JP6321634B2 - 光第二高調波発生化合物、光第二高調波発生色素組成物及び細胞検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な光第二高調波発生化合物、光第二高調波発生色素組成物及びそれを用いた細胞検査方法に関する。

脳機能の理解のためには、まず、その生理機能を観察する必要がある。脳の高次機能を支える神経細胞の情報処理は細胞膜の電位の変化として行われることから、パッチクランプ法の開発以来、細胞膜電位の測定が主としてこれらの電気生理学的手法を用いて行われてきた。

脳組織は多数の神経細胞やグリア細胞が複雑に入り組んだネットワークにより形成され、更に各細胞は非常に複雑な構造をしているため、電気生理学的手法による観察には制約があった。例えば、情報処理の鍵を握ると考えられるスパインやそれを支える細部樹状突起の多くは直径が１ミクロンにも満たない非常に微細な構造をしているため、これらに対してはガラス電極の大きさが問題となり、上記電気生理学的手で観察を行うには適していない。

そのため、電気生理学的手法に換えて光学的手法を用いた膜電位の測定や可視化が試みられている（特許文献１〜５）。これまでに電位感受性色素や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からの蛍光観測を基盤としたイメージング法が多く開発されたが、これらには時間分解能と定量性という二つの大きな問題があった。これらの問題を克服し得るものとして、光第二次高調波発生（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ;ＳＨＧ）イメージングの利用が提案されている（特許文献４、５）。

ＳＨＧは、二つの光子が中心対称性を欠いて存在する物質と相互作用した後、入射光と同じ方向に進み二倍のエネルギーを持つ一つの光子へと変換される二光子現象である。ＳＨＧを利用した観察は、二光子顕微鏡の組織透過性の高い近赤外光を利用することができるため、組織深部の観察に適している。また、蛍光色素を利用した観察において色素が一つの又は二つの光子を吸収して励起され、緩和の後基底状態に戻る際に発する蛍光を利用する場合、原理的に定量的な測定は不可能なのに対し、このＳＨＧイメージングによれば、細胞の形態に依存しない膜電位感受性とそれによる膜電位の定量的な可視化が可能である。また、色素の励起に起因する生体組織へのダメージを防止することができることも利点の一つである。

神経細胞に細胞外から、蛍光用の色素として知られるＦＭ４−６４を導入しそこにフェムト秒レーザーを当てると、蛍光（ＴＰＦ）シグナルに加えて非常に強いＳＨＧシグナルが透過光経路の検出器により検出される（特許文献４）。この方法を採用することにより、遠位樹状突起やスパインのような微細構造も観察することができるようになった。更に、膜電位固定法により細胞体の膜電位を変化させると、それに応じてＳＨＧのシグナルが忠実に変化する事も確かめられた。

特開平０８−１２２３２６号公報 特開平０９−００５２４３号公報 特表平１１−５０８３５５号公報 特開２００４−２１２１３２号公報 特表２０１２−１４０６６号公報

現在のところ、ＳＨＧイメージングに適用できる色素としては上記のＦＭ４−６４を用いたものが最も一般的であるが、この色素は蛍光用として開発されたものであるため、ＳＨＧシグナルのみならず蛍光までも同時に発してしまい、生体組織にダメージを与えるという問題を有している。そのため、観察の際、ＳＨＧシグナルを発するが、ＴＰＦシグナルは抑えられて微弱かあるいは発生しない化合物が求められていた。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞膜に効果的に作用し、ＳＨＧシグナルを発するが、ＴＰＦシグナルの発生は抑えられた化合物及びそれを用いた細胞検査方法を提供すること目的とする。

本発明者らは、特定の化学構造を有す化合物が、細胞膜に効果的に作用し、ＳＨＧシグナルを発するがＴＰＦシグナルは抑えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の第一の態様は、式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体又はその塩である光第二高調波発生化合物である。
（式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に炭素数６〜１２の直鎖状又は分岐状のアルキル基を示し、Ｒ_３からＲ_１８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、アルコシキ基、アリール基、アミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基から選択されるいずれかの置換基を示すが、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_９とＲ_１０、Ｒ_１３とＲ_１４、Ｒ_１７とＲ_１８とは、一緒になって炭素数５〜７の環構造をとってもよい。Ｘは、−Ｎ^＋Ｒ_１９Ｒ_２０Ｒ_２１、スルホニル基、カルボキシル基、−ＯＲ基を示す。ここで、Ｒ_１９、Ｒ_２０、Ｒ_２１はそれぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基を、−ＯＲは末端にアルコキシ基を有する１価のポリアルキレンオキシド基を示す。ただし、ａは０又は１、ｂは０又は１、ｎは１〜１０の整数である。）

本発明の第二の態様は、第一の態様の化合物を含有する光第二高調波発生色素組成物である。

本発明の第三の態様は、細胞膜近傍の第一態様の光第二高調波発生化合物により生じる第二高調波を利用した細胞の検査方法であって、第二態様の光第二高調波発生色素組成物を検査対象の細胞に導入する色素導入工程と、前記細胞に導入された光第二高調波発生化合物から放出される第二高調波を検出する第二高調波検出工程とを有するものである。

本発明によれば、細胞膜に効果的に作用し、ＳＨＧシグナルを発するが、ＴＰＦシグナルの発生が抑えられた色素をＳＨＧイメージングに適用できるため、生体組織にあたえるダメージを最小限にして細胞膜の観察を行うことができる。

比較例１のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 比較例３のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 実施例１のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 比較例４のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 比較例５のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 比較例６のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 実施例２のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。 実施例３のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルを示す図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。

本発明の第一の態様は、式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体又はその塩である光第二高調波発生化合物である。
（式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に炭素数６〜１２の直鎖状又は分岐状のアルキル基を示し、Ｒ_３からＲ_１８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、アルコシキ基、アリール基、アミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基から選択されるいずれかの置換基を示すが、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_９とＲ_１０、Ｒ_１３とＲ_１４、Ｒ_１７とＲ_１８とは、一緒になって炭素数５〜７の環構造をとってもよい。Ｘは、−Ｎ^＋Ｒ_１９Ｒ_２０Ｒ_２１、スルホニル基、カルボキシル基、−ＯＲ基を示す。ここで、Ｒ_１９、Ｒ_２０、Ｒ_２１はそれぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基を、−ＯＲは末端にアルコキシ基を有する１価のポリアルキレンオキシド基を示す。ただし、ａは０又は１、ｂは０又は１、ｎは１〜１０の整数である。）

式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体又はその塩である光第二高調波発生化合物を、細胞に導入することにより、時間分解能と定量性に優れたＳＨＧを用いた膜電位の測定や可視化が可能となる。

式（１）中のＲ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に炭素数６〜１２の直鎖状又は分岐状のアルキル基であり、本発明の第一の態様の化合物が細胞膜と相互作用するための疎水性部位である。上記炭素数は６〜１２が好ましく、６〜１０が更に好ましい。ＳＨＧは、二つの光子が中心対称性を欠いて存在する物質と相互作用した場合に生じるため、ＳＨＧは、本質的にその空間反転対称性の破れた細胞膜の表面・界面にある化合物でのみ発生が許される。ここで、Ｒ_１及びＲ_２の炭素数が６以上であれば細胞膜との相互作用が高くなって、細胞に導入された際に、Ｒ_１及びＲ_２の部分が細胞膜に挿入されて化合物が中心対称性を欠いた分布をとる。その結果、導入された化合物がＳＨＧ活性を発現するようになる。Ｒ_１及びＲ_２の炭素数が１２以下であれば、化合物の親水性が極度に損なわれることがなく好ましい。

式（１）中のＸは、−Ｎ^＋Ｒ_１９Ｒ_２０Ｒ_２１、スルホニル基、カルボキシル基、−ＯＲ基であり、本発明の第一の態様の化合物の水溶性を担保するための親水性部位である。ここで、Ｒ_１９、Ｒ_２０、Ｒ_２１はそれぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基を、−ＯＲは末端にアルコキシ基を有する１価のポリアルキレンオキシド基を示す。なかでも、−Ｎ^＋Ｒ_１９Ｒ_２０Ｒ_２１、スルホニル基、カルボキシル基を選択することが、水や親水性溶媒への溶解性が向上するため好ましい。

本発明の第一の態様の化合物において、式（１）中のＸが−Ｎ^＋Ｒ_１９Ｒ_２０Ｒ_２１であり、且つ、ａ＝ｂ＝０である場合が、化合物の親水性と疎水性のバランスの点からは好ましい。また、ｎは１〜１０が好ましく、３〜８がより好ましい。ｎが１以上であれば毒性の問題がなく細胞への影響が小さいために好ましく、１０以下であれば溶解性に問題がないために好ましい。

本発明の第一の態様の化合物は、式（１）の構造中「−ＮＲ_１Ｒ_２」及び「−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｘ」で挟まれる構造部分を最適化したことにより、ＳＨＧ活性を示すがＴＰＦ活性を示さないという特有の性質を示す。

ＳＨＧイメージングに用いる化合物は、二光子との相互作用及びその結果としての光第二高調波発生効率が高いことが必要となる。より強いシグナルを得るにはより強い入射光の照射が必要となるが、過度に強いレーザー光を照射すると、例えば生体組織の光損傷を招いたり、また色素そのものが光劣化を起こしたりしてしまう可能性が高くなるため望ましくない。そこで、なるべく弱い励起光強度で強いＳＨＧ光を得るには、効率よく二光子と相互作用してＳＨＧを発することが必要である。一般的に有機化合物材料において非線形光学特性を向上させる方法として、適切な電子供与性・吸引性置換基を選択して、共役系を拡大させる方法がとられる。本発明第一の態様の化合物では、例えば、ａ又はｂを１とし共鳴構造を延長したり、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_９とＲ_１０、Ｒ_１３とＲ_１４、Ｒ_１７とＲ_１８とを環構造として、キノリン又はナフタレン構造としたりすることで共役系の調節を行うことが可能である。

上記Ｒ_３からＲ_１８のとりうるアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル基等の炭素数１〜４程度のアルキル基等を挙げることができる。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ基等の炭素数１〜６程度のアルコキシ基等を挙げることができる。また、アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等の炭素数６〜１４程度のアリール基等が挙げられる。

これらのうち、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_９とＲ_１０、Ｒ_１３とＲ_１４、Ｒ_１７とＲ_１８とは、一緒になって炭素数５〜７の環構造をとってもよい。これらが環構造をなす場合は、キノリン又はナフタレン構造をとることが好ましい。

式（１）の化合物として、下記の構造式（２）〜（３）で示されるものが特に好ましい。ここで、Ｒ_１からＲ_１８、Ｘ、ｎ等の記号の指す内容は式（１）におけるものと同じである。また、Ｒ_２２からＲ_２９は、それぞれ独立に水素又はアルキル基である。

上記Ｒ_２２からＲ_２９のとりうるアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル基等の炭素数１〜４程度のアルキル基等を挙げることができる。

本発明の第一の態様の化合物として、更に具体的には下記の構造式で示されるものが挙げられる。

式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体は、塩の形態で存在する場合もある。本発明の塩の種類は特に限定されないが、例えば、ＣｌＯ_４ ⁻付加塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。

本発明の第二の態様は、上記第一の態様の化合物を含有する光第二高調波発生色素組成物である。本発明の色素組成物の形態は特に限定されず、第一の態様の化合物を含有すれば、溶液、懸濁液又は粉末等任意の形態をとることができる。なかでも、溶液とすることが取り扱いの容易性の点から好ましい。

式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体又はその塩は適当な溶媒（例えば、水、メタノール等の低級アルコール、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒）に溶解することにより、光第二高調波発生色素組成物溶液を調製することができる。更に適当な緩衝剤や保存剤等、蛍光色素により細胞ないし細胞膜を観察する際に用いられる組成物に通常添加される化合物を含有していてもよい。光等の刺激を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発する生理活性物質を加えることも可能である。

本発明の第三の態様は、細胞膜近傍の第一態様の光第二高調波発生化合物により生じる第二高調波を利用した細胞の検査方法であって、第二態様の光第二高調波発生色素組成物を検査対象の細胞に導入する色素導入工程と、前記細胞に導入された光第二高調波発生化合物から放出される第二高調波を検出する第二高調波検出工程とを有するものである。

本発明の第三態様における色素導入工程において、光第二高調波発生色素組成物を観察対象の細胞に導入するには、蛍光色素による観察の際に用いられる方法が、特に限定されること無く使用することができる。

例えば、検査対象である生体から抽出した細胞を、本発明の第一態様の光第二高調波発生化合物を適切な濃度で含む第二態様の組成物溶液中に所定時間浸漬することで、本発明の第一態様の光第二高調波発生化合物を細胞に適用することができる。また、細胞に第二態様の組成物溶液をピペットで供給してもよい。

本発明の第三態様における第二高調波検出工程には、二光子レーザー走査顕微鏡を好適に用いることができる。ここで二光子レーザー走査顕微鏡とは、近赤外パルスレーザーを標本面上に集光し走査させて、そこでの二光子現象により発生するＳＨＧシグナルを検出することにより像を得る顕微鏡である。

使用できる二光子レーザー走査顕微鏡は、近赤外域波長のサブピコ秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザー光源と、レーザー光源からの光束を所望の大きさに変える光束変換光学系と、光束変換光学系で変換された光束を対物レンズの像面に集光し走査させる走査光学系と、集光された上記変換光束を標本面上に投影する対物レンズ系と、光検出器と、を備えていれば、特に限定されること無く使用することができる。

パルスレーザー光を、ダイクロイックミラーを経て、光束変換光学系、対物レンズ系により集光して、標本面で焦点を結ばせることにより、標本内にある光第二高調波発生化合物に二光子相互作用により誘起されたＳＨＧを生じさせる。標本面をレーザービームで走査し、各場所での蛍光強度を光検出器等の光検出装置で検出して、得られた位置情報に基づいて、コンピュータでプロットすることにより、二次元又は三次元像が得られる。走査機構としては、例えば、ガルバノミラー等の可動ミラーを用いてレーザービームを走査してもよく、ステージ上に置かれた光第二高調波発生材料を含む標本を移動させてもよい。

二光子励起レーザー走査顕微鏡は、このような構成により、二光子吸収そのものの非線形効果を利用して、面内、高軸方向共に高い空間分解能を得ることができる。

本発明の第一の態様の化合物は、その一部を細胞膜に埋めているため、細胞膜の膜電位感受性を有する。そのため、化合物が発するＳＨＧシグナル光の光強度は、細胞膜の膜電位変化に依存して変化する。

本実施態様に係る細胞検査方法においては、このＳＨＧシグナル光の膜電位感受性による光強度の変化を膜電位の光学測定法として用いることで、従来の数倍〜数十倍の信号強度で測定することを可能とする。また、二光子励起レーザー走査顕微鏡の高い時空間分解能をもって細胞の膜電位の経時変化を、ＳＨＧシグナル光の経時変化として間接的に観察することも可能である。例えば、神経細胞の情報処理は、細胞膜の電位の変化として行われるため、本実施形態に係る細胞検査方法は、神経細胞の情報処理の観察に特に有効である。

パッチクランプ法の開発以来、神経細胞膜電位の測定は電気生理学的手法が主にとられている。しかしながら、神経細胞は非常に複雑な構造を持ち、特に情報処理の鍵を握ると考えられるスパインやそれを支える樹状突起の多くは直径が１ミクロンにも満たない非常に微細な構造を有する。そのため、ガラス電極の大きさが問題となり、非常に細かな構造に対しては、このような電気生理学的手法の適用には限界があった。本実施態様に係る細胞検査方法では、第二高調波検出工程が細胞の形態に依存しないため、細部構造を対象とする神経細胞の情報処理の観察に特に有用である。また、同時に、従来のパッチクランプによる膜電位測定を行うことで、より多くの情報を得ることも可能である。

このような神経細胞の情報処理の観察を行う場合、神経細胞への色素導入工程後、第二高調波検出工程前に、細胞膜の膜電位変化を誘発する細胞刺激工程を設けることが有用である。細胞膜の膜電位変化の誘発は、例えば、パッチクランプ等の刺入電極により電気刺激したり、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質を細胞に導入し、任意の刺激領域に刺激光（ＵＶレーザー光）を照射して刺激領域の細胞に興奮性の刺激を与える等、通常採られる方法が特に制限無く採用できる。

上記光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質としては、例えば、生理活性物質であるグルタミン酸に、グルタミン酸の生理活性を不活化させる側鎖（ケージドコンパウンド）がついたケージドグルタミン酸を用いる。このケージドグルタミン酸は、普段は不活性であるが、紫外線を照射するとそのコンパウンドが開裂しグルタミン酸が解離して生理活性を誘導する。また、ケージドコンパウンドにグルタミン酸を結びつけたケージドグルタミン酸に代えて、例えば、生理活性を誘導するアミノ酸、環状ヌクレオチド（ｃＮＭＰｓ）、又は、カルシウム等をケージドコンパウンドに結びつけたケージド試薬を、あるいは、チャネルロドプシン等の光感受性チャネル分子を用いてもよい。

本実施態様に係る細胞検査方法は、神経、血管等各細胞の微細構造から組織全体の広い時空間領域での生理変化を明らかにすることが可能となり、脳機能疾患等の病態生理解明に有効である。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［合成例１］Ａｐ１の合成

＜第一段階＞
１００ｍｌナスフラスコに４２％テトラフルオロほう酸水溶液１５．０ｍｌ（９４．０ｍｍｏｌ）、４−アミノピリジン０．４７８ｇ（５．０８ｍｍｏｌ）を加え氷冷で攪拌した。その中に、亜硝酸ナトリウム０．３５７ｇ（５．１７ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、更に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン１．２１ｇ（９．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で１６時間攪拌した。水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを約１２にし、オレンジ色の結晶を析出させた後、吸引ろ過を行い、結晶を得た。これをクロロホルムに溶かしてろ過をした。ろ液を１００ｍｌナスフラスコに取り、エバポレーターで溶媒を留去して粗結晶を得た。この粗結晶をトルエン：ヘキサンで再結晶を行ったところ、オレンジ色の結晶化合物１が０．４４１ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）得られた（収率：３８％）。得られた結晶化合物１のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：３．１３（ｓ，６Ｈ），６．７６（ｄｄ，Ｊ_１＝２．２Ｈｚ，Ｊ_２＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｄｄ，Ｊ_１＝１．５Ｈｚ，Ｊ_２＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｄｄ，Ｊ_１＝２．２Ｈｚ，Ｊ_２＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．７１（ｄｄ，Ｊ_１＝１．５Ｈｚ，Ｊ_２＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）

＜第二段階＞
耐圧チューブに化合物１を４９．６ｍｇ（０．２１９ｍｍｏｌ）、３−ブロモプロピルトリエチルアンモニウムブロミドを４６．６ｍｇ（０．１５４ｍｍｏｌ）、アセトニトリルを１．２２ｍｌ加えて５分間Ｎ_２バブリングし、８０℃で２３時間加熱攪拌した。反応溶液を５０ｍｌナスフラスコに移して、溶媒を留去した。酢酸エチル、アセトンでそれぞれデカンテーションした。これを蒸留水１００ｍｌに溶かして分液ロートに移し、１００ｍｌの酢酸エチルで洗浄する操作を３回行った。水をエバポレータで留去すると、紫色固体のＡｐ１が３７．５ｍｇ（７０．９ｍｍｏｌ）得られた（収率：４６％）。得られたＡｐ１のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：１．５０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，９Ｈ），２．８５−２．９８（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，６Ｈ），３．４４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），３．８４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．２３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１０．０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）

［合成例２］Ａｐ２の合成

＜第一段階＞
二口フラスコにアニリン１．７２ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ５０ｍｌ、炭酸ナトリウム３．４３ｇ（３２．４ｍｍｏｌ）、１−ヨードブタン７．００ｍｌ（５９．８ｍｍｏｌ）を加えて窒素置換した。９５℃で還流させて２０時間過熱攪拌した後、室温まで放冷した。水１００ｍｌを加えて分液ロートに移し、酢酸エチル１００ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水５０ｍｌで２回、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ｈｅｘ＝１：９、ｖ／ｖ）で精製し、透明の油状液体３．０９ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）を得た（収率：８１％）。得られた油状液体のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：０．９５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３５（ｔｑ，Ｊ_１＝７．３Ｈｚ，Ｊ_２＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），１．５６（ｔｔ，Ｊ_１＝７．６Ｈｚ，Ｊ_２＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ_１＝７．２Ｈｚ，Ｊ_２＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）

＜第二段階＞
１００ｍｌナスフラスコに４２％テトラフルオロほう酸水溶液１４．６ｍｌ（９１．５ｍｍｏｌ）、４−アミノピリジン０．２３５ｇ（２．４９ｍｍｏｌ）を加え氷冷攪拌した。３０ｍｌ三角フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジブチルアニリン１．０１ｇ（４．９３ｍｍｏｌ）、エタノール１１．０ｍｌ、４２％テトラフルオロほう酸１１．０ｍｌ（６８．９ｍｍｏｌ）を加えて氷冷攪拌した。氷冷攪拌していた１００ｍｌナスフラスコ中の溶液に亜硝酸ナトリウム０．１７１ｇ（２．４８ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。ここに氷冷攪拌していた３０ｍｌ三角フラスコ中の溶液をゆっくり滴下していった後、室温で１５時間攪拌した。水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを約１２にし、飽和食塩水２５ｍｌを加えた後、その溶液を分液ロートに移し、酢酸エチル１５０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水３００ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、エバポレーターで溶媒を留去した。更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ｈｅｘ＝１：３、ｖ／ｖ）で精製して、赤褐色の粘性固体の化合物２を０．１８５ｇ（０．５８９ｍｍｏｌ）得た（収率：２４％）。得られた化合物２のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：０．９９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），１．４０（ｔｑ，Ｊ_１＝７．３Ｈｚ，Ｊ_２＝１５Ｈｚ，４Ｈ），１．６１−１．７０（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），６．６９（ｄｄ，Ｊ_１＝２．１Ｈｚ，Ｊ_２＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄｄ，Ｊ_１＝１．６Ｈｚ，Ｊ_２＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ_１＝２．１Ｈｚ，Ｊ_２＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），８．７０（ｄｄ，Ｊ_１＝１．６Ｈｚ，Ｊ_２＝４．７Ｈｚ，２Ｈ）

＜第三段階＞
耐圧チューブに化合物２を４８．９ｍｇ（０．１５８ｍｍｏｌ）、３−ブロモプロピルトリエチルアンモニウムブロミドを５１．４ｍｇ（０．１７０ｍｍｏｌ）、アセトニトリルを０．８０ｍｌ加えて５分間Ｎ_２バブリングし、１００℃で２４時間加熱攪拌した。反応溶液を５０ｍｌナスフラスコに移して、溶媒を留去した後、トルエンでデカンテーションした。紫色固体のＡｐ２が９６．１ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌ）得られた（収率：９９％）。得られたＡｐ２のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：１．０１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），１．３６−１．５１（ｍ，１７Ｈ），２．８０−２．９７（ｍ，２Ｈ），３．４１−３．８０（ｍ，１０Ｈ），３．８３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），５．１８（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ_１＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），９．８７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）

［合成例３］Ａｐ３の合成

＜第一段階＞
３０ｍｌナスフラスコに４２％テトラフルオロほう酸水溶液２．３０ｍｌ（１４．４ｍｍｏｌ）、４−アミノピリジン３８．４ｍｇ（０．４０８ｍｍｏｌ）を加え氷冷攪拌した。１０ｍｌ三角フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジヘキシルアニリン０．２０８ｇ（０．７９４ｍｍｏｌ）、エタノール１．７０ｍｌ、４２％テトラフルオロほう酸１．７０ｍｌ（１０．７ｍｍｏｌ）を加えて氷冷攪拌した。氷冷攪拌していた３０ｍｌナスフラスコ中の溶液に亜硝酸ナトリウム３０．３ｍｇ（０．４３９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。ここに氷冷攪拌していた１０ｍｌ三角フラスコ中の溶液をゆっくり滴下し、室温で１９時間攪拌した。水酸化ナトリウムを加えてｐＨを約１２にし、飽和食塩水５ｍｌを加えた後、その溶液を分液ロートに移し、酢酸エチル２５ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水８０ｍｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、エバポレーターで溶媒を留去した。更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ｈｅｘ＝１：３、ｖ／ｖ）で精製して、赤褐色の粘性固体の化合物３［（Ｅ）―Ｎ，Ｎ−ｄｉｈｅｘｙｌ−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌｄｉａｚｅｎｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ］を２２．３ｍｇ（０．０６０８ｍｍｏｌ）得た（収率：１５％）。得られた化合物３のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：０．９１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ），１．２８−１．４３（ｍ，１２Ｈ），１．５５−１．７１（ｍ，４Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），６．６８（ｄｄ，Ｊ_１＝１．９Ｈｚ，Ｊ_２＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄｄ，Ｊ_１＝１．６Ｈｚ，Ｊ_２＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ_１＝１．９Ｈｚ，Ｊ_２＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），８．７０（ｄｄ，Ｊ_１＝１．６Ｈｚ，Ｊ_２＝４．６Ｈｚ，２Ｈ）

＜第二段階＞
耐圧チューブに化合物３を５１．８ｍｇ（０．１４１ｍｍｏｌ）、３−ブロモプロピルトリエチルアンモニウムブロミドを２９．７ｍｇ（９８．０μｍｏｌ）、アセトニトリルを１．２２ｍｌ加えて５分間Ｎ_２バブリングし、８０℃で２３時間加熱攪拌した。反応溶液を５０ｍｌナスフラスコに移して、溶媒を留去した後、酢酸エチルでデカンテーションした。これを蒸留水１００ｍｌに溶かして抽出ロートに移し、１００ｍｌの酢酸エチルで洗浄する操作を８回行った。水をエバポレーターで留去すると、紫色固体のＡｐ３が５１．６ｍｇ（７７．１μｍｏｌ）得られた（収率：７９％）。得られたＡｐ３のスペクトルデータを以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３ ２７０ＭＨｚ）δ：０．９２（ｔ，Ｊ＝６．６２Ｈｚ，６Ｈ），１．４２−１．２５（ｍ，１２Ｈ），１．５０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，９Ｈ），１．６０−１．７７（ｍ，８Ｈ），２．８３−２．９８（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），３．８３（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．２０（ｔ，Ｊ_１＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），６．７４（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），９．９０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）

上記Ａｐ１〜Ａｐ３及び市販のＳＨＧイメージング用色素ＦＭ４−６４を用い、以下の手順に従って、ＳＨＧイメージングをおこなった。ＦＭ４−６４は下記構造を有す化合物である。

＜比較例１＞
ＦＭ４−６４を１００μＭ含有する緩衝液を作成し、培養したヒトの正常な星状細胞にピペットを用いて導入した。細胞に導入された色素は時間と共に細胞体全体に広がる。

測定には、市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡に波長可変型フェムト秒モード同期赤外レーザーを光源として組み込むことにより、ＳＨＧイメージングやＴＰＦイメージングが可能な多光子顕微鏡を用いた。１，０００ｎｍの励起光を照射することにより、色素から波長５００ｎｍのＳＨＧシグナル光が、赤外パルスレーザーが進行する方向と同方向に発生する。シグナルはレーザー光進行方向側に設けた光電子増倍管にて検出することができる。又、同様の励起光を照射して、ＴＰＦシグナル光の後方散乱成分を観察する。図１に、得られたＳＨＧ及びＴＰＦイメージ像を示す。

＜比較例２，３及び実施例１＞
色素としてＡｐ１〜Ａｐ３を用いるほかは比較例１と同様にしてＳＨＧ及びＴＰＦイメージングを行い、それぞれ比較例２，３及び実施例１とした。図２に比較例３（Ａｐ２を用いた場合）、図３に実施例１（Ａｐ３を用いた場合）において得られたイメージ像をそれぞれ示す。ここで、Ａｐ１を用いた比較例２による像は、ＳＨＧシグナル光を観察することができなかったため記載していない。

図１のＦＭ４−６４を用いた例では、ＳＨＧシグナル以外にＴＰＦシグナルも同様に観察される。これに対し、Ａｐ２を用いた図２は、ＳＨＧシグナルはほとんどみられない。ＴＰＦシグナルも、非常に弱いものであった。

これに対し、本発明の光第二高調波発生色素であるＡｐ３を用いた場合は、図３から明らかなようにＳＨＧシグナルを観察できる一方、ＴＰＦシグナルについては観察されていない。

更に、表１に示される、アニオン性、中性、双性、ジカチオン性の色素を用いて、それぞれ、緩衝液への溶解性、毒性、培養細胞（ＣＨＯ細胞）に適用した際のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルの有無を評価した。ここで、＃１〜５の色素は、本発明の範囲外の光第二高調波発生色素であり、＃６及び７の色素は、本発明の範囲内の光第二高調波発生色素である。

表１に記した上記光第二高調波発生色素のうち、＃６、７の双性イオン性色素の合成法について、以下に説明する。

［合成例４］色素＃６［（Ｅ）−３−（４−（（４−（ｄｉｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−１−ｉｕｍ−１−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］の合成：

１，３−プロパンスルトン１２２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）と、上記合成例３の第一段階で合成された化合物３［（Ｅ）−Ｎ，Ｎ−ｄｉｈｅｘｙｌ−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌｄｉａｚｅｎｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ］を５０ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）とをジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした溶液を室温で２４時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝５／１）で精製し、３２ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の色素＃６を得た（収率：４５％）。得られた化合物の^１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＲＭＳ（高分解能マススペクトロスコピー）による分析結果を以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，４００ＭＨｚ）δ：０．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．３１（ｂｓ，１２Ｈ），１．６０（ｂｓ，４Ｈ），２．２２（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），４．６６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，２Ｈ），８．９７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，２Ｈ）

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値［Ｃ_２６Ｈ_４０Ｎ_４Ｏ_３Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）^＋］：５１１．２７１３３、実測値：５１１．２７０５９

［合成例５］色素＃７［（Ｅ）−３−（４−（（４−（ｄｉｏｃｔｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−１−ｉｕｍ−１−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］の合成：
＜第一段階＞

４−アミノピリジン２０１ｍｇ（２．１ｍｍｏｌ）に４２％テトラフルオロホウ酸２．１ｇを０℃で加え攪拌すると乳濁状の液体が得られた。これに硝酸ナトリウム１３８ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの水に溶かした水溶液をゆっくり加え更に０℃で攪拌した。そこに、Ｎ，Ｎ−ジヘキシルアニリン１．３ｇ（５．０ｍｍｏｌ）と酢酸（３ｍＬ）の混合物を加えた後、更にＴＨＦ（５ｍＬ）を加え、室温で３時間攪拌した。その後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝１５／１）で精製し、目的物を２２０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）得た（収率：３０％）。得られた化合物４［（Ｅ）−Ｎ，Ｎ−ｄｉｏｃｔｙｌ−４−（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌｄｉａｚｅｎｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ］の^１Ｈ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），１．２９−１．３４（ｍ，２０Ｈ），１．６４（ｂｓ，４Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），８．７０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，２Ｈ）

＜第二段階＞

１，３−プロパンスルトンを１２２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）と、化合物４を４２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）とをジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした溶液を室温で２４時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝５／１）で精製し、４２ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）の色素＃７を得た（収率：７４％）。得られた化合物の^１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＲＭＳ（高分解能マススペクトロスコピー）による分析結果を以下に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，４００ＭＨｚ）δ：０．８６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．３１（ｍ，２０Ｈ），１．６０（ｂｓ，４Ｈ），２．２４（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），４．６６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ），８．９６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ）

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値［Ｃ_３０Ｈ_４８Ｎ_４Ｏ_３Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）^＋］：５６７．３３３９３、実測値：５６７．３３３７５

＃１〜７の光第二高調波発生色素及び上記で検討したＡｐ３の溶解性、細胞毒性、ＣＨＯ細胞に適用した際のＳＨＧ及びＴＰＦシグナルの有無を、表２に示す。ここで、本発明外の色素＃１〜５を使用した試験を、それぞれ比較例４〜８とした。これに対し、本発明内の色素＃６、７及びａｐ３を使用した試験を、それぞれ実施例２〜４とした。

［色素の溶解性評価］
合成された表２の色素群（色素♯１〜♯７）に対しＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を色素の濃度が約１００ｍＭとなるように加え、溶解を試みた。色素♯１、♯２及び♯３が容易に溶解したのに対し、色素♯６及び♯７は一部難溶性が認められ、色素♯４、♯５に関しては全く溶解が見られなかった。

［色素のＳＨＧ及びＴＰＦシグナル評価］
色素♯１〜♯３、♯４、♯５及びＡｐ３のＤＭＳＯ溶液を、細胞外液（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ）を用いて１，０００倍希釈し、すべて解けたとして最終濃度が約１００μＭとなるようにした。

観測の対象としてはカバーガラスの上で培養したＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞を用い、これを上記の色素溶液に浸す事で細胞膜の染色を試み、そのまま数分のうちに顕微鏡下で観測を行った。

観測には超短フェムト秒レーザー（Ｎｅｗｐｏｒｔ社製ＭａｉｔａｉＨＰ）を搭載した多光子レーザー顕微鏡システム（オリンパス社製ＦＶ１０００ＭＰＥ）を用い、１，０００ｎｍのパルスレーザー照射後のＳＨＧ及び２光子蛍光（Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＰＦ）を各色素同じ検出条件にて観測した。各色素につき視野を変えて３枚ずつの画像を取得し、各色素間のシグナル強度を定性的に比較した。上記検討で得られた画像のうち、各色素について一枚ずつを図４〜８に示す。それぞれ、図４〜６は比較例４〜６の画像、図７、８は実施例２、３の画像である。

なお、色素の溶解が不可能であった色素♯４、♯５に関してはＳＨＧ、ＴＰＦともにシグナルが全く得られなかったため、評価できない（ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ：ｎ／ａ）ものとした。

［色素の細胞毒性評価］
色素による細胞毒性の評価のため、近赤外光を用いた微分干渉像により染色前後の細胞の形態を確認した。特に、細胞の生理状態が悪化すると、１）細胞外基質との相互作用により伸びた構造を持っていた細胞がその接着を失う事でカバーガラスから離れ丸くなること、２）滑らかな様相を呈していた細胞膜が不均一で凸凹した形態になること、の２点に着目し、細胞毒性を評価した。

本発明内の色素＃６、７及びａｐ３を使用した実施例２〜４は、緩衝液への溶解性や毒性に問題はなかった。これらの色素＃６、７及びａｐ３を細胞に適用した場合、ＴＰＦシグナルは観察されず、ＳＨＧシグナルのみが観察された。図６、７に、実施例２、３のＳＨＧ及びＴＰＦのシグナルを示す。以上の検討から、本発明の色素を細胞に導入することによって、無蛍光ＳＨＧイメージングが可能である事が確認され、膜電位の測定や可視化が可能となることが示唆された。

Claims (6)

1. 下記式（１）で表されるアゾベンゼン系誘導体又はその塩である光第二高調波発生化合物。
   （式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に炭素数６〜１２の直鎖状又は分岐状のアルキル基を示し、Ｒ_３からＲ_１８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、アルコシキ基、アリール基、アミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基から選択されるいずれかの置換基を示すが、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_９とＲ_１０、Ｒ_１３とＲ_１４、Ｒ_１７とＲ_１８とは、一緒になって炭素数５〜７の環構造をとってもよい。Ｘは、−Ｎ ^＋ Ｒ _１９ Ｒ _２０ Ｒ _２１ を示す。ここで、Ｒ_１９、Ｒ_２０、Ｒ_２１はそれぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基を示す。ただし、ａは０、ｂは０、ｎは１〜１０の整数である。）
2. 少なくとも請求項１記載の化合物を含有する光第二高調波発生色素組成物。
3. 細胞膜近傍の色素により生じる第二高調波を利用した細胞の検査方法であって、請求項２記載の光第二高調波発生色素組成物を検査対象の細胞に導入する色素導入工程と、前記細胞に導入された光第二高調波発生化合物から放出される第二高調波を検出する第二高調波検出工程とを有する細胞検査方法。
4. 前記色素導入工程後、前記第二高調波検出工程前に、前記細胞の細胞膜の膜電位変化を誘発する細胞刺激工程を有する請求項３記載の細胞検査方法。
5. 前記第二高調波検出工程において、第二高調波の検出を経時的に行う請求項４記載の細胞検査方法。
6. 前記細胞が神経細胞である請求項３〜５いずれか１項記載の細胞検査方法。