烯(TPE)的典型AIE发光团具有螺旋桨状的非平面结构。在稀溶液中，TPE分子经历分子间旋转，通过非照射途径消耗能量并使TPE分子不发光。在聚集状态下，由于来自相邻分子的物理约束，限制了分子间旋转(图1A)。
由于它们简便的合成和出色的性能，已经将TPE及其衍生物广泛用于构建AIE发光体的各种应用，这些应用包括化学传感、生物成像和智能光学材料。但是，一些用于金属离子感测的AIE发光体在感测银离子方面有些困难。
因此，本主题考虑了具有聚集诱导发光(AIE)特征的有机水溶性化合物。在本文中也将该化合物称为“四唑官能化AIE发光体”或“荧光探针”，可以通过银离子与诱导荧光的有机化合物之间的聚集或沉淀反应感测或检测银离子。该化合物呈酸性，在水相中具有良好的溶解性(特别是当在碱性条件形成盐时)，并且在水溶液中提供了低的背景荧光。
根据一个实施方案，该化合物具有的骨架结构式选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000131
Figure BDA0002453678700000141
其中R、R'、R”或R”'中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000142
并且其中R、R'、R”和R”'的所有其他基团选自由H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基组成的组。
根据一个实施方案，该化合物具有以下骨架结构式：
Figure BDA0002453678700000151
其中R、R'、R”或R”'中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure BDA0002453678700000152
并且其中R、R'、R”和R”'的所有其他基团选自由H、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基组成的组。
在一个实施方案中，化合物选自：
Figure BDA0002453678700000153
合成
化合物的合成可为简洁的并且可以使用各种合成途径完成。下面提供了制备本发明化合物的示例性反应方案：
Figure BDA0002453678700000161
可以按照J Org Chem 2007，72，8054中报道的程序，由二苯甲烷和相应的溴化联苯酮合成溴化TPE(TPE-Br和TPE-2Br)。TPE-4Br的合成可以包括TPE的溴化，这能够以良好的产率通过二苯甲酮的McMurry偶联获得TPE。在TPE中添加的液态溴化物是芳族溴化物。通过在升高的温度下使用氰化铜(CuCN)作为DMF中的亲核试剂，这些溴化TPE衍生物可以进行亲核芳族取代，这导致了Br原子被-CN基团取代。这些CN衍生的TPE能够以适当的产率分离。在最终步骤中，可以将这些CN衍生的TPE(TPE-CN、TPE-2CN和TPE-4CN)与叠氮基离子(N3 -)环合，从而以良好的产率得到目标四唑标记的TPE。合成这些四唑衍生的TPE的总体方案简单、有效，并且不需要苛刻的条件和特定的试剂。
在一个示例性实施方案中，如下所示，可以使用腈-叠氮化物环加成作用获得四唑官能部分，其中通过在储备液中或通过卤素取代的化合物的取代反应获得CN化合物：
Figure BDA0002453678700000162
AIE活性
本发明化合物在固态下强烈发光，具有良好的荧光量子产率。当这些化合物溶解在水溶液中时，它们弱发光或不发光。如本文中详细描述的，(例如)TPE-1TTZ、TPE-2TTZ和TPE-4TTZ表现出强烈的蓝绿色发光，具有良好的荧光量子产率(Qy：TPE-1TTZ为39.6％；TPE-2TTZ为36.2％；TPE-4TTZ为76.8％)。相反，当这些化合物溶解时，溶液仅发出微弱的光(Qy<1％)。这些化合物很好地溶于乙醇。这些化合物能够适度溶解(对于TPE-4TTZ，在去离子水中高达100μM)在水相中。此外，通过添加NaOH溶液，形成的盐很好的溶于水相(对于TPE-4TTZ，在水中高达1M)。自由溶解的水溶液不发光，这进一步证明了本发明化合物的AIE性质。
与银的反应
如图1B所示，本发明化合物中的四唑基团充当银相互作用基团，而TPE核心具有响应性AIE荧光。如下图所示，四唑官能部分可以在银四唑沉淀反应中“提取”出作为白色固体的银离子。
Figure BDA0002453678700000171
四唑以两种互变异构形式(1H和2H)存在，并且两种形式处于动态平衡。据信，所得四唑-银复合物存在于聚合物配位网络中，其中银以单齿、双齿或三齿形式通过配位键合到氮中心。该复合物微溶于许多溶液中。
银的检测
一种检测在溶剂中存在银离子的方法，可以包括使一种或多种四唑官能化的AIE发光体与溶剂接触，并且用紫外线照射该溶剂。可观察到的发光可以表示存在银离子。溶剂可以包括天然水、工业废水、缓冲水溶液和生物样品中的至少一者。根据一个实施方案，溶剂的pH＞4。
一种对离子态银进行体内成像的方法，可以包括将一种或多种四唑官能化的AIE发光体施用给生物体，并且使用荧光成像在化合物位于生物体内时获取生物体的图像。
当通过添加银离子(例如，500μM)处理包括TPE-4TTZ(例如，5μM)的不发光水溶液并用UV光照射(例如，在手持式UV灯350nm照射下)时，溶液变为强发光。开启荧光反应是即时的。银离子的检测具有高度敏感性，并且用肉眼可以检测到剧烈的强度变化。DLS(动态光散射)测定证实了纳米颗粒的形成。在荧光液体蒸发后，在SEM中观察到均匀分布的纳米级颗粒(d＝5nm至30nm)(图2A)。在TEM中的进一步表征没有示出相应的颗粒，但是检测到了金属银点(d＝2nm至5nm)(图2B)。这可能是由于在TEM研究期间通过强电子束减少了银-四唑复合物。这些发光的银化合物固体复合物几乎不溶于一系列溶剂，包括DMSO、甲醇和水。这些复合物的NMR分析是不可能的。复合物还耐酸/碱处理或耐通过热风枪的加热。
参考以上设计，提出以下四唑-Ag+相互作用模式以解释银-TPE-4TTZ聚合复合物的形成并在这些情况下检测银离子。
Figure BDA0002453678700000181
根据该模型，溶液中的银离子与AIE探针的四唑单元进行即时螯合。然后，当使用化合物TPE-2TTZ和化合物TPE-4TTZ时，由Ag+桥接的螯合产生了TPE-1TTZ和/或最可能的金属超分子聚合物的难溶性物质。这些物质可以有效地形成簇，即聚集体。结果，聚集体内的这些AIE活性分子示出了受限制的运动，这导致了有效发光。
在荧光光谱法中，就强度而言，含有银离子的溶液与没有银离子的溶液的行为有很大不同，在504nm处的最大峰值处的强度的比率超过400倍(图3A至3D)。如图4A至4C和图5A至5C所示，化合物TPE-1TTZ和TPE-2TTZ对银离子的响应相似，具有增强的荧光。所有的三种含银荧光溶液均显示出相似的最大发射波长(TPE-1TTZ为490nm；TPE-2TTZ为489nm；TPE-3TTZ为504nm)。滴定研究表明，金属化合物混合物的发射强度随银离子的添加而增加(图3C、4B和5B)。通过绘制最大强度峰的强度与离子浓度的比率的关系，预计可以建立用于定量检测银离子的工作曲线。例如，当绘制相应峰强度(504nm)对银离子浓度的关系时，显示出线性关系，范围为0.04μM至15μM，相关系数的平方等于0.9993(图3D)。同时，银离子的检出限(LOD)估计为40nM(S/N＝3并且n＝11)。随着[Ag+]的进一步增加，强度达到平稳。对于化合物TPE-2TTZ(图4A至4C)和化合物TPE-1TTZ(图5A至5C)观察到相似的结果。表1总结了三种用于银检测的探针的性能。
表1银感测参数的汇总。LOD：检出限。探针：去离子水中5μM。通过Perkin-Elmer LS55分光荧光计测定。
Figure BDA0002453678700000191
对于所有发光体，观察到饱和的PL强度平稳。当[Ag+]：[TPE-4TTZ]的比率接近4时，PL强度饱和，而当[Ag+]:[TPE-2TTZ]为2.6和[Ag+]:[TPE-1TTZ]为0.6时，PL强度达到最大。这表明[Ag+]的最大线性检测浓度与TPE核心分子探针中四唑部分的数量有关。鉴于化学计量配位相互作用，这是合理的。因此，线性检测范围取决于探针的浓度，并且可以通过设定探针的浓度进一步扩展(表1)。
由于选择性是感测技术的重要参数，因此检查了这些探针对其他金属离子的响应。图6A至6B说明除银离子之外，汞离子诱导了TPE-4TTZ的磷酸盐水溶液(10mM，pH 7.4)中PL强度的显著提高，但是可见程度远低于由银离子诱导的可见程度。据报道，汞与四唑基团配位。在相同条件下，包括Mg2+、Mn2+、Zn2+、Al3+等的其他金属离子几乎不增加TPE-4TTZ的PL强度。我们还观察到Fe2+、Fe3+、Co2+和Cu2+可以淬灭TPE-4TTZ的弱荧光。对于其他四唑标记的TPE，观察到了相似的结果。
Ag+/Hg2+配位诱导的荧光可以对pH敏感。例如，对于TPE-4TTZ，在磷酸盐缓冲溶液中以4至12不等的不同pH进行了一系列测试。在pH值低于4时，四唑部分(pKa为4至5)大部分处于质子化形式，并且微溶于溶液，因此聚集。聚集物引发的荧光具有与银复合物引发的荧光不同的颜色。因此，仅在pH>4的溶液中才能够进行开启检测。当pH为5至6时，PL响应对于银离子的高分辨率检测足够显著。予以注意，当pH>6时，最大PL响应相对稳定，这表明该体系是用于中性至碱性溶液的强大感测体系。此外，关于汞的检测，FL响应仅在pH窗口(4至7)时才显著；当pH>8时，不再观察到荧光开启。因此，TPE-4TTZ仅在碱性溶液中对银离子敏感。对于其他四唑标记的TPE，具有类似的观察结果。
检测可以基于涉及静电相互作用的选择性配位。进行测试以确定银结合部分(例如，阴离子)是否可能是混合物中的另一种干扰因素。在测试中，首先将银离子与可疑干扰试剂(100当量)混合，干扰试剂分别包含大多数阴离子、DNA/RNA碱基和氨基酸。短暂振动后，添加探针(10当量)。将各溶液轻轻混合，然后在PL机中检查。与对照组相比，包含氨基酸和DNA/RNA碱基的干扰试剂仅对银-四唑感测过程产生弱干扰。换句话说，四唑阴离子可从这些配体上捕获银离子并引发荧光开启。也有例外，特别是与强银相互作用的结构。为含硫氨基酸的半胱氨酸通过强烈的S-Ag相互作用阻止了感测。从SCN-和S2O3 2-看到了类似的结果，因为SCN-和S2O3 2-对Ag+的结合亲和力比四唑阴离子(CN4 -)更强。此外，铵溶液通过将Ag+还原为金属态银而阻止了感测。图8提供了结果，表明当前的银感测在涉及银物质的应用中可以是有效的，例如生物银染色。
从金属态银中释放的银离子的监测
一种监测从金属态银中释放银离子的方法，可以包括在培养基中提供包含金属银的样品，向该培养基中添加一种或多种四唑官能化的AIE发光体，并且在化合物在培养基中的同时对样品进行荧光成像，以监测从样品中释放的银离子。样品可以选自表面涂层、银纳米材料和药物。在一个实施方案中，当存在银离子时，化合物聚集为不溶性荧光纳米颗粒。
本发明化合物可以即时感测银离子，同时对金属银不敏感。该属性非常适合监视从金属银中释放银。测试了TPE-4TTZ染料以确定银纳米线(AgNWs，500μg/L)在SM7培养基中的溶解动力学。将TPE-4TTZ探针添加到新鲜的银纳米线样品中后，通过PL机在某些时间点反复监控混合物。如图9A所示，开启荧光随时间增加。通过参考用于[Ag+]-荧光定量的校准曲线，描绘了Ag+释放动力学(图9B)，这与使用常规超滤随后进行ICP-MS检测的传统方法很好地相关。AIE荧光响应能够赶上银离子的释放，仅示出了比ICP-MS定量稍短的半衰期。这些结果进一步表明，提出的AIE检测可用于精准监测AgNWs的溶解过程。此外，与ICP-MS方法相比，通过TPE-4TTZ使用相同样品进行的监测非常简单，并且更容易操作。
银离子的释放可以受到诸多因素的影响，包括封端剂和金属银的尺寸/形状。荧光方法在这些不同的情况下效果很好。本文描述的使用本发明化合物的银感测方法可以应用于各种银纳米材料，以监测它们在不同条件下的银离子释放曲线。如图10A至10C所示，通过该方法成功地反映了银的释放动力学，此外，与超滤后的ICP-MS检测的结果一致(表2)。
表2.使用ICP-MS方法和使用TPE-4TTZ的新方法，不同NP的溶解半衰期和最终银离子浓度。
Figure BDA0002453678700000211
用于蛋白质和其他生物分子的凝胶内检测的荧光银染色
样品中生物分子的凝胶内检测和分离方法可包括进行凝胶电泳，以分离样品中的生物分子；用银离子对分离的生物分子进行染色；在用银离子进行染色后，用一种或多种四唑官能化的AIE发光体对生物分子进行染色；并且在用四唑官能化的AIE发光体染色后，对分离的生物分子进行荧光成像。至少一种生物分子可以选自蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖。
在生物实验室中，银染色已常规用于生物分子的检测和分离。与其他类型的染色相比，银染色具有高度敏感性，并且通常认为银染色提供了最佳的检出限(例如SDS-PAGE蛋白中的LOD，每条带0.25ng)。银离子与包括羧基、含硫醇基和胺基的生物官能团相互作用并选择性结合。在天然蛋白质中，与羧酸基团(Asp和Glu)、咪唑(His)、巯基(Cys)和胺(Lys)具有最强的相互作用。
对于传统的银染色，首先用Ag+浸渍样品，然后将Ag+还原为金属银，产生棕黑色以可视化(图12A)。发色过程是由于形成了银纳米颗粒(d>10nm)。因此，银染色方案对于确保高稳定性通常具有挑战性。此外，为了控制特异性和效率，各种敏化剂和增强剂是必不可少的。银染色的传统方案使用戊二醛或甲醛这两者中的一者作为增强剂。这些试剂可以引起凝胶基质中蛋白质的化学交联，限制了与用于通过质谱(MS)的分析的脱色和洗脱方法的相容性。尽管如此，在生物实验室中使用荧光染料的染色是常见的，因为这种染色通常快速且易于实施。
在SDS-PAGE电泳的可视化步骤(荧光银染色凝胶内检测方法)中，将使用
Figure BDA0002453678700000221
Ruby染色的传统的银染色(图12B)与使用本发明化合物的染色进行了比较(图12C)。初步的溶液测试表明，该探针在附着到与银结合的氨基酸(例如，Asp、His、Glu、Lys)上之前可以捕获银离子并引发荧光开启。在此，结合敏感的银染色和荧光成像技术，新的染色能够以相似的形式感测SDS-PAGE凝胶中的蛋白质条带(图12C)。
用于荧光银染色凝胶内检测方法的程序流程图示于图11。整个过程可以在约2小时至24小时内完成。如图12C所示，通过使用本发明方法，在荧光图像中蛋白质条带清晰可见。虽然当使用市售梯形蛋白质时，荧光检出限估计为每条带<1.25ng蛋白质，但通过优化，染色方案有可能可以实现每条带1pg。
除较高的敏感性之外，根据本教导的荧光银染色方案与常规的银染色相比具有实际的优点(图12B)。由于方案中没有发生化学修饰，因此可以通过硫代硫酸钠完全使离体的蛋白质条带脱色(数据未示出)，并回收蛋白质以通过质谱或测序进行分析。该方案也简单并且容易实施。此外，该常规荧光银染色方案可类似地用于许多生物分子的凝胶内检测，包括蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖。
通过以下实施例说明本教导。
实施例
实施例1
合成
四苯乙烯(TPE)的合成。将锌粉(7.2g)和干燥的THF(80mL)添加到两颈圆底烧瓶中，将两颈圆底烧瓶抽真空并用干燥的氮气吹扫3次。然后在30分钟的时间段内将TiCl4(6mL)缓慢注入到烧瓶中。移去冰水浴，并将反应混合物回流约2小时。将苯甲酮(5.0g)溶于干燥的THF(20mL)中，并且用注射器将苯甲酮的THF溶液缓慢添加到混合物中。将混合物在氮气中回流过夜。冷却至室温后，将反应混合物用(2w％)HCl水溶液淬灭，并用乙酸乙酯和水(2×200mL)萃取。用蒸馏水洗涤合并的有机萃取物，用无水硫酸镁干燥并过滤。用旋转蒸发仪除去溶剂。用乙醇洗涤粗产物并过滤，从而得到白色结晶固体(3.7g，80％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.05-7.08(m,8H),7.10-7.13(m,12H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ126.6,127.8,131.5,141.1,143.9。
四(4-溴苯)乙烯(TPE-4Br)的合成。在两颈圆底烧瓶中，将四苯乙烯(2g)与冰醋酸(30mL)在冰浴中溶解。用注射器在10分钟的时间内将溴(5mL)注入到溶液中，随后添加二氯甲烷(20mL)。15分钟后，移去冰水浴，并且将所得混合物在50℃加热约15分钟。将反应混合物添加到200mL冰水中，并且将沉淀的固体过滤并用水和乙醇反复洗涤直到出现浅黄色。粗产物的产率为1.65g(43％)。该产物无需进一步纯化即可直接使用。1H NMR(CDCl3,500MHz):δ(ppm)7.27(d,J＝8.5Hz,8H)和6.85(d,J＝8.5Hz,8H)。
四(4-氰苯)乙烯(TPE-4CN)的合成。将TPE-4Br(6.67g)、CuCN(5.0g，56mmol)和DMF(50mL)添加到两颈圆底烧瓶中。将混合物在氮气条件下加热回流60小时，然后使混合物悬浮在300mL的水中。添加乙二胺(10mL)后，将所得混合物在100℃搅拌1小时，然后过滤。用二氯甲烷(3×150mL)萃取沉淀的固体，并将合并的有机相用无水硫酸镁干燥。过滤并蒸发溶剂后，将残余物通过硅胶柱色谱法反复纯化，用己烷和二氯甲烷(v/v，1/1)作为洗脱剂，从而得到3.1g作为白色固体的TPE-4CN，产率为70％。1H NMR(CDCl3,500MHz):δ(ppm)7.48(t,J＝5.0Hz,8H)和7.08(t,J＝5.0Hz,8H)。HRMS(MALDI-TOF)，C30H16N4的m/z计算值：432.1375；实测值432.1379。
TPE-4TTZ的合成。向25mL圆底烧瓶中添加叠氮化钠(1.12g，16mmol)、溴化锌(450mg，2当量)和2mL的水。将TPE-4CN(2mmol)溶解在10mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，并且注入到溶液中。将反应混合物以150℃剧烈搅拌，回流24小时。用HCl水溶液(3M)将混合物酸化至pH 1，并用乙酸乙酯(20mL)萃取至有机层。用3M HCl(2×10mL)洗涤有机相，蒸发溶剂，从而得到粗产物。将该粗产物添加到NaOH溶液(0.25M，40mL)中并剧烈搅拌直至观察到白色的氢氧化锌沉淀。过滤所得悬浮液以除去氢氧化锌。用乙酸乙酯(10mL×2)洗涤滤液，并用3M HCl酸化至pH1。在搅拌下沉淀出四唑产物，将四唑产物再次萃取至20mL乙酸乙酯中，并分离有机层。用乙酸乙酯(20mL×2)洗涤水层。合并有机层，浓缩并在真空下干燥，从而得到作为淡黄色固体的TPE-4TTZ(71％)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ7.89(d,8H,J＝8.2Hz),7.31(d,8H,J＝8.2Hz)。HRMS(MALDI-TOF)，C30H20N16Na+的m/z计算值：627.1949；实测值627.1986(M+Na+)。
TPE-2Br的合成。在氩气气氛下，在0℃将2.2M的正丁基锂的己烷(10mL)溶液和二苯甲烷(3.36g，20mmol)的无水四氢呋喃(50mL)溶液添加到圆底烧瓶中。搅拌1小时后，添加双(4-溴苯)甲酮(5.4g，17mmol)，并搅拌10小时的时间，使反应混合物升温至室温。添加10％碳酸氢钠溶液淬灭反应。用二氯甲烷(3×50mL)萃取混合物，用无水硫酸镁干燥合并的有机层。蒸发溶剂，从而得到所得粗醇。在100mL烧瓶中将粗醇溶解于80mL的甲苯中。添加催化量的对甲苯磺酸(0.68g)，并将混合物回流12小时。将所得混合物冷却至室温后，用10％碳酸氢钠水溶液(2×25mL)洗涤甲苯层，并且用无水硫酸镁干燥并蒸发，得到粗四苯-乙烯衍生物(TPE-2Br，3.6g，46％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):6.82-6.90(m,4H),6.95-7.05(s,4H),7.06-7.16(s,6H),7.18-7.27(m,4H)。CNMR(75MHz,CDCl3)δ(ppm):120.93,127.10,128.10,131.30,133.20,138.55,142.38,143.40。HRMS(MALDI-TOF)，C26H18Br2的m/z计算值:489.9755；实测值489.9713。
TPE-2CN的合成。将TPE-2Br(975mg，2mmol)、CuCN(560mg)和DMF(10mL)添加到两颈圆底烧瓶中。将混合物在氮气条件下加热回流60小时，然后使混合物悬浮在300mL水中。添加乙二胺(10mL)后，将所得混合物在100℃搅拌1小时，然后过滤。用二氯甲烷(3×150mL)萃取沉淀的固体，并用无水硫酸镁干燥合并的有机相。过滤并蒸发溶剂后，将残余物通过硅胶柱色谱法反复纯化，用己烷和二氯甲烷(v/v，1/1)作为洗脱剂，从而得到产率为53％的TPE-2CN。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.45-7.42(dm,4H),7.31(m,2H),7.21-7.14(m,8H),7.11(dm,4H)。HRMS(MALDI-TOF)，C28H18N2的m/z计算值：382.1470；实测值382.1496。
TPE-2TTZ的合成。在25mL烧瓶中添加叠氮化钠(300mg)、溴化锌(450mg)和0.5mL的水。将TPE-2CN(250mg)溶解在4.5mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，并且将其注入到溶液中。将反应混合物在150℃搅拌过夜。用HCl水溶液(3M)将混合物酸化至pH 1，并剧烈搅拌30分钟。用乙酸乙酯(20mL×2)萃取有机混合物，用3M HCl(50mL×2)洗涤并且浓缩，以得到粗产物。将该粗产物添加到NaOH溶液(0.25M，40mL)中并剧烈搅拌直至观察到氢氧化锌的白色沉淀。过滤所得悬浮液以除去氢氧化锌。用乙酸乙酯(10mL×2)洗涤滤液，并用3M HCl酸化至pH1。在搅拌下沉淀出四唑产物，将四唑产物再次萃取至20mL乙酸乙酯中，并分离有机层。用乙酸乙酯(20mL×2)洗涤水层。合并有机层、浓缩并在真空中干燥，从而得到纯产物(82％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ(TMS,ppm)9.92(s,1H),7.51-7.45(m,5H),7.35-7.34(m,2H),7.25-7.23(m,3H),3.84(s,3H)。13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(TMS,ppm)181.73,142.42,140.68,135.09,132.63,129.83,129.00,128.64,127.72,126.79,126.48,32.28。HRMS(MALDI-TOF)，C26H19Br的m/z计算值：410.0670实测值410.0677。
(2-(4-溴苯基)乙烯-1,1,2-三基)三苯(TPE-Br)的合成。在氩气气氛下，在0℃将2.5M正丁基锂的己烷溶液(10mL)和二苯甲烷(3.36g)的无水四氢呋喃溶液(50mL)添加到圆底烧瓶中。将所得橙红色溶液搅拌1小时后，添加(4-溴苯基)(苯基)甲酮(4.4g)，并在搅拌6小时的时间内将反应混合物升温至室温。添加10％氯化钠溶液淬灭反应。用二氯甲烷(3×50mL)萃取混合物，并且用无水硫酸镁干燥合并的有机层。蒸发溶剂，从而得到所得粗醇。在250mL烧瓶中将粗醇溶解在80mL的甲苯中。添加催化量的对甲苯磺酸(680mg)，并将混合物回流12小时。将所得混合物冷却至室温后，用10％碳酸氢钠水溶液(2×25mL)洗涤甲苯层，用无水硫酸镁干燥并蒸发，从而得到粗四苯基-乙烯衍生物(TPE-Br，63％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.88(d,J＝8.5Hz,2H),7.00(m,6H),7.09(m,9H),7.20(d,J＝8.5Hz,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ120.6,126.8,126.8,126.9,127.9,128.0,128.1,131.0,131.42,131.44,131.5,133.2,139.8,141.8,142.9,143.4,143.5,143.6。HRMS(MALDI-TOF)，C26H19Br的m/z计算值：410.0670；实测值410.0677。
4-(1,2,2,-三苯基乙烯基)氰苯(TPE-CN)的合成。将TPE-Br(820毫克)、CuCN(268毫克)和DMF(10毫升)添加到两颈圆底烧瓶中。将混合物在氮气条件下加热回流60小时，然后使混合物悬浮在300mL水中。添加乙二胺(10mL)后，将所得混合物在100℃搅拌1小时，然后过滤。用二氯甲烷(3×150mL)萃取沉淀的固体，并用无水硫酸镁干燥合并的有机相。过滤并蒸发溶剂后，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用己烷和二氯甲烷(v/v，1/1)作为洗脱剂，从而得到产率为53％的作为白色粉末的TPE-CN。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.40(d,2H,J＝8.4Hz),7.15(m,11H),7.03(m,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3):δ149.0,143.5,143.0,142.9,142.8,139.3,132.1,131.7,131.4,131.3,128.2,128.0,127.4,127.2,119.2,110.0。HRMS(MALDI-TOF)，C30H20N16Na+的m/z计算值：357.1517；实测值357.1536。
TPE-1TTZ的合成。向10mL圆底烧瓶中添加叠氮化钠(138mg，2mmol)、溴化锌(225mg，2mmol)和0.5mL的水。将TPE-CN(357mg，1mmol)溶于4.5mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，并将其注入到溶液中。将反应混合物在150℃搅拌。用HCl水溶液(3M)将混合物酸化至pH1，并剧烈搅拌30分钟。用乙酸乙酯(20mL×2)萃取有机混合物，用3M HCl(50mL×2)洗涤、浓缩以得到粗产物。将该粗产物添加到NaOH溶液(0.25M，40mL)中并剧烈搅拌直至观察到氢氧化锌的白色沉淀。过滤所得悬浮液以除去氢氧化锌。用乙酸乙酯(10mL×2)洗涤滤液，并用3M HCl酸化至pH 1。在搅拌下沉淀出产物，将产物再次萃取至20mL乙酸乙酯中，并分离有机层。用乙酸乙酯(20mL×2)洗涤水层。合并有机层，浓缩并在真空中干燥，从而得到为白色粉末的纯产物(82％)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ7.80(d,2H,J＝8.4Hz),7.20-7.13(m,11H),7.03-6.98(m,6H)。HRMS(MALDI-TOF)，C27H20N4的m/z计算值：400.1722；实测值400.1762。
实施例2
银离子的检测
四唑标记的AIE发光体TPE-4TTZ(5μM)对银离子的溶液发生荧光开启响应。溶液可以包括有机溶液、包括天然水的水溶液、废水和/或生物缓冲溶液。在Perkin-Elmer LS 55分光荧光计上记录PL光谱。
参考图3A至3D和7，由上述发光体(TPE-1TTZ、TPE-2TTZ、TPE-4TTZ)(5μM)定量[Ag+]的荧光校准曲线示出了良好的线性和可重复性。溶液包括有机溶液、包括天然水的水溶液、废水和/或生物缓冲溶液。对于相同的探针，校准曲线在不同的溶液中有所不同。在Biochrom Libra S80PC双光束光谱仪上测定UV光谱。在Perkin-Elmer LS 55分光荧光计上记录PL光谱。
参考图7，在磷酸盐水溶液(10mM，pH 7.4)中存在其他金属离子的情况下，四唑标记的AIE发光体TPE-4TTZ(10μM)对银离子的溶液进行了荧光开启响应。在Perkin-Elmer LS55分光荧光计上记录PL光谱。在磷酸盐水溶液(10mM，pH 7.4)中存在其他结合银的分子时，四唑标记的AIE发光体TPE-4TTZ(10μM)对银离子的溶液进行荧光开启响应。在各实施例中，在从储备溶液中添加探针之前，添加结合银的分子。在乙醇中的探针的储备溶液的浓度为1mM。在Perkin-Elmer LS 55分光荧光计上记录PL光谱。
实施例3
从材料中释放银离子的监测
参考图9A至9B，通过这些探针确定了Ag+从银纳米材料中的释放动力学。在典型情况下，将AgNPs悬浮液(500μg L-1)添加到包含3mM荧光的TPE-4TTZ的SM7培养基中。根据方案(Adv.Mater.2002，14，833-837)制备AgNWs。用去离子水稀释合成的AgNWs，然后使AgNWs沉积在硅基板上，并通过配备有EDAX附件的Bruker扫描电子显微镜(SEM)进行表征。通过荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS 55分光荧光计)在不同时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、60h、72h和96h)检测混合物溶液。为了进行比较，还通过常规超速离心，随后进行ICP-MS检测确定释放动力学。在这种常规方法中，由通过3kD膜(孔径约1nm，Millipore，美国)的超速离心确定SM7培养基中的AgNWs浓度。将AgNWs悬浮液在4000rpm离心20分钟。之后，在不同的时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h和72h)对包含可溶性Ag的滤液(在膜上捕捉纳米颗粒)进行采样。通过ICP-MS测定滤液中的Ag浓度。
参考图13A至13C，通过这些探针确定了Ag+从具有不同尺寸(20nm、60nm)和不同涂层/稳定剂(柠檬酸盐、吐温-20)的银纳米颗粒的释放动力学。通过以下方案(Environ.Sci.Technol.2010,44,2169-2175)合成AgNPs。在典型情况下，将AgNPs悬浮液(500μg/L)添加到包含3mM荧光的TPE-4TTZ的SM7培养基中。在不同的时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、60h、72h和96h)，通过荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS 55分光荧光计)追踪混合物。为了进行比较，类似于AgNWs的情况，还通过常规超速离心随后进行ICP-MS检测确定释放动力学。
实施例4
凝胶内蛋白质检测的荧光银染色
参考图11和12A至12C，建立了将常规银染色和荧光银离子感测相结合的方案，用于在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)后蛋白质的检测。在SDS-PAGE中，使用的试剂/产品包括：Thermo Fisher Scientific：迷你凝胶罐(Invitrogen)、NuPAGETM 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(目录号：NP0323BOX)、NuPAGETM MES SDS运行缓冲液(目录号：NP0002)、PageRulerTM未染色蛋白质梯子(目录号：26614)、NuPAGETM样品减少缓冲液(目录号：NP0004)和NuPAGETM LDS样品缓冲液(目录号：NP0007)。遵循Thermo FisherScientific提供的标准方案。参考图11，电泳后，通过以下方案进行荧光银染色：
1.将凝胶在固定溶液(40％EtOH、7％乙酸)中固定2×1小时，更换溶液。
2.在超纯水中洗涤2×5分钟。
3.在100mL的0.001％AgNO3(溶液必须在室温下)中染色90分钟。
4.在超纯水中孵育凝胶2×5分钟(更换水)，以在AIE化合物(TPE-1TTZ、TPE-2TTZ、TPE-4TTZ)染色之前将凝胶的pH值提高至中性(使用pH试纸测试)。
5.用10μM的AIE化合物染色一小时。
6.成像前，在水中短暂冲洗凝胶(5分钟)。
7.在ProteinSimple仪器(Alphalmager MINI)上进行成像：302nm和365UV通道这两者均显示出良好的结果。
参考图12B，使用类似的凝胶染色，使用市售荧光成像染料进行比较。
对本主题如此进行描述，将显而易见的是，可以以许多方式修改或改变该主题。不将此类修改和改变视为背离本主题事项的精神和范围，并且所有此类修改和改变均旨在包含在所附权利要求的范围内。

Claims (20)

1.一种用于离子态银检测的荧光探针，该探针包含呈现出聚集诱导发光性质的化合物，其中所述化合物包括的一个或多个骨架结构选自由以下组成的组：
Figure FDA0003120514400000011
Figure FDA0003120514400000021
其中R、R'、R''或R'''中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure FDA0003120514400000022
并且其中R、R'、R''或R'''的所有其他基团选自H。
2.根据权利要求1所述的探针，该探针包含的一种或多种化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003120514400000023
Figure FDA0003120514400000031
3.一种检测在溶剂中存在银离子的方法，包括：
使权利要求1所述的化合物与所述溶剂接触，所述溶剂选自由天然水、工业废水、缓冲水溶液和生物样品组成的组；并且随后用紫外线照射所述溶剂，
其中可观察到的发光表示存在所述银离子。
4.一种离子态银的体内成像方法，包括：
将权利要求1所述的化合物施用给生物体；以及
当所述化合物在所述生物体内的同时，使用荧光成像获取所述生物体的图像。
5.一种凝胶内检测和分离样品中的生物分子的方法，包括：
进行凝胶电泳以分离所述样品中的所述生物分子；
用银离子对分离的生物分子进行染色；
用银离子染色后，用权利要求1所述的化合物对所述生物分子进行染色；以及
在用权利要求1所述的化合物进行染色后，对所述分离的生物分子进行荧光成像，
其中至少一种所述生物分子选自由蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖组成的组。
6.一种监测从金属银中释放银离子的方法，包括：
提供在培养基中包含金属银的样品；
将权利要求1所述的化合物添加到所述培养基中；以及
当所述化合物处于培养基中以监测从所述样品中释放银离子的同时，对所述样品进行荧光成像，其中所述样品选自由表面涂层、银纳米材料和药物组成的组。
7.根据权利要求6所述的方法，其中当存在银离子时，所述化合物聚集为不溶性荧光纳米颗粒。
8.一种用于离子态银检测的荧光探针，该探针包含呈现出聚集诱导发光性质的化合物，其中所述化合物包括以下骨架结构：
Figure FDA0003120514400000041
其中R、R'、R''或R'''中的至少一者选自由以下组成的组：
Figure FDA0003120514400000042
并且其中R、R'、R''或R'''的所有其他基团选自H。
9.根据权利要求8所述的探针，该探针包含的一种或多种化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003120514400000043
Figure FDA0003120514400000051
10.一种检测在溶剂中存在银离子的方法，包括：
使权利要求8所述的化合物与所述溶剂接触，所述溶剂选自由天然水、工业废水、缓冲水溶液和生物样品组成的组；并且随后用紫外线照射所述溶剂，
其中可观察到的发光表示存在所述银离子。
11.一种离子态银的体内成像方法，包括：
将权利要求8所述的化合物施用给生物体；以及
当所述化合物在所述生物体内的同时，使用荧光成像获取所述生物体的图像。
12.一种凝胶内检测和分离样品中的生物分子的方法，包括：
进行凝胶电泳以分离所述样品中的所述生物分子；
用银离子对分离的生物分子进行染色；
用银离子染色后，用权利要求8所述的化合物对所述生物分子进行染色；以及
在用权利要求8所述的化合物进行染色后，对所述分离的生物分子进行荧光成像，
其中至少一种所述生物分子选自由蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖组成的组。
13.一种监测从金属银中释放银离子的方法，包括：
提供在培养基中包含金属银的样品；
将权利要求8的所述化合物添加到所述培养基中；以及
当所述化合物处于培养基中以监测从所述样品中释放银离子的同时，对所述样品进行荧光成像，其中所述样品选自由表面涂层、银纳米材料和药物组成的组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中当存在银离子时，所述化合物聚集为不溶性荧光纳米颗粒。
15.一种用于离子态银检测的荧光探针，包含：
选自由以下组成的组中的一种或多种化合物：
Figure FDA0003120514400000061
16.一种检测在溶剂中存在银离子的方法，包括：
使权利要求15所述的化合物与所述溶剂接触，所述溶剂选自由天然水、工业废水、缓冲水溶液和生物样品组成的组；并且
用紫外线照射所述溶剂，
其中可观察到的发光表示存在所述银离子。
17.一种离子态银的体内成像方法，包括：
将权利要求15所述的化合物施用给生物体；以及
当所述化合物在所述生物体内的同时，使用荧光成像获取所述生物体的图像。
18.一种凝胶内检测和分离样品中的生物分子的方法，包括：
进行凝胶电泳以分离所述样品中的所述生物分子；
用银离子对所述分离的生物分子进行染色；
用银离子染色后，用权利要求15所述的化合物对所述生物分子染色；以及
在用权利要求15所述的化合物进行染色后，对所述分离的生物分子进行荧光成像,
其中至少一种所述生物分子选自由蛋白质、核酸、脂多糖、糖蛋白和多糖组成的组。
19.一种监测从金属银中释放银离子的方法，包括：
提供在培养基中包含金属银的样品；
将权利要求15所述的化合物添加到所述培养基中；以及
当所述化合物处于培养基中以监测从所述样品中释放银离子的同时，对所述样品进行荧光成像，其中所述样品选自由表面涂层、银纳米材料和药物组成的组。
20.根据权利要求19所述的方法，其中当存在银离子时，所述化合物聚集为不溶性荧光纳米颗粒。
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