JPH08122326A - 膜電位固定方法及びその装置 - Google Patents
膜電位固定方法及びその装置Info
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- JPH08122326A JPH08122326A JP25855494A JP25855494A JPH08122326A JP H08122326 A JPH08122326 A JP H08122326A JP 25855494 A JP25855494 A JP 25855494A JP 25855494 A JP25855494 A JP 25855494A JP H08122326 A JPH08122326 A JP H08122326A
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- potential
- cell
- membrane
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は膜電位固定方法及び装置に関し、細
胞内に挿入する電極が１本で済み、かつ常時膜電流を計
測でき、細胞内の電位固定領域を検出できることを目的
とする。 【構成】 細胞外の基準電位に対する細胞内の電位であ
る膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフ
ィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する際に、
細胞を電位依存性色素で染色し、染色された細胞を光学
的に測定して上記膜電位を算出する。
胞内に挿入する電極が１本で済み、かつ常時膜電流を計
測でき、細胞内の電位固定領域を検出できることを目的
とする。 【構成】 細胞外の基準電位に対する細胞内の電位であ
る膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフ
ィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する際に、
細胞を電位依存性色素で染色し、染色された細胞を光学
的に測定して上記膜電位を算出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は膜電位固定方法及びその
装置に関し、特に細胞の膜電位を固定する方法及び装置
に関する。神経や筋線維等の興奮性細胞の電気的性質を
説明するイオン機構を調べるためには、イオンに対する
細胞膜の透過性（膜コンダクタンス）が膜電位と時間に
よってどのように変化するかを定量的に測定する必要が
ある。しかしながら、一般に膜コンダクタンスは電位依
存性を持つため、膜電位を変化させると膜コンダクタン
スも変化し、それがさらに膜電位を変化させてしまう。
この電位依存性のコンダクタンス変化によって、活動電
位は毎秒数百ボルトという速さで脱分極してしまうた
め、これを追随して測定するのは困難である。これを解
決するには膜電位をある一定の値に保持（クランプ）
し、その際に膜を横切って流れる電流と時間経過を測定
する必要がある。
装置に関し、特に細胞の膜電位を固定する方法及び装置
に関する。神経や筋線維等の興奮性細胞の電気的性質を
説明するイオン機構を調べるためには、イオンに対する
細胞膜の透過性（膜コンダクタンス）が膜電位と時間に
よってどのように変化するかを定量的に測定する必要が
ある。しかしながら、一般に膜コンダクタンスは電位依
存性を持つため、膜電位を変化させると膜コンダクタン
スも変化し、それがさらに膜電位を変化させてしまう。
この電位依存性のコンダクタンス変化によって、活動電
位は毎秒数百ボルトという速さで脱分極してしまうた
め、これを追随して測定するのは困難である。これを解
決するには膜電位をある一定の値に保持（クランプ）
し、その際に膜を横切って流れる電流と時間経過を測定
する必要がある。
【０００２】
【従来の技術】図４は従来の膜電位固定装置の一例の構
成図を示す。同図中、細胞１０はチャンバ１１内のリン
ゲル液１２に浸されている。細胞１０にはガラス微小電
極１４，１５を挿入する。電極１４は電圧固定用増幅器
１６の反転入力端子に接続すると共に、電圧測定用増幅
器１７に接続してリンゲル液１２の基準電位（アース電
位）に対する細胞内電位、つまり膜電位Ｖｍを測定す
る。また基準電位に実験者の設定した任意の電圧（コマ
ンド電圧Ｖｃ）を加えて電圧固定用増幅器１６の非反転
入力端子に印加する。この増幅器１６の出力端子をもう
１本のガラス微小電極１５に接続し、そこから電流を細
胞１０内に流す。この電流は細胞膜を横切って流れる電
流となるから、この電極に直列に小さな抵抗Ｒ1 を入れ
ておき、そこに生じる電圧降下を増幅器１８で測定すれ
ばその電流を測ることができる。Ｖｍ＜Ｖｃである場
合、増幅器１６から細胞１０内へプラスの電流が流れて
ＶｍをＶｃに近づけようとする。逆にＶｍ＞Ｖｃである
場合は増幅器１６から細胞１０内へマイナスの電流が流
れる。
成図を示す。同図中、細胞１０はチャンバ１１内のリン
ゲル液１２に浸されている。細胞１０にはガラス微小電
極１４，１５を挿入する。電極１４は電圧固定用増幅器
１６の反転入力端子に接続すると共に、電圧測定用増幅
器１７に接続してリンゲル液１２の基準電位（アース電
位）に対する細胞内電位、つまり膜電位Ｖｍを測定す
る。また基準電位に実験者の設定した任意の電圧（コマ
ンド電圧Ｖｃ）を加えて電圧固定用増幅器１６の非反転
入力端子に印加する。この増幅器１６の出力端子をもう
１本のガラス微小電極１５に接続し、そこから電流を細
胞１０内に流す。この電流は細胞膜を横切って流れる電
流となるから、この電極に直列に小さな抵抗Ｒ1 を入れ
ておき、そこに生じる電圧降下を増幅器１８で測定すれ
ばその電流を測ることができる。Ｖｍ＜Ｖｃである場
合、増幅器１６から細胞１０内へプラスの電流が流れて
ＶｍをＶｃに近づけようとする。逆にＶｍ＞Ｖｃである
場合は増幅器１６から細胞１０内へマイナスの電流が流
れる。
【０００３】例えば、Ｖｃを細胞１０の静止膜電位（−
７０〜−８０ｍＶ）よりも低く設定して脱分極させる
と、細胞膜のナトリウム透過性が高まり、細胞膜を横切
ってナトリウムイオンの流入が起こる。しかし膜電位固
定下では増幅器１６がそれに反応してこの内向きの電流
とちょうど同じ大きさのマイナス電流を発生するので、
膜電位はＶｃの値に保たれる。いいかえれば増幅器１６
から流れ込む電流の大きさは細胞膜を横切るイオン電流
の大きさに等しい、従って電圧固定法を用いると膜電位
が一定の値に保たれると共に、常時膜電流の大きさを測
ることができる。
７０〜−８０ｍＶ）よりも低く設定して脱分極させる
と、細胞膜のナトリウム透過性が高まり、細胞膜を横切
ってナトリウムイオンの流入が起こる。しかし膜電位固
定下では増幅器１６がそれに反応してこの内向きの電流
とちょうど同じ大きさのマイナス電流を発生するので、
膜電位はＶｃの値に保たれる。いいかえれば増幅器１６
から流れ込む電流の大きさは細胞膜を横切るイオン電流
の大きさに等しい、従って電圧固定法を用いると膜電位
が一定の値に保たれると共に、常時膜電流の大きさを測
ることができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来方法で
は、電位が固定されるのは通電用の電極１５が挿入され
ている細胞体近傍にすぎず、神経細胞の樹状突起部や長
い軸索中の電位固定は不可能であり、実際に細胞内の電
位がどの範囲まで固定されているかを見積ることができ
ない。
は、電位が固定されるのは通電用の電極１５が挿入され
ている細胞体近傍にすぎず、神経細胞の樹状突起部や長
い軸索中の電位固定は不可能であり、実際に細胞内の電
位がどの範囲まで固定されているかを見積ることができ
ない。
【０００５】また、電位計測用と電流注入用の２本の電
極を１つの細胞内に挿入しなければならないため、ある
程度大きな細胞にしか適用できない。その解決法として
単一電極で記録と通電を交互に時分割で行う方法がある
が、膜電位のステップ応答がクロック単位の遅延を生じ
るため、速い電流応答に追従できないという問題があっ
た。
極を１つの細胞内に挿入しなければならないため、ある
程度大きな細胞にしか適用できない。その解決法として
単一電極で記録と通電を交互に時分割で行う方法がある
が、膜電位のステップ応答がクロック単位の遅延を生じ
るため、速い電流応答に追従できないという問題があっ
た。
【０００６】本発明は上記の点に鑑みなされたもので、
細胞内に挿入する電極が１本で済み、かつ常時膜電流を
計測でき、細胞内の電位固定領域を検出できる膜電位固
定方法及び装置を提供することを目的とする。
細胞内に挿入する電極が１本で済み、かつ常時膜電流を
計測でき、細胞内の電位固定領域を検出できる膜電位固
定方法及び装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明
は、細胞外の基準電位に対する細胞内の電位である膜電
位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフィード
バック電流を流し、上記膜電位を固定する膜電位固定方
法において、上記細胞を電位依存性色素で染色し、上記
染色された細胞を光学的に測定して上記膜電位を算出す
る。
は、細胞外の基準電位に対する細胞内の電位である膜電
位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフィード
バック電流を流し、上記膜電位を固定する膜電位固定方
法において、上記細胞を電位依存性色素で染色し、上記
染色された細胞を光学的に測定して上記膜電位を算出す
る。
【０００８】請求項２に記載の発明は、染色された細胞
を光学的に測定して得られた蛍光強度変化量から膜電位
を算出する。請求項３に記載の発明は、染色された細胞
を光学的に測定して得られた吸光度変化量から膜電位を
算出する。請求項４に記載の発明は、染色された細胞を
光学的に測定して得られた複屈折変化量から膜電位を算
出する。
を光学的に測定して得られた蛍光強度変化量から膜電位
を算出する。請求項３に記載の発明は、染色された細胞
を光学的に測定して得られた吸光度変化量から膜電位を
算出する。請求項４に記載の発明は、染色された細胞を
光学的に測定して得られた複屈折変化量から膜電位を算
出する。
【０００９】請求項５に記載の発明は、染色された細胞
の各点を光学的に測定して上記各点の膜電位を算出し、
上記細胞内の各点の膜電位を検出する。請求項６に記載
の発明は、細胞外の基準電位に対する細胞内の電位であ
る膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフ
ィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する膜電位
固定装置において、電位依存性色素で染色された細胞を
光学的に測定する測定手段と、上記測定手段の測定結果
から上記膜電位を算出する算出手段とを有する。
の各点を光学的に測定して上記各点の膜電位を算出し、
上記細胞内の各点の膜電位を検出する。請求項６に記載
の発明は、細胞外の基準電位に対する細胞内の電位であ
る膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内にフ
ィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する膜電位
固定装置において、電位依存性色素で染色された細胞を
光学的に測定する測定手段と、上記測定手段の測定結果
から上記膜電位を算出する算出手段とを有する。
【００１０】請求項７に記載の発明は、測定手段を蛍光
顕微鏡及びフォトダイオードアレイで構成する。請求項
８に記載の発明は、測定手段をフォトマルチプライヤを
用いた共焦点光学システムで構成する。
顕微鏡及びフォトダイオードアレイで構成する。請求項
８に記載の発明は、測定手段をフォトマルチプライヤを
用いた共焦点光学システムで構成する。
【００１１】
【作用】請求項１乃至４に記載の発明においては、電位
依存性色素で染色された細胞を光学的に測定し、得られ
た蛍光強度変化量、又は吸光度変化量、又は複屈折変化
量から膜電位を算出するため、細胞に膜電位検出用の電
極を挿入する必要がなく、フィードバック電流を流すた
めの電極だけを挿入すれば良く、常時膜電位を計測でき
る。
依存性色素で染色された細胞を光学的に測定し、得られ
た蛍光強度変化量、又は吸光度変化量、又は複屈折変化
量から膜電位を算出するため、細胞に膜電位検出用の電
極を挿入する必要がなく、フィードバック電流を流すた
めの電極だけを挿入すれば良く、常時膜電位を計測でき
る。
【００１２】請求項５に記載の発明においては、細胞の
各点の膜電位を検出するため、細胞内の膜電位が固定さ
れた領域を検出できる。請求項６に記載の発明において
は、請求項１の方法を用いた膜電位固定を実現できる。
請求項７に記載の発明においては、フォトダイオードア
レイを用いているため、複数点の膜電位を同時に検出で
き、細胞全体の膜電位を短時間で計測できる。
各点の膜電位を検出するため、細胞内の膜電位が固定さ
れた領域を検出できる。請求項６に記載の発明において
は、請求項１の方法を用いた膜電位固定を実現できる。
請求項７に記載の発明においては、フォトダイオードア
レイを用いているため、複数点の膜電位を同時に検出で
き、細胞全体の膜電位を短時間で計測できる。
【００１３】請求項８に記載の発明においては、共焦点
光学システムを用いているため、細胞各部の膜電位を高
い解像度で計測できる。
光学システムを用いているため、細胞各部の膜電位を高
い解像度で計測できる。
【００１４】
【実施例】図１は本発明装置の第１実施例の構成図を示
す。この装置は、蛍光顕微鏡２０と、膜電位固定装置２
１と、膜電位計測システム２２とから大略構成される。
蛍光顕微鏡２０としては例えばカールツァイス製ＩＣＭ
−４０５を用い、膜電位固定装置としては日本光学製Ｃ
ＥＺ−１２００を用い、膜電位計測システムとしては例
えば浜松ホトニクス製ＡＲＧＵＳ−５０を用いる。
す。この装置は、蛍光顕微鏡２０と、膜電位固定装置２
１と、膜電位計測システム２２とから大略構成される。
蛍光顕微鏡２０としては例えばカールツァイス製ＩＣＭ
−４０５を用い、膜電位固定装置としては日本光学製Ｃ
ＥＺ−１２００を用い、膜電位計測システムとしては例
えば浜松ホトニクス製ＡＲＧＵＳ−５０を用いる。
【００１５】観察する細胞２５は蛍光顕微鏡２０のステ
ージ上に載置されたチャンバ２６内のリンゲル液２７に
浸しておく。この細胞２５は電位依存性色素である膜電
位感受性蛍光色素で細胞膜を染色されたものである。蛍
光顕微鏡２０の光源２８から出射された励起光はフィル
タ２９を通して細胞２５に照射され、細胞２５の蛍光を
対物レンズ３１で拡大し、ミラー３２で反射して膜電位
計測システム２２のフォトダイオードアレイ３３によっ
て測光する。
ージ上に載置されたチャンバ２６内のリンゲル液２７に
浸しておく。この細胞２５は電位依存性色素である膜電
位感受性蛍光色素で細胞膜を染色されたものである。蛍
光顕微鏡２０の光源２８から出射された励起光はフィル
タ２９を通して細胞２５に照射され、細胞２５の蛍光を
対物レンズ３１で拡大し、ミラー３２で反射して膜電位
計測システム２２のフォトダイオードアレイ３３によっ
て測光する。
【００１６】フォトダイオードアレイ３３で得られた蛍
光画像は演算用画像解析装置３４に供給される。その蛍
光強度Ｆ及び蛍光強度変化量ΔＦが膜電位変化量ΔＶに
変換され、更に静止膜電位値に基づいて膜電位Ｖｍが算
出され、この膜電位Ｖｍを膜電位固定装置２１に供給す
る。更に蛍光画像をモニタ３５に表示して観察する。上
記のフォトダイオードアレイ３３と蛍光顕微鏡２０とが
測定手段に対応し、演算用画像解析装置３４が算出手段
に対応する。
光画像は演算用画像解析装置３４に供給される。その蛍
光強度Ｆ及び蛍光強度変化量ΔＦが膜電位変化量ΔＶに
変換され、更に静止膜電位値に基づいて膜電位Ｖｍが算
出され、この膜電位Ｖｍを膜電位固定装置２１に供給す
る。更に蛍光画像をモニタ３５に表示して観察する。上
記のフォトダイオードアレイ３３と蛍光顕微鏡２０とが
測定手段に対応し、演算用画像解析装置３４が算出手段
に対応する。
【００１７】一方、チャンバ２６には塩化銀（ＡｇＣ
ｌ）で被覆した銀リード線を不関電極４０として導入し
リンゲル液２７に浸してある。また、電圧固定しようと
する細胞２５には電流注入用ガラス微小電極４１を油圧
マイクロ・マニピュレータを用いて刺入する。ガラス微
小電極４１は中芯入りパイレックスガラス管を微小電極
作製器（例えばナリシゲ製ＰＮ−３）で引き伸ばして作
製し、電極４１内に３Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶
液を充填し、塩化銀で被覆した銀リード線を挿入して構
成する。
ｌ）で被覆した銀リード線を不関電極４０として導入し
リンゲル液２７に浸してある。また、電圧固定しようと
する細胞２５には電流注入用ガラス微小電極４１を油圧
マイクロ・マニピュレータを用いて刺入する。ガラス微
小電極４１は中芯入りパイレックスガラス管を微小電極
作製器（例えばナリシゲ製ＰＮ−３）で引き伸ばして作
製し、電極４１内に３Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶
液を充填し、塩化銀で被覆した銀リード線を挿入して構
成する。
【００１８】上記不関電極４０の基準電位（アース電
位）に対して、コマンド電圧Ｖｃを加えて電圧固定用増
幅器４３の非反転入力端子に印加し、この増幅器４３の
反転入力端子に膜電位計測システム２２で得た膜電位Ｖ
ｍを印加する。増幅器４３はコマンド電圧Ｖｃと膜電位
Ｖｍとの電位差に基づいてガラス微小電極から細胞２５
にフィードバック電流を流す。この電流は細胞膜を横切
って流れるイオン電流の大きさに等しく、フィードバッ
ク電流の経路に挿入した抵抗Ｒ10の電圧降下を増幅器４
４で測定して、その電流値を測定する。また、細胞２５
の全体の膜電位を測定する場合はステージを移動させる
ことにより細胞２５を走査する。
位）に対して、コマンド電圧Ｖｃを加えて電圧固定用増
幅器４３の非反転入力端子に印加し、この増幅器４３の
反転入力端子に膜電位計測システム２２で得た膜電位Ｖ
ｍを印加する。増幅器４３はコマンド電圧Ｖｃと膜電位
Ｖｍとの電位差に基づいてガラス微小電極から細胞２５
にフィードバック電流を流す。この電流は細胞膜を横切
って流れるイオン電流の大きさに等しく、フィードバッ
ク電流の経路に挿入した抵抗Ｒ10の電圧降下を増幅器４
４で測定して、その電流値を測定する。また、細胞２５
の全体の膜電位を測定する場合はステージを移動させる
ことにより細胞２５を走査する。
【００１９】ここで、電位固定するニューロンはアカミ
ミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａ）の巨大介在ニ
ューロンの一つであるＭＧＦ（Ｍｅｄｉｕｍ Ｇｉａｎ
ｔＦｉｂｅｒ）を選び、腹髄神経節を１％プロテアーゼ
（ＳＩＧＭＡ，ＴｙｐｅＸＩＶ）で３分間処理して表面
の斜紋筋を除去した後、膜電位感受性蛍光色素ＲＨ４１
４ １ｍＭ溶液に２時間浸し細胞膜を染色する。この試
料を顕微鏡ステージ上のチャンバ２６内に移し、キセノ
ンランプ光源２８からフィルタ２９を通して５４０nmの
波長の光で励起すると、背側正中線上に、ＭＧＦの幅２
０μm 程度の蛍光の帯が観察される。さらに実体顕微鏡
下で観察しながらガラス微小電極４１をＭＧＦに刺入す
る。１６×１６のフォトダイオードアレイ３３上に電極
刺入部位の前後４０μm がモニタできるように、ＭＧＦ
を位置させると、１画素は約５μm ×５μm の範囲に相
当する。電位固定に用いる膜電位計測点は刺入部位のす
ぐ隣の画素を選ぶ。微小ガラス電極４１から誘導される
電位は細胞外に対して−６０ｍＶを示す場合、この時の
蛍光強度を静止膜電位−６０ｍＶとして設定する。次に
コマンド電圧Ｖｃを−２０ｍＶとして膜電位を固定させ
る。その結果、通電用電極の周囲４×４画素、約４００
μm 2 の範囲は−２０ｍＶに固定されていたが、それ以
外の部位は電極から遠ざかるほどコマンド電圧Ｖｃより
も低い電位を示す。これからＭＧＦの軸索で膜電位固定
を行った場合、軸索の長軸方向で約２０μm が正確にク
ランプされている領域であることが分る。
ミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａ）の巨大介在ニ
ューロンの一つであるＭＧＦ（Ｍｅｄｉｕｍ Ｇｉａｎ
ｔＦｉｂｅｒ）を選び、腹髄神経節を１％プロテアーゼ
（ＳＩＧＭＡ，ＴｙｐｅＸＩＶ）で３分間処理して表面
の斜紋筋を除去した後、膜電位感受性蛍光色素ＲＨ４１
４ １ｍＭ溶液に２時間浸し細胞膜を染色する。この試
料を顕微鏡ステージ上のチャンバ２６内に移し、キセノ
ンランプ光源２８からフィルタ２９を通して５４０nmの
波長の光で励起すると、背側正中線上に、ＭＧＦの幅２
０μm 程度の蛍光の帯が観察される。さらに実体顕微鏡
下で観察しながらガラス微小電極４１をＭＧＦに刺入す
る。１６×１６のフォトダイオードアレイ３３上に電極
刺入部位の前後４０μm がモニタできるように、ＭＧＦ
を位置させると、１画素は約５μm ×５μm の範囲に相
当する。電位固定に用いる膜電位計測点は刺入部位のす
ぐ隣の画素を選ぶ。微小ガラス電極４１から誘導される
電位は細胞外に対して−６０ｍＶを示す場合、この時の
蛍光強度を静止膜電位−６０ｍＶとして設定する。次に
コマンド電圧Ｖｃを−２０ｍＶとして膜電位を固定させ
る。その結果、通電用電極の周囲４×４画素、約４００
μm 2 の範囲は−２０ｍＶに固定されていたが、それ以
外の部位は電極から遠ざかるほどコマンド電圧Ｖｃより
も低い電位を示す。これからＭＧＦの軸索で膜電位固定
を行った場合、軸索の長軸方向で約２０μm が正確にク
ランプされている領域であることが分る。
【００２０】この実施例では１回につきフォトダイオー
ドアレイのダイオード数だけの箇所の膜電位を測定で
き、高速の膜電位測定が可能である。図２は本発明装置
の第２実施例の構成図を示す。この装置は、共焦点光学
システム５０と、図１に示すものと同一の膜電位固定装
置２１と、演算用画像解析装置３４及びモニタ３５とか
ら大略構成される。共焦点光学システム５０としては例
えばＢｉｏ−ｒａｄ製ＭＲＣ−６００を用いる。
ドアレイのダイオード数だけの箇所の膜電位を測定で
き、高速の膜電位測定が可能である。図２は本発明装置
の第２実施例の構成図を示す。この装置は、共焦点光学
システム５０と、図１に示すものと同一の膜電位固定装
置２１と、演算用画像解析装置３４及びモニタ３５とか
ら大略構成される。共焦点光学システム５０としては例
えばＢｉｏ−ｒａｄ製ＭＲＣ−６００を用いる。
【００２１】測定手段に対応する共焦点光学システム５
０は、レーザ光源５１と、ダイクロイックミラー５２
と、フォトマルチプライヤ５３と、励起波長用フィルタ
５４と、蛍光波長用フィルタ５５と、瞳絞り５６と、対
物レンズ５７とから構成されている。観察する細胞２５
は膜電位感受製蛍光色素で細胞膜を染色してステージに
載置されたチャンバ２６内のリンゲル液２７に浸してお
く。レーザ光源５１から励起波長用フィルタ５４を通し
て出射されたレーザ光はダイクロイックミラー５２で反
射された後対物レンズで細胞２５に照射される。細胞２
５の蛍光は対物レンズ５７及びダイクロイックミラー５
２を通し、更に蛍光波長用フィルタ５５で周波数選択さ
れ、瞳絞り５６を通してフォトマルチプライヤ５２に入
射される。
０は、レーザ光源５１と、ダイクロイックミラー５２
と、フォトマルチプライヤ５３と、励起波長用フィルタ
５４と、蛍光波長用フィルタ５５と、瞳絞り５６と、対
物レンズ５７とから構成されている。観察する細胞２５
は膜電位感受製蛍光色素で細胞膜を染色してステージに
載置されたチャンバ２６内のリンゲル液２７に浸してお
く。レーザ光源５１から励起波長用フィルタ５４を通し
て出射されたレーザ光はダイクロイックミラー５２で反
射された後対物レンズで細胞２５に照射される。細胞２
５の蛍光は対物レンズ５７及びダイクロイックミラー５
２を通し、更に蛍光波長用フィルタ５５で周波数選択さ
れ、瞳絞り５６を通してフォトマルチプライヤ５２に入
射される。
【００２２】フォトマルチプライヤ５２で得られた蛍光
画像は演算用画像解析装置３４に供給され、ここで蛍光
強度Ｆ及びその変化量ΔＦが膜電位変化量ΔＶに変換さ
れ、膜電位Ｖｍが算出される。この膜電位Ｖｍは電圧固
定用増幅器４３に供給され、また蛍光画像はモニタ３５
に表示される。膜電位固定装置２１については図１と同
一であり、その説明を省略する。また、細胞２５の全体
の膜電位を測定する場合はステージを移動させることに
より細胞２５を走査する。
画像は演算用画像解析装置３４に供給され、ここで蛍光
強度Ｆ及びその変化量ΔＦが膜電位変化量ΔＶに変換さ
れ、膜電位Ｖｍが算出される。この膜電位Ｖｍは電圧固
定用増幅器４３に供給され、また蛍光画像はモニタ３５
に表示される。膜電位固定装置２１については図１と同
一であり、その説明を省略する。また、細胞２５の全体
の膜電位を測定する場合はステージを移動させることに
より細胞２５を走査する。
【００２３】ここで、共焦点レーザ顕微鏡によるポイン
ト測光を用いた電圧固定法を適用して逆転電位の計測を
行う場合について説明する。電位固定を行う試料とし
て、アカミミズの培養神経細胞を用いる。アカミミズを
抗生物質を添加したミミズ用生理食塩水中で解剖し、腹
髄神経節を摘出する。摘出した神経節を一体節ごとに切
断後、パスツールピペットによりマルチウェル内に移
し、室温（２２〜２３℃）で約２４時間無菌的に放置し
た。マルチウェルにはファルコン社製の２４ウェルマル
チプレートフタ付きを用い、事前にコラーゲンタイプIV
で修飾しておく。なお、培養溶液には以下の組成のもの
を用いる。
ト測光を用いた電圧固定法を適用して逆転電位の計測を
行う場合について説明する。電位固定を行う試料とし
て、アカミミズの培養神経細胞を用いる。アカミミズを
抗生物質を添加したミミズ用生理食塩水中で解剖し、腹
髄神経節を摘出する。摘出した神経節を一体節ごとに切
断後、パスツールピペットによりマルチウェル内に移
し、室温（２２〜２３℃）で約２４時間無菌的に放置し
た。マルチウェルにはファルコン社製の２４ウェルマル
チプレートフタ付きを用い、事前にコラーゲンタイプIV
で修飾しておく。なお、培養溶液には以下の組成のもの
を用いる。
【００２４】 Leuboewitz L-15 培地（Sigma 社製） ８５％ V/V 非働化処理馬血清（UBT 社製） １５％ V/V ゲンタマイシン（Sigma 社製） ２０ mg/ml ファギゾーン（Sigma 社製） ５μg/ml グルコース（和光純薬、特級） １５ mg/ml (pH
7.4,1NNaOHにて調整) ゲンタマイシンとファギゾーンは雑菌増殖を抑えるため
の抗生物質である。また非働化馬血清は、購入した血清
を５６℃で３０分間湯せんすることにより得る。約２４
時間を経過したあたりから、神経節から突起を持つ細胞
の遊離が観察でき、神経節は培養器具上に強く接着す
る。培養した神経細胞は、膜電位感受製蛍光色素ＲＨ４
１４ １ｍＭ溶液に２時間浸し微小ガラス電極４１を挿
入する。遊離した培養細胞はほとんどが球形に近いた
め、細胞全体で等電位であると考えられる。そこで電位
固定に用いる膜電位計測点は細胞２５内の任意の５点の
うち１点を選んでポイント測光し、測定毎に測定点を移
す。これによって長時間の測定を行ってもレーザ光の照
射による色素褪色を防ぎ、時間分解能を上げることがで
きる。静止膜電位である−６０ｍＶから１０ｍＶ毎に＋
６０ｍＶまで順に膜電位を固定する。電位固定時間はそ
れぞれ２０ｍｓとし、一過性電流のピーク値を計測す
る。その結果を図３に示す。膜電位に対して電流値をプ
ロットしたところ、約−１５ｍＶで電流値は０となり、
逆転電位は−１５ｍＶであることが分る。
7.4,1NNaOHにて調整) ゲンタマイシンとファギゾーンは雑菌増殖を抑えるため
の抗生物質である。また非働化馬血清は、購入した血清
を５６℃で３０分間湯せんすることにより得る。約２４
時間を経過したあたりから、神経節から突起を持つ細胞
の遊離が観察でき、神経節は培養器具上に強く接着す
る。培養した神経細胞は、膜電位感受製蛍光色素ＲＨ４
１４ １ｍＭ溶液に２時間浸し微小ガラス電極４１を挿
入する。遊離した培養細胞はほとんどが球形に近いた
め、細胞全体で等電位であると考えられる。そこで電位
固定に用いる膜電位計測点は細胞２５内の任意の５点の
うち１点を選んでポイント測光し、測定毎に測定点を移
す。これによって長時間の測定を行ってもレーザ光の照
射による色素褪色を防ぎ、時間分解能を上げることがで
きる。静止膜電位である−６０ｍＶから１０ｍＶ毎に＋
６０ｍＶまで順に膜電位を固定する。電位固定時間はそ
れぞれ２０ｍｓとし、一過性電流のピーク値を計測す
る。その結果を図３に示す。膜電位に対して電流値をプ
ロットしたところ、約−１５ｍＶで電流値は０となり、
逆転電位は−１５ｍＶであることが分る。
【００２５】第２実施例では１回につき１箇所の膜電位
の測定しか行えないが、その解像度は第１実施例に比べ
て高くなる。なお、上記実施例では電位依存性色素とし
て膜電位感受性蛍光色素を用い、蛍光強度変化量から膜
電位を算出しているが、この他にＲＨ１５５等の膜電位
感受性吸光色素を用い吸光度Ａ及び吸光度変化量ΔＡか
ら膜電位を算出したり、更に複屈折量ΔＲ及び複屈折変
化量ΔＲから膜電位を検出しても良く、上記実施例に限
定されない。
の測定しか行えないが、その解像度は第１実施例に比べ
て高くなる。なお、上記実施例では電位依存性色素とし
て膜電位感受性蛍光色素を用い、蛍光強度変化量から膜
電位を算出しているが、この他にＲＨ１５５等の膜電位
感受性吸光色素を用い吸光度Ａ及び吸光度変化量ΔＡか
ら膜電位を算出したり、更に複屈折量ΔＲ及び複屈折変
化量ΔＲから膜電位を検出しても良く、上記実施例に限
定されない。
【００２６】
【発明の効果】上述の如く、請求項１乃至４に記載の発
明によれば、電位依存性色素で染色された細胞を光学的
に測定し、得られた蛍光強度変化量、又は吸光度変化
量、又は複屈折変化量から膜電位を算出するため、細胞
に膜電位検出用の電極を挿入する必要がなくフィードバ
ック電流を流すための電極だけを挿入すれば良く、常時
膜電位を計測できる。
明によれば、電位依存性色素で染色された細胞を光学的
に測定し、得られた蛍光強度変化量、又は吸光度変化
量、又は複屈折変化量から膜電位を算出するため、細胞
に膜電位検出用の電極を挿入する必要がなくフィードバ
ック電流を流すための電極だけを挿入すれば良く、常時
膜電位を計測できる。
【００２７】また、請求項５に記載の発明によれば、細
胞の各点の膜電位を検出するため、細胞内の膜電位が固
定された領域を検出できる。また、請求項６に記載の発
明によれば、請求項１の方法を用いた膜電位固定を実現
できる。また、請求項７に記載の発明によれば、フォト
ダイオードアレイを用いているため、複数点の膜電位を
同時に検出でき、細胞全体の膜電位を短時間で計測でき
る。
胞の各点の膜電位を検出するため、細胞内の膜電位が固
定された領域を検出できる。また、請求項６に記載の発
明によれば、請求項１の方法を用いた膜電位固定を実現
できる。また、請求項７に記載の発明によれば、フォト
ダイオードアレイを用いているため、複数点の膜電位を
同時に検出でき、細胞全体の膜電位を短時間で計測でき
る。
【００２８】また、請求項８に記載の発明によれば、共
焦点光学システムを用いているため、細胞各部の膜電位
を高い解像度で計測でき、実用上きわめて有用である。
焦点光学システムを用いているため、細胞各部の膜電位
を高い解像度で計測でき、実用上きわめて有用である。
【図１】本発明装置の構成図である。
【図２】本発明装置の構成図である。
【図３】膜電流と膜電位との関係を示す図である。
【図４】従来装置の構成図である。
２０ 蛍光顕微鏡 ２１ 膜電位固定装置 ２２ 膜電位計測システム ２５ 細胞 ２６ チャンバ ２７ リンゲル液 ２８ 光源 ２９，５４，５５ フィルタ ３１，５７ 対物レンズ ３３ フォトダイオードアレイ ３４ 演算用画像解析装置 ３５ モニタ ４０ 不関電極 ４１ ガラス微小電極 ４３ 電圧固定用増幅器 ４４ 増幅器 ５０ 共焦点光学システム ５１ レーザ光源 ５２ ダイクロイックミラー ５３ フォトマルチプライヤ
Claims (8)
- 【請求項１】 細胞外の基準電位に対する細胞内の電位
である膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内
にフィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する膜
電位固定方法において、 上記細胞を電位依存性色素で染色し、 上記染色された細胞を光学的に測定して上記膜電位を算
出することを特徴とする膜電位固定方法。 - 【請求項２】 前記染色された細胞を光学的に測定して
得られた蛍光強度変化量から膜電位を算出することを特
徴とする請求項１記載の膜電位固定方法。 - 【請求項３】 前記染色された細胞を光学的に測定して
得られた吸光度変化量から膜電位を算出することを特徴
とする請求項１記載の膜電位固定方法。 - 【請求項４】 前記染色された細胞を光学的に測定して
得られた複屈折変化量から膜電位を算出することを特徴
とする請求項１記載の膜電位固定方法。 - 【請求項５】 前記染色された細胞の各点を光学的に測
定して上記各点の膜電位を算出し、上記細胞内の各点の
膜電位を検出することを特徴とする請求項１記載の膜電
位固定方法。 - 【請求項６】 細胞外の基準電位に対する細胞内の電位
である膜電位が任意のコマンド電圧となるように細胞内
にフィードバック電流を流し、上記膜電位を固定する膜
電位固定装置において、 電位依存性色素で染色された細胞を光学的に測定する測
定手段と、 上記測定手段の測定結果から上記膜電位を算出する算出
手段とを有することを特徴とする膜電位固定装置。 - 【請求項７】 前記測定手段を蛍光顕微鏡及びフォトダ
イオードアレイで構成したことを特徴とする請求項６記
載の膜電位固定装置。 - 【請求項８】 前記測定手段をフォトマルチプライヤを
用いた共焦点光学システムで構成したことを特徴とする
請求項６記載の膜電位固定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25855494A JPH08122326A (ja) | 1994-10-24 | 1994-10-24 | 膜電位固定方法及びその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25855494A JPH08122326A (ja) | 1994-10-24 | 1994-10-24 | 膜電位固定方法及びその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08122326A true JPH08122326A (ja) | 1996-05-17 |
Family
ID=17321846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25855494A Withdrawn JPH08122326A (ja) | 1994-10-24 | 1994-10-24 | 膜電位固定方法及びその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08122326A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999046588A1 (fr) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Isao Karube | Appareil servant a mesurer automatiquement le potentiel d'une membrane minuscule |
| WO2002099408A1 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Signal detecting sensor provided with multi-electrode |
| WO2014189145A1 (ja) | 2013-05-23 | 2014-11-27 | 学校法人慶應義塾 | 光第二高調波発生化合物、光第二高調波発生色素組成物及び細胞検査方法 |
-
1994
- 1994-10-24 JP JP25855494A patent/JPH08122326A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999046588A1 (fr) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Isao Karube | Appareil servant a mesurer automatiquement le potentiel d'une membrane minuscule |
| WO2002099408A1 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Signal detecting sensor provided with multi-electrode |
| US7006929B2 (en) | 2001-06-05 | 2006-02-28 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Signal detecting sensor provided with multi-electrode |
| WO2014189145A1 (ja) | 2013-05-23 | 2014-11-27 | 学校法人慶應義塾 | 光第二高調波発生化合物、光第二高調波発生色素組成物及び細胞検査方法 |
| US9709555B2 (en) | 2013-05-23 | 2017-07-18 | Keio University | Compound for generating second harmonic of light, dye composition for generating second harmonic of light, and cell examination method |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020115 |