CN113416196B - 一种苯并噻二唑-tb类化合物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及一类具有优异光学性能的苯并噻二唑-TB衍生物的合成及其在金属离子识别、光动力治疗和生物成像中的应用。
背景技术
光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是一种用光敏药物和激光活化治疗肿瘤等疾病的新方法。与传统方法相比,具有副作用低、微创、没有明显的耐药性、高肿瘤破坏选择性以及易与其他疗法合用等优点。光动力疗法(PDT)在临床研究和治疗上具有较好时空精准性和有效性,已成为临床肿瘤精准治疗的重要新兴手段。随着PDT的快速发展,人们对光敏剂种类的多样性、光敏剂的效率等要求越来越高。针对传统PDT的光敏剂存在的可见吸收、穿透性差等问题,越来越多的新型高效光敏剂被研发出来。但是,基于TB骨架的光敏剂尚处于初级阶段,只有一篇相关报道。
荧光成像具有极高的时间和空间解析度,是了解细胞代谢、观察细胞形态和追踪机体生理变化的有效研究手段,作为检测生命系统中目标分子和生命进程的有力工具已广泛应用到现代医药行业的多个领域,如生物技术、临床诊断等。而荧光材料的光学性能在细胞或活体荧光成像应用中起着至关重要的作用。
细胞内黏度是化学信号传递、生物分子间相互作用和物质交换的重要影响因素,可作为某些疾病诊断的参考指标,如阿尔兹海默症、细胞恶性肿瘤、动脉粥样硬化等,因此,检测细胞水平的黏度变化对维持正常生命活动十分重要。荧光探针因具有使用方便、灵敏度高、响应速度快等优点,被广泛应用于检测细胞黏度的变化。
2,1,3-苯并噻二唑(BTD)是一种具有平面芳香性的含氮、硫原子的缺电子基团,其π-平面拓展有利于增强A和D之间的电子流动,同时增加分子间相互作用,并提供良好有序的晶体结构。BTD作为电子受体可使材料保持较高的发光效率;具有较大的T2-T1能极差,可降低三线态激子内转换速率,调节能隙,光学性能优异;易于进行结构修饰,在荧光探针、离子识别、有机发光二极管、太阳能电池等领域有广泛应用。
因此,本发明通过在TB骨架上引入苯并噻二唑基团,设计、合成了三种苯并噻二唑-TB类化合物,并将其应用于金属离子的识别、光动力治疗和生物成像等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种苯并噻二唑-TB类化合物及其合成方法和应用,通过在TB骨架上引入苯并噻二唑基团,设计、合成了苯并噻二唑-base类化合物,并将其应用于金属离子的识别、光动力治疗和生物成像等领域。
一种苯并噻二唑-TB类化合物,其结构通式如式A所示:
其中,R为氢、烷氧基、羟基、烷基的一种。
优选的,所述苯并噻二唑-TB类化合物的结构式为以下的一种:
一种苯并噻二唑-TB类化合物的合成方法,包括以下步骤:
(1)化合物1或2与多聚甲醛反应得到中间体3或4,反应式如下:
(2)中间体3或4与硼酸三甲酯反应得到中间体5或6,反应式如下:
(3)中间体5或6与2,7-二溴-苯并噻二唑(7)通过偶联反应得到化合物8或9,反应式如下:
(4)化合物9水解得到化合物10,反应式如下:
所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为光动力治疗光敏剂的应用。
所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为荧光材料在生物成像中的应用。
所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为Fe3+荧光探针在金属离子识别中的应用。
(1)合成方法简单,后处理方便;
(2)具有大的Stokes位移,表现出优异的发光性能,具有优异的固态发光,有成为优异的OLED材料的潜能;
(3)具有广泛的pH适用范围,可应用于人生理环境中;
(4)对黏度有效好的响应,有成为黏度响应的荧光探针的可能;
(5)对Fe3+具有识别能力,有望成为优异的Fe3+荧光探针;
(6)具有较好的PDT效果,且可对A549细胞进行染色成像,拓展了光敏剂的种类,为合成成像引导的PDT的光敏剂提供了新思路。
附图说明
图1是实施例中产物化合物8的1H NMR谱图;
图2是实施例中产物化合物8的13C NMR谱图;
图3是实施例中产物化合物9的1H NMR谱图;
图4是实施例中产物化合物9的13C NMR谱图;
图5是实施例中产物化合物10的1H NMR谱图;
图6是实施例中产物化合物10的13C NMR谱图;
图7a是化合物8在不同溶剂中的紫外吸收光谱;
图7b是化合物8在不同溶剂中的荧光发射光谱;
图7c是化合物9在不同溶剂中的紫外吸收光谱;
图7d是化合物9在不同溶剂中的荧光发射光谱;
图7e是化合物10在不同溶剂中的紫外吸收光谱;
图7f是化合物10在不同溶剂中的荧光发射光谱;
图8是化合物9在不同黏度下的荧光发射光谱(a)和折线图(b);
图9是化合物9在不同pH下的荧光发射光谱(a)和折线图(b);
图10是不同浓度Fe3+存在下化合物9的荧光发射光谱(a)和折线图(b);
图11是不同浓度Fe3+存在下化合物9的荧光发射光谱(a)和标准曲线(b);
图12是化合物9-Fe3+体系的Job’s曲线;
图13是化合物9与Fe3+可能的配位模式;
图14是无光照(L-)和光照(L+)下9对A549细胞的荧光显微镜图。
具体实施方式
其中,R为氢、烷氧基、羟基、烷基的一种。
表1通式A所示化合物的示例化合物
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例式示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。
实施例
本实施例中,以对溴苯胺、多聚甲醛、正丁基锂、4,7-二溴-苯并噻二唑等为原料通过偶联反应制得。包括以下步骤:
化合物1或2与多聚甲醛反应得到中间体3或4,中间体3或4与硼酸三甲酯反应得到中间体5或6,中间体5或6与2,7-二溴-苯并噻二唑(7)通过偶联反应得到化合物8或9,9进一步水解得到化合物10。
通过上述合成方法,制备一下实施例的化合物:
(1)将4-溴苯胺1(50.0mmol)和多聚甲醛(100.0mmol)依次加入200.0mL圆底烧瓶中,置于低温槽中调温至-15℃,搅拌下向烧瓶内缓慢滴加三氟乙酸(100.0mL,约30min滴加完毕)后,室温下反应7天。反应完全后(TLC追踪),将混合物倒入冰水中,氨水调节pH=9-10,冷却至室温,二氯甲烷萃取(50.0mL×3),旋干得粗产物。加入丙酮,加热至粗产物全部溶解,室温下重结晶,抽滤,丙酮洗涤,得中间体3。
(2)将4-溴-3-甲氧基苯胺2(50.0mmol)和多聚甲醛(100.0mmol)依次加入200.0mL圆底烧瓶中,置于低温槽中调温至-15℃,搅拌下向烧瓶内缓慢滴加三氟乙酸(100.0mL,约30min滴加完毕)后,室温下反应7天。反应完全后(TLC追踪),将混合物倒入冰水中,氨水调节pH=9-10,冷却至室温,抽滤,乙醇洗涤三次,得中间体4。
方程式1TB-Br和TB-OCH3-Br的合成
(3)将3或4(5.0mmol)加入100mL圆底烧瓶内,抽换气三次后,置于低温槽中调温至-78℃,搅拌下向烧瓶内加入20.0mL无水四氢呋喃,滴加2.5mL正丁基锂,在氩气保护下反应1h后滴加0.6mL硼酸三甲酯,之后置于室温下反应4h。TLC追踪至反应完全后,二氯甲烷萃取(30.0mL×3),旋干得粗产物。粗产物经柱层析提纯(VPE:VEA=5:1)得中间体5(65%)或6(70%)。
方程式2中间体5和6的合成
(4)取5或6(2.0mmol)、4,7-二溴-苯并噻二唑7(4.8mmol)、四(三苯基磷)钯(20%mmol,0.06g)依次加入100mL圆底烧瓶中,氩气保护下加入35.0mL无水甲苯,然后加入碳酸钾(0.53g),108℃反应12h。反应完全后(TLC追踪),冷却至室温,二氯甲烷萃取(10.0mL×3),有机相用无水硫酸钠干燥,旋干得粗产物,粗产物经柱层析提纯(VDCM:VEA=100:1)得化合物8(65%)或9(70%)。
2,8-双(7-溴苯并[c][1,2,5]噻二唑-4-基)-6H,12H-5,11-二苯并[b,f][1,5]二氮芳辛(8)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J=7.6Hz,2H,Ar-H),7.75(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),7.53(s,2H,Ar-H),7.48(d,J=7.6Hz,2H,Ar-H),7.40(d,J=8.0Hz,2H,Ar-H),4.93(d,J=16.4Hz,2H,-CH2-bridge),4.51-4.40(m,4H,TB-CH2*2).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ153.9,153.1,132.4,128.7,128.1,127.9,125.5,66.9,58.6,29.8.
7,7'-(3,9-二甲氧基-6H,12H-5,11-二苯并[b,f][1,5]二氮芳辛-2,8-二基)双(4-溴苯并[c][1,2,5]噻二唑)(9)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.40(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.02(s,1H,Ar-H),6.85-6.61(m,5H,Ar-H),4.73-4.68(m,2H,-CH2-bridge),4.32-4.18(m,4H,TB-CH2*2),3.73(d,J=8.8Hz,6H,-OCH3*2).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ159.1,156.3,153.9,153.4,149.7,149.0,132.0,131.2,130.2,129.7,127.8,122.2,120.0,119.8,112.8,111.3,109.6,107.9,66.8,58.2,58.1,55.8,55.4.
方程式3化合物8和9的合成
(5)取化合物9(2.0mmol)于50mL圆底烧瓶中,抽换气三次后,置于低温槽中调至-15℃,加入15.0mL无水二氯甲烷,然后滴加三溴化硼,滴加结束后,将反应瓶移至室温,在氩气保护下继续反应12h。反应完全后(TLC追踪),加水淬灭,二氯甲烷萃取(10.0mL×3),有机相用无水硫酸钠干燥,旋干后得化合物10(75%)。
方程式4化合物10的合成
2,8-双(7-溴苯并[c][1,2,5]噻二唑-4-基)-6H,12H-5,11-二苯并[b,f][1,5]二氮芳辛-3,9-二醇(10)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.58(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.22(s,1H,Ar-H),7.03(d,J=8.4Hz 1H,Ar-H),6.96(s,1H,Ar-H),6.79-6.71(m,3H,Ar-H),4.88-4.80(m,4H,TB-CH2*2),4.32(dd,J1=6.0Hz,J2=16.0Hz,2H,-CH2-bridge).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ157.6,155.1,153.7,153.1,132.7,130.8,130.7,130.4,128.9,112.4,111.3,110.7,66.3,56.9
光学性能测试
测试了本发明化合物的溶剂化效应,具体试验方案如下:
将化合物8,9和10分别用二氯甲烷(DCM),四氢呋喃(THF),甲醇(MeOH),乙腈(MeCN),二甲亚砜(DMSO),甲苯(Toluene),N,N-二甲基甲酰胺(DMF),正己烷(n-Hexane)八种溶剂将其配制成浓度为1×10-5mol/L的工作液,并测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱。如图7a-图7f所示。
从图7a-图7f可看出,化合物A在中小极性溶剂中的相对荧光强度较强,且λem发生明显的红移,在大极性溶剂则发生蓝移。其紫外吸收峰出现在290nm左右,归属于芳环上π-π*跃迁导致的B带吸收;其在390nm处的紫外吸收归属于杂原子上n-π*跃迁导致的R带吸收。
测试了化合物在DCM溶液中的紫外吸收和荧光发射光谱及其固态荧光发射光谱,具体试验方案如下:
称取10-5mol的化合物3,4,5,6,7,8,9和10,用DCM溶液定容至浓度为1×10-5mol/L,测试其紫外吸收、荧光发射及固态荧光发射光谱。
3、4、7、8、9和10的光谱数据如表2所示。
由表2可知,10具有最大的摩尔吸光系数,可能是因为其取代基为羟基,电子云密度最大,最易在光激发下发生跃迁;另外,羟基易与邻近的噻二唑杂环形成分子内螯合氢键,使分子刚性增加、电子共轭程度提高。9的取代基为甲氧基,具有一定吸电子诱导效应,因此其吸光度小于取代基为羟基的10。
相比于原料3、4和7,产物8-10的吸光度均有增强,说明与TB骨架相连后,化合物的电子云密度得到提高。
表2化合物3、4、7、8、9和10的光谱数据(DCM)
a溶液中紫外吸收波长(狭缝为2.5/5nm);b摩尔消光系数ε=A/bC,单位为1×105L·mol-1·cm-1;c溶液中荧光发射波长;d溶液中Stokes位移;e相对荧光量子产率(参比:硫酸奎宁);f荧光亮度,单位为L·mol-1·cm-1;g固态激发波长(狭缝为2.5/2.5nm);h固态荧光发射波长;i固态Stokes位移。”-”表示强度过低无法测试。
与原料4和7相比,产物的荧光性质具有以下变化:
(1)化合物8-10的溶液及固态λem均发生明显红移,溶液及固态Stokes位移明显增大;
(2)化合物8和9溶液相对荧光量子产率明显增加,发光亮度明显增强;
(3)化合物10的溶液相对荧光量子产率和发光亮度变化不明显。
这可能是由于化合物8和9具有高度扭曲结构,使其亚分子原子团旋转受阻(RIR机理),进而增强了固态发光强度;而化合物10在固态下形成了分子内氢键,引起了OH-O伸缩振动,增加了非辐射效率,导致固态荧光发射较弱。
以上结果说明,将TB骨架上与苯并噻二唑基团结合可放大二者在发光性能上的优势,是获得具有优异发光性能的产物的新途径。
黏度响应测试
以化合物9为例,用甲醇作为溶剂将化合物9配制成浓度为1×10-4mol·L-1的工作溶液。取10个10mL容量瓶,分别加入0-9mL丙三醇,量取1mL工作液于容量瓶中,甲醇定容,使其浓度均为1×10-5mol·L-1,测得荧光发射光谱(甲醇:丙三醇依次为1:9–10:0)(λex=270nm,狭缝:2.5/5nm)(图8)。
由图8可知,随着黏度的增大,化合物9的荧光强度增强。这可能是由于在低黏度中,分子内旋转程度高,荧光强度降低;而随着黏度的升高,亚分子原子团的运动受阻,分子主要以辐射方式释放能量,使荧光强度增加(RIR机理)。该结果说明化合物9具有成为黏度响应荧光探针的潜力。
pH响应测试
以化合物9为例,测试了其对pH的响应情况。用THF作为溶剂将化合物9配制成浓度为1×10-4mol·L-1的工作溶液,分别量取1mL工作液于10mL容量瓶中,随后加入1mL pH值分别为2-10的缓冲溶液(pH为2-8时选取柠檬酸/磷酸氢二钠体系,pH为9-10时选取碳酸氢钠/碳酸钠体系),用THF定容,使其浓度均为1×10-5mol L-1,测得荧光发射光谱(λex=280nm,狭缝:2.5/5nm),如图9。
由图9可以看出,当溶液pH为2-10时,其荧光发射光谱无明显变化,表明9具有广泛的pH适用范围,且可以适用于人生理环境中。
离子检测测试
称取9(0.0071g,1×10-5mol)于100mL容量瓶中,DMSO定容,配制成浓度为1×10- 4mol·L-1的工作液。取10个10mL容量瓶,分别加入1mL浓度为1×10-2mol L-1的Fe3+、Na+、K+、Cu2+、Zr4+、Al3+、PO4 3-、F-、Cys、GSH、Hcy、thioglycol溶液,加入1mL PBS缓冲溶液,再量取1mL工作液于该10mL容量瓶中,DMSO定容,测得荧光发射光谱(λex=280nm,狭缝:5/10nm)。
用上述方法同样测试了10(0.0068g,1×10-5mol)与Fe3+、Na+、K+、Cu2+、Zr4+、Al3+、PO4 3-、F-的荧光发射光谱(λex=290nm,狭缝:5/10nm)。
不加金属离子时化合物9或10溶液的荧光强度记作I0,加入金属离子溶液以后的荧光强度记作I,加入金属离子后化合物荧光强度变化率记作η,则识别效率η=(I-I0)/I0×100%。化合物9和10与不同离子、生物硫醇作用后的荧光强度变化见表3、4。
表3化合物9与不同离子、生物硫醇的作用
a加入金属离子后化合物荧光强度变化率,η=(I-I0)/I0×100%。’”/”表示无。
表4化合物10与不同离子的作用
a加入金属离子后化合物荧光强度变化率,η=(I-I0)/I0×100%。“/”表示无。
由表3、表4可以看出,离子半径与识别效率无相关性。化合物9和10与Fe3+作用后,其λem均发生明显红移,说明化合物9和10与Fe3+可能发生了配位反应。
进一步研究了化合物9对Fe3+的识别:分别依次量取1mL化合物9工作溶液(1×10- 4mol·L-1)、1mL PBS缓冲溶液和7mL DMSO于10mL容量瓶中,再从浓度为1×10-2mol·L-1的Fe3+溶液中分别取不同体积的溶液至该容量瓶中,二次蒸馏水定容,配制成浓度从1×10-6-1×10-3mol·L-1的溶液,来观察其对化合物9的荧光的影响(λex=280nm,狭缝:5/10nm)(图10)。
如图10所示,在Fe3+浓度为5×10-6-2×10-4范围内,化合物9的荧光强度表现出急剧的降低,而当浓度进一步增大,其荧光强度变化缓慢,直至完全淬灭。
随后探究了化合物9-Fe3+体系标准曲线:(图11,R2=1.00),计算了化合物9对Fe3+的检测限(LOD=3δblank/k,其中δblank和k分别为空白溶液的标准偏差和校准曲线的斜率)。LOD为9.6×10-6mol·L-1,说明化合物9具有开发为Fe3+荧光探针的潜力。
为探究9识别Fe3+的原因,在9和Fe3+总浓度不变的条件下,在1:9到9:1的范围内,改变9和Fe3+的摩尔比,测试了各溶液的荧光强度,绘制了Job’s曲线(λex=280nm,狭缝:5/10nm,浓度为1×10-5mol·L-1)(图12)。由图12可以看出,9与Fe3+的摩尔比为3:7时荧光强度表现出拐点,可能是由于9与Fe3+形成了配位比约为1:2的配合物。据此推测9与Fe3+可能的配位模式如图13所示。
细胞毒性测试
以人支气管上皮样(HBE)细胞为模型,采用MTT法检测原料7以及化合物8、9和10对HBE细胞的细胞毒性。将HBE细胞接种在96微孔板中(1×10-5个/mL),每个孔中加入100μL的培养基,在37℃的CO2培养箱中培养24h后,加入不同浓度的化合物7、8、9和10到接种好的细胞中孵育24h。然后用PBS缓冲溶液冲洗微孔板3次,在每个孔中加入10μL的MTT溶液继续培养4h。移除孔内的培养基,在每个孔中加入150μL的DMSO用以溶解细胞内的蓝紫色甲臜(Formazam)晶体,并将其置于摇床上,低速震荡5–7min,使结晶物质充分溶解。最后采用酶联免疫检测仪测量各个孔在560nm和670nm处的吸光度值。细胞毒性通过下列公式计算:
%viability=[∑(Ai/A0×100)/n]
式中Ai分别为不同浓度化合物的吸光度值;A0为无添加化合物的对照孔的平均吸光度值;n(=3)表示三次平行实验。
采用MTT法检测化合物9对人支气管上皮(HBE)细胞的生物毒性以及对人非小肺癌(A549)细胞的暗毒性和光毒性。光源为423nm,对照组不进行光照处理,并采用酶联免疫检测仪测量各个孔在560nm和670nm处的吸光度值。
表5化合物9对两种细胞的半数抑制率(IC50)
化合物9对HBE和A549细胞的半数抑制率如表5所示,结果表明,化合物9对A549细胞具有极低的暗毒性和较高的光毒性,PDT效率高,但对HBE细胞的光毒性也很高,需要进行进一步结构修饰以降低其光毒性。
细胞成像测试
将A549细胞接种到96微孔板中培养24h。随后细胞用不同浓度(6.25、12.50μmol/L)的化合物9再培养24h后,一半进行光照2h,一半不光照。将培养基换成含有钙黄绿素(CA,100μg/mL)的培养基进一步培养24h,以染色活细胞和死细胞。接着用PBS缓冲溶液冲洗微孔板3次,加入MTT溶液继续培养4h。移除培养基后加入DMSO,并将其低速震荡5-7min。最后,使用荧光显微镜分析细胞。
通过活/死细胞染色直接观察了产物9对A549细胞的体外光动力治疗效果(图14)。活细胞可被钙黄绿素(CA)染色为绿色信号。
如图14所示,未经化合物9处理的A549细胞(control组)在光照前和光照后形态没有明显变化。在没有光照的情况下,经浓度分别为6.25和12.50μmol·L-1的化合物9处理的黑暗组均未引起明显的细胞死亡,这表明化合物9没有暗毒性;在有光照的情况下,在经两种浓度的化合物9处理后的荧光显微镜图中都观察到了明显的细胞死亡,细胞形态遭到破坏,仅可观察到化合物9本身的黄绿色发光,表明化合物9对A549细胞具有较好的光毒性,这与体外光动力治疗实验分析中的结果相互印证。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
3.权利要求1所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为光动力治疗光敏剂的应用。
4.权利要求1所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为荧光材料在生物成像中的应用。
5.权利要求1所述的苯并噻二唑-TB类化合物作为Fe3+荧光探针在金属离子识别中的应用。
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