CN103896928B - 一种pH荧光化学传感器及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种荧光化学传感器，其包括联吡啶分子骨架、氢离子键合单元、和异硫氰酸酯荧光素荧光团。本发明还提供了pH荧光化学传感器的制备方法，pH荧光化学传感器在检测溶液氢离子的应用，及在细胞成像及细胞内环境下pH检测的应用。本发明提供了异硫氰酸荧光素酯在制备pH荧光化学传感器中的应用。本发明的pH荧光化学传感器为一种以联吡啶分子骨架为基础，同时引入一个氨基和一个荧光团，可对细胞内的pH变化做出响应，本发明提供了异硫氰酸酯荧光素新的应用途径。

Description

一种pH荧光化学传感器及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学材料领域，涉及一种pH荧光化学传感器及其合成方法和应用。

背景技术

pH值是水溶液最重要的物理化学参数之一，凡涉及水及溶液的自然现象、化学变化以及生产过程都与pH有关。在生物体系中，pH值在一些生理过程中发挥着重要的作用，比如细胞的增值、酶的活性、离子传输、癌细胞的生存状态等等(J.Am.Chem.Soc.,2009,131,3016；Chem.Rev.,2010,5,2709_.)。因此，pH值的测定一直以来就是工农业生产、科学研究、临床医学及环境保护与监测等领域必不可少的工作。pH玻璃电极因存在阻抗高，较难微型化、较易破损、不能用于含HF溶液pH测定，存在“钠误差”和“酸误差”等缺陷，使它在细胞内的pH值检测和细胞成像研究方面的应用受到了限制。与电化学检测方法相比，基于荧光探针的光学检测方法就克服了以上缺点(ChemRev.,1997,97,1515；ChemRev.,2003,103,4419.)。荧光传感器因具有灵敏度高，选择性好，检测限低，仪器操作简单等优点受到了广大科研工作者的青睐(ChemCommun.,2008,45,5915；InorgChem.,2010,49,10753；AnalBioanalChem.,2005,383,349；ChemSocRev.,2011,40,79.)。目前，文献报道的pH化学传感器只有为数不多的可用于定量检测和细胞成像(J.Am.Chem.Soc.,2010,132,13951；J.Mater.Chem.,2011,21,4056.)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种生物相容性好、具有特定光学响应的高灵敏pH荧光化学传感器。本发明的pH荧光化学传感器结构中引入了联吡啶基团和异硫氰酸酯荧光素(FluoresceinisothiocyanateisomerI,FITC)，联吡啶基团上含有N原子，易质子化，作为键合基，FITC作为荧光团，具有水溶性好、量子产率高、荧光响应灵敏等优点。

本发明高灵敏的pH荧光化学传感器，包括联吡啶分子骨架、氢离子键合单元、和信号传输单元异硫氰酸酯荧光素荧光团；其中，所述pH荧光化学传感器如式(I)所示：

其中，X为S或O元素；R为具有荧光性质的化学基团。进一步地，R为异硫氰酸酯荧光素(FITC)、蒽、芘或者它们的衍生物。

本发明还提供了所述pH荧光化学传感器的制备方法，是以联吡啶分子骨架为基础，同时引入一个氨基和一个荧光团，从而使其在水溶液中对pH具有特定的荧光响应。具体而言，以联吡啶分子为分子骨架，在其四位上分别引入氨基、荧光素基，联吡啶分子上的两个氮原子和氨基作为键合位点，荧光素基作为信号单元，合成pH荧光化学传感器。其反应路线如下：

本发明在上述反应路线第一步中，用二甲基亚砜(DMSO)做反应溶剂，代替了文献反应溶剂二甲基甲酰胺(DMF)，可将反应温度由60℃降至室温，其它实验条件相同，则获得产物的产率提高两倍，方法优良。

本发明pH荧光化学传感器可对细胞内的pH变化做出响应。信号传输单元异硫氰酸酯荧光素作为有机染料可通过与蛋白质分子的氨基反应接枝到蛋白质分子上形成荧光蛋白，从而标记蛋白质。现有技术中，异硫氰酸酯荧光素因其本身不能渗入细胞而限制了其在生物荧光探针领域的应用。本发明首次提出将异硫氰酸酯荧光素与联吡啶基团连接得到pH荧光化学传感器。本发明pH荧光化学传感器通过细胞成像可对细胞内的微小pH变化进行响应。通过细胞成像实验研究，本发明pH荧光化学传感器在无血清培养基中与细胞共培养后可进入细胞，进行荧光成像，从而提供了异硫氰酸酯荧光素的新的应用。

本发明还提供一种具有特定光学响应的高灵敏pH荧光化学传感器的制备方法。本发明制备方法通过联吡啶基团和FITC的引入合成了新的对细胞内的pH值进行检测的pH荧光化学传感器。本发明合成路线反应条件温和，操作简单，产率较高，尤其是纯化过程只需萃取和抽滤，避免了费时费力的柱层析纯化方法的使用。

本发明制备方法，利用氨基易对异硫氰酸酯基进行亲核加成的性质，通过多步化学衍生引入联吡啶分子，同时引入信号单元异硫氰酸酯荧光素，制得pH荧光化学传感器。在pH荧光化学传感器溶液中，联吡啶基团上的氮原子和氨基易被质子化，导致信号单元共轭结构的电子密度发生变化，pH荧光化学传感器溶液的荧光强度也会相应的发生变化。即，本发明pH荧光化学传感器对水溶液中氢离子(pH值)有特定的光学响应。

其合成方法具体如下：

(1)在联吡啶分子的四位上引入氨基的衍生物的合成

第一步：将4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶溶于二甲基亚砜(DMSO)，加入叠氮化钠，氮气保护下室温搅拌过夜。反应完毕后，将反应液倒入蒸馏水中，用乙醚萃取，收集有机相，用蒸馏水洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，得白色固体4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶上的溴原子被叠氮基取代的化合物，即为4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶。具体反应式如下：

本发明在上述第一步中，还可以用二甲基亚砜(DMSO)代替DMF,可将反应温度由60℃降至室温，其他实验条件相同，则获得产物的产率提高两倍，方法优良。

第二步：将第一步制得的4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶溶于干燥的四氢呋喃(THF)中，再迅速加入三乙胺和催化量的钯碳(含10％水)，通氮气排空三次，撤除氮气后用氢气排净氮气。在氢气气氛下反应48小时，过滤，滤液旋干，得白色固体，为4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶上的叠氮基被还原成氨基的化合物。具体反应式如下：

(2)基于联吡啶的pH荧光化学传感器分子的合成

向干燥的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中加入异硫氰酸酯荧光素，再向混合溶液中慢慢加入4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶。滴加完毕后，氮气保护下室温搅拌过夜，反应液中有大量沉淀产生。过滤，沉淀采用索氏提取器(萃取剂是二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，v:v＝1:1)，萃除可溶性杂质，得到橘红色固体，即为pH荧光化学传感器。具体反应式如下：

本发明还提供了pH荧光化学传感器在检测溶液中氢离子的应用。在pH6.50-8.00范围内，pH荧光化学传感器可定量传感溶液pH值，而不受其它常见金属离子(Hg²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Na⁺等等)和阴离子(Cl^-、Br^-、F^-、H₂PO₄ ^-、HSO₄ ^-等等)的干扰。氢离子可以与含有孤对电子的氮原子质子化，导致信号单元的荧光性质发生变化，达到选择性传感氢离子的作用。

pH荧光化学传感器对溶液中pH值的传感研究在在H₂O/DMSO(v(H₂O)/v(DMSO)＝95:1，40mmolHEPES缓冲溶液)的溶液中进行。配制pH荧光化学传感器浓度固定(5.0×10^-6mol·L^-1)而pH值不同的一系列溶液，静置5小时后分别测不同pH值溶液的荧光发射光谱，利用origin8.0将得到的一系列数据作图分析观察谱图变化情况。

本发明还提供了所述pH荧光化学传感器在生物细胞成像及细胞内环境下pH值检测的应用。异硫氰酸酯荧光素作为有机染料其本身不能渗入细胞而限制了其在生物荧光探针领域的应用。本发明提供了异硫氰酸荧光素酯在制备pH荧光化学传感器中的应用。本发明pH荧光化学传感器可对细胞内的pH变化做出响应。本发明将异硫氰酸酯荧光素与联吡啶基团连接得到pH荧光化学传感器。本发明pH荧光化学传感器将异硫氰酸酯荧光素通过生成硫脲基与联吡啶连接，可以与细胞共培养检测细胞内的pH值变化情况。MTT实验表明pH荧光化学传感器对细胞的毒性很小。本发明在生物分析和医药生物学中具有重要意义。通过细胞成像实验研究，本发明pH荧光化学传感器在无血清培养基中与细胞共培养后可进入细胞，进行荧光成像，本发明首次创新提出了异硫氰酸酯荧光素的一种新的应用途径。

本发明pH荧光化学传感器的信号单元异硫氰酸酯荧光素具有水溶性好、量子产率高、颜色易于肉眼观察的优点。将异硫氰酸酯荧光素应用于细胞成像和pH检测，为异硫氰酸酯荧光素提供了一条新的应用途径。

附图说明

图1表示本发明pH荧光化学传感器分子的核磁共振氢谱图(溶剂：DMSO-d₆)。

图2表示本发明pH荧光化学传感器分子的UPLC-MS谱图(溶剂：CH₃OH/DMSO)。

图3表示本发明pH荧光化学传感器荧光激发和发射波长的确定谱图。

图4表示本发明pH荧光化学传感器在不同pH条件下的荧光变化谱图。

图5表示本发明pH荧光化学传感器在最大发射峰处的荧光强度与pH值的变化关系图。

图6表示本发明pH荧光化学传感器在pH6.50-8.00范围内的线性拟合图。

图7表示本发明pH荧光化学传感器在不同浓度下对HELA细胞的MTT毒性检测图。

图8表示本发明pH荧光化学传感器在不同浓度下对MCF-7细胞的MTT毒性检测图。

图9表示本发明pH荧光化学传感器在不同浓度下对SMMC-7721细胞的MTT毒性检测图。

图10表示本发明pH荧光化学传感器与HELA细胞共培养后在细胞内的pH为6.5、7.4、8.0环境下的荧光显微镜成像图。

图11表示本发明pH荧光化学传感器与MCF-7细胞共培养后在细胞内的pH为6.5、7.4、8.0环境下的荧光显微镜成像图。

图12表示本发明pH荧光化学传感器与SMMC-7721细胞共培养后在细胞内的pH为6.5、7.4、8.0环境下的荧光显微镜成像图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：含异硫氰酸酯荧光素的pH荧光化学传感器的合成

(1)合成在联吡啶分子的四位上引入氨基的衍生物：

第一步：在50mL的圆底烧瓶中加入1.0g(1.6mmol)4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶,960mg(14.77mmol)NaN₃和20mL的二甲基亚砜(DMSO)，反应液在氮气保护下室温搅拌过夜。反应完毕后，将反应液用150mL乙醚稀释，100mL蒸馏水水洗，分别收集有机相和水相。水相用50mL乙醚萃取三次，合并有机相。然后有机相用50mL蒸馏水洗涤三次，100mL饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，得白色固体4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶773mg,产率99％。¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)δ:8.70(d，J＝7.5Hz，2H，-bipyH)，8.38(s，2H，-bipyH)，7.33(d，J＝7.5Hz，2H，-bipyH)，4.51(s,4H，-CH₂)，MS(ESI):C₁₂H₁₀N₈+Na289.1。

上述第一步产物4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶的结构：

第二步：将0.22g(0.83mmol)4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶溶于20mL干燥的四氢呋喃(THF)中，再迅速加入1mL三乙胺和20mg10％的钯碳，通氮气排空三次，撤除氮气后用氢气排净氮气。在氢气气氛下反应48小时，过滤，滤液旋干，得白色固体4,4’-二氨甲基-2,2’-联吡啶170mg,产率96％。¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)δ:8.54(d，J＝7.50Hz，2H，-bipyH),8.28(s，2H，-bipyH),7.22(d,J＝7.5Hz，2H，-bipyH),3.91(s，4H，-CH₂),1.54(s,4H，-NH₂)MS(ESI):C₁₂H₁₀N₈+H215.2。

上述第二步产物4,4’-二氨甲基-2,2’-联吡啶的结构：

(2)基于联吡啶的pH荧光化学传感器分子的合成

向20mL干燥的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(v:v＝10:10)中加入异硫氰酸酯荧光素，再向混合溶液中慢慢加入20mL含27mg(0.126mmol)4,4’-二叠氮甲基-2,2’-联吡啶溶液(v(DCM):v(CH₃OH)＝10:10)。滴加完毕后，氮气保护下室温搅拌过夜，反应液中有大量沉淀产生。过滤，沉淀采用索氏提取器(萃取剂是50mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂,v:v＝1:1)，萃除可溶性杂质，得橘红色固体，为pH荧光化学传感器34mg，产率50％。¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)δ:3.86(s，2H，-CH₂)，4.92(s，2H，-CH₂)，6.53-6.64(m,6H,-FITCH)，7.18(d,J＝8.2Hz，1H，-ArH),7.40(d,J＝4.3Hz，2H，-bipyH),7.78(d,J＝7.7Hz，1H，-ArH),8.27(s,1H，-ArH),8.36(d,J＝13.4Hz，1H，-bipyH),8.40(d,J＝7.6Hz，1H，-bipyH),8.58(d,J＝5.1Hz，1H，-bipyH),8.63(d,J＝4.9Hz，1H，-bipyH),8.76(s,H，-NH)，MS(ESI):C₃₃H₂₅N₅O₅S+H604.38。

本实施例所制备的pH荧光化学传感器的结构：

图1表示本发明pH荧光化学传感器分子的核磁共振氢谱图(溶剂：DMSO-d₆)。图2表示本发明pH荧光化学传感器分子的UPLC-MS谱图(溶剂：CH₃OH/DMSO)。

实施例2：pH荧光化学传感器在溶液中氢离子检测方面的应用

在水与二甲基亚砜(DMSO)的混合溶液(v(H₂O):v(DMSO)＝95:5)中，配制浓度为5.0×10^-6mol·L^-1pH荧光化学传感器溶液，静置1小时后测其荧光光谱，如图3所示本发明pH荧光化学传感器荧光激发和发射波长的确定谱图，确定该pH荧光化学传感器分子的荧光激发波长为494nm,发射波长为517nm。

配制一系列pH值分别为4.30,5.26,5.95,6.37,6.50,6.63,6.79,6.92,7.03,7.15,7.23,7.32,7.42,7.52,7.64,7.71,7.85,8.00,8.39,9.10,10.04,及10.96的pH荧光化学传感器溶液(用40mM的HEPES缓冲液来调制不同pH值)，静置1小时候测其荧光发射光谱。如图4所示本发明pH荧光化学传感器在不同pH条件下的荧光变化谱图，在检测过程中，在pH值4.0至6.5范围内，随着传感器溶液pH值的增大，其荧光强度在缓慢地增加。如图6所示本发明pH荧光化学传感器在pH6.50-8.00范围内的线性拟合图，在6.5至8.0范围内，传感器溶液的荧光强度随pH值的增大而明显增大，而且荧光强度随pH值的变化几乎是成线性增大的。然后pH值在8.0至10.0范围内，传感器溶液的荧光强度几乎没有变化。在6.5至8.0范围内，pH荧光化学传感器可高灵敏地检测溶液中的氢离子浓度。

图5表示本发明pH荧光化学传感器在最大发射峰处的荧光强度与pH值的变化关系图。pH荧光化学传感器溶液的荧光强度与pH之间有强烈的依赖关系。在强酸条件下，pH荧光化学传感器溶液的荧光强度较弱且变化不大，在6.5-8.0范围内，其荧光强度随pH值的增大而增大，在强碱条件下，其荧光强度最大且趋于不变。pH荧光化学传感器可对中性范围内的溶液进行pH值检测。此实验研究表明pH荧光化学传感器设计具有合理和应用意义。

实施例3：pH荧光化学传感器荧光化学器在检测生物细胞内的pH值方面的应用

细胞毒性(MTT)实验

收集对数生长期细胞，将贴壁生长的细胞使用0.1％胰酶消化后再悬浮于新鲜的培养基中调整细胞悬液浓度，将细胞以100μL孔接种于96孔板，使待测细胞密度为1×10⁴/孔,实验组和对照组分别设6个复孔。在5％CO₂，37℃的环境中培养过夜，弃去该培养液，然后加入含有不同浓度的C04(1×10^-5,5×10^-5,1×10^-6,5×10^-6,1×10^-7,5×10^-7,1×10^-8和5×10^-8M)培养基100μL继续培养24小时和48小时。每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL，HEPES)，振摇5分钟后，继续在5％CO₂，37℃的环境中培养4小时。小心地吸去孔内旧的培养基溶液。每孔加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速(100rpm)振荡15分钟，使结晶物充分溶解后于570nm处测量各孔的光密度值。计算不同浓度C04作用下的细胞存活率。细胞生存率＝(实验组吸光度均值、空白对照吸光强度均值)×100％。

图7表示本发明pH荧光化学传感器对HELA细胞的毒性研究(图7a：C04与HELA细胞共培养24小时；图7b：C04与HELA细胞共培养48小时)；图7表示本发明pH荧光化学传感器对MCF-7细胞的毒性研究(a图：C04与MCF-7细胞共培养24小时；b图：C04与MCF-7细胞共培养48小时)；图9表示本发明pH荧光化学传感器对SMMC-7721细胞的毒性研究(a图：C04与SMMC-7721细胞共培养24小时；b图：C04与SMMC-7721细胞共培养48小时)。MTT实验研究表明浓度在0.01-10μM的pH荧光化学传感器溶液分别HELA细胞、MCF-7细胞和SMMC-7721细胞共培养24小时和48小时后，细胞的存活率都超过了95％,即pH荧光化学传感器具有优良的生物相容性，对细胞的毒性很小，具有应用于生物材料领域的潜力。

不同pH值下的细胞成像实验

收集对数生长期细胞，将贴壁生长的细胞使用0.1％胰酶消化后再悬浮于新鲜的培养基中(不含血清)，调整细胞悬液浓度，将细胞接种于覆有盖玻片的24孔培养板中，每孔接种1000μL,使细胞浓度为1×10⁵个/孔，在5％CO₂，37℃，的环境中培养12小时后。弃去孔内旧的培养基溶液,然后加入含有5×10^-5MC04培养液与细胞共培养60分钟。吸出培养基，使用不同pH值HEPES缓冲(6.5，7.4，8.0)洗涤，使H⁺迅速与K⁺交换，细胞内外H⁺快速达到平衡。然后用多聚甲醛溶液固定15分钟，最后使用封片剂封片，置于荧光显微镜下观察拍照。

图10表示本发明HELA细胞与pH荧光化学传感器共培养1小时后未用pH值缓冲液冲洗和用pH值缓冲液冲洗后的荧光照片和光学照片。一行：未用pH值缓冲液浸泡细胞；二行：pH＝6.5缓冲液浸泡细胞10分钟；三行：pH＝7.4缓冲液浸泡细胞10分钟；四行：pH＝8.0缓冲液浸泡细胞10分钟。图11表示本发明MCF-7细胞与pH荧光化学传感器共培养1小时后未用pH值缓冲液冲洗和用pH值缓冲液冲洗后的荧光照片和光学照片。一行：未用pH值缓冲液浸泡细胞；二行：pH＝6.5缓冲液浸泡细胞10分钟；三行：pH＝7.4缓冲液浸泡细胞10分钟；四行：pH＝8.0缓冲液浸泡细胞10分钟。图12表示本发明SMMC-7721细胞与pH荧光化学传感器共培养1小时后未用pH值缓冲液冲洗和用pH值缓冲液冲洗后的荧光照片和光学照片。一行：未用pH值缓冲液浸泡细胞；二行：pH＝6.5缓冲液浸泡细胞10分钟；三行：pH＝7.4缓冲液浸泡细胞10分钟；四行：pH＝8.0缓冲液浸泡细胞10分钟。pH荧光化学传感器与细胞共培养后，荧光显微镜成像实验显示细胞内的pH值越强，细胞的荧光强度越强，即本发明设计合成的pH荧光化学传感器具有良好的生物相容性，可对细胞内环境的酸碱性进行检测。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (7)

1.一种pH荧光化学传感器，其特征在于，包括联吡啶分子骨架、氢离子键合单元、和异硫氰酸酯荧光素荧光团；所述的pH荧光化学传感器的结构式(Ⅰ)如下：

2.一种pH荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，以联吡啶分子为分子骨架，在其四位上分别引入氨基、荧光素基，以所述联吡啶分子上的两个氮原子和氨基为键合位点，以荧光素基为信号单元，合成如权利要求1所述的pH荧光化学传感器；

其反应路线如下：

3.如权利要求2所述的pH荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，在所述反应路线第一步中，以二甲基亚砜作为反应溶剂，在室温条件下反应。

4.如权利要求1所述的pH荧光化学传感器在检测溶液氢离子的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在pH6.50-8.00范围内，所述pH荧光化学传感器定量传感溶液pH值，不受Hg²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Na⁺和Cl^-、Br^-、F^-、H₂PO₄ ^-、HSO₄ ^-的干扰。

6.如权利要求1所述的pH荧光化学传感器在细胞成像及细胞内环境下pH检测的应用。

7.如权利要求1所述的pH荧光化学传感器在HELA细胞和SMMC-7721细胞的pH检测中的应用。