JP3172060B2 - 細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法 - Google Patents
細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、細胞内イオンの濃度
変化および膜電位変化それぞれを実質同時に測定できる
方法に関するものである。
変化および膜電位変化それぞれを実質同時に測定できる
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体細胞では生体の活動に伴い膜電位や
細胞内のイオン濃度例えばカルシウム、カリウム、塩
素、ナトリウムなどの各イオンの濃度が変化することが
知られている。またこれら膜電位の変化やイオン濃度の
変化は、生体における情報伝達のメカニズムを構築する
一因になっていると考えられている。このため生体を研
究するに当たり、膜電位変化（活動電位すなわち一過性
の膜電位変化も含む。以下、同様。）や細胞内イオン濃
度変化を測定することが、重要になる。従来、膜電位の
測定には電極法が、イオン濃度変化の測定には蛍光観察
法が用いられていた。前者は、細胞で生じる膜電位変化
を細胞に予め刺した複数の電極で検出する方法である。
後者は、細胞をイオン濃度変化に応答し蛍光強度が変化
する蛍光色素により予め処理（染色）しておき、この蛍
光強度を観察する方法である。また、生体の研究におい
ては、膜電位変化とイオン濃度変化との相互関係をみる
ため、両変化を同時に測定することが多々ある。その場
合は、上記電極法と蛍光観察法とを組み合わせて当該測
定がなされていた。
細胞内のイオン濃度例えばカルシウム、カリウム、塩
素、ナトリウムなどの各イオンの濃度が変化することが
知られている。またこれら膜電位の変化やイオン濃度の
変化は、生体における情報伝達のメカニズムを構築する
一因になっていると考えられている。このため生体を研
究するに当たり、膜電位変化（活動電位すなわち一過性
の膜電位変化も含む。以下、同様。）や細胞内イオン濃
度変化を測定することが、重要になる。従来、膜電位の
測定には電極法が、イオン濃度変化の測定には蛍光観察
法が用いられていた。前者は、細胞で生じる膜電位変化
を細胞に予め刺した複数の電極で検出する方法である。
後者は、細胞をイオン濃度変化に応答し蛍光強度が変化
する蛍光色素により予め処理（染色）しておき、この蛍
光強度を観察する方法である。また、生体の研究におい
ては、膜電位変化とイオン濃度変化との相互関係をみる
ため、両変化を同時に測定することが多々ある。その場
合は、上記電極法と蛍光観察法とを組み合わせて当該測
定がなされていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところで、電極法で
は、その原理上細胞に電極を刺すことが不可欠となる。
しかし、カエル脳下垂体に代表される微細な神経繊維や
モルモット小腸自律神経細胞に代表される強固な結合組
織で覆われた細胞に電極を刺すことは困難である。この
ため、カエル脳下垂体やモルモット小腸自律神経細胞な
どついて、細胞内イオン濃度変化の測定および膜電位変
化の測定を同時に行なう場合は、細胞内イオン濃度変化
に応答し蛍光強度が変化する蛍光色素および膜電位変化
に応答し蛍光強度が変化する蛍光色素により測定対象の
生体組織を予め処理しておき、この生体組織からの蛍光
強度を観察する方法が考えられる。しかしながら、膜電
位変化の測定および細胞内のイオン濃度変化の測定を同
時に行なう際にこれらの測定に単に蛍光観察法を適用す
ると、例えば膜電位変化に応答し出力される蛍光の波長
とイオン濃度変化に応答し出力される蛍光の波長が近接
している場合などは両蛍光の分離が困難となるから、膜
電位変化および細胞内のイオン濃度変化の同時測定が行
なえない場合が生じる。また、両蛍光の波長が近接して
いないとしても、両蛍光を同時に測定するためには生体
組織から発せられる光を分割することになるが、そうす
ると蛍光光自体が減衰するのでＳ／Ｎ比の問題等でやは
り膜電位変化および細胞内のイオン濃度変化の同時測定
が行なえない場合が生じる。微細な細胞や強固な結合組
織で覆われた細胞などについても、膜電位変化の測定お
よび細胞内のイオン濃度変化の測定を同時に行なえる方
法が望まれる。
は、その原理上細胞に電極を刺すことが不可欠となる。
しかし、カエル脳下垂体に代表される微細な神経繊維や
モルモット小腸自律神経細胞に代表される強固な結合組
織で覆われた細胞に電極を刺すことは困難である。この
ため、カエル脳下垂体やモルモット小腸自律神経細胞な
どついて、細胞内イオン濃度変化の測定および膜電位変
化の測定を同時に行なう場合は、細胞内イオン濃度変化
に応答し蛍光強度が変化する蛍光色素および膜電位変化
に応答し蛍光強度が変化する蛍光色素により測定対象の
生体組織を予め処理しておき、この生体組織からの蛍光
強度を観察する方法が考えられる。しかしながら、膜電
位変化の測定および細胞内のイオン濃度変化の測定を同
時に行なう際にこれらの測定に単に蛍光観察法を適用す
ると、例えば膜電位変化に応答し出力される蛍光の波長
とイオン濃度変化に応答し出力される蛍光の波長が近接
している場合などは両蛍光の分離が困難となるから、膜
電位変化および細胞内のイオン濃度変化の同時測定が行
なえない場合が生じる。また、両蛍光の波長が近接して
いないとしても、両蛍光を同時に測定するためには生体
組織から発せられる光を分割することになるが、そうす
ると蛍光光自体が減衰するのでＳ／Ｎ比の問題等でやは
り膜電位変化および細胞内のイオン濃度変化の同時測定
が行なえない場合が生じる。微細な細胞や強固な結合組
織で覆われた細胞などについても、膜電位変化の測定お
よび細胞内のイオン濃度変化の測定を同時に行なえる方
法が望まれる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、この発明によれ
ば、細胞内イオン濃度変化および膜電位変化を同時に測
定するため、測定対象の生体組織を細胞内イオン濃度変
化に応答して蛍光強度が変化する第１の蛍光色素および
膜電位変化に応答して蛍光強度が変化する第２の蛍光色
素それぞれにより処理をし、該処理済みの生体組織に対
し前記第１の蛍光色素を励起する第１の励起光および前
記第２の蛍光色素を励起する第２の励起光を時分割で照
射すると共に、前記第１の励起光を照射するごとの前記
生体組織から発せられる蛍光強度を順次に記録し、か
つ、第２の励起光を照射するごとの前記生体組織から発
せられる蛍光強度を順次に記録することを特徴とする。
ば、細胞内イオン濃度変化および膜電位変化を同時に測
定するため、測定対象の生体組織を細胞内イオン濃度変
化に応答して蛍光強度が変化する第１の蛍光色素および
膜電位変化に応答して蛍光強度が変化する第２の蛍光色
素それぞれにより処理をし、該処理済みの生体組織に対
し前記第１の蛍光色素を励起する第１の励起光および前
記第２の蛍光色素を励起する第２の励起光を時分割で照
射すると共に、前記第１の励起光を照射するごとの前記
生体組織から発せられる蛍光強度を順次に記録し、か
つ、第２の励起光を照射するごとの前記生体組織から発
せられる蛍光強度を順次に記録することを特徴とする。
【０００５】ただし、この発明において前記第１の蛍光
色素は２種以上の細胞内イオンごとの２種以上の蛍光色
素であっても良い。その場合は、前記第１の励起光をこ
れら２種以上の蛍光色素ごとの励起光とし、前記時分割
による照射においては該蛍光色素ごとの励起光も時分割
照射し、かつ、蛍光強度の記録もこれら２種以上の蛍光
色素ごとにするものとする。
色素は２種以上の細胞内イオンごとの２種以上の蛍光色
素であっても良い。その場合は、前記第１の励起光をこ
れら２種以上の蛍光色素ごとの励起光とし、前記時分割
による照射においては該蛍光色素ごとの励起光も時分割
照射し、かつ、蛍光強度の記録もこれら２種以上の蛍光
色素ごとにするものとする。
【０００６】なお、この発明の実施に当たり、前記励起
光用の光源として前記第１の励起光および第２の励起光
を含む光を発する１つの光源を用い、前記各蛍光強度の
記録を共通の測定系により行なうものとし、および、前
記光源と生体組織との間に前記第１の励起光選択用フィ
ルタおよび前記第２の励起光選択用フィルタを前記時分
割で照射される励起光に対応する順で挿入し、かつ、該
生体組織と前記測定系との間に前記第１の蛍光色素から
の蛍光選択用フィルタおよび第２の蛍光色素からの蛍光
選択用フィルタを前記時分割で照射される励起光により
生じる蛍光光に対応する順で挿入するのが良い。こうす
ると光源および測定系それぞれを細胞内イオン濃度変化
の測定および膜電位変化の測定それぞれで共用できるか
らである。ただし、前記第１の蛍光色素を２種以上の異
なる細胞内イオンごとの２種以上の蛍光色素とする場合
は、この好適例においては、前記励起光選択用フィルタ
および蛍光選択用フィルタそれぞれは該２種以上の蛍光
色素用の励起光および蛍光を考慮した複数の波長選択フ
ィルタを含むものとする。
光用の光源として前記第１の励起光および第２の励起光
を含む光を発する１つの光源を用い、前記各蛍光強度の
記録を共通の測定系により行なうものとし、および、前
記光源と生体組織との間に前記第１の励起光選択用フィ
ルタおよび前記第２の励起光選択用フィルタを前記時分
割で照射される励起光に対応する順で挿入し、かつ、該
生体組織と前記測定系との間に前記第１の蛍光色素から
の蛍光選択用フィルタおよび第２の蛍光色素からの蛍光
選択用フィルタを前記時分割で照射される励起光により
生じる蛍光光に対応する順で挿入するのが良い。こうす
ると光源および測定系それぞれを細胞内イオン濃度変化
の測定および膜電位変化の測定それぞれで共用できるか
らである。ただし、前記第１の蛍光色素を２種以上の異
なる細胞内イオンごとの２種以上の蛍光色素とする場合
は、この好適例においては、前記励起光選択用フィルタ
および蛍光選択用フィルタそれぞれは該２種以上の蛍光
色素用の励起光および蛍光を考慮した複数の波長選択フ
ィルタを含むものとする。
【０００７】
【作用】この発明の構成によれば、測定対象の生体組織
に対し、細胞内イオン濃度変化を測定対象とする蛍光観
察法と、膜電位変化を測定対象とする蛍光観察法とが、
時分割の形で実施される。しかも、測定対象ごとに蛍光
強度が順次に記録される。ここで、膜電位変化および細
胞内イオン濃度変化おのおのは、時分割で測定されるか
ら、実際は連続するデータとならないのであるが、時分
割の間隔を適正化すれば、膜電位変化および細胞内イオ
ン濃度変化おのおのは、実質的に同時に測定されたもの
とみなせる。また、両測定を時分割により実施している
から、両測定の蛍光の波長が近接している場合であって
も、各蛍光は正確に測定できるし、また、蛍光を２分割
するようなことも必要ない。
に対し、細胞内イオン濃度変化を測定対象とする蛍光観
察法と、膜電位変化を測定対象とする蛍光観察法とが、
時分割の形で実施される。しかも、測定対象ごとに蛍光
強度が順次に記録される。ここで、膜電位変化および細
胞内イオン濃度変化おのおのは、時分割で測定されるか
ら、実際は連続するデータとならないのであるが、時分
割の間隔を適正化すれば、膜電位変化および細胞内イオ
ン濃度変化おのおのは、実質的に同時に測定されたもの
とみなせる。また、両測定を時分割により実施している
から、両測定の蛍光の波長が近接している場合であって
も、各蛍光は正確に測定できるし、また、蛍光を２分割
するようなことも必要ない。
【０００８】
【実施例】以下、図面を参照してこの発明の実施例につ
いて説明する。ただし、説明に用いる各図はこの発明を
理解出来る程度に概略的に示してある。また、説明に用
いる各図において同様な構成成分については同一の番号
を付し、その重複する説明を省略することもある。
いて説明する。ただし、説明に用いる各図はこの発明を
理解出来る程度に概略的に示してある。また、説明に用
いる各図において同様な構成成分については同一の番号
を付し、その重複する説明を省略することもある。
【０００９】１．用いた装置の説明 後にいくつかの実施例を挙げて細胞内イオンの濃度変化
と膜電位変化とをこの発明の方法により同時に測定する
例を説明するが、これら測定のためここでは図１〜図３
を参照して以下に説明するような測定装置を用いた。そ
こではじめにこの測定装置について説明する。ここで、
図１は測定装置１０の全体構成図、図２は第１の励起光
選択用フィルタ３５と第２の励起光選択用フィルタ３７
とを切り換えるための励起光選択用フィルタ切換手段３
０の説明図、図３は第１の蛍光選択用フィルタ４１と第
２の蛍光選択用フィルタ４３とを切り換えるための蛍光
選択用フィルタ切換手段４０の説明図である。
と膜電位変化とをこの発明の方法により同時に測定する
例を説明するが、これら測定のためここでは図１〜図３
を参照して以下に説明するような測定装置を用いた。そ
こではじめにこの測定装置について説明する。ここで、
図１は測定装置１０の全体構成図、図２は第１の励起光
選択用フィルタ３５と第２の励起光選択用フィルタ３７
とを切り換えるための励起光選択用フィルタ切換手段３
０の説明図、図３は第１の蛍光選択用フィルタ４１と第
２の蛍光選択用フィルタ４３とを切り換えるための蛍光
選択用フィルタ切換手段４０の説明図である。
【００１０】この測定装置１０は、倒立型蛍光顕微鏡
（以下、蛍光顕微鏡ともいう）２０と、励起光選択用フ
ィルタ切換手段３０と、蛍光選択用フィルタ切換手段４
０と、光源５０と、フォトダイオード６０と、制御手段
７０とを具える。なお、図１において８０は測定対象の
生体組織である。
（以下、蛍光顕微鏡ともいう）２０と、励起光選択用フ
ィルタ切換手段３０と、蛍光選択用フィルタ切換手段４
０と、光源５０と、フォトダイオード６０と、制御手段
７０とを具える。なお、図１において８０は測定対象の
生体組織である。
【００１１】ここで、蛍光顕微鏡２０は周知のものとで
きる。図１において、２０ａは対物レンズ、２０ｂはハ
ーフミラー、２０ｃ，２０ｄはそれぞれミラー、２０ｅ
は接眼レンズ、２０ｆは試料台をそれぞれ示す。
きる。図１において、２０ａは対物レンズ、２０ｂはハ
ーフミラー、２０ｃ，２０ｄはそれぞれミラー、２０ｅ
は接眼レンズ、２０ｆは試料台をそれぞれ示す。
【００１２】また、励起光選択用フィルタ切換手段３０
は、光源５０から発せられた光のうち、細胞内イオン濃
度変化に応答する第１の蛍光色素を励起するための第１
の励起光を測定対象の生体組織に選択的に送るか、膜電
位変化に応答する第２の蛍光色素を励起するための第２
の励起光を測定対象の生体組織に選択的に送るかを切り
換えるもので、ここでは以下に図２を用いて説明する構
成のものとしてある。すなわち、励起光選択用フィルタ
切換手段３０はこの場合、容器３１と、回転円板円板３
３と、第１の励起光選択用フィルタ３５と、第２の励起
光選択用フィルタ３７と、回転円板駆動手段３９とで構
成してある。ただし、容器３１はその壁面のうちの対向
する壁面３１ａ，３１ｂに光透過用の互いに対向する窓
３１ｘを有したものとしてある。また、回転円板３３は
その板面が容器３１の壁面３１ａ，３１ｂに対向するよ
う容器３１内に収納されていて、然も、板面の所定の複
数位置に第１及び第２の励起光選択用フィルタ３５，３
７を設置するための開口部を有したものとなっている。
この所定位置とは、この場合、円板３１における容器３
１の窓３１ｘと対向し得る円周上であって、１８０°ず
れた２個所としてある。また第１及び第２の励起光選択
用フィルタ３５、３７は、任意好適なもので構成出来る
が、ここでは干渉フィルタで構成してある。また、回転
円板駆動手段３９は例えばモータで構成でき出来制御手
段７０によって制御されるものである。
は、光源５０から発せられた光のうち、細胞内イオン濃
度変化に応答する第１の蛍光色素を励起するための第１
の励起光を測定対象の生体組織に選択的に送るか、膜電
位変化に応答する第２の蛍光色素を励起するための第２
の励起光を測定対象の生体組織に選択的に送るかを切り
換えるもので、ここでは以下に図２を用いて説明する構
成のものとしてある。すなわち、励起光選択用フィルタ
切換手段３０はこの場合、容器３１と、回転円板円板３
３と、第１の励起光選択用フィルタ３５と、第２の励起
光選択用フィルタ３７と、回転円板駆動手段３９とで構
成してある。ただし、容器３１はその壁面のうちの対向
する壁面３１ａ，３１ｂに光透過用の互いに対向する窓
３１ｘを有したものとしてある。また、回転円板３３は
その板面が容器３１の壁面３１ａ，３１ｂに対向するよ
う容器３１内に収納されていて、然も、板面の所定の複
数位置に第１及び第２の励起光選択用フィルタ３５，３
７を設置するための開口部を有したものとなっている。
この所定位置とは、この場合、円板３１における容器３
１の窓３１ｘと対向し得る円周上であって、１８０°ず
れた２個所としてある。また第１及び第２の励起光選択
用フィルタ３５、３７は、任意好適なもので構成出来る
が、ここでは干渉フィルタで構成してある。また、回転
円板駆動手段３９は例えばモータで構成でき出来制御手
段７０によって制御されるものである。
【００１３】また、蛍光選択用フィルタ切換手段４０
は、測定対象の生体組織に取り込まれた第１の蛍光色素
から発せられる蛍光を選択的にフォトダイオード６０に
送るか、同じく取り込まれた第２の色素から発せられる
蛍光を選択的にフォトダイオード６０に送るかを切り換
えるもので、用いるフィルタを、第１の蛍光色素からの
蛍光を選択する透過波長を有するフィルタ４１および第
２の蛍光色素からの蛍光を選択する透過波長を有するフ
ィルタ４３とした点が異なること以外は（図３参照）、
基本的には励起光選択用フィルタ切換手段３０と同じ構
成としてある。
は、測定対象の生体組織に取り込まれた第１の蛍光色素
から発せられる蛍光を選択的にフォトダイオード６０に
送るか、同じく取り込まれた第２の色素から発せられる
蛍光を選択的にフォトダイオード６０に送るかを切り換
えるもので、用いるフィルタを、第１の蛍光色素からの
蛍光を選択する透過波長を有するフィルタ４１および第
２の蛍光色素からの蛍光を選択する透過波長を有するフ
ィルタ４３とした点が異なること以外は（図３参照）、
基本的には励起光選択用フィルタ切換手段３０と同じ構
成としてある。
【００１４】上述の励起光選択用フィルタ切換手段３０
および蛍光選択用フィルタ切換手段４０それぞれは、所
定の複数のフィルタを有した回転円板３１を回転させて
フィルタの切換をするので、例えば個々にフィルタを切
換挿入したり、複数のフィルタを直線状に配置しこれを
スライドさせてフィルタを切換挿入する場合に比べ、フ
ィルタの切換が容易である。
および蛍光選択用フィルタ切換手段４０それぞれは、所
定の複数のフィルタを有した回転円板３１を回転させて
フィルタの切換をするので、例えば個々にフィルタを切
換挿入したり、複数のフィルタを直線状に配置しこれを
スライドさせてフィルタを切換挿入する場合に比べ、フ
ィルタの切換が容易である。
【００１５】また、光源５０は、上記第１の蛍光色素を
励起するための第１の励起光と上記第２の蛍光色素を励
起するための第２の励起光を少なくとも含む光を発する
もので、この場合はキセノンアークランプで構成してあ
る。
励起するための第１の励起光と上記第２の蛍光色素を励
起するための第２の励起光を少なくとも含む光を発する
もので、この場合はキセノンアークランプで構成してあ
る。
【００１６】また、フォトダイオード６０は、測定対象
の生体組織８０から蛍光顕微鏡を経て送られてくる蛍光
を測定するもので、周知のもので構成してある。
の生体組織８０から蛍光顕微鏡を経て送られてくる蛍光
を測定するもので、周知のもので構成してある。
【００１７】また、制御手段７０は、励起光選択用フィ
ルタ切換手段３０、蛍光選択用フィルタ切換手段４０に
備わる各回転円板３１を所定の速度でかつ手段３０側の
各フィルタ３３または３５と、手段４０側の各フィルタ
４１または４３とが、所定の関係で同期するよう制御す
ること、および、フォトダイオード６０からの出力を時
系列が分かる状態で記録する機能を有したものである。
ルタ切換手段３０、蛍光選択用フィルタ切換手段４０に
備わる各回転円板３１を所定の速度でかつ手段３０側の
各フィルタ３３または３５と、手段４０側の各フィルタ
４１または４３とが、所定の関係で同期するよう制御す
ること、および、フォトダイオード６０からの出力を時
系列が分かる状態で記録する機能を有したものである。
【００１８】これら構成成分２０、３０、４０、５０、
６０を、光源５０から出た励起光が励起光選択用フィル
タ切換手段３０を介し生体組織８０の蛍光色素を励起出
来、かつ、生体組織に取り込まれた蛍光色素からの蛍光
が蛍光選択用フィルタ選択手段４０を介しフォトダイオ
ード６０に入力出来るように、図１に示す様に配置す
る。
６０を、光源５０から出た励起光が励起光選択用フィル
タ切換手段３０を介し生体組織８０の蛍光色素を励起出
来、かつ、生体組織に取り込まれた蛍光色素からの蛍光
が蛍光選択用フィルタ選択手段４０を介しフォトダイオ
ード６０に入力出来るように、図１に示す様に配置す
る。
【００１９】２．測定例の説明 次に、細胞内イオン濃度変化および膜電位変化を同時に
測定するいくつかの例を説明する。
測定するいくつかの例を説明する。
【００２０】２−１．第１実施例 先ず、測定対象の生体組織をカエル脳下垂体とし、この
カエル脳下垂体における細胞内カルシウムイオン濃度変
化および膜電位変化を、この発明の方法により以下に説
明するように測定する。
カエル脳下垂体における細胞内カルシウムイオン濃度変
化および膜電位変化を、この発明の方法により以下に説
明するように測定する。
【００２１】このため、カエル脳下垂体を第１および第
２の蛍光色素で処理する。これをこの実施例では次の様
に行なう。細胞内イオン濃度変化に応答して蛍光強度が
変化する第１の蛍光色素としてカルシウムイオン濃度変
化に応答するＦｕｒａ２−ＡＭ（Ｓｉｇｍａ社製）を３
０μｇ／ｍｌの濃度で、および、膜電位に応答して蛍光
強度が変化する第２の蛍光色素（すなわち膜電位感受性
蛍光色素）としてＭ５４０（コダック社製）を１０μｇ
／ｍｌの濃度でそれぞれ含み、かつ、ｐＨが７．５に調
整されたリンゲル液を用意する。ここで、Ｆｕｒａ２−
ＡＭは波長３４０ｎｍの光で励起されて波長５００ｎｍ
の蛍光を発するものである。また、Ｍ５４０は波長５３
０ｎｍの光で励起されて波長５８０ｎｍの蛍光を発する
ものである。次に、体長約５ｃｍのアフリカツメガエル
（Xenopus ）から抽出した下垂体をこのリンゲル液中に
３０分浸漬する。これにより、カエル脳下垂体に対する
第１及び第２の色素による処理が行なえる。その後、こ
の試料をリンゲル液で洗浄する。このように蛍光色素に
よる処理の済んだカエル脳下垂体を、リンゲル液を満た
してあるシャーレ中に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の
試料台２０ｆ上に置く。
２の蛍光色素で処理する。これをこの実施例では次の様
に行なう。細胞内イオン濃度変化に応答して蛍光強度が
変化する第１の蛍光色素としてカルシウムイオン濃度変
化に応答するＦｕｒａ２−ＡＭ（Ｓｉｇｍａ社製）を３
０μｇ／ｍｌの濃度で、および、膜電位に応答して蛍光
強度が変化する第２の蛍光色素（すなわち膜電位感受性
蛍光色素）としてＭ５４０（コダック社製）を１０μｇ
／ｍｌの濃度でそれぞれ含み、かつ、ｐＨが７．５に調
整されたリンゲル液を用意する。ここで、Ｆｕｒａ２−
ＡＭは波長３４０ｎｍの光で励起されて波長５００ｎｍ
の蛍光を発するものである。また、Ｍ５４０は波長５３
０ｎｍの光で励起されて波長５８０ｎｍの蛍光を発する
ものである。次に、体長約５ｃｍのアフリカツメガエル
（Xenopus ）から抽出した下垂体をこのリンゲル液中に
３０分浸漬する。これにより、カエル脳下垂体に対する
第１及び第２の色素による処理が行なえる。その後、こ
の試料をリンゲル液で洗浄する。このように蛍光色素に
よる処理の済んだカエル脳下垂体を、リンゲル液を満た
してあるシャーレ中に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の
試料台２０ｆ上に置く。
【００２２】また、図１〜図３を用いて説明した測定装
置に、フィルタ３５として透過波長が３４０ｎｍでかつ
透過帯域幅が２０ｎｍのフィルタを、またフィルタ３７
として透過波長が５３０ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎ
ｍのフィルタを、またフィルタ４１として透過波長が５
００ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタを、ま
たフィルタ４３として透過波長が５８０ｎｍでかつ透過
帯域幅が２０ｎｍのフィルタを、それぞれ設置する。ま
た、蛍光顕微鏡２０の倍率を２０倍とする。この倍率は
蛍光測定に好適な様に設定されたものである。もちろ
ん、この倍率は一例である。
置に、フィルタ３５として透過波長が３４０ｎｍでかつ
透過帯域幅が２０ｎｍのフィルタを、またフィルタ３７
として透過波長が５３０ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎ
ｍのフィルタを、またフィルタ４１として透過波長が５
００ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタを、ま
たフィルタ４３として透過波長が５８０ｎｍでかつ透過
帯域幅が２０ｎｍのフィルタを、それぞれ設置する。ま
た、蛍光顕微鏡２０の倍率を２０倍とする。この倍率は
蛍光測定に好適な様に設定されたものである。もちろ
ん、この倍率は一例である。
【００２３】次に、光源５０からの出力光の光軸上に透
過波長が３４０ｎｍであるフィルタ３５が位置した時
は、フォトダイオード６０への蛍光の光軸上に透過波長
が５００ｎｍであるフィルタ４１が位置するように、一
方、光源５０からの出力光の光軸上に透過波長が５３０
ｎｍであるフィルタ３７が位置した時は、フォトダイオ
ード６０への蛍光の光軸上に透過波長が５８０ｎｍであ
るフィルタ４３が位置するように、各フィルタの同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。ここで、前者のフィルタ
位置はカルシウムイオン濃度変化の測定モードとなり、
後者のフィルタ位置は膜電位変化の測定モードとなる。
またここでは、回転円板３１を１０6 回／秒の速度で回
転させた。もちろん、この回転速度は設計に応じ変更出
来る。ただし、この測定装置１０の場合は、この回転円
板３１の回転速度でイオン濃度変化、膜電位変化おのお
ののサンプリング周期したがってデータの分解能が決ま
るので、上記回転速度の決定はこの点を考慮する。
過波長が３４０ｎｍであるフィルタ３５が位置した時
は、フォトダイオード６０への蛍光の光軸上に透過波長
が５００ｎｍであるフィルタ４１が位置するように、一
方、光源５０からの出力光の光軸上に透過波長が５３０
ｎｍであるフィルタ３７が位置した時は、フォトダイオ
ード６０への蛍光の光軸上に透過波長が５８０ｎｍであ
るフィルタ４３が位置するように、各フィルタの同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。ここで、前者のフィルタ
位置はカルシウムイオン濃度変化の測定モードとなり、
後者のフィルタ位置は膜電位変化の測定モードとなる。
またここでは、回転円板３１を１０6 回／秒の速度で回
転させた。もちろん、この回転速度は設計に応じ変更出
来る。ただし、この測定装置１０の場合は、この回転円
板３１の回転速度でイオン濃度変化、膜電位変化おのお
ののサンプリング周期したがってデータの分解能が決ま
るので、上記回転速度の決定はこの点を考慮する。
【００２４】また、測定時は、第１の励起光である波長
３４０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を順次
に記録し、かつ、第２の励起光である波長５３０ｎｍの
励起光が照射されるごとの蛍光強度を順次に記録する。
それぞれの蛍光強度のデータを時系列に並べると、細胞
内のカルシウム濃度変化および膜電位変化を実質同時に
測定出来たことになる。図４はこの結果を示した特性図
である。図４において破線Ｉが細胞内カルシウムイオン
濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電
位変化に対応する蛍光強度変化である。なお、図４にお
いて横軸は時間（秒）であり縦軸は蛍光強度（任意単
位）である。この図４から、微細な神経繊維に相当する
カエル脳下垂体であっても、細胞内カルシウムイオン濃
度変化および膜電位変化共に良好に測定できていること
が分かる。また図４から、カエル脳下垂体で特徴的なカ
ルシウムチャネルの開閉に起因するダウンストローク
（図中Ｐ）と細胞内カルシウム濃度の上昇とが一致して
いるのが分かる。
３４０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を順次
に記録し、かつ、第２の励起光である波長５３０ｎｍの
励起光が照射されるごとの蛍光強度を順次に記録する。
それぞれの蛍光強度のデータを時系列に並べると、細胞
内のカルシウム濃度変化および膜電位変化を実質同時に
測定出来たことになる。図４はこの結果を示した特性図
である。図４において破線Ｉが細胞内カルシウムイオン
濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電
位変化に対応する蛍光強度変化である。なお、図４にお
いて横軸は時間（秒）であり縦軸は蛍光強度（任意単
位）である。この図４から、微細な神経繊維に相当する
カエル脳下垂体であっても、細胞内カルシウムイオン濃
度変化および膜電位変化共に良好に測定できていること
が分かる。また図４から、カエル脳下垂体で特徴的なカ
ルシウムチャネルの開閉に起因するダウンストローク
（図中Ｐ）と細胞内カルシウム濃度の上昇とが一致して
いるのが分かる。
【００２５】２−２．第２実施例 また、測定対象の生体組織をモルモット小腸自律神経
（submucous plexus）とし、このモルモット小腸自律神
経における細胞内カルシウムイオン濃度変化および膜電
位変化をこの発明の方法により以下に説明するように測
定する。
（submucous plexus）とし、このモルモット小腸自律神
経における細胞内カルシウムイオン濃度変化および膜電
位変化をこの発明の方法により以下に説明するように測
定する。
【００２６】このため、体重約１５０ｇの生後２週間の
モルモットから小腸自律神経を抽出する。この抽出した
小腸自律神経を、９５％酸素／５％二酸化炭素の環流に
より酸素濃度を上げたリンゲル液であって上記Ｆｕｒａ
２−ＡＭを３０μｇ／ｍｌの濃度で、および、小腸自律
神経用に適した膜電位感受性蛍光色素としてＤｉ−８−
ＡＮＮＥＰＳを１００μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ含
み、かつ、ｐＨを７．０に調整したリンゲル液中に、１
０分間浸漬する。これにより小腸自律神経に対する第１
および第２の蛍光色素による処理が行なえる。その後、
この試料をリンゲル液で清浄する。次に、この試料を、
それが死ぬのを防ぐため、９５％酸素／５％二酸化炭素
の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液（所定のリン
ゲル液）が満たされかつ循環されているシャーレ）に入
れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上に置い
た。なお、ここで用いた膜電位感受性蛍光色素Ｄｉ−８
−ＡＮＮＥＰＳは、たとえば文献Ｉ（ハ゛イオフィシ゛ックスシ゛ャーナ
ル(Biophys.J.)(1994)67(1) 208-16）に開示されている
ものであり、この出願に係る発明者が入手したものであ
る。また、この膜電位感受性蛍光色素Ｄｉ−８−ＡＮＮ
ＥＰＳは、波長５３０ｎｍの励起光で励起されて波長５
８０ｎｍの蛍光を発するものである。またこの第２実施
例では、蛍光顕微鏡２０の倍率は１００倍とする。
モルモットから小腸自律神経を抽出する。この抽出した
小腸自律神経を、９５％酸素／５％二酸化炭素の環流に
より酸素濃度を上げたリンゲル液であって上記Ｆｕｒａ
２−ＡＭを３０μｇ／ｍｌの濃度で、および、小腸自律
神経用に適した膜電位感受性蛍光色素としてＤｉ−８−
ＡＮＮＥＰＳを１００μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ含
み、かつ、ｐＨを７．０に調整したリンゲル液中に、１
０分間浸漬する。これにより小腸自律神経に対する第１
および第２の蛍光色素による処理が行なえる。その後、
この試料をリンゲル液で清浄する。次に、この試料を、
それが死ぬのを防ぐため、９５％酸素／５％二酸化炭素
の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液（所定のリン
ゲル液）が満たされかつ循環されているシャーレ）に入
れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上に置い
た。なお、ここで用いた膜電位感受性蛍光色素Ｄｉ−８
−ＡＮＮＥＰＳは、たとえば文献Ｉ（ハ゛イオフィシ゛ックスシ゛ャーナ
ル(Biophys.J.)(1994)67(1) 208-16）に開示されている
ものであり、この出願に係る発明者が入手したものであ
る。また、この膜電位感受性蛍光色素Ｄｉ−８−ＡＮＮ
ＥＰＳは、波長５３０ｎｍの励起光で励起されて波長５
８０ｎｍの蛍光を発するものである。またこの第２実施
例では、蛍光顕微鏡２０の倍率は１００倍とする。
【００２７】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３４０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図５はこの結果を示した特性図で
ある。図５において破線Ｉが細胞内カルシウムイオン濃
度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位
変化に対応する蛍光強度変化である。この図５から、強
固な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経で
あっても、細胞内カルシウムイオン濃度変化および膜電
位変化共に良好に測定できていることが分かる。また図
５から、急峻な膜電位変化（活動電位）の後にゆっくり
としたカルシウム濃度の上昇が見られることが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３４０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図５はこの結果を示した特性図で
ある。図５において破線Ｉが細胞内カルシウムイオン濃
度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位
変化に対応する蛍光強度変化である。この図５から、強
固な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経で
あっても、細胞内カルシウムイオン濃度変化および膜電
位変化共に良好に測定できていることが分かる。また図
５から、急峻な膜電位変化（活動電位）の後にゆっくり
としたカルシウム濃度の上昇が見られることが分かる。
【００２８】２−３．第３実施例 また、カエル脳下垂体における細胞内カリウムイオン濃
度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以下に
説明するように測定する。
度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以下に
説明するように測定する。
【００２９】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、細胞内カリウムイオン濃度変化に応
答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＰＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第１実施例と同様にして、カエル脳下垂体
に対する蛍光色素による処理をする。そして、この生体
組織を、第１実施例と同様に、リンゲル液を満たしたシ
ャーレに入れた状態で蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置く。なお、ＰＢＦＩ−ＡＭは波長３６０ｎｍの光で
励起されて波長５７０ｎｍの蛍光を発するものである。
る蛍光色素として、細胞内カリウムイオン濃度変化に応
答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＰＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第１実施例と同様にして、カエル脳下垂体
に対する蛍光色素による処理をする。そして、この生体
組織を、第１実施例と同様に、リンゲル液を満たしたシ
ャーレに入れた状態で蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置く。なお、ＰＢＦＩ−ＡＭは波長３６０ｎｍの光で
励起されて波長５７０ｎｍの蛍光を発するものである。
【００３０】また、細胞内イオン濃度変化に応答する蛍
光色素をＰＢＦＩ−ＡＭに代えたことに対応して、図１
〜図３を用いて説明した測定装置におけるフィルタ３５
を透過波長が３６０ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍの
フィルタに交換し、かつ、フィルタ４１を透過波長が５
７０ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換
する。
光色素をＰＢＦＩ−ＡＭに代えたことに対応して、図１
〜図３を用いて説明した測定装置におけるフィルタ３５
を透過波長が３６０ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍの
フィルタに交換し、かつ、フィルタ４１を透過波長が５
７０ｎｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換
する。
【００３１】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３６０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図６はこの結果を示した特性図で
ある。図６において破線Ｉが細胞内カリウムイオン濃度
変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変
化に対応する蛍光強度変化である。この図６から、微細
な神経繊維に相当するカエル脳下垂体であっても、細胞
内カリウムイオン濃度変化および膜電位変化共に良好に
測定できていることが分かる。また図６から、カエル脳
下垂体で特徴的なカリウム依存性カリウムチャネルの開
閉に起因するダウンストローク（図中Ｐ）と細胞内カリ
ウム濃度の上昇とが一致しているのが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３６０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図６はこの結果を示した特性図で
ある。図６において破線Ｉが細胞内カリウムイオン濃度
変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変
化に対応する蛍光強度変化である。この図６から、微細
な神経繊維に相当するカエル脳下垂体であっても、細胞
内カリウムイオン濃度変化および膜電位変化共に良好に
測定できていることが分かる。また図６から、カエル脳
下垂体で特徴的なカリウム依存性カリウムチャネルの開
閉に起因するダウンストローク（図中Ｐ）と細胞内カリ
ウム濃度の上昇とが一致しているのが分かる。
【００３２】２−４．第４実施例 また、モルモット小腸自律神経における細胞内カリウム
イオン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法によ
り以下に説明するように測定する。
イオン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法によ
り以下に説明するように測定する。
【００３３】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、細胞内カリウムイオン濃度変化に応
答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＰＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第２実施例と同様にして、モルモット小腸
自律神経に対する蛍光色素による処理をする。そして第
２実施例同様に、この生体組織を９５％酸素／５％二酸
化炭素の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液（所定
のリンゲル液）が満たされかつ循環されているシャー
レ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置いた。
る蛍光色素として、細胞内カリウムイオン濃度変化に応
答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＰＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第２実施例と同様にして、モルモット小腸
自律神経に対する蛍光色素による処理をする。そして第
２実施例同様に、この生体組織を９５％酸素／５％二酸
化炭素の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液（所定
のリンゲル液）が満たされかつ循環されているシャー
レ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置いた。
【００３４】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３６０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図７はこの結果を示した特性図で
ある。図７において破線Ｉが細胞内カリウムイオン濃度
変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変
化に対応する蛍光強度変化である。この図７から、強固
な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経であ
っても、細胞内カリウムイオン濃度変化および膜電位変
化共に良好に測定できていることが分かる。また図７か
ら、急峻な膜電位変化（活動電位）の後にゆっくりとし
たカリウム濃度の上昇が見られることが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３６０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図７はこの結果を示した特性図で
ある。図７において破線Ｉが細胞内カリウムイオン濃度
変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変
化に対応する蛍光強度変化である。この図７から、強固
な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経であ
っても、細胞内カリウムイオン濃度変化および膜電位変
化共に良好に測定できていることが分かる。また図７か
ら、急峻な膜電位変化（活動電位）の後にゆっくりとし
たカリウム濃度の上昇が見られることが分かる。
【００３５】２−５．第５実施例 また、カエル脳下垂体における細胞内塩素イオン濃度変
化および膜電位変化をこの発明の方法により以下に説明
するように測定する。
化および膜電位変化をこの発明の方法により以下に説明
するように測定する。
【００３６】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、塩素イオン濃度変化に応答して蛍光
強度が変化する蛍光色素である６−メトキシ−Ｎ−３−
サルフォプロピル−キノリニウム［6-Methoxy-N-(3-Sul
fopropyl)-Quinolinium-］（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μ
ｇ／ｍｌの濃度で用いること以外は、第１実施例と同様
にして、カエル脳下垂体に対する蛍光色素による処理を
する。そして、この生体組織を、第１実施例と同様に、
リンゲル液を満たしたシャーレに入れた状態で蛍光顕微
鏡２０の試料台２０ｆ上に置く。なお、６−メトキシ−
Ｎ−３−サルフォプロピル−キノリニウムは波長３５０
ｎｍの光で励起されて波長４５０ｎｍの蛍光を発するも
のである。
る蛍光色素として、塩素イオン濃度変化に応答して蛍光
強度が変化する蛍光色素である６−メトキシ−Ｎ−３−
サルフォプロピル−キノリニウム［6-Methoxy-N-(3-Sul
fopropyl)-Quinolinium-］（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μ
ｇ／ｍｌの濃度で用いること以外は、第１実施例と同様
にして、カエル脳下垂体に対する蛍光色素による処理を
する。そして、この生体組織を、第１実施例と同様に、
リンゲル液を満たしたシャーレに入れた状態で蛍光顕微
鏡２０の試料台２０ｆ上に置く。なお、６−メトキシ−
Ｎ−３−サルフォプロピル−キノリニウムは波長３５０
ｎｍの光で励起されて波長４５０ｎｍの蛍光を発するも
のである。
【００３７】また、細胞内イオン濃度変化に応答する蛍
光色素を６−メトキシ−Ｎ−３−サルフォプロピル−キ
ノリニウムに代えたことに対応して、図１〜図３を用い
て説明した測定装置におけるフィルタ３５を透過波長が
３５０ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍのフィルタに交
換し、かつ、フィルタ４１を透過波長が４５０ｎｍでか
つ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換する。
光色素を６−メトキシ−Ｎ−３−サルフォプロピル−キ
ノリニウムに代えたことに対応して、図１〜図３を用い
て説明した測定装置におけるフィルタ３５を透過波長が
３５０ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍのフィルタに交
換し、かつ、フィルタ４１を透過波長が４５０ｎｍでか
つ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換する。
【００３８】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３５０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図８はこの結果を示した特性図で
ある。図８において破線Ｉが細胞内塩素イオン濃度変化
に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変化に
対応する蛍光強度変化である。この図８から、微細な神
経繊維に相当するカエル脳下垂体であっても、細胞内塩
素イオン濃度変化および膜電位変化共に良好に測定でき
ていることが分かる。また図８から、カエル脳下垂体で
神経パルスの発生初期に塩素の移動が起きていることが
分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３５０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図８はこの結果を示した特性図で
ある。図８において破線Ｉが細胞内塩素イオン濃度変化
に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変化に
対応する蛍光強度変化である。この図８から、微細な神
経繊維に相当するカエル脳下垂体であっても、細胞内塩
素イオン濃度変化および膜電位変化共に良好に測定でき
ていることが分かる。また図８から、カエル脳下垂体で
神経パルスの発生初期に塩素の移動が起きていることが
分かる。
【００３９】２−６．第６実施例 また、モルモット小腸自律神経における細胞内塩素イオ
ン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以
下に説明するように測定する。
ン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以
下に説明するように測定する。
【００４０】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、細胞内塩素イオン濃度変化に応答し
て蛍光強度が変化する蛍光色素である６−メトキシ−Ｎ
−３−サルフォプロピル−キノリニウムを３０μｇ／ｍ
ｌの濃度で用いること以外は、第２実施例と同様にし
て、モルモット小腸自律神経に対する蛍光色素による処
理をする。そして、第２実施例同様に、この生体組織を
９５％酸素／５％二酸化炭素の環流により酸素濃度を上
げたリンゲル液（所定のリンゲル液）が満たされかつ循
環されているシャーレ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２
０の試料台２０ｆ上に置いた。
る蛍光色素として、細胞内塩素イオン濃度変化に応答し
て蛍光強度が変化する蛍光色素である６−メトキシ−Ｎ
−３−サルフォプロピル−キノリニウムを３０μｇ／ｍ
ｌの濃度で用いること以外は、第２実施例と同様にし
て、モルモット小腸自律神経に対する蛍光色素による処
理をする。そして、第２実施例同様に、この生体組織を
９５％酸素／５％二酸化炭素の環流により酸素濃度を上
げたリンゲル液（所定のリンゲル液）が満たされかつ循
環されているシャーレ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２
０の試料台２０ｆ上に置いた。
【００４１】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３５０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図９はこの結果を示した特性図で
ある。図９において破線Ｉが細胞内塩素イオン濃度変化
に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変化に
対応する蛍光強度変化である。この図９から、強固な結
合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経であって
も、細胞内塩素イオン濃度変化および膜電位変化共に良
好に測定できていることが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長３５０ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図９はこの結果を示した特性図で
ある。図９において破線Ｉが細胞内塩素イオン濃度変化
に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜電位変化に
対応する蛍光強度変化である。この図９から、強固な結
合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律神経であって
も、細胞内塩素イオン濃度変化および膜電位変化共に良
好に測定できていることが分かる。
【００４２】２−７．第７実施例 また、カエル脳下垂体における細胞内ナトリウムイオン
濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以下
に説明するように測定する。
濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法により以下
に説明するように測定する。
【００４３】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、細胞内ナトリウムイオン濃度変化に
応答し蛍光強度が変化する蛍光色素であるＳＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第１実施例と同様にして、カエル脳下垂体
に対する蛍光色素による処理をする。そして、この生体
組織を、第１実施例と同様に、リンゲル液を満たしたシ
ャーレに入れた状態で蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置く。なお、ＳＢＦＩ−ＡＭは波長４００ｎｍの光で
励起されて波長５７０ｎｍの蛍光を発するものである。
る蛍光色素として、細胞内ナトリウムイオン濃度変化に
応答し蛍光強度が変化する蛍光色素であるＳＢＦＩ−Ａ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用いる
こと以外は、第１実施例と同様にして、カエル脳下垂体
に対する蛍光色素による処理をする。そして、この生体
組織を、第１実施例と同様に、リンゲル液を満たしたシ
ャーレに入れた状態で蛍光顕微鏡２０の試料台２０ｆ上
に置く。なお、ＳＢＦＩ−ＡＭは波長４００ｎｍの光で
励起されて波長５７０ｎｍの蛍光を発するものである。
【００４４】また、細胞内イオン濃度変化に応答する蛍
光色素をＳＢＦＩ−ＡＭに代えたことに対応して、図１
〜図３を用いて説明した測定装置におけるフィルタ３５
を透過波長が４００ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍの
フィルタに交換し、フィルタ４１を透過波長が５７０ｎ
ｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換する。
光色素をＳＢＦＩ−ＡＭに代えたことに対応して、図１
〜図３を用いて説明した測定装置におけるフィルタ３５
を透過波長が４００ｎｍでかつ透過帯域幅が２０ｎｍの
フィルタに交換し、フィルタ４１を透過波長が５７０ｎ
ｍでかつ透過帯域幅が１０ｎｍのフィルタに交換する。
【００４５】次に、第１実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長４００ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図１０はこの結果を示した特性図
である。図１０において破線Ｉが細胞内ナトリウムイオ
ン濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜
電位変化に対応する蛍光強度変化である。この図１０か
ら、微細な神経繊維に相当するカエル脳下垂体であって
も、細胞内ナトリウムイオン濃度変化および膜電位変化
共に良好に測定できていることが分かる。また図１０か
ら、カエル脳下垂体で神経パルスの発生初期にナトリウ
ムの移動が起きていることが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長４００ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図１０はこの結果を示した特性図
である。図１０において破線Ｉが細胞内ナトリウムイオ
ン濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜
電位変化に対応する蛍光強度変化である。この図１０か
ら、微細な神経繊維に相当するカエル脳下垂体であって
も、細胞内ナトリウムイオン濃度変化および膜電位変化
共に良好に測定できていることが分かる。また図１０か
ら、カエル脳下垂体で神経パルスの発生初期にナトリウ
ムの移動が起きていることが分かる。
【００４６】２−８．第８実施例 また、モルモット小腸自律神経における細胞内ナトリウ
ムイオン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法に
より以下に説明するように測定する。
ムイオン濃度変化および膜電位変化をこの発明の方法に
より以下に説明するように測定する。
【００４７】このため、細胞内イオン濃度変化に応答す
る蛍光色素として、細胞内ナトリウムイオン濃度変化に
応答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＳＢＦＩ−
ＡＭ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用い
ること以外は、第２実施例と同様にして、モルモット小
腸自律神経に対する蛍光色素による処理をする。そし
て、第２実施例同様に、この生体組織を９５％酸素／５
％二酸化炭素の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液
（所定のリンゲル液）が満たされかつ循環されているシ
ャーレ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０
ｆ上に置いた。
る蛍光色素として、細胞内ナトリウムイオン濃度変化に
応答して蛍光強度が変化する蛍光色素であるＳＢＦＩ−
ＡＭ（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｇ／ｍｌの濃度で用い
ること以外は、第２実施例と同様にして、モルモット小
腸自律神経に対する蛍光色素による処理をする。そし
て、第２実施例同様に、この生体組織を９５％酸素／５
％二酸化炭素の環流により酸素濃度を上げたリンゲル液
（所定のリンゲル液）が満たされかつ循環されているシ
ャーレ）に入れた状態で、蛍光顕微鏡２０の試料台２０
ｆ上に置いた。
【００４８】次に、第７実施例において説明したと同様
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長４００ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図１１はこの結果を示した特性図
である。図１１において破線Ｉが細胞内ナトリウムイオ
ン濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜
電位変化に対応する蛍光強度変化である。この図１１か
ら、強固な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律
神経であっても、細胞内ナトリウムイオン濃度変化およ
び膜電位変化共に良好に測定できていることが分かる。
また図１１から、急峻な細胞内ナトリウム濃度の上昇が
見られることが分かる。
な手順で、各フィルタ３５、３７、４１、４３の同期を
確保しつつ、フィルタ選択手段３０、４０の回転円板３
１を、所定速度で回転させる。また、測定時は、第１の
励起光である波長４００ｎｍの励起光が照射されるごと
の蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光である
波長５３０ｎｍの励起光が照射されるごとの蛍光強度を
順次に記録する。それぞれの蛍光強度のデータを図４と
同様にプロットする。図１１はこの結果を示した特性図
である。図１１において破線Ｉが細胞内ナトリウムイオ
ン濃度変化に対応する蛍光強度変化であり、実線IIが膜
電位変化に対応する蛍光強度変化である。この図１１か
ら、強固な結合組織で覆われた細胞に相当する小腸自律
神経であっても、細胞内ナトリウムイオン濃度変化およ
び膜電位変化共に良好に測定できていることが分かる。
また図１１から、急峻な細胞内ナトリウム濃度の上昇が
見られることが分かる。
【００４９】上述においては、この発明のいくつかの実
施例について説明したがこの発明は上述の実施例に限ら
れない。例えば、上述では膜電位変化および１種の細胞
内イオンの濃度変化を同時に測定する例を説明したが、
膜電位変化と例えば２種以上の細胞内イオン濃度のそれ
ぞれの変化とを同時に測定することも可能と考える。一
例で説明すれば、例えば細胞内カルシウムイオンに応答
して蛍光強度が変化する蛍光色素と、細胞内ナトリウム
イオンに応答して蛍光強度が変化する蛍光色素とを、膜
電位感受性蛍光色素と共に用いて生体組織を処理し、そ
の後、３種類の蛍光色素について時分割による励起光照
射や蛍光強度記録を処理をするようにすれば、細胞内カ
ルシウムイオン濃度変化、細胞内ナトリウムイオン濃度
変化および膜電位変化を同時に測定できると考える。ま
た上述において説明した測定装置は一例にすぎず、他の
任意好適な構成とできる。
施例について説明したがこの発明は上述の実施例に限ら
れない。例えば、上述では膜電位変化および１種の細胞
内イオンの濃度変化を同時に測定する例を説明したが、
膜電位変化と例えば２種以上の細胞内イオン濃度のそれ
ぞれの変化とを同時に測定することも可能と考える。一
例で説明すれば、例えば細胞内カルシウムイオンに応答
して蛍光強度が変化する蛍光色素と、細胞内ナトリウム
イオンに応答して蛍光強度が変化する蛍光色素とを、膜
電位感受性蛍光色素と共に用いて生体組織を処理し、そ
の後、３種類の蛍光色素について時分割による励起光照
射や蛍光強度記録を処理をするようにすれば、細胞内カ
ルシウムイオン濃度変化、細胞内ナトリウムイオン濃度
変化および膜電位変化を同時に測定できると考える。ま
た上述において説明した測定装置は一例にすぎず、他の
任意好適な構成とできる。
【００５０】
【発明の効果】上述した説明から明らかなように、この
発明によれば、測定対象の生体組織を、細胞内イオン濃
度変化に応答して蛍光強度が変化する第１の蛍光色素お
よび膜電位変化に応答して蛍光強度が変化する第２の蛍
光色素それぞれにより処理する。そして、該処理済みの
生体組織に対し前記第１の蛍光色素を励起する第１の励
起光および前記第２の蛍光色素を励起する第２の励起光
を時分割で照射すると共に、各励起光照射ごとの前記生
体組織から発せられる蛍光強度をそれぞれ順次に記録す
る。このため、蛍光観察法を利用して膜電位変化と少な
くとも１種の細胞内イオン濃度変化とを実質同時に測定
出来る。したがって、微細な細胞や強固な結合組織で覆
われた細胞などについても、膜電位変化の測定および細
胞内のイオン濃度変化の測定を同時に行なうことが可能
になる。
発明によれば、測定対象の生体組織を、細胞内イオン濃
度変化に応答して蛍光強度が変化する第１の蛍光色素お
よび膜電位変化に応答して蛍光強度が変化する第２の蛍
光色素それぞれにより処理する。そして、該処理済みの
生体組織に対し前記第１の蛍光色素を励起する第１の励
起光および前記第２の蛍光色素を励起する第２の励起光
を時分割で照射すると共に、各励起光照射ごとの前記生
体組織から発せられる蛍光強度をそれぞれ順次に記録す
る。このため、蛍光観察法を利用して膜電位変化と少な
くとも１種の細胞内イオン濃度変化とを実質同時に測定
出来る。したがって、微細な細胞や強固な結合組織で覆
われた細胞などについても、膜電位変化の測定および細
胞内のイオン濃度変化の測定を同時に行なうことが可能
になる。
【図１】この発明の測定方法の実施に用いた測定装置の
説明図である。
説明図である。
【図２】励起光選択用フィルタ切換手段の説明図であ
る。
る。
【図３】蛍光選択用フィルタ切換手段の説明図である。
【図４】第１実施例で得た特性の説明図である。
【図５】第２実施例で得た特性の説明図である。
【図６】第３実施例で得た特性の説明図である。
【図７】第４実施例で得た特性の説明図である。
【図８】第５実施例で得た特性の説明図である。
【図９】第６実施例で得た特性の説明図である。
【図１０】第７実施例で得た特性の説明図である。
【図１１】第８実施例で得た特性の説明図である。
１０：測定装置 ２０：倒立型蛍光顕微鏡 ３０：励起光選択用フィルタ切換手段 ３５：第１の励起光選択用フィルタ ３７：第２の励起光選択用フィルタ ４０：蛍光選択用フィルタ切換手段 ４１：第１の蛍光色素からの蛍光を選択するフィルタ ４３：第２の蛍光色素からの蛍光を選択するフィルタ ５０：光源 ６０：フォトダイオード ７０：制御手段
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−273337（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−109641（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−332937（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−245044（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−26813（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−21800（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，253（13) ｐ4631（1978) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/75 - 21/83 G01N 21/64 G01N 33/48 - 33/52 G01N 33/58 - 33/98 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 測定対象の生体組織を、細胞内イオン濃
度変化に応答して蛍光強度が変化する第１の蛍光色素お
よび膜電位変化に応答して蛍光強度が変化する第２の蛍
光色素それぞれにより処理をし、 該処理済みの生体組織に対し前記第１の蛍光色素を励起
する第１の励起光および前記第２の蛍光色素を励起する
第２の励起光を時分割で照射すると共に、 前記第１の励起光を照射するごとの前記生体組織から発
せられる蛍光強度を順次に記録し、かつ、第２の励起光
を照射するごとの前記生体組織から発せられる蛍光強度
を順次に記録することを特徴とする細胞内イオン濃度変
化および膜電位変化同時測定方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の細胞内イオン濃度変化
および膜電位変化同時測定方法において、 前記第１の蛍光色素が２種以上の細胞内イオンごとの２
種以上の蛍光色素であるとき、前記第１の励起光をこれ
ら蛍光色素ごとの励起光として、前記時分割による照射
においては該蛍光色素ごとの励起光も時分割照射するも
のとし、かつ、前記蛍光強度の記録も蛍光色素ごとに行
なうことを特徴とする細胞内イオン濃度変化および膜電
位変化同時測定方法。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の細胞内イオン
濃度変化および膜電位変化同時測定方法において、 前記励起光用の光源として前記第１の励起光および第２
の励起光を含む光を発する１つの光源を用い、 前記各蛍光強度の記録を共通の測定系により行なうもの
とし、および、 前記光源と生体組織との間に前記第１の励起光選択用フ
ィルタおよび前記第２の励起光選択用フィルタを前記時
分割で照射される励起光に対応する順で挿入し、かつ、
該生体組織と前記測定系との間に前記第１の蛍光色素か
らの蛍光選択用フィルタおよび第２の蛍光色素からの蛍
光選択用フィルタを前記時分割で照射される励起光によ
り生じる蛍光に対応する順で挿入することを特徴とする
細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の細胞内イオン濃度変化
および膜電位変化同時測定方法において、 前記第１の蛍光色素が２種以上の細胞内イオンごとの２
種以上の蛍光色素であるとき、前記励起光選択用フィル
タおよび前記蛍光選択用フィルタそれぞれは、該２種以
上の蛍光色素用の励起光および蛍光を考慮した複数の波
長選択フィルタを含むことを特徴とする細胞内イオン濃
度変化および膜電位変化同時測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15780995A JP3172060B2 (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | 細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15780995A JP3172060B2 (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | 細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH095243A JPH095243A (ja) | 1997-01-10 |
| JP3172060B2 true JP3172060B2 (ja) | 2001-06-04 |
Family
ID=15657769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15780995A Expired - Fee Related JP3172060B2 (ja) | 1995-06-23 | 1995-06-23 | 細胞内イオン濃度変化および膜電位変化同時測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3172060B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4429577B2 (ja) | 2002-09-30 | 2010-03-10 | 株式会社ニコン | 細胞内反応測定装置および細胞内反応測定方法 |
| JP4521155B2 (ja) | 2002-11-27 | 2010-08-11 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡画像処理装置 |
| DE102005005984B4 (de) * | 2005-02-09 | 2019-10-24 | Leica Instruments (Singapore) Pte. Ltd. | Fluoreszenz-/Infraroteinrichtung für Operationsmikroskope |
| JP4899648B2 (ja) * | 2006-06-05 | 2012-03-21 | 株式会社ニコン | スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム |
| CN102809593B (zh) * | 2012-08-15 | 2014-07-02 | 西安交通大学 | 用于测定或者监测组织或细胞跨膜电位变化的方法及装置 |
| US9709555B2 (en) | 2013-05-23 | 2017-07-18 | Keio University | Compound for generating second harmonic of light, dye composition for generating second harmonic of light, and cell examination method |
-
1995
- 1995-06-23 JP JP15780995A patent/JP3172060B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３（１３）ｐ４６３１（１９７８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH095243A (ja) | 1997-01-10 |
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|---|---|---|---|
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