CN108329336A - 双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，具有如式II所示的化学结构。上述的配合物毒性小、生物相容性高，适于与核酸、肽或蛋白等生物分子共价结合，形成荧光量子率高、荧光寿命长、检测限低的荧光探针分子，适于细胞、组织或者活体中的生物分子检测，在生物医药领域中具有广泛的应用前景。本发明公开了上述配合物的合成方法，为配合物的合成提供了多种选择途径，合成路径简单易行，制得的配合物产率高，适于配合物的大规模生产制备。
Description
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种双杯[4]芳烃衍生物及其金属配合物、合成方法和应用。
背景技术
分子识别是主体(受体)对客体(底物)选择性结合并产生特定功能的过程。识别过程可能引起体系的磁性、电学、光学性质及构象的变化，从而导致化学信息的存储、传递以及处理。因此，分子识别在信息处理传递、分子及超分子器件制备过程中起着重要作用。
利用主客体分子的结合引起磁性或者荧光性能的改变进行分子识别是目前主要的研究方向，在离子的萃取分离、生物分析、环境工程、材料科学和医药等多领域有着广泛的应用。其中，荧光标记分析是分子识别的一个关键领域，荧光探针建立在分子识别和荧光技术的基础上，是一类能将分子识别过程通过荧光信号有效表达的分子，它广泛应用于阳离子、阴离子和中性分子等多种目标物质的荧光识别检测。荧光探针分子通常由识别基团和荧光基团两部分组成，识别基团决定对不同客体的选择性，通过选择性结合，实现分子的识别并得到分子的信息；随之通过相荧光基团的荧光信号传导机制将分子结合信息转换为易于检测的荧光信号，从而实现在分子水平上的原位实时检测。
为了进一步提高分子识别中主体与客体分子的结合稳定性、选择性，寻找新的分子识别的主体分子成为研究的热点。杯芳烃(calixarenes)作为一类新型大环化合物，是由苯酚单元通过亚甲基连接起来的一类环状低聚物，因其由芳环编织成的外形酷似希腊圣杯，故命名为杯芳烃。杯芳烃具有合成原料价廉易得，在溶剂中构象可变，具有独特的空间结构、空腔大小可调节，与阳离子、阴离子和中性分子均能形成主客体包结物等优点；可以借助于氢键、静电作用、分子作用力、π堆积等非共价键作用来识别客体分子，因此，杯芳烃被看作超分子化学中继冠醚和环糊精之后的更具发展潜力的“第三代主体分子”。
Talanova等人报道了基于杯[4]芳烃衍生物的Hg2+化学传感器。其中，杯[4]芳烃衍生物是将萘磺酰胺的衍生物修饰在杯[4]芳烃上得到，其分子结构如下所示：
该杯[4]芳烃衍生物的氯仿溶液在520nm处有强的荧光，加入Hg2+后,杯[4]芳烃衍生物选择性识别Hg2+，并发生从磺酰胺基团向Hg2+的电子转移，使其荧光强度大为减小，实现光学检测。但上述的杯[4]芳烃衍生物选择性结合 Hg2+，基于荧光淬灭原理成像，在荧光检测时存在背景信号大、灵敏度较低等缺点，不适于标记核酸或蛋白等生物分子用于生物样品的检测，限制了其在生物医学领域中的应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中的杯[4]芳烃衍生物结合金属离子在荧光检测时存在灵敏度较低、不适于标记生物分子的缺陷，从而提供一种灵敏度较高，适于生物分子标记的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物。
为此，本发明提供了一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，具有如式II所示的结构：
其中，M为稀土金属离子；
R1～R8分别独立地选自-H、-NH2、-COOH、-CH2COOH、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-SO3H、 -SO3R、-NHCO(CH2)XCOOH、-NO2、-CH2PO(OH)2、 R为碱金属或苯，R1～R8不同时为-H，X为0～3的整数；
A选自-(CH2-CH2)n-、-(CH2OCH2)n-、-CONH(CH2)nNHCO-和n为1～3的整数。
优选地，上述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，所述稀土金属为铽或铕。
进一步优选地，上述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，所述双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物选自式II-1～II-51 任一所示的化学结构。
本发明提供了一种上述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成式E所示的杯[4]芳烃类化合物和式E’所示的杯[4]芳烃类化合物；式E’所示的杯[4]芳烃类化合物经缩合反应，引入-O-A-基团，得到式F’所示的中间体；
其中，R1’～R8’分别独立地选自-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO、-SO3R、-H、-NH2、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-NO2、-CH2PO(OH)2、R为碱金属或苯，X为0～3 的整数，R1’～R8’不同时为-H；
TsO-为对甲苯磺酸基；
(2)将式F’所示的中间体溶于第一有机溶剂，加入对甲基苯磺酰氯，在0～4℃下反应，反应结束后将反应溶液倒入酸中，析出沉淀，即为式F所示的杯[4]芳烃类化合物；
(3)将式E所示的杯[4]芳烃类化合物与碱金属盐溶于第二有机溶剂，混匀后加入F所示的杯[4]芳烃类化合物，在70～75℃下回流反应，然后将所述第二有机溶剂更换为第三有机溶剂，继续回流反应，反应结束后过滤，析出滤液中的晶体；
(4)当R1’～R8’不包括-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和-SO3R时，步骤(3)中制得的晶体即为式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
当R1’～R8’中包括至少一个-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和/或-SO3R时，步骤(3)中制得的晶体为式 I’所示的中间体，将式I’所示的中间体经过氧化和/或水解后，制得式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
(5)在惰性气体环境下，将稀土金属盐与脱水脱氧处理的第四有机溶剂混合后在75～80℃下回流，然后加入式 I所示的双杯[4]芳烃衍生物，继续回流反应，反应结束后冷却反应产物，过滤，分离得到式II所示的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物；
合成路线如下所示：
本发明提供了一种上述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成式E所示的杯[4]芳烃类化合物和式E’所示的杯[4]芳烃类化合物；其中，R1’～R8’分别独立地选自-CHO、 -CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO、-SO3R、-H、-NH2、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-NO2、-CH2PO(OH)2、R为碱金属或苯，X为0～3的整数，R1’～R8’不同时为-H；
S2.将式E所示的杯[4]芳烃类化合物、式E’所示的杯[4]芳烃类化合物和碱金属盐混匀，溶于第五有机溶剂，继续加入化合物TsO-A-OsT，在惰性气体保护下，在105-120℃下回流反应，反应结束后冷却反应溶液，柱分离得到反应产物；其中，TsO-为对甲苯磺酸基；
S3.当R1’～R8’不包括-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和-SO3R时，步骤S2中制得的反应产物为式I所示的中间体；
当R1’～R8’中包括至少一个-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和/或-SO3R时，步骤S2中制得的反应产物为式I’所示的中间体，将式I’所示的中间体经过氧化和/或水解后，制得式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
S4.在惰性气体环境下，将稀土金属盐与脱水脱氧处理的第四有机溶剂混合后在75～80℃下回流，然后加入式I 所示的双杯[4]芳烃衍生物，继续回流反应，反应结束后冷却反应产物，过滤，分离得到式II所示的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物；
合成路线如下所示：
优选地，上述的合成方法，所述第一有机溶剂为吡啶，所述第二有机溶剂为乙腈，所述第三有机溶剂为乙醇和水以1:1的体积比的混合溶液，所述第四有机溶剂为乙腈，所述碱金属盐为碳酸钾。
优选地，上述的合成方法，所述第五有机溶剂为甲苯。
优选地，上述的合成方法，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物与所述式F所示的杯[4]芳烃类化合物的摩尔比为3:2～1:1，所述式I所示的双杯[4]芳烃衍生物与所述稀土金属盐的摩尔比为1:1～2:3，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物与所述碱金属盐的摩尔比为1:5。
优选地，上述的合成方法，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物、所述式E’所示的杯[4]芳烃类化合物、所述化合物TsO-A-OsT和所述碱金属盐的摩尔比为(2～3)：(2～3)：(2.5～3)：(12.5～20)。
本发明提供了上述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物作为荧光染料的用途。
本发明提供了一种荧光探针分子，所述荧光探针分子为荧光染料标记的生物分子，所述荧光染料为权利要求1-3 任一项所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，所述生物分子选自氨基酸、多肽、蛋白、核苷酸、寡核苷酸和核酸中的至少一种。
优选地，上述的荧光探针分子，所述核苷酸、寡核苷酸和核酸为氨基修饰的核苷酸、寡核苷酸和核酸。
优选地，上述的荧光探针分子，所述双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物在连接剂的存在下，与所述生物分子的氨基、羧基和巯基中的任一基团相连。
进一步优选地，上述的荧光探针分子，所述连接剂为N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺盐、马来酰亚胺、戊二醛或碳二亚胺。
本发明的上述技术方案具有以下优点：
1.本发明提供的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，具有如式II所示的结构。
式II所示的配合物是以双杯[4]芳烃衍生物I为主体，以稀土金属离子为客体键合而成的包结物，其中双杯[4] 芳烃衍生物I是由两个单杯[4]芳烃衍生物分别通过下缘的羟基与桥联单元A相连接形成的四桥联的双杯[4]芳烃，A 分别独立地选自-(CH2-CH2)n-、-(CH2OCH2)n-、-(CH2PhCH2)n-和-CONH(CH2)nNHCO-，n为1～3的整数。上述的双杯 [4]芳烃衍生物构象稳定，双杯[4]芳烃衍生物在桥联位置处形成三维的管道空腔，对进入管道空腔内的金属离子形成一定的空间限位；桥联基团A一方面利用非共价键形成对金属离子的配合作用，另一方面通过调节桥联基团A，能够对三维管道空腔的大小进行调节，以形成对特定金属离子的的限位作用。通过空间限位与非共价键配合两者之间的协同作用，使式I所示结构的双杯[4]芳烃衍生物选择性识别稀土金属离子，并具有优良的配合能力。
双杯[4]芳烃衍生物选择性络合稀土金属离子形成的配合物，具有水溶性好、毒性小，能够与活细胞相容等优势。同时，R1～R8取代基团能够通过酰胺化或者磺酰胺化等缩合反应与核酸、蛋白、多肽等生物分子共价结合，得到配合物与生物分子的偶联物，以实现对特定蛋白、DNA分子的体外、细胞内或者生物活体检测。R1～R8取代基团中的酰胺键能够增加双杯[4]芳烃衍生物对稀土金属离子的选择络合效应，以提高配合物作为生物分子检测探针的检测效果。
双杯[4]芳烃衍生物选择性络合稀土金属离子，使稀土金属离子进入双杯[4]芳烃衍生物的三维管道空腔内，形成构象稳定的配合物。配合物中的能量由稀土金属离子传递至双杯[4]芳烃衍生物，使双杯[4]芳烃衍生物发生能级跃迁，最终以荧光光子的形式将能量释放出来，使配合物产生特征荧光。双杯[4]芳烃中的酰胺基、羰基、等结构有益于进一步增加杯芳烃对稀土金属离子的能力吸收，进行能量的有效传递，使最终以配合物制备的荧光探针的荧光量子产率高、荧光寿命长、检测限低、发光性质稳定，能够实现长时间、实时、动态连续测定。另外，由于荧光探针具有较好的水溶性、在生理条件下稳定，对细胞膜穿透性好，且对细胞毒性小，适用于活体细胞检测。
2.本发明提供两种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的合成方法，为配合物II提供了多种可选择的合成路径，且合成过程简单易行，合成所需的原料廉价易得，以上述两种方法制备配合物II的产率高，适于大规模的工业生产制备。
本发明提供了适于高产率双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的原料配比及合成条件，能够减少式E所示杯[4]芳烃类化合物、式E’所示杯[4]芳烃类化合物和化合物TsO-A-OsT，或者式E所示杯[4]芳烃类化合物和式F所示的杯[4] 芳烃类化合物在缩合反应过程中的错配结合，提高了双杯[4]芳烃衍生物I的得率。
3.本发明提供的荧光探针分子，其中，荧光探针分子为荧光染料标记的生物分子，荧光染料为上述的双杯[4] 芳烃衍生物的金属配合物，生物分子选自氨基酸、多肽、蛋白、核苷酸、寡核苷酸和核酸中的至少一种。上述荧光探针分子与待测目标分子特异性结合(例如待测目标分子为抗原，则生物分子为与之特异性结合的抗体)，然后通过荧光检测以得到待测目标分子信息。由于双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子形成的金属配合物兼具荧光产率高、荧光寿命长、荧光性能稳定，以及毒性小、细胞膜穿透性好和生物兼容性高的优势，可广泛应用于细胞内外物质检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等，在生物医学研究领域里具有重要的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中的双杯[4]芳烃衍生物I-1的核磁共振图；
图2为本发明实验例1中配合物II-1的荧光光谱的检测结果；
图3为本发明实验例1中配合物II-2的荧光光谱的检测结果；
图4为本发明实验例1中配合物II-3的荧光光谱的检测结果；
图5为本发明实验例1中配合物II-4的荧光光谱的检测结果；
图6为本发明实验例2中不同浓度的配合物II-1对前列腺癌细胞DU-145生长抑制的检测结果图；
图7为本发明实验例2中不同浓度的配合物II-2对前列腺癌细胞DU-145生长抑制的检测结果图；
图8为本发明实验例2中不同浓度的配合物II-3对前列腺癌细胞DU-145生长抑制的检测结果图；
图9为本发明实验例2中不同浓度的配合物II-4对前列腺癌细胞DU-145生长抑制的检测结果图；
图10显示本发明实验例3中以配合物II-1标记EGFR抗体作为荧光探针分子检测癌症细胞中EGFR表达的荧光成像结果图；
图11显示本发明实验例5中配合物II-1～配合物II-4作为荧光染料的荧光稳定性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明实施例所用的试剂等基础化工原料，均可在国内化工产品市场买到，或在有关中间体制备厂定做。
实施例1
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其制备方法，双杯[4]芳烃衍生物具有如式I-1所示的分子结构；双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子Tb3+配合得到配合物，其分子结构如式II-1所示：
以中间体E-1和中间体F-1合成中间体I’-1，中间体I’-1氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-1，双杯[4]芳烃衍生物 I-1络合稀土金属离子Tb3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1，合成路线为：
(1)中间体E-1的制备
步骤1：以杯[4]芳烃为反应原料，取杯[4]芳烃(30.0g/70.7mmol)、无水碳酸钾(10.7g/77.4mmol)和对甲基苯磺酸甲酯(26.3g/141.4mmol)，溶于500mL的CH3CN中回流24h，抽干，然后加入500mL的CH2Cl2并加入1mol/L HCl(2×50mL)，盐水50mL，除去溶剂，抽干，干燥后得到产物I-1-1:
步骤2：取化合物I-1-1(5.00g,9.83mmol)，NaH(1.60g,39.30mmol,以60％的质量分数悬浮在油中)，溶于200mL 的DMF后搅拌30min，然后加入对硝基苯磺酰氯(8.71g，39.30mmol),室温反应7天得到化合物I-1-2：
步骤3：将化合物I-1-2(0.5g,0.57mmol),四氮六甲圜(2.87g,20.00mmol)溶于30mL三氟乙酸中，在-80℃、氮气保护下反应22h，得化合物I-1-3，化合物I-1-3在KOH的乙醇溶液中回流12h得化合物I-1-4。
化合物I-1-4的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.23(s,2H,CHO),7.28(s，4H，Ar)，6.91(s，6H，Ar)，5.99(s， 4H，OH)，3.81(s，8H，CH2)。
mass spectrum mlecalcd 480.14，found(M-H+)481.20。
步骤4：将化合物I-1-4(1.0mmol)，含有1mol/L氟化四丁铵的四氢呋喃溶液0.0038mL、3.8mmol乙酸溶解在 7.2mL的DMF中室温反应3h；然后向反应混合物中加入1.2mol/L的HCl，溶液分层，用氯仿萃取，旋蒸干燥，即得中间体E-1，产率88％：
中间体E-1的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.23(s，2H，CHO)，7.28(s，4H，Ar)，6.91(s，6H，Ar)，5.99(s， 4H，OH)，3.81(s，8H，CH2)，3.76(s，3H，OCH3)。
mass spectrum mlecalcd 494.17，found(M-H+)495.26。
(2)中间体F-1的制备
步骤5：将中间体E-1溶于250mL的乙醚中，加入NaH(33.5mmol)，在0℃反应过夜，继续向反应液中慢慢加入33.5mmol的BrCH2CH2OH，析出沉淀，除去乙腈溶剂，层析法分离得到化合物I-1-5，产率：57％：
步骤6：在0℃温度下，将化合物I-1-5(1.2mmol)溶于25ml的吡啶中，然后加入对甲基苯磺酰氯(14.5mmol)，在4℃冰箱中保存4天，溶液倒入250mL 2mol/L冰冻的HCl中，析出沉淀，过滤，收集，干燥得中间体F-1：
中间体F-1的核磁表征数据1H-NMR(CDC13)8.23(s，2H，CHO)，8.0-7.84(d，10H，Ar)，7.78(m，12H，Ar)， 4.77(s，12H，CH2)，3.81(m，8H，CH2)，3.76(s，3H，OCH3)。
mass spectrum mlecalcd 1088.28，found(M-H+)1089.21。
(3)中间体I’-1的制备
将中间体E-1(0.7mmol)和碳酸钾(3.5mmol)溶于乙腈中，搅拌2h然后加入中间体F-1(0.7mmol)，在70℃下回流5天，真空泵除去溶剂后，向固体物质中加入1：1(v:v)的乙醇-水混合液溶解，悬浊液加热回流过夜，然后趁热过滤，粗产物溶于50mL氯仿中，然后用滤纸过滤得到清澈的溶液，然后加入40mL的丙酮，晶体析出得中间体I’-1，产率为73％：
中间体I’-1的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)9.9，9.7(s，4H，CHO)，7.54-7.16(m，20H，Ar)，4.36(d，16H， PhOCH2CH2OPh)，3.81(s，16H，PhCH2)，3.76(s，6H，OCH3)。
mass spectrum mlecalcd 1066.38，found(M-H+)1067.45。
(4)双杯[4]芳烃衍生物I-1、双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1的制备
中间体I’-1溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸(TFA)反应2h即得双杯[4]芳烃衍生物I-1，氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入TbCl3和脱水脱氧处理过的乙腈，在75℃下回流半个小时后，往该白色悬浊液中滴加双杯[4]芳烃衍生物I-1的乙腈溶液，TbCl3与化合物I-1的摩尔比为1.2:1，反应4h。反应结束后冷却反应溶液，过滤，HPLC分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1：
双杯[4]芳烃衍生物I-1的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)7.83-7.09(m，20H，Ar)，4.36(d，16H，PhOCH2CH2OPh)， 3.81(s，16H，PhCH2Ph)，3.79，3.76(s，6H，PhOCH3)；
Mass spectrum mlecalcd 1130.38，found(M-H+)1131.36。
实施例2
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物II-1的合成方法：
以中间体E-1、中间体E’-1(等同于中间体E-1)和TsO-CH2-CH2-OsT合成中间体I’-1，中间体I’-1氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-1，双杯[4]芳烃衍生物I-1络合稀土金属离子Tb3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1，合成路线为：
(1)中间体E-1的制备
合成过程同实施例1的中间体E-1的合成，中间体E’-1与中间体E-1为同一化合物。
(2)中间体I’-1的制备
将中间体E-1(0.8mmol)、中间体E’-1(1mmol)和K2CO3(7mmol)溶于甲苯中，然后加入TsO-CH2-CH2-OsT (1.1mmol)，在氮气保护下，在105℃温度下回流3h，然后加入一定量的聚乙二醇，再回流2.5天，冷却，硅胶柱分离得到中间体I’-1，产率为69％：
(3)双杯[4]芳烃衍生物I-1、双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1的制备
中间体I’-1溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸(TFA)反应2h即得双杯[4]芳烃衍生物I-1，氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入TbCl3和脱水脱氧处理过的乙腈，在80℃回流半个小时后，往该白色悬浊液中滴加双杯[4]芳烃衍生物I-1的乙腈溶液，TbCl3与化合物I-1的摩尔比为1:1，反应4h。反应结束后冷却反应溶液，过滤，HPLC分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-1与Tb3+的配合物II-1：
实施例3
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其制备方法，双杯[4]芳烃衍生物具有如式I-2所示的分子结构；双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子Eu3+配合得到配合物，其分子结构如式II-2所示：
以中间体E-2和中间体F-2(式F-2所示的中间体等同于式F-1所示的中间体)合成中间体I’-2，中间体I’-2氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-2，双杯[4]芳烃衍生物I-2络合稀土金属离子Eu3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2，合成路线为：
(1)中间体E-2的制备
步骤1：以杯[4]芳烃为反应原料，取杯[4]芳烃(30.0g/70.7mmol)、无水碳酸钾(10.7g/77.4mmol)、对甲基苯磺酸甲酯(26.3g/141.4mmol)，溶于500mL的CH3CN中回流24h，抽干，然后加入500mL的CH2Cl2并加入1mol/L HCl(2×50mL)，盐水50mL，除去溶剂，抽干，干燥后得到产物I-1-1:
步骤2：取化合物I-1-1(5.00g，9.83mmol)，NEH(1.60g，39.30mmol，以60％的质量分数悬浮在油中)，溶于200mL 的DMF后搅拌30min，然后加入对硝基苯磺酰氯(8.71g，39.30mmol)，室温反应7天得到化合物I-1-2：
化合物I-1-2的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.34(d，4H，Er)，7.91(m，4H，Er)，7.7(d，6H，Er)，6.91(m， 6H，Er)，3.81(d，14H，CH2，CH3)，1.2(s，2H，OH)。
mass spectrum mlecElcd 822.16，found(M-H+)823.17。
步骤3：化合物I-1-2(1.14mmol)溶于100mL二氯甲烷和12mL醋酸溶液，继续向其中滴加4mL的硝酸，室温反应48h，倒入水中，然后用3×100mL的CH2Cl2萃取，除去溶剂得化合物I-2-1，产率83％：
化合物I-2-1的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.34(d，4H，Er)，8.02(m，4H，Er)，7.91(d，4H，Er)，6.91(m， 6H，Er)，3.81(d，14H，CH2,CH3)，1.2(s，2H，OH)。
mass spectrum mlecElcd 822.16，found(M-H+)823.17。
步骤4：化合物I-2-1(1.0mmol)、1mol/L氟化四丁铵的四氢呋喃溶液0.0044mL与4.4mmol乙酸共同混合于 7.2mL的DMF中，室温反应3h。继续向反应混合物加入1.2mol/L的HCl，溶液分层，用氯仿萃取，旋蒸干燥得化合物I-2-2，产率为93％：
化合物I-2-2的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.17(d，4H，Er)，7.24～6.77(m，6H，Er)，3.81(d，14H，CH2,CH3)， 0.62(s，2H，OH)。
mass spectrum mlecElcd 542.16，found(M-H+)543.27。
步骤5：向化合物I-2-2(0.67mmol)中加入催化剂镍，溶于含有1.5mL水合肼的甲醇(100mL)溶液中，加入回流7h，再加入1.5mL的水合肼和催化剂镍继续回流15h，冷却至室温，过滤，层析法分离，得到化合物I-2-3：
中间体I-2-3的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)8.52(s，2H，OH)，7.16(d，4H，Er)，6.9(m，2H，Er)，6.68(d， 4H,Er)，4.09(s，4H，NH2)，3.86(s，6H，CH3)，3.81(s，8H，CH2)；
mass spectrum mlecElcd 482.22，found(M-H+)483.26。
步骤6：将化合物I-2-3(1.0mmol)，含有1mol/L氟化四丁铵的四氢呋喃溶液0.0038mL，以及3.8mmol乙酸溶解在7.2mL的DMF中室温反应3h。然后，向反应混合物加入1.2mol/L的HCl，溶液分层，用氯仿萃取，旋蒸干燥得中间体E-2，产率为85％：
中间体E-2的合成表征数据：1H-NMR(CDC13)7.15(d，4H，Ar)，6.93(d，2H，Ar)，6.52(s，4H，Ar)，3.93(s， 4H，NH2)，3.86(s，3H，CH3)，3.81(s，8H，CH2)。
mass spectrum mlecalcd 468.22，found(M-H+)467.26。
(2)中间体F-2的制备
中间体F-2与实施例1中制备的中间体F-1为同一物质。
(3)中间体I’-2的制备
中间体E-2(0.84mmol)，碳酸钾(4.2mmol)溶于乙腈中，搅拌2h然后加入中间体F-2(0.7mmol)，80℃回流5天，真空泵除去溶剂，将固体物质用1：1(V:V)的乙醇-水混合液溶解，悬浊液加热回流过夜，回流温度为 75℃，然后趁热过滤，粗产物溶于50mL氯仿中，然后用滤纸过滤得到清澈的溶液，然后加入40mL的丙酮，晶体析出得中间体I’-2，产率为72％：
中间体I’-2的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)9.88(s，2H，CHO)，7.84-6.50(m，20H，Ar)，4.36(d，12H， PhOCH2CH2OPh)，3.81(s，16H，CH2)，3.76(s，6H，OCH3)，3.72(s，6H，CH2)，2.16(m，4H，NH2)。
mass spectrum mlecElcd 1040.60，found(M-H+)1041.21。
(4)双杯[4]芳烃衍生物I-2、双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2的制备
中间体I’-2溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸(TFA)反应2h即得双杯[4]芳烃衍生物I-2，氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入EuCl3和脱水脱氧处理过的乙腈，在80℃下回流半个小时后，往该白色悬浊液中滴加双杯[4]芳烃衍生物I-2的乙腈溶液，，EuCl3和化合物I-2的摩尔比为1.5:1，反应5h。反应结束后冷却反应溶液，过滤，HPLC分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2：
实施例4
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物II-2的合成方法：
以中间体E-2、中间体E’-2(式E’-2所示的中间体与式E-1所示的中间体为同一物质)和TsO-CH2-CH2-OsT合成中间体I’-2，中间体I’-2氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-2，双杯[4]芳烃衍生物I-2络合稀土金属离子Eu3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2，合成路线为：
(1)中间体E-2的制备
合成过程同实施例3的中间体E-2的合成。
(2)中间体E’-2的制备
合成过程同实施例1的中间体E-1的制备过程。
(3)中间体I’-2的制备
将中间体E-2(1.2mmol)、中间体E’-2(0.8mmol)和K2CO3(5mmol)溶于甲苯中，然后加入TsO-CH2-CH2-OsT (1mmol)，在氮气保护下，在120℃温度下回流2h，然后加入一定量的聚乙二醇，再回流2天，冷却，硅胶柱分离得到中间体I’-2，产率为71％：
(3)双杯[4]芳烃衍生物I-2、双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2的制备
中间体I’-2溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸(TFA)反应2.2h即得双杯[4]芳烃衍生物I-2，氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入EuCl3和脱水脱氧处理过的乙腈。在75℃下回流半个小时后，往该白色悬浊液中滴加双杯[4]芳烃衍生物I-2的乙腈溶液，EuCl3和化合物I-2的摩尔比为1.2:1，反应5h。反应结束后冷却反应溶液，过滤，HPLC分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-2与Eu3+的配合物II-2：
实施例5
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其制备方法，双杯[4]芳烃衍生物具有如式I-3所示的分子结构；双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子Eu3+配合得到配合物，其分子结构如式II-3所示：
以中间体E-3和中间体F-3合成中间体I’-3-1，中间体I’-3-1氧化后得到中间体I’-3-2，中间体I’-3-2经水解得到双杯[4]芳烃衍生物I-3，双杯[4]芳烃衍生物I-3络合稀土金属离子Eu3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-3与Eu3+的配合物II-3，合成路线为：
(1)中间体E-3的制备
步骤1：以杯[4]芳烃为反应原料，取杯[4]芳烃(30.0g/70.7mmol)、无水碳酸钾(10.7g/77.4mmol)、对甲基苯磺酸甲酯(26.3g/141.4mmol)，溶于500mL的CH3CN中回流24h，抽干，然后加入500mL的CH2Cl2并加入1mol/L HCl(2×50mL)，盐水50mL，除去溶剂，抽干，干燥后得到产物I-1-1:
步骤2：化合物I-1-1(3.9mmol)溶于200mL的CH2Cl2和2mL的醋酸的混合液中，再加入0.5mL的HNO3，常温反应45min，用150mL饱和的NaHCO3水溶液终止反应，继续搅拌10min，除去溶剂，层析法提纯，得化合物 I-3-1：
步骤3：化合物I-3-1(1.81mmol)溶于30mL的CHCl3中，冷却到-13℃，然后加入Cl2CHOCH3(5.43mmol) 和SnCl4(1.81mmol)，室温搅拌3h,然后用1mol/L的HCl终止反应，继续搅拌20min，然后除去溶剂，层析法纯化得到化合物I-3-2：
步骤4：化合物I-3-2(1.72mmol)，含有1mol/L氟化四丁铵的四氢呋喃溶液0.0038mL，3.8mmol乙酸溶解在 7.2mL的DMF中室温反应3.3h；然后向反应混合物中加入1.2mol/L的HCl，溶液分层，用氯仿萃取，旋蒸干燥，得到化合物I-3-3：
步骤5：将水合肼(8.36mmol)和催化剂Pd/C加到含有0.418mmol化合物I-3-3的乙醇(25mL)溶液中，60℃下反应3h，在N2保护下过滤除去Pd/C催化剂，除去溶剂，纯化得到化合物E-3，产率76％：
(2)中间体F-3的制备
步骤6：对磺酸钠杯[4]芳烃(13.6mol)溶于220mL的乙醚中，加入LiAlH4(11.5mmol)，在0℃反应过夜，往反应液中慢慢加入2mol/L的HCl，析出沉淀，除去乙醚，层析法分离得到化合物I-3-4，产率为84％：
步骤7：在0℃温度下，化合物I-3-4(1.2mmol)溶于25ml的吡啶中，然后加入对甲基苯磺酰氯(14.5mmol)，然后在4℃冰箱中保存4天，溶液倒入250mL2mol/L冰冻的HCl中，有沉淀析出，过滤，收集沉淀，干燥得到中间体F-3：
(3)双杯[4]芳烃衍生物I-3的制备
中间体E-3(1.05mmol)，碳酸钾(5.25mmol)溶于乙腈中，搅拌2h然后加入中间体F-3(0.7mmol)，在72℃下回流5天，真空泵除去溶剂，将固体物质用1：1(V:V)的乙醇-水混合液溶解，悬浊液加热回流过夜，然后趁热过滤，粗产物溶于50mL氯仿中，然后用滤纸过滤得到清澈的溶液，然后加入40mL的丙酮，晶体析出得双杯[4]芳烃衍生物I’-3-1，产率为77％：
步骤8：化合物I’-3-1(1.72mmol)溶于氯仿/丙酮(60ml,1/1,v/v)，冷却到0℃，然后加入H2NSO3H(545mg，5.62 mmol)和NaClO2(342mg，3.78mmol)混合液15mL，室温搅拌18h，除去溶剂，层析法得到化合物I’-3-2，产率为70％：
步骤9：将化合物I’-3-2(1.72mmol)溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸，室温搅拌6h，除去溶剂，干燥，纯化得到化合物I-3：
化合物I-3的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)7.69-7.12(d，16H，Ar)，6.71，6.60(d，4H，OH)，4.36(d，12H， CH2)，3.95(d，8H，CH2)，3.81(m，8H，CH2)，3.75(s，6H，CH3)；
mass spectrum mlecalcd1331.23，found(M-H+)1332.25。
(4)双杯[4]芳烃衍生物I-3与Eu3+的配合物II-3的制备
氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入一定量的EuCl3和脱水脱氧处理过的乙腈，在78℃下回流半个小时后，往该白色悬浊液中滴加双杯[4]芳烃衍生物I-3的乙腈溶液，EuCl3与化合物I-1的摩尔比为1.3:1。反应4h，冷却，过滤，HPLC分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-3与Eu3+的配合物II-3：
实施例6
以中间体E-3、中间体E’-3(式E’-3所示的中间体即为对磺酸钠杯[4]芳烃)和TsO-CH2-CH2-OsT合成双杯[4] 芳烃衍生物I’-3-1，双杯[4]芳烃衍生物I’-3-1氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I’-3-2，化合物I’-3-2水解得到双杯[4] 芳烃衍生物I-3，化合物I-3络合稀土金属离子Eu3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-3与Eu3+的配合物II-3，合成路线为：
(1)中间体E-3的制备
合成过程同实施例5的中间体E-3的合成，式E’-3所示的中间体即为对磺酸钠杯[4]芳烃。
(2)中间体I’-3-1的制备
将中间体E-3(1mmol)、中间体E’-3(1.2mmol)和K2CO3(8mmol)溶于甲苯中，然后加入TsO-CH2-CH2-OsT (1.2mmol)，在氮气保护下，在110℃温度下回流2.5h，然后加入一定量的聚乙二醇，再回流2天，冷却，硅胶柱分离得到中间体I’-3-1，产率为78％：
(4)双杯[4]芳烃衍生物I-3、双杯[4]芳烃衍生物I-3与Eu3+的配合物II-3的制备
合成过程同实施例5。
实施例7
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物及其制备方法，双杯[4]芳烃衍生物具有如式I-4所示的分子结构；双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子Tb3+配合得到配合物，其分子结构如式II-4所示：
以中间体E-4和中间体F-4合成中间体I’-4，中间体I’-4氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-4，双杯[4]芳烃衍生物 I-4络合稀土金属离子Tb3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-4与Tb3+的配合物II-4，合成路线为：
(1)中间体E-4的制备
步骤1：以实施例3的中间体E-2的合成方法制得下述的中间体E-2：
步骤2：将中间体E-2(0.6mmol)溶于50mL的乙腈中，加入适量三氟乙酸，然后加入4-(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)苯甲酸(1.2mmol)，回流12h，除去溶剂，纯化得到中间体E-4：
(2)中间体F-4的制备
中间体F-4等同于式F-2所示的中间体，合成方法见实施例3中的制备方法。
(3)中间体I’-4的制备
将中间体E-4(1.04mmol)和碳酸钾(5.2mmol)溶于乙腈中，搅拌2h然后加入中间体F-4(0.8mmol)，在74℃下回流5天，真空泵除去溶剂，固体用1：1的乙醇-水混合液溶解，悬浊液加热回流过夜，然后趁热过滤，粗产物溶于50mL氯仿中，然后用滤纸过滤得到清澈的溶液，然后加入40mL的丙酮，晶体析出得中间体I’-4，产率为63％：
(4)双杯[4]芳烃衍生物I-4、双杯[4]芳烃衍生物I-4与Tb3+的配合物II-4的制备
中间体I’-4溶于乙腈中，加入适量的三氟乙酸(TFA)室温搅拌反应2h，过滤，除去溶剂，过柱子分离得到双杯[4]芳烃衍生物I-4。双杯[4]芳烃衍生物I-4溶于乙腈中，氩气保护条件下，往脱水脱氧的100mL两口烧瓶中加入一定量的TbCl3和脱水脱氧处理过的乙腈，TbCl3与化合物I-1的摩尔比为1.4:1，在77℃回流半个小时后，冷却，过滤，HPLC分离得到化合物双杯[4]芳烃衍生物I-4的与Tb3+的配合物II-4：
化合物I-4的核磁表征数据：1H-NMR(CDC13)7.98(s,2H,NH)，7.73-7.40(m，28H，Ar)，6.89(m,8H,CH2)， 4.36(d，16H，PhOCH2CH2)，3.81(s，12H，PhCH2)。
实施例8
本实施例提供一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物II-4的合成方法：
以中间体E-4、中间体E’-4(等同于中间体A-1)和TsO-CH2-CH2-OsT合成中间体I’-4，中间体I’-4氧化后得到双杯[4]芳烃衍生物I-4，双杯[4]芳烃衍生物I-4络合稀土金属离子Tb3+，得到双杯[4]芳烃衍生物I-4与Tb3+的配合物II-4，合成路线为：
(1)中间体E-4的制备
合成过程同本实施例7的中间体E-4的合成。
(2)中间体E’-4的制备
中间体E’-4与中间体E-1为同一化合物，合成过程同实施例1。
(3)中间体I’-4的制备
将中间体E-1(1.1mmol)、中间体E’-1(0.8mmol)和K2CO3(6.5mmol)溶于甲苯中，然后加入TsO-CH2-CH2-OsT (0.8mmol)，在氮气保护下，在115℃温度下回流2h，然后加入一定量的聚乙二醇，再回流2天，冷却，硅胶柱分离得到中间体I’-4，产率为64％：
(3)双杯[4]芳烃衍生物I-4、双杯[4]芳烃衍生物I-4与Tb3+的配合物II-2的制备
合成过程同实施例7。
实施例9
本实施例提供一种荧光探针分子，其中，荧光标记物为实施例1中制备的双杯[4]芳烃衍生物与Te3+形成的配合物II-1，生物分子为EGFR抗体(E1282，购于Merck)。
表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是ErbB受体家族的一种，是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，与配体结合激活EGF和TGF (transforming growth factor)激活后，EGFR由单体转化为二聚体后激活它位于细胞内的激酶通路，引导下游(包括MPAK、Akt和JNK通路)的磷酸化，诱导细胞增殖。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR的过表达在恶性肿瘤的发展中起重要作用，肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和胶质细胞瘤等组织中都有EGFR的过度表达。EGFR 的表达程度与肿瘤的发生、发展以及转移具有密切的相关性，在肿瘤的临床诊断和治疗中具有重要意义。
配合物II-1标记的EGFR抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)称取适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和适量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，分别溶于0.01M的PBS缓冲液中，配制得到10mg/mL的NHS溶液和10mg/mL的EDC溶液。
(2)称取5mg的配合物II-1，向其中加入1mL的PBS缓冲液，溶解配合物II-1，得到配合物II-1溶液。
(3)向步骤(2)中制得的配合物II-1溶液中缓慢加入EDC溶液，室温下摇匀反应15min，其中配合物II-1和 EDC使用的质量比为1:2。
(4)向步骤(3)中反应后的溶液中加入NHS溶液，混匀后室温下反应30min，得到活化的配合物II-1，其中配合物II-1和NHS使用的质量比为1:4。
(5)向活化后的配合物II-1溶液中加入30mg/mL的EGFR抗体溶液，配合物II-1与EGFR抗体使用的质量比为20:1，在混匀仪上室温交联反应16小时。
(6)反应结束后，将反应液用0.01M的PBS缓冲液在4℃下透析8h(换液4次)，收集，得到配合物II-1标记的EGFR抗体，-20℃保存。
作为可替代的实施方式，形成荧光探针分子的荧光标记物还可以是II-2～II-51任一所示结构的双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子的配合物。
实验例1
1、实验目的：检测双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子的金属配合物的荧光光谱。
2、实验方法：
(1)在10.0mL容量瓶中加入配合物II-1的二甲基亚砜储备液(10μg/mL，1mL)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl)缓冲溶液(1X10-3mol/L，1mL)和双蒸水(3mL)，用二甲基亚砜溶液稀释至刻度，摇匀，室温放置l0min，移入lcm的石英比色皿(Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司)进行荧光光谱测定。
(2)以步骤(1)中所示的方法，分别测定配合物II-2、II-3和II-4的荧光光谱。
3、实验结果：
图2～图4显示配合物II-1～配合物II-4的荧光光谱检测结果。在受特定波长的光激发后，配合物II-1～配合物II-4 能够产生明显的光吸收，然后发射荧光，其中图2显示配合物II-1的荧光光谱，图3显示配合物II-2的荧光光谱，图4显示配合物II-3的荧光光谱，图5显示配合物II-4的荧光光谱。配合物II-1～配合物II-4的荧光发射的信号稳定，能形成特定峰形的荧光发射谱，且荧光发射峰的峰值高，说明式I所示结构的双杯[4]芳烃衍生物对稀土金属离子中的Tb3+和Eu3+具有高选择性的荧光信号能量传递，从而产生强的荧光信号响应，适于作为荧光染料分子标记核酸、蛋白等生物分子用于生物医学领域的检测。上述配合物II-1～配合物II-4的荧光激发波长和发射波长统计如表1所示：
表1
| 荧光分子 | 激发波长(nm) | 最大荧光发射波长(nm) |
| 配合物II-1 | 298 | 550 |
| 配合物II-2 | 299 | 620 |
| 配合物II-3 | 299 | 620 |
| 配合物II-4 | 298 | 550 |
实验例2
1、实验目的：检测双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物(配合物II-1、配合物II-2、配合物II-3和配合物II-4)的细胞毒性。
2、实验方法：
(1)配制不同浓度的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物
将DU-145细胞株(人前列腺癌细胞)放入96孔板内进行培养。用DMSO(二甲基亚砜)分贝制备40mg/mL的配合物II-1、配合物II-2、配合物II-3和配合物II-4，然后将40mg/mL的配合物II-1～配合物II-4溶液分别用不含血清的高糖DMEM培养液稀释成25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL的溶液，并放在温度为4℃的条件下保存。待96孔板内的细胞贴壁后，分别取10μL上述配好的溶液放于已经含有90μL含血清培养液的96孔板内培养(在孔内的本发明杯芳烃荧光化合物浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、 40μg/mL和80μg/mL)。
(2)细胞培养
DU-145细胞贴壁生长至90～95％即可传代。在超净工作台内，吸弃上述96孔板内的培养液，再用2mL经高压除菌后的PBS(磷酸盐缓冲液)对96孔板内的贴壁细胞进行润洗，然后加入1mL胰蛋白酶(gibco公司生产的0.25％ Trypsin-EDTA)对96孔板内的贴壁细胞进行消化，在显微镜下观察至大部分细胞缩小变后圆后，立刻加入2mL培养液终止消化，然后用离心管吸取15mL经消化后的细胞液并将其放入离心机中，以1000r/min的转速进行离心5分钟。去除上清液后，加入1mL培养液，然后将底部沉淀的细胞打散均匀形成细胞悬液。吸取400μL细胞悬液放入另一培养器皿中进行培养，另外再吸取100μL细胞悬液放于细胞计数板数数，然后对余下500μL细胞悬液进行稀释使其密度达到5.6*104/mL，并将稀释后的细胞悬液接种于3块96孔板(每孔加入90μL细胞悬液)内继续培养。
(3)MTT试验
次日观察96孔板内的细胞生长状况，待细胞贴壁后，分别加入10μL(25μg/mL)、10μL(50μg/mL)、10μL(100μg/mL)、 10μL(200μg/mL)、10μL(400μg/mL)和10μL(800μg/mL)的本发明化合物和不含血清的高糖DMEM培养液于孔内。 MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴盐)溶解于PBS(磷酸盐缓冲液)中形成MTT溶液。培养1、2、3天后，在孔内分别加入10μL(5mg/mL)经过滤除菌的MTT溶液，继续培养4小时后，吸弃孔内废液，每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜)溶液，放置摇床(其林贝尔仪器制造有限公司生产的TS-2摇床)在摆振幅度为70Rpm的条件下摇晃20分钟，最后用酶联免疫检测仪(伯腾仪器公司生产的Epoch系列)在490nm波长处测定光吸收值，记录数据，以双杯[4]芳烃衍生物的金属离子配合物浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标绘制柱状图。
3、实验结果：
图6显示不同浓度的配合物II-1对前列腺癌细胞DU-145生长活性的影响，图7显示不同浓度的配合物II-2对前列腺癌细胞DU-145生长活性的影响，图8显示不同浓度的配合物II-3对前列腺癌细胞DU-145生长活性的影响，图9显示不同浓度的配合物II-4对前列腺癌细胞DU-145生长活性的影响。由图中结果可知，在配合物浓度控制在 10μg/mL以内时，配合物II-1～配合物II-4对细胞生长无明显抑制；在配合物浓度为80μg/mL时，细胞的生长活力仍旧保持在60％以上，说明本发明提供的双杯[4]芳烃衍生物的金属离子配合物的细胞毒性低，适合应用于活体细胞内的检测。
实验例3
1、实验目的：检测双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物II-1偶联EGFR抗体形成的荧光探针在细胞中的荧光成像。
2、实验方法：
(1)在6孔培养板中预置25mm的盖玻片，取对数生长期的DU-145细胞，接种于6孔培养板中，以人胚肾细胞293T作为阴性对照，然后在5％CO2、37℃孵育，培养48h；
(2)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，使用PBS缓冲液轻洗细胞3次，每次5min；
(3)吸去PBS缓冲液，加入4％多聚甲醛(PBS配制)室温固定20分钟；
(4)吸去含4％多聚甲醛的PBS，使用PBS缓冲液轻洗细胞3次，每次5min；
(5)吸去PBS，使用0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；
(6)除去Triton X-100，使用PBS轻洗细胞3次，每次5min；
(6)吸去PBS，在盖玻片上滴加10％体积分数的与EGFR抗体同源的血清(PBS配制)室温封闭半小时；
(7)除去封闭液，不洗，向每张盖玻片中滴加足量的(1:200)体积稀释的配合物II-1标记的EGFR抗体溶液 (1mg/mL)，然后放入湿盒中4℃孵育过夜(或37℃，60min)；
(8)除去配合物II-1标记的EGFR抗体，PBST(1*PBS，含1‰Tween20)浸洗3次，每次5min；
(9)复染核：滴加0.5μg/ml DAPI，避光孵育5min，对标本进行核染；
(10)PBST(1*PBS，含1‰Tween-20)浸洗3次，每次5min；
(11)载玻片上滴一小滴含抗荧光淬灭剂的封片液，将盖玻片从孔中取出，吸水纸吸干多余液体，面朝下盖到封片液上，使其轻轻接触到载玻片上；将玻片置于暗处5min使其晾干，在荧光显微镜下观察并采集图像。
3、实验结果：
图10显示以配合物II-1标记的EGFR抗体检测DU-145细胞和293T中的EGRF表达的结果图。由图10结果可知，在以荧光探针分子(配合物II-1修饰EGFR抗体)孵育后的DU-145细胞后，DU-145细胞中能够检测到明显的绿色荧光，其荧光强度明显强于293T细胞。配合物II-1标记的EGFR抗体对细胞膜的穿透性好，荧光强度高，能够特异性结合癌症细胞内过表达的EGFR蛋白。以配合物II-1作为荧光染料偶联生物分子后具有明显的荧光，配合物II-1偶联生物分子具有荧光成像性好、检测的特异性强和灵敏度高的优势，适于基础科学研究以及临床医学检测等领域。
实验例4
1、实验目的：测定双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物II-1偶联EGFR抗体形成荧光探针分子的检测限。
2、实验方法：
(1)将荧光探针分子固定在酶标板表面
a.选用聚苯乙烯或聚丙烯材料的96孔酶标板，酶标板使用前用PBS缓冲液冲洗，然后将实施例5中制备的荧光探针分子稀释为3～10μg/mL，加入酶标板中；
b.盖上膜板包被4℃，放置6-24小时；然后弃去包被液，用PBST洗涤液洗涤3次，轻拍酶标板使洗涤液甩干；
c.向酶标板的每孔中加入200μl质量分数为1％的BSA封闭液封板，在37℃放置1-2小时；
d.甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，置于4℃保存备用。
(2)将EGFR蛋白用PBS缓冲液配制为不同浓度，分别加入到固定有EGFR蛋白的酶标板的不同孔内，在37℃下孵育两个小时，使其充分结合，然后移去荧光探针溶液，用PBST洗涤3次，使用酶标仪检测不同孔内的荧光强度(仪器条件：激发波长：550nm，扫描范围：200～700nm，PMT Voltage:700V，EXSlit：5.0nm)，以PBS缓冲液作为空白样品溶液。
(3)绘制不同抗体浓度对应EGFR检测荧光光强的线性拟合的标准曲线，以[LoD＝(3X空白值的标准偏差)/ 线性拟合的斜率]来计算检测限(LoD)。
3、实验结果：
EGFR蛋白浓度变化在3.7x 10-1～8.9x 102μg/mL的范围内，能够得到EGFR蛋白浓度对应荧光探针分子检测荧光强度的线性曲线，空白值的标准偏差通过测定10个批次的空白样品溶液进行测定，通过线性曲线得到配合物II-1 标记的EGFR抗体检测EGFR蛋白的检测限如表2所示，荧光探针分子适于检测到最低浓度为2.6x 10-2μg/mL的蛋白分子，探针分子的检测限低、检测的灵敏度高。
表2
| 线性范围(μg/mL) | 相关系数 | 检测限(μg/mL) | |
| 荧光探针分子 | 3.7x 10-1～8.9x 102 | 0.997 | 2.6x 10-2 |
实验例5
1、实验目的：检测双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物(配合物II-1～II-4)在细胞中的荧光稳定性。
2、实验方法：
(1)将DU-145细胞在5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养至对数期；
(2)配合物II-1、配合物II-2、配合物II-3和配合物II-4溶解在二甲基亚砜溶液中使其浓度分别为1mg/mL；
(3)取对数生长期的DU-145细胞，接种于6孔培养板中，细胞培养至覆盖单个培养孔的60％～70％面积；
(4)将培养板中的培养基移除，加入1.0mL，pH＝7.4的灭菌PBS缓冲溶液洗一次。然后在单个的细胞培养孔中分别加入10μl的配合物II-1～II-3溶液和1.9mL的细胞培养基。继续培养细胞，在培养12h、24h和48h时分别取出孵育有配合物II-1～II-4的培养板，将培养孔中的溶液吸出，用PBS缓冲溶液小心清洗三次。而后拍摄荧光照片。
3、实验结果：
图11显示以配合物II-1～II-4进行细胞染色在培养不同时间后细胞内的的荧光强度变化结果。横向第一排从左向右依次显示以配合物II-1培养12h、24h和48h时的荧光成像情况，横向第二排从左向右依次显示以配合物II-2 培养12h、24h和48h时的荧光成像情况，横向第三排从左向右依次显示以配合物II-3培养12h、24h和48h时的荧光成像情况，横向第四排从左向右依次显示以配合物II-4培养12h、24h和48h时的荧光成像情况。由图11结果可知，在以配合物II-1～II-4染色的细胞中，均能检测到明显的细胞内荧光成像，其荧光强度高，且细胞形态并未因配合物的添加而发生发明改变，说明配合物II-1～II-4作为荧光染料分子的荧光量子率高、细胞膜穿透性高，且生物相容性好。随着细胞培养时间的增加，细胞内的荧光强度未发生明显变化，双杯[4]芳烃衍生物与稀土金属离子形成的配合物在48小时内能提供稳定的荧光，其荧光稳定性高、荧光寿命长。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (14)
1.一种双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，其特征在于，具有如式II所示的结构：
其中，M为稀土金属离子；
R1～R8分别独立地选自-H、-NH2、-COOH、-CH2COOH、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-SO3H、-SO3R、-NHCO(CH2)XCOOH、-NO2、-CH2PO(OH)2、 R为碱金属或苯，R1～R8不同时为-H，X为0～3的整数；
A选自-(CH2-CH2)n-、-(CH2OCH2)n-、-CONH(CH2)nNHCO-和n为1～3的整数。
2.根据权利要求1所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，其特征在于，所述稀土金属为铽或铕。
3.根据权利要求2所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，其特征在于，所述双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物选自下述结构：
4.一种权利要求1所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成式E所示的杯[4]芳烃类化合物和式E’所示的杯[4]芳烃类化合物；式E’所示的杯[4]芳烃类化合物经缩合反应，引入-O-A-基团，得到式F’所示的中间体；
其中，R1’～R8’分别独立地选自-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO、-SO3R、-H、-NH2、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-NO2、-CH2PO(OH)2、R为碱金属或苯，X为0～3的整数，R1’～R8’不同时为-H；
TsO-为对甲苯磺酸基；
(2)将式F’所示的中间体溶于第一有机溶剂，加入对甲基苯磺酰氯，在0～4℃下反应，反应结束后将反应溶液倒入酸中，析出沉淀，即为式F所示的杯[4]芳烃类化合物；
(3)将式E所示的杯[4]芳烃类化合物与碱金属盐溶于第二有机溶剂，混匀后加入F所示的杯[4]芳烃类化合物，在70～75℃下回流反应，然后将所述第二有机溶剂更换为第三有机溶剂，继续回流反应，反应结束后过滤，析出滤液中的晶体；
(4)当R1’～R8’不包括-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和-SO3R时，步骤(3)中制得的晶体即为式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
当R1’～R8’中包括至少一个-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和/或-SO3R时，步骤(3)中制得的晶体为式I’所示的中间体，将式I’所示的中间体经过氧化和/或水解后，制得式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
(5)在惰性气体环境下，将稀土金属盐与脱水脱氧处理的第四有机溶剂混合后在75～80℃下回流，然后加入式I所示的双杯[4]芳烃衍生物，继续回流反应，反应结束后冷却反应产物，过滤，分离得到式II所示的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物；
合成路线如下所示：
5.一种权利要求1所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成式E所示的杯[4]芳烃类化合物和式E’所示的杯[4]芳烃类化合物；其中，R1’～R8’分别独立地选自-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO、-SO3R、-H、-NH2、-CONH(CH2)XNH2、-CONH2、-SH、-CH2SH、-NO2、-CH2PO(OH)2、R为碱金属或苯，X为0～3的整数，R1’～R8’不同时为-H；
S2.将式E所示的杯[4]芳烃类化合物、式E’所示的杯[4]芳烃类化合物和碱金属盐混匀，溶于第五有机溶剂，继续加入化合物TsO-A-OsT，在惰性气体保护下，在105-120℃下回流反应，反应结束后冷却反应溶液，柱分离得到反应产物；其中，TsO-为对甲苯磺酸基；
S3.当R1’～R8’不包括-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和-SO3R时，步骤S2中制得的反应产物为式I所示的中间体；
当R1’～R8’中包括至少一个-CHO、-CH2CHO、-NHCO(CH2)XCHO和/或-SO3R时，步骤S2中制得的反应产物为式I’所示的中间体，将式I’所示的中间体经过氧化和/或水解后，制得式I所示的双杯[4]芳烃衍生物；
S4.在惰性气体环境下，将稀土金属盐与脱水脱氧处理的第四有机溶剂混合后在75～80℃下回流，然后加入式I所示的双杯[4]芳烃衍生物，继续回流反应，反应结束后冷却反应产物，过滤，分离得到式II所示的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物；
合成路线如下所示：
6.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为吡啶，所述第二有机溶剂为乙腈，所述第三有机溶剂为乙醇和水以1:1的体积比的混合溶液，所述第四有机溶剂为乙腈，所述碱金属盐为碳酸钾。
7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述第五有机溶剂为甲苯。
8.根据权利要求4或6所述的合成方法，其特征在于，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物与所述式F所示的杯[4]芳烃类化合物的摩尔比为3:2～1:1，所述式I所示的双杯[4]芳烃衍生物与所述稀土金属盐的摩尔比为1:1～2:3，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物与所述碱金属盐的摩尔比为1:5。
9.根据权利要求5或7所述的合成方法，其特征在于，所述式E所示的杯[4]芳烃类化合物、所述式E’所示的杯[4]芳烃类化合物、所述化合物TsO-A-OsT和所述碱金属盐的摩尔比为(2～3)：(2～3)：(2.5～3)：(12.5～20)。
10.权利要求1-3任一项所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物作为荧光染料的用途。
11.一种荧光探针分子，所述荧光探针分子为荧光染料标记的生物分子，其特征在于，所述荧光染料为权利要求1-3任一项所述的双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物，所述生物分子选自氨基酸、多肽、蛋白、核苷酸、寡核苷酸和核酸中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的荧光探针分子，其特征在于，所述核苷酸、寡核苷酸和核酸为氨基修饰的核苷酸、寡核苷酸和核酸。
13.根据权利要求11或12所述的荧光探针分子，其特征在于，所述双杯[4]芳烃衍生物的金属配合物在连接剂的存在下，与所述生物分子的氨基、羧基和巯基中的任一基团相连。
14.根据权利要求13所述的荧光探针分子，其特征在于，所述连接剂为N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺盐、马来酰亚胺、戊二醛或碳二亚胺。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190807 Address after: Science and Technology City kolding road high tech Zone of Suzhou City, Jiangsu Province, No. 88 215163 Applicant after: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences Applicant after: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences Address before: Science and Technology City kolding road high tech Zone of Suzhou City, Jiangsu Province, No. 88 215163 Applicant before: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Science and Technology City kolding road high tech Zone of Suzhou City, Jiangsu Province, No. 88 215163 Applicant after: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology Chinese Academy of Sciences Applicant after: Suzhou Guoke medical technology development (Group) Co., Ltd Address before: Science and Technology City kolding road high tech Zone of Suzhou City, Jiangsu Province, No. 88 215163 Applicant before: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology Chinese Academy of Sciences Applicant before: SUZHOU GUOKE MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |