CN115869308B - 一种小分子化合物在制备抗结直肠癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小分子化合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。本发明的一种小分子化合物和/或其药学上可接受的衍生物可以有效抑制结直肠癌细胞体内外增殖，有望制备天然抗肿瘤小分子的药物应用于对结直肠癌的治疗；并且该小分子对于USP4有良好的抑制作用，可以作为USP4抑制剂。该小分子和/或其药学上可接受的衍生物与奥沙利铂联用还具有协同增强结直肠癌治疗效果的作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及一种小分子化合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
恶性实体肿瘤一直以来是威胁人类生命健康的疾病。结直肠癌是发生率和死亡率高居前三的恶性实体肿瘤。结直肠癌早期症状不明显，例如大部分结直肠癌患者在初诊时癌细胞已扩散和转移，为临床诊治带来了极大的挑战。因此寻找有效性强、安全性佳的治疗手段对延长患癌患者生存期、改善生活质量具有重要意义。目前，对于结直肠癌的治疗策略仍然是优先考虑行根治性手术治疗，放疗和化疗为辅，然而由于结直肠癌具有发展快、难发现以及手术根治不完全等因素，导致了扩散和转移，此时化疗将作为主要手段用于治疗。随着近年来靶向药物的开发，展示出了良好的疗效和安全性，因此靶向药物也被用于临床治疗。例如HER2单抗被用于HER2阳性的转移性胃癌患者以及乳腺癌患者，而在HER2阴性PD-L1CPS≥5的患者中，PD-1单抗联合细胞毒性药物被用于一线治疗。尽管靶向药物的使用提高了一线治疗的效果和安全性，然而靶向治疗受限于靶标状态、个体遗传背景等因素导致适用人群并不广泛；传统细胞毒性化疗药物由于在杀伤肿瘤细胞的同时也能对正常细胞造成一定程度的损伤，会引起严重的毒副作用，因此在很大程度上限制了其使用。因此针对于结直肠癌寻找安全性佳、疗效好的靶向或广谱抗癌药物具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种小分子化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，该小分子化合物可有效抑制结直肠癌细胞的体内外增殖能力。
本发明的第二个方面提出了一种USP4抑制剂。
根据本发明的第一个方面，提出了式(I)所示化合物和/或其药学上可接受的衍生物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用：
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)结构的化合物的CAS号为956941-31-4。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的衍生物的有效浓度为10μM～60μM。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的衍生物为可以体内水解得到与式(I)具有相同或相近药学活性的衍生物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药学上可接受的衍生物选自式(I)的药用盐、药用酯、药用醚、药用酰胺、糖基化物中的一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、赋形剂、填充剂中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物和/或其药学上可接受的衍生物作为所述药物的活性物质。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物中的活性物质还包括奥沙利铂。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物和/或其药学上可接受的衍生物作为所述药物的唯一活性物质。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物和/或其药学上可接受的衍生物通过抑制泛素特异肽酶4(USP4)发挥作用。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述药物为外用制剂。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述外用制剂选自栓剂或灌肠剂。
根据本发明的第二个方面，提出了一种USP4抑制剂，包括第一方面所述的式(I)结构的化合物和/或其药学上可接受的衍生物。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂中，式(I)结构的化合物或其药学上可接受的衍生物的有效浓度为0.2nM～10nM。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物或其药学上可接受的衍生物作为所述USP4抑制剂的活性成分。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物或其药学上可接受的衍生物抑制USP4已知下游蛋白Twist1的表达水平。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物或其药学上可接受的衍生物抑制USP4已知下游蛋白beta-catenin的表达水平。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述式(I)结构的化合物或其药学上可接受的衍生物作为所述USP4抑制剂的唯一活性成分。
本发明的有益效果为：
本发明的小分子化合物和/或其药学上可接受的衍生物可以有效抑制结直肠癌细胞体内外增殖，有望作为天然抗肿瘤小分子药物应用于对结直肠癌的治疗；对于USP4有良好的抑制作用，可以作为USP4抑制剂。本发明小分子化合物与奥沙利铂联用，具有协同增强结直肠癌治疗效果的作用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为不同浓度式(I)化合物对结直肠癌细胞株的抑制情况；
图2为衍生物1，2，3号的化学结构图；
图3中A是衍生物1，2，3号分子对LoVo细胞的细胞增殖与剂量浓度关系结果图；B是衍生物1，2，3号分子对SW480细胞的细胞增殖与剂量浓度关系结果图；
图4为式(I)化合物在体外3D培养环境下对结直肠癌细胞株生长的抑制情况；
图5是式(I)化合物在体外对结直肠癌细胞株肿瘤干性标记物的抑制情况；
图6是式(I)化合物在体内对结直肠癌肿瘤的抑制情况；
图7是式(I)化合物对小鼠体重的影响；
图8是式(I)化合物与其靶点USP4的结合亲和力检测；
图9是式(I)化合物对USP4已知下游蛋白Twist1和beta-catenin的表达水平抑制结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。本说明书中的实验结果统计学差异均通过Graphpad prism 8软件完成。非配对双尾Student’t检验被用于评估两组之间的显著性差异，p值小于0.05被认为具有统计学差异。为了简便起见，以下用编号U4-I05名称代替式(I)化合物，其化学式为C29H26N2O6，名称为(1S,5R)-3-(2-((4-(4-methoxyphenyl)-2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)acetyl)-3,4,5,6-tetrahydro-1H-1,5-methanopyrido[1,2-a][1,5]diazocin-8(2H)-one，CAS号为956941-31-4。
1.细胞培养
结直肠癌细胞株SW620、SW480、LoVo来源于ATCC。培养细胞所用的培养基购自于Gibco公司，胎牛血清购自ExCell Bio公司。细胞株是通过含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养，培养环境为37℃、5％ CO2的培养箱，取生长状态良好的细胞进行后续实验。
2.细胞增殖实验-浓度梯度
将U4-I05以及衍生物1，2，3号(结构式如图2所示)小分子化合物分别溶解于DMSO配制为10mM母液。待上述SW480和LoVo细胞株生长至80％汇合度，使用0.05％胰蛋白酶消化，RPMI-1640完全培养基重悬，计数，接种于96孔板中，每孔1500个细胞，使用100μL上述含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。待细胞单层贴壁后，分别加入U4-I05和衍生物1，2，3号小分子化合物母液，使其终浓度均分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100、200μM。同时设空白孔和100％细胞培养基孔作对照，每个药物浓度设3个复孔，将培养板放回37℃、5％CO2培养箱。培养48h后加入10μL的MTT溶液，继续在培养箱中孵育4h，吸掉上清，加入150μL的DMSO，培养箱孵育10min，用全自动酶标仪在490nm测定吸光度(OD值)。根据各孔的OD值，采用以下公式分别计算U4-I05以及衍生物1，2，3号对细胞的抑制率：抑制率％＝[(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100％，细胞存活率％＝(1-抑制率％)×100％。采用Graphpad prism 8软件进行非线性拟合并绘制抑制曲线和计算半数致死剂量(IC50)，实验结果如图1、3所示。
结果分析：从图1可以看出，U4-I05对结直肠癌细胞株的杀伤具有剂量依赖性，并且其对癌细胞的抑制作用具有阈值效应，剂量处于0.001μM～10μM之间时，对肿瘤细胞没有抑制效果，而剂量处于10μM～100μM时，表现出了明显的细胞抑制作用。通过计算得到了U4-I05对LoVo(人结肠癌贴壁细胞)和SW480(人结肠癌细胞)的IC50分别是58.26μM和34.03μM。
从图3可以看出衍生物1，2，3号对结直肠癌细胞株的杀伤具有剂量依赖性，并且其对癌细胞的抑制作用具有阈值效应，衍生物1剂量处于0.001μM～1μM之间时，对肿瘤细胞没有抑制效果，而剂量处于1μM～100μM时，表现出了明显的细胞抑制作用；衍生物2剂量处于0.001μM～0.1μM，对肿瘤细胞没有抑制效果，而剂量处于0.1μM～100μM时，表现出了明显的细胞抑制作用；衍生物3剂量处于0.001μM～1μM，对肿瘤细胞没有抑制效果，而剂量处于1μM～100μM时，表现出了明显的细胞抑制作用。
3.3D肿瘤球抑制实验
体外3D肿瘤球培养是检测肿瘤细胞自我更新能力的标准方法，具体步骤为：待细胞株生长至80％汇合度，使用0.05％胰蛋白酶消化，加入3D培养基(DMEM/F12＝1:1(V/V)，3D培养基中还含有终浓度为20ng/mL的表皮细胞生长因子EGF，1×B27培养基，20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子bFGF)重悬，计数，接种于超低吸附6孔板中，每孔20000个细胞，使用2mL的3D培养基培养，24h后，对照组为加入等体积的DMSO，处理组加入终浓度为10μM的U4-I05溶液。对照组和处理组均设3个复孔，将培养板放回37℃、5％CO2培养箱。培养7天后将培养板取出，使用倒置显微镜进行拍照并统计直径大于50μm的肿瘤球数量。实验结果如图4所示，A为LoVo细胞在DMSO或U4-I05处理下的肿瘤球生长代表图(比例尺＝100μm)；B为LoVo细胞在DMSO或U4-I05处理下的肿瘤球数量定量统计图；C为SW620细胞在DMSO或U4-I05处理下的肿瘤球生长代表图(比例尺＝100μm)；D为SW620细胞在DMSO或U4-I05处理下的肿瘤球数量定量统计图。
结果分析：由图4中A和C图可分别看到LoVo和SW620细胞在溶剂(DMSO)或U4-I05处理下的肿瘤球形成情况。该实验结果表明U4-I05(10μM)处理下可导致LoVo和SW620结直肠癌细胞株的体外自我更新能力受到显著抑制，提示U4-I05具有抑制结直肠癌发生和发展的功效。*代表t假设检验中p值小于0.05；**代表t假设检验中p值小于0.01，标尺代表100μm。
4.流式细胞分析
肿瘤细胞干性标志物的表达是反应肿瘤细胞自我更新能力强弱的重要方法，具体步骤为：将适量细胞株铺设至6孔板中，待细胞株生长至70％汇合度，处理组加入终浓度为10μM的U4-I05溶液，对照组加入等体积DMSO，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h。使用0.05％胰蛋白酶消化，RPMI-1640完全培养基重悬，室温1000rpm离心4min，使用PBS重悬一次，再次在室温1000rpm离心4min，再次使用PBS重悬，进行细胞计数，加入FITC-CD44(FITC偶联的CD44抗体)、APC-EpCAM、PE-Lgr5抗体(2uL/1×106细胞)于冰上孵育半小时，同时设置无抗体的空白对照。孵育完成后，室温1000rpm离心4min，去除上清，使用PBS重悬后再次离心，最后加入500uL预冷的PBS溶液重悬，使用流式细胞分析仪进行检测。每组含有3个生物学重复，3次技术重复，实验结果如图5所示，A为流式细胞术检测LoVo细胞在DMSO处理下的CD44，EpCAM，Lgr5阳性细胞比例；B为流式细胞术检测LoVo细胞在U4-I05处理下的CD44，EpCAM，Lgr5阳性细胞比例；C为LoVo细胞在DMSO或U4-I05处理下的CD44，EpCAM，Lgr5三阳性细胞比值的定量统计图；D为流式细胞术检测SW620细胞在DMSO处理下的CD44，EpCAM，Lgr5阳性细胞比例；E为流式细胞术检测SW620细胞在U4-I05处理下的CD44，EpCAM，Lgr5阳性细胞比例；F为SW620细胞在DMSO或U4-I05处理下的CD44，EpCAM，Lgr5三阳性细胞比值的定量统计图。*代表t假设检验中p值小于0.05；***代表t假设检验中p值小于0.001。
结果分析：实验结果显示U4-I05在10μM浓度下处理12h可显著降低LoVo、SW620结直肠癌肿瘤细胞干性标志蛋白CD44，EpCAM，Lgr5的表达，U4-I05可显著抑制CD44、EpCAM、LGR5三阳性细胞的含量，提示U4-I05具有抑制肿瘤细胞自我更新能力的作用。
5.体内肿瘤增殖实验
为验证U4-I05的体内抗肿瘤活性，使用BALB/c免疫缺陷型小鼠建立了SW620细胞来源的异种皮下瘤移植模型，并通过注射药物观测肿瘤的生长情况，具体步骤为：将处于指数生长期的5×106SW620细胞重悬于100μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中注射于免疫缺陷型小鼠颈后皮下，待肿瘤生长至约100mm3，腹腔分别注射溶剂(DMSO)，6mg/kg(一次)奥沙利铂，15mg/kg的U4-I05(每天一次，持续5天)，以及奥沙利铂和U4-I05联合治疗(奥沙利铂：6mg/kg一次，第一天；U4-I05：15mg/kg每天一次，持续5天)，用药后第0天、第5天、第12天测量肿瘤体积和小鼠体重。并于实验终点取出肿瘤组织，拍照、测量体积，每组6只小鼠，肿瘤体积生长曲线采用Two-way ANOVA统计分析，实验结果如图6所示，A为肿瘤体积随给药后时间变化的统计曲线；B为第12天取出肿瘤后拍照与肿瘤质量统计柱状图。*代表t假设检验中p值小于0.05，**代表t假设检验中p值小于0.01，***代表t假设检验中p值小于0.001。
结果分析：如图6结果显示，生长曲线和实验终点的肿瘤质量结果显示，U4-I05和奥沙利铂都可显著抑制体内肿瘤生长，相对于溶剂组(vehicle)，U4-I05可显著抑制肿瘤的生长，另外相对于单用奥沙利铂(Oxaliplatin)治疗，U4-I05联合奥沙利铂治疗具有显著更强的抗肿瘤生长的疗效，也就是说U4-I05联合奥沙利铂具有显著更佳的疗效。于实验终点(即给药后12天)将肿瘤解剖出后进行称重，结果显示U4-I05和奥沙利铂都可显著抑制体内肿瘤生长，U4-I05联合奥沙利铂具有显著更佳的疗效。
6.体内安全性评估
为检测U4-I05的体内安全性，在药物治疗前后测量了上述通过U4-I05，奥沙利铂，U4-I05联用奥沙利铂治疗的BALB/c免疫缺陷型小鼠的体重：用药后第0天、第5天、第12天称量分别使用U4-I05、奥沙利铂(对照组)、U4-I05联合奥沙利铂治疗的BALB/c免疫缺陷型小鼠体重并绘制体重时间曲线，每组有6只小鼠，实验结果如图7所示。
结果分析：从图7可看出，对照组和药物治疗组体重均无明显变化，相对于溶剂组(vehicle)，U4-I05不会引起小鼠体重显著性的改变，说明U4-I05具有较好的体内安全性，具有良好的应用潜能。
7.靶点亲和力检测
生物膜干涉实验检测，将原核表达纯化后的His标签融合的USP4活性结构域(296位氨基酸-490位氨基酸)截短子重组蛋白USP4296-490进行生物素化，具体步骤为将1：1000比例的生物素(21312，Thermo)与USP4296-490混合并放置于冰上孵育1小时，并使用脱盐柱(Cytiva17-1408-01)除去未结合的生物素，使用Octet Red System(Fortebio)生物膜干涉仪器，将生物素化USP4296-490装载至链霉素探针(18-5057，Fortebio)，并设置双扣除对照(设置空白缓冲液和仅含有生物素的孔作为对照，最终实验结果为生物素化USP4296-490与U4-I05所在的样品孔中的数值减去两个对照的数值，即为双扣除对照)，将得到的数据绘制为时间相关曲线，实验结果如图8所示。
结果分析：U4-I05与USP4的解离系数为2.39×10-7M，即239nM，解离系数误差为4.03×10-8M即40.3nM，这说明U4-I05与预期靶点USP4活性结构域具有较好的结合能力。
8.免疫印迹检测蛋白表达量
Twist1是USP4的直接结合下游靶点，USP4可直接结合Twist1并促进其蛋白稳定性从而增加其蛋白水平，因此，检测U4-I05对USP4下游蛋白Twist1的表达水平抑制作用即可反映出U4-I05对USP4的抑制效果和抑制机理。具体步骤为：将LoVo和SW620(人结肠癌细胞)细胞铺至六孔板，每一个剂量设置1个孔。待细胞汇合度生长至约70％，更换含有0，0.01，0.1，1μM的U4-I05的完全培养基，继续培养48h后，使用0.05％胰蛋白酶消化，RPMI-1640完全培养基重悬，室温1000rpm离心4min，使用PBS重悬一次再次在室温1000rpm离心4分钟，去掉上清收取细胞沉淀并提取和制备蛋白样品液用于蛋白电泳和印迹，使用Twist1抗体(AF4009，Affinity，1：1000)4度孵育12h，孵育完成后使用TBST清洗3次，每次10min，随后使用二抗(1：5000)室温孵育1h并再次使用TBST清洗3次，每次10min后使用凝胶成像系统曝光拍照。实验结果如图9中A所示。
结果分析：该实验结果显示U4-I05可显著降低USP4下游Twist1的蛋白表达水平，其起效剂量浓度低于或等于10nM，结合图6的结果说明U4-I05可直接与USP4的活性结构域结合从而抑制其功能。
9.免疫荧光检测
检测U4-I05对USP4下游蛋白beta-catenin的表达水平抑制作用：将LoVo和SW620细胞铺至24孔板，每一个剂量设置3个孔。待细胞汇合度生长至约70％，更换含有0、0.01、0.1、1μM的U4-I05的完全培养基，继续培养24h后，去掉培养基冰用PBS清洗2次，使用4％冰甲醛固定10min，随后用0.2％Triton X-100孵育10min，PBS清洗2次，使用4％BSA室温封闭1h，加入beta-catenin抗体(66379-1-Ig，Proteintech，1：100)于4度孵育12h。一抗赋予完毕后使用PBS清洗2次，每次10min，然后加入荧光二抗(1：5000)室温避光孵育1h，再次使用PBS清洗2次，每次10min后使用倒置荧光显微镜拍照，使用Image J计算平均荧光强度并绘制曲线，实验结果如图9中B所示。
结果分析：U4-I05化合物可显著抑制beta-catenin的蛋白表达，起效浓度不高于0.01μM(10nM)。在LoVo和SW620细胞中抑制beta-catenin蛋白表达水平的IC50分别为9.706nM和0.2457nM。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (7)
1.式（I）所示化合物和/或其药学上可接受的衍生物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用：
式（I）；
所述药学上可接受的衍生物选自以下衍生物中的一种：
衍生物1号：；
衍生物2号：；
衍生物3号：。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述式（I）所示化合物或其药学上可接受的衍生物的有效浓度为10 μM~60 μM。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中的活性物质为式（I）所示化合物和奥沙利铂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为外用制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外用制剂选自栓剂或灌肠剂。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述式（I）所示化合物和/或其药学上可接受的衍生物通过抑制泛素特异肽酶4发挥作用。
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