KR101269096B1 - 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 - Google Patents
글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101269096B1 KR101269096B1 KR1020120004236A KR20120004236A KR101269096B1 KR 101269096 B1 KR101269096 B1 KR 101269096B1 KR 1020120004236 A KR1020120004236 A KR 1020120004236A KR 20120004236 A KR20120004236 A KR 20120004236A KR 101269096 B1 KR101269096 B1 KR 101269096B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- glucose
- photon
- photon fluorescent
- fluorescence
- indicator
- Prior art date
Links
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract 4
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 claims description 46
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOYNUTHNTBLRMT-MXWOLSILSA-N 2-Deoxy-2(F-18)fluoro-2-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([18F])C=O AOYNUTHNTBLRMT-MXWOLSILSA-N 0.000 description 1
- -1 2-acetyl-6-dimethylaminonaphthalene compound Chemical class 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N D-fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102000058062 Glucose Transporter Type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000834948 Homo sapiens Tomoregulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091006298 SLC2A3 Proteins 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- 102100026160 Tomoregulin-2 Human genes 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001639 boron compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000005620 boronic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
- C07F5/02—Boron compounds
- C07F5/025—Boronic and borinic acid compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법에 관한 것으로, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 따른 글루코스 검출을 위한 이광자 형광 표시자는 오랜 시간 동안 생체 세포 또는 생체 조직 내 100 내지 200 ㎛의 깊이에 존재하는 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 따른 글루코스 검출을 위한 이광자 형광 표시자는 오랜 시간 동안 생체 세포 또는 생체 조직 내 100 내지 200 ㎛의 깊이에 존재하는 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있다.
Description
본 발명은 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있는 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
글루코오스는 생물계에서 생명 유지에 필수적인 역할을 한다. 글루코오스 항상성은 에너지 대사와 밀접한 관련이 있고 기본적으로 인슐린-매개 신호경로에 의해 조절된다.
인슐린 분비 또는 인슐린 작용의 결함은 혈중 글루코오스 농도를 비정상적으로 높게 하여 2형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈압과 심혈관계 고위험으로 나타날 수 있다.
이와 관련하여, 생물계에서 글루코오스의 생물학적 역할을 규명하기 위한 중요한 과제는 글루코오스를 세포, 조직과 유기체 수준에서 모니터링하는 능력이다. 이를 위해, 형광색소분자로서 안트라센, 피렌, 스틸벤 및 단당류에 대한 결합부위로서 보론산으로부터 유도된 각종 형광탐침이 개발되어 왔다.
그러나 이들 탐침을 일광자(OP) 현미경법과 함께 사용하기 위해서는 상대적으로 짧은 여기 파장(~350-500 nm)을 필요로 하지만, 탐침의 투과 깊이가 얕아(< 80 m) 심조직 영상화에서의 사용이 제한된다. [18F]-2-플루오로-2-데옥시글루코오스(18FDG)를 이용하는 양전자 방출 단층촬영법(PET)에 의한 체내 암 진단을 제외하고는 조직과 전 유기체와 같이 보다 두터운 시료 내 글루코오스를 영상화하기 위한 방법은 상대적으로 찾아보기 어렵다.
생체 조직 내 깊숙한 곳의 글루코오스를 검출하기 위한 매우 유리한 방법은 이광자 현미경법(TPM) 이용을 통한 방법이다. 여기를 위해 에너지가 비교적 낮은 2개의 광자를 활용하는 TPM이 제공하는 이점에 의해 TPM의 사용이 생의학 연구에서 점점 더 보편화되고 있다. 이러한 이점에는 투과깊이의 증가(> 500 μm), 여기 집중과 관찰시간의 연장이 있다.
종래 한국등록특허 제1101304에는 인간 환자의 정상 조직과 결장암 조직에서 3000초가 넘는 시간 동안 글루코오스 흡수를 모니터링할 수 있는 이광자(TP) 글루코오스 추적자에 대하여 개시하고 있다. 그러나 상기 기술은 글루코스 흡수속도만 검출할 수 있을 뿐 감소속도는 검출할 수 없기 때문에 글루코오스의 실시간 모니터링에는 적합하지 않은 문제가 있다.
따라서 상기 글루코스 흡수속도 및 감소속도를 모니터링하기 위해서는 글루코스용 작동 탐침이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있는 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 이광자 형광 표시자를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 이광자 형광 표시자를 이용하여 생체 세포 또는 생체 조직 내에서 글루코스를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 이광자 형광 표시자는 하기 화학식 1로 표시된다;
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 이광자 형광 표시자를 제조하는 방법은 하기 반응식 1에 따라 보로닉 산을 하기 화학식 2와 반응시켜 제조된다;
[반응식 1]
[화학식 2] [화학식 1] .
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 글루코스를 검출하는 방법은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 표시자를 이용한다.
상기 글루코스가 감지되는 생체 세포 또는 생체 조직의 깊이는 100 내지 200 ㎛이다.
상기 생체 세포는 헬라 세포 또는 뉴런 세포이며, 상기 생체 조직은 쥐 해마 조직이다.
본 발명의 이광자 형광 표시자는 60분 이상 생체 세포 또는 생체 조직 내 100 내지 200 ㎛의 깊이에 존재하는 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 세포 또는 생체 조직에서의 글루코스의 분포 및 활성을 영상화할 수 있다.
또한, 본 발명은 글루코스의 흡수속도뿐만 아니라 감소속도를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 및 조직을 염색하기 위한 수용해성, pH 저항성 및 광안정성이 우수하며, 밝은 TPM영상을 위한 넓은 이광자 단면적이 넓다.
도 1a는 이광자 형광 표시자의 용해도에 따른 형광강도를 도시한 것이며, 도 1b는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 단일광자와 이광자의 형광을 통합하여 도시한 것이다.
도 2는 다양한 용매(solvent)에서 이광자 형광 표시자의 광물리적 성질을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 D-글루코오스(0-1.0 M)가 존재하는 PBS(pH 7.4) 중 이광자 형광 표시자의 일광자 발광 스펙트럼이며, 도 3b는 D-프룩토오스, D-갈락토오스, D-글루코오스와 이광자 형광 표시자의 착화에 대한 일광자 및 이광자 형광 적정 곡선을 나타낸 도면이다.
도 4a는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 4b는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이고, 도 4c는 글루코스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이다.
도 5a는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 5b는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼 이고, 도 5c는 플루코스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이며, 도 5d는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이고, 도 5e는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이며, 도 5f는 갈라토스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이다.
도 6a는 pH에 따른 형광 스펙트럼을 도시한 것이고, 도 6b는 pH에 따른 형광증가율을 도시한 것이다.
도 7a는 이광자 작동 면적에 대한 파장을 나타낸 도면이며, 도 7b는 방출되는 형광 세기가 들어오는 형광 세기에 받는 영향의 정도를 도시한 것이며, 위의 선형 곡선은 들어오는 형광 세기의 이 제곱 값에 대한 방출되는 형광의 세기를 도시한 것이다.
도 8은 100초(a,d), 300초(b,e)와 1000초(c,f)에서 2 μM 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(a-c)와 일차 피질신경세포(d-f)의 의사 색상의 TPM 사진이며, 시간 함수로서 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(g)와 일차 피질신경세포(h)의 TPEF 세기의 변화를 나타낸 도면이다.
도 9a는 HeLa 세포(a-c)에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9b는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9c는 상기 도 9a와 9b를 겹친 것이다. 도 9d는 일차 피질신경세포 (d-f) 에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9e는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9f는 상기 도 9d와 9e를 겹친 도면이다.
도 10은 세포내 D-글루코오스 농도가 감소되는 것을 나타낸 도면이다.
도 11a와 도 11b는 HeLa 세포(a, b, e, f)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이며, 도 11c와 도 11d는 일차 피질신경 세포(c, d, g, h)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이고, 도 11e는 상기 도 11a에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11f는 상기 도 11b에 갈라토스를 넣은 후의 영상이고, 도 11g는 상기 도 11c에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11h는 상기 도 11d에 갈라토스를 넣은 후의 영상이다.
도 12는 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색하여 4000초 동안 레이져을 가한 결과의 영상(좌)과 형광 세기 변화 도식(우)으로 광안정도를 보인 것이다.
도 13은 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 농도별로 염색하여 흡광도를 측정한 것으로, 이광자 형광 표시자가 세포에 해가 되지 않음을 보인 결과이다.
도 14는 (a-c) 약 100 μm의 깊이에서 20 μM 이광자 형광 표시자로 염색한 갓 태어난 래트 해마 박편의 TPM사진(배율 10×)이다. 이때 TPM 사진을 (a) 100, (b) 1,500, (c) 3,000초에서 얻었다.
도 15는 쥐의 해마조직으로 도 15a는 흑백영상이며, 15b 이광자 형광 표시자를 염색하여 얻은 이광자 형광 영상이다.
도 16은 도 15b의 깊이별 영상이다.
도 17은 쥐의 해마조직으로서, 도 17a와 17e는 해마조직의 각기 다른 영역을 표기한 흑백영상이며, 도 17b와 도 17f는 이광자 형광 표시자를 20 μM 염색한 이광자 형광 영상이고, 도 17c는 상기 도 17b에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 플루토스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17d는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화 도식이고, 도 17g는 상기 도 17f에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 갈라토오스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17h는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화를 도식한 것이다.
도 2는 다양한 용매(solvent)에서 이광자 형광 표시자의 광물리적 성질을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 D-글루코오스(0-1.0 M)가 존재하는 PBS(pH 7.4) 중 이광자 형광 표시자의 일광자 발광 스펙트럼이며, 도 3b는 D-프룩토오스, D-갈락토오스, D-글루코오스와 이광자 형광 표시자의 착화에 대한 일광자 및 이광자 형광 적정 곡선을 나타낸 도면이다.
도 4a는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 4b는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이고, 도 4c는 글루코스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이다.
도 5a는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 5b는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼 이고, 도 5c는 플루코스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이며, 도 5d는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이고, 도 5e는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이며, 도 5f는 갈라토스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이다.
도 6a는 pH에 따른 형광 스펙트럼을 도시한 것이고, 도 6b는 pH에 따른 형광증가율을 도시한 것이다.
도 7a는 이광자 작동 면적에 대한 파장을 나타낸 도면이며, 도 7b는 방출되는 형광 세기가 들어오는 형광 세기에 받는 영향의 정도를 도시한 것이며, 위의 선형 곡선은 들어오는 형광 세기의 이 제곱 값에 대한 방출되는 형광의 세기를 도시한 것이다.
도 8은 100초(a,d), 300초(b,e)와 1000초(c,f)에서 2 μM 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(a-c)와 일차 피질신경세포(d-f)의 의사 색상의 TPM 사진이며, 시간 함수로서 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(g)와 일차 피질신경세포(h)의 TPEF 세기의 변화를 나타낸 도면이다.
도 9a는 HeLa 세포(a-c)에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9b는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9c는 상기 도 9a와 9b를 겹친 것이다. 도 9d는 일차 피질신경세포 (d-f) 에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9e는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9f는 상기 도 9d와 9e를 겹친 도면이다.
도 10은 세포내 D-글루코오스 농도가 감소되는 것을 나타낸 도면이다.
도 11a와 도 11b는 HeLa 세포(a, b, e, f)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이며, 도 11c와 도 11d는 일차 피질신경 세포(c, d, g, h)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이고, 도 11e는 상기 도 11a에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11f는 상기 도 11b에 갈라토스를 넣은 후의 영상이고, 도 11g는 상기 도 11c에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11h는 상기 도 11d에 갈라토스를 넣은 후의 영상이다.
도 12는 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색하여 4000초 동안 레이져을 가한 결과의 영상(좌)과 형광 세기 변화 도식(우)으로 광안정도를 보인 것이다.
도 13은 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 농도별로 염색하여 흡광도를 측정한 것으로, 이광자 형광 표시자가 세포에 해가 되지 않음을 보인 결과이다.
도 14는 (a-c) 약 100 μm의 깊이에서 20 μM 이광자 형광 표시자로 염색한 갓 태어난 래트 해마 박편의 TPM사진(배율 10×)이다. 이때 TPM 사진을 (a) 100, (b) 1,500, (c) 3,000초에서 얻었다.
도 15는 쥐의 해마조직으로 도 15a는 흑백영상이며, 15b 이광자 형광 표시자를 염색하여 얻은 이광자 형광 영상이다.
도 16은 도 15b의 깊이별 영상이다.
도 17은 쥐의 해마조직으로서, 도 17a와 17e는 해마조직의 각기 다른 영역을 표기한 흑백영상이며, 도 17b와 도 17f는 이광자 형광 표시자를 20 μM 염색한 이광자 형광 영상이고, 도 17c는 상기 도 17b에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 플루토스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17d는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화 도식이고, 도 17g는 상기 도 17f에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 갈라토오스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17h는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화를 도식한 것이다.
본 발명은 오랜 시간 동안 생체 세포 또는 생체 조직 내 100 내지 200 ㎛의 깊이에 존재하는 글루코스를 높은 선택성으로 감지할 수 있는 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 하기 [화학식 1]로 표시되는 이광자 형광 표시자(AS1)는 한 분자 내에 두 개의 탐침이 도입되어 생체 세포 또는 생체 조직 내 글루코스에 선택적으로 반응하여 강한 형광을 나타낸다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]의 이광자 형광 표시자는 하기 [반응식 1]의 합성과정으로 합성된다.
[반응식 1]
[화학식 2] [화학식 1]
[화학식 1]의 이광자 형광 표시자는 상기 [화학식 2]로 표시되는 2-아세틸-6-디메틸아미노나프탈렌 화합물과 보로닉 산(boronic acid)이 요오드화 나트륨(NaI), 프로톤 스폰지 및 아세토나이트릴(MeCN) 하에서 반응하여 합성된 것으로서, 글리신아미드 연결기를 통하여 보로닉 산기를 상기 [화학식 2]로 표시되는 화합물과 연결하는 것이다.
상기 [화학식 2]로 표시되는 화합물은 극성-민감성 형광색소 분자이다.
본 발명의 이광자 형광 표시자는 60 분 이상, 바람직하게는 60 내지 120 분의 시간 동안 생체 세포 또는 생체 조직 내 100 내지 200 ㎛의 깊이에 존재하는 글루코스를 선택적으로 검출할 수 있으므로 생체 세포 또는 생체 조직에서의 글루코스 분포 및 활성을 영상화할 수 있다.
본 발명의 이광자 형광 표시자의 구조는 1H NMR, 13CNMR분석을 통하여 확인할 수 있다.
아래에서 도면을 참조하여 본 발명의 이광자 형광 표시자를 구체적으로 설명한다.
도 1a는 이광자 형광 표시자의 용해도에 따른 형광강도를 도시한 것이며, 도 1b는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 단일광자와 이광자의 형광을 통합하여 도시한 것이다.
본 발명의 이광자 형광 표시자의 용해도는 3.0 μM이하(~ 3.0 μM), 바람직하게는 0.3 내지 3.0 μM이며, 이는 이광자 형광 표시자를 세포 염색용으로 충분히 사용할 수 있다는 의미이다.
상기 용해도는 PBS(Phosphate-buffered saline, 30mM, pH 7.2, I=0.10)에서 측정한다.
도 2는 다양한 용매(solvent)에서 이광자 형광 표시자의 광물리적 성질을 요약한 것이다.
형광 스펙트럼은 용매의 극성이 증가함에 따라 1,4-Dioxane < DMF < EtOH < H2O의 순서로 점진적인 적색 천이(bathochromic shift)를 보인다.
상기 용매의 극성이 증가함에 따라 큰 적색 천이를 보이는 것은 분자들이 극성 표지자로서 유용하다는 의미이다.
도 3a는 D-글루코오스(0-1.0 M)가 존재하는 PBS(pH 7.4) 중 이광자 형광 표시자의 일광자 발광 스펙트럼이며, 도 3b는 D-프룩토오스(■, □), D-갈락토오스(▲, △), D-글루코오스(●, ○) (0-1.0 M)와 이광자 형광 표시자의 착화에 대한 일광자(검정색) 및 이광자(백색) 형광 적정 곡선을 나타낸 도면이다.
또한, 도 4a는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 4b는 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이고, 도 4c는 글루코스에 대한 표시자의 힐 플롯(hill plots)을 도시한 것이다.
또한, 도 5a는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이며, 도 5b는 플루코스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이고, 도 5c는 플루코스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이며, 도 5d는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 흡수 스펙트럼이고, 도 5e는 갈라토스에 대한 표시자의 이광자 형광 표시자의 농도에 따른 형광 스펙트럼이며, 도 5f는 갈라토스에 대한 표시자의 힐 플롯을 도시한 것이다.
도 6a는 pH에 따른 형광 세기 변화를 도시한 것이고, 도 6b는 pH에 따른 형광증가율을 도시한 것이다.
이광자 형광 표시자가 첨가된 PBS에 글루코스를 넣으면 형광이 서서히 증가되었다. 이를 형광증가율 [FEF = (F Fmin)/Fmin]로 계산한 결과 글루코스의 농도가 1.0 M일 때 단일 광자(OP)와 이광자(TP)에서 4.0의 증가율을 보였다 (도 3a 및 도 4 참조).
이광자 형광 표시자와 당의 반응 분해상수(Kd OP)를 PBS(pH 7.4)에서 측정하고 이를 형광 적정 곡선으로 계산한 결과 D-글루코스, D-갈라토스, D-플루코스의 경우 Kd OP=0.60±0.03, 0.35±0.01, 0.048±0.002 M이었다(도 3b, 도 4 및 도 5 참조). 이는 본 발명의 이광자 형광 표시자가 TPM으로 적은 농도의 당을 검출 할 수 있음을 의미한다.
또한, 일광자 및 이광자에 대한 여기 파장은 각각 365와 780 nm이었다.
특히, 상기 적정 곡선의 결과와 힐 플롯(Hill plots)의 기울기가 1.0 값을 보임으로서 이광자 형광 표시자와 당이 1 : 1 착물로 형성함을 입증하였다(도 4c, 도 5c 및 5f 참조).
이광자 형광 표시자의 pK a 값은 5.3으로 보로닉 산(boronic acid)이 없는 모체 화합물인 [화학식 2]로 표시되는 화합물의 pK a =4.5보다 높다(도 6b 참조). 이는 보론(boron)이 탄소보다 전기음성도가 작기 때문이다.
또한, 이광자 형광 표시자의 형광은 pH > 6에서 pH의 영향을 받지 않는다 (도 6b 참조). 따라서 상기 본 발명의 이광자 형광 표시자는 생체 내 pH 범위 내에서는 단일 당을 검출하는데 적절하다.
도 7a는 이광자 작동 면적에 대한 파장을 나타낸 도면이며, 도 7b는 방출되는 형광 세기가 들어오는 형광 세기에 받는 영향의 정도를 도시한 것이며, 위의 선형 곡선은 들어오는 형광 세기의 이 제곱 값에 대한 방출되는 형광의 세기를 도시한 것이다.
이광자 형광 표시자의 이광자 작동 단면적(two-photon cross section, δ)은 D-글루코스가 함유된 PBS에서 측정하였으며 이광자 여기 형광(TPEF) 펨토 초 (femto-second, fs) 레이져를 사용하였다(도 7b 참조). 과량의 당이 함유된 PBS에서의 이광자 작동 단면적(δΦ)의 값은 780 nm에서 85 GM이다(도 7a 참조).
이는 이광자 형광 표시자로 생체 세포 또는 생체 조직을 염색 시 세포 또는 조직 내에서의 TPM 이미지가 밝을 것을 의미한다.
도 8은 100초(a,d), 300초(b,e)와 1000초(c,f)에서 2 μM 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(a-c)와 일차 피질신경세포(d-f)의 의사 색상의 TPM 사진이며, 시간 함수로서 이광자 형광 표시자-표지된 HeLa 세포(g)와 일차 피질신경세포(h)의 TPEF 세기의 변화를 나타낸 도면이다.
도 8은 살아있는 세포 내에서 이광자 형광 표시자의 단당류 검출 능력을 확인한 것이다.
도 8a는 HeLa 세포에 AS1 2 μM을 20 분 동안 37 ℃에서 염색한 것으로 펨토 초(fs)펄스로 780 nm에서 여기 시 TPEF를 500 내지 620 nm에서 수집한다.
이광자 형광 표시자가 pH < 5에서 증가하기 때문에 약산성인 라이소좀에서 TPM 영상이 보일 가능성이 있다. 이를 확인하기 위하여, 대뇌 피질성의 뉴런 세포와 HeLa 세포에 각각 이광자 형광 표시자와 산성 낭에 염색되는 것이 알려진 Lysotracker-Red(LTR)를 염색하여(도 9c 및 도 9f 참조) 두 영상의 겹침값(Pearson’s colocalization coefficient, A)을 Autoquant X2 software를 이용하여 구하였다. 대뇌 피질성의 뉴런 세포와 HeLa 세포에서의 겹침값(A)은 각각 0.21, 0.16 이다. 즉, 이광자 형광 표시자가 원형질 내에 존재하여 일부는 라이소좀에 들어가며, 이로 인해 D-글루코스가 추가되어도 라이소좀 내의 이광자 형광 표시자의 농도가 증가하지 않아 형광값이 증가하지 않음을 알 수 있다 (도 8g 및 8h 참조).
20 mM 의 D-글루코스를 세포에 넣어주자 TPEF 값이 가파르게 증가하다가 서서히 기본 형광값으로 떨어졌다(도 8c참조). 이 감소는 t 1 /2 = 170초로 일차 감쇠에 피팅될 수 있는 바, 이는 이 속도로 세포내 D-글루코오스 농도가 감소된다는 것을 의미한다(도 8c 참조). 이와 비슷한 결과가 대뇌 피질성의 뉴런 세포에서도 보였다(도 8 및 도 11 참조).
또한, HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 염색 후 60 분 동안 fs-레이져를 가한 결과, 형광의 세기가 변하지 않았다. 이는 세포 내에서 이광자 형광 표시자의 광안정성이 높음을 의미한다.
도 9a는 HeLa 세포(a-c)에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9b는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9c는 상기 도 9a와 9b를 겹친 것이다. 도 9d는 일차 피질신경세포 (d-f) 에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 도면이며, 도 9e는 Lysotracker-Red(LTR)을 1 μM 염색한 도면이고, 도 9f는 상기 도 9d와 9e를 겹친 도면이다.
도 10은 세포내 D-글루코오스 농도가 감소되는 것을 나타낸 도면이다.
도 11a와 도 11b는 HeLa 세포(a, b, e, f)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이며, 도 11c와 도 11d는 일차 피질신경 세포(c, d, g, h)에서의 실험 결과로서, 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색한 사진이고, 도 11e는 상기 도 11a에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11f는 상기 도 11b에 갈라토스를 넣은 후의 영상이고, 도 11g는 상기 도 11c에 플루코스를 넣은 후의 영상이며, 도 11h는 상기 도 11d에 갈라토스를 넣은 후의 영상이다.
도 12는 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 2 μM 염색하여 4000초 동안 레이져을 가한 결과의 영상(좌)과 형광 세기 변화 도식(우)으로 광안정도를 보인 것이다.
도 13은 HeLa 세포에 이광자 형광 표시자를 농도별로 염색하여 흡광도를 측정한 것으로, 이광자 형광 표시자가 세포에 해가 되지 않음을 보인 결과이다.
도 14는 (a-c) 약 100 μm의 깊이에서 20 μM 이광자 형광 표시자로 염색한 갓 태어난 래트 해마 박편의 TPM사진(배율 10×)이au, 도 14e는 시간에 따른 형광 증가율을 나타낸 그래프이다. 이때 (a) 100, (b) 1,500, (c) 3,000초에서 TPM 사진을 얻었다. 또한, 도 14a 및 도 14e에 표시된 1은 CA1, 2는 DG, 3은 CA3을 의미한다.
도 15는 쥐의 해마조직으로 도 15a는 흑백영상이며, 도 15b는 이광자 형광 표시자를 염색하여 얻은 이광자 형광 영상이다.
도 16은 상기 도 15b의 깊이별 영상이다.
도 17은 쥐의 해마조직으로서, 도 17a와 17e는 해마조직의 각기 다른 영역을 표기한 흑백영상이며, 도 17b와 도 17f는 이광자 형광 표시자를 20 μM 염색한 이광자 형광 영상이고, 도 17c는 상기 도 17b에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 플루토스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17d는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화 도식이고, 도 17g는 상기 도 17f에 1000초 후 50 nM 인슐린, 50 mM KCl, 50 mM 갈라토오스를 첨가하여 얻은 형광 영상이며, 도 17h는 상기 도 17b에 표기된 영역의 시간별 형광 세기 변화를 도시한 것이다.
도 17은 이광자 형광 표시자를 조직에서 영상화한 것이다. 2 일령 쥐(rat)에서 해마조직을 분리하여, 이광자 형광 표시자 20 μM을 한 시간 동안 37 ℃에서 염색하였다.
흑백영상은 조직의 Ca1(1로 표시), DG(dentate gyrus, 2로 표시) 및 CA3(3으로 표시)를 보여준다(도 14d 및 도 15 참조). TPM 영상이 가능한 깊이는 80 내지 150 μm 으로 이는 기저 당류가 있는 영역이다. 50 nM의 인슐린(글루코스의 운송자인 GLUT3을 원형막으로 운동해주는 역할)과 50 mM KCl(세포막을 비그성화 시켜 GLUT3 낭이 원형질막과의 융합을 유도)을 미리 처리한 해마조직에 50 mM의 글루코스를 추가하자 TPEF가 증가하였다 (도 14e 참조). 그러나 D-프록토오즈와 D-갈락토오즈는 어느 영역에서도 검출되지 않음을 보았다(도 17 참조).
따라서 이광자 형광 표시자는 TPEF으로 살아있는 조직 내의 D-글루코스를 명확히 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 이광자 형광 표시자는 넓은 범위의 생체 pH에서 pH에 독립적인 물성을 보였으며, 다양한 깊이에서 글루코스를 선택적으로 살아있는 세포 및 조직에서 검출할 수 있다. 이는 생명의학 연구에 유용하게 응용되기를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
합성예. [화학식 1]로 표시되는 이광자 형광 표시자 합성
하기 [반응식 1]에 따라 합성하였고, 정제된 아세토나이트릴 20 ㎖에 보론 화합물 100 mg(0.35 mmol), 하기 [화학식 2]로 표시되는 화합물 242mg(0.70 mmol), 프로톤 스폰지로 1,8-비스-(디메틸아미노)나프탈렌인 220 mg(1.03 mmol), 요오드화 나트륨(NaI)을 첨가한 후 질소 베이스 하로 실온에서 30분 동안 교반하고 8시간 동안 환류하였다. 그 후 실온으로 냉각시켜 여과한 후 여과액을 에틸아세테이트와 소금물로 차례로 추출하고 진공상태에서 농축하였다. 농축된 화합물을 컬럼크로마토그래피(CHCl3/MeOH10:1)로 정제하여 하기 [화학식 2]로 표시되는 이광자 형광 표시자(수율 31%, mp 189 ℃)를 얻었다.
1H NMR(400MHz,DMSOd 6):d 9.68(s, 1H),8.34(s, 1H),8.12(s, 2H),7.81(d, 1H, J=9Hz),7.71(d,1H,J=9Hz),7.57(d,1H,J=9Hz),7.43(d,2H,J=8Hz),7.12(m,3H),6.97(m,2H),6.85(s,1H),6.41(d,2H,J=8Hz),4.67(s,2H),4.62(brs,1H),4.16(s,2H),3.06(s,3H),2.52(s,3H);13C NMR(100MHz,DMSOd 6):d 197.2, 167.4, 149.9, 149.5, 144.9, 142.3, 137.2, 133.8, 130.7, 130.6, 130.2, 129.0, 128.1, 126.0, 125.6, 124.8, 124.7, 124.1, 121.1, 116.2, 112.0, 104.9, 59.8, 55.4, 54.7, 26.5 ppm; Anal. Calcd for C28H28BN3O4:C,69.87;H,5.86;N,8.73.Found: C, 70.05; H, 5.99; N, 8.58.
[반응식 1]
Claims (6)
- 하기 화학식 1로 표시되는 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자;
[화학식 1]
.
- 하기 반응식 1에 따라 보로닉 산을 하기 화학식 2와 반응시켜 제조된 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 표시자를 제조하는 방법;
[반응식 1]
[화학식 2] [화학식 1] . - 제1항의 이광자 형광 표시자를 이용하여 생체 세포 또는 생체 조직에서 글루코스를 검출하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 글루코스가 감지되는 생체 세포 또는 생체 조직의 깊이는 100 내지 200 ㎛인 것을 특징으로 하는 생체 세포 또는 생체 조직에서 글루코스를 검출하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 생체 세포는 헬라 세포 또는 뉴런 세포인 것을 특징으로 하는 생체 세포 또는 생체 조직에서 글루코스를 검출하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 생체 조직은 쥐 해마 조직인 것을 특징으로 하는 생체 세포 또는 생체 조직에서 글루코스를 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120004236A KR101269096B1 (ko) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120004236A KR101269096B1 (ko) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101269096B1 true KR101269096B1 (ko) | 2013-05-29 |
Family
ID=48667135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120004236A KR101269096B1 (ko) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101269096B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102297417B1 (ko) | 2020-05-20 | 2021-09-02 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 신규 화합물 및 이를 이용한 글루코스 검출방법 |
| KR20230119420A (ko) | 2022-02-07 | 2023-08-16 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 기재의 표면에 포도당 감응 시약이 작용기에 의해 화학 결합되어 있는 고정화물, 그 제조방법 및 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100662021B1 (ko) | 2005-12-30 | 2006-12-27 | 주식회사 인포피아 | 바이오 카트리지 |
| KR101101304B1 (ko) | 2009-09-07 | 2012-01-02 | 서울대학교산학협력단 | 이광자 트레이서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 |
-
2012
- 2012-01-13 KR KR1020120004236A patent/KR101269096B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100662021B1 (ko) | 2005-12-30 | 2006-12-27 | 주식회사 인포피아 | 바이오 카트리지 |
| KR101101304B1 (ko) | 2009-09-07 | 2012-01-02 | 서울대학교산학협력단 | 이광자 트레이서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102297417B1 (ko) | 2020-05-20 | 2021-09-02 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 신규 화합물 및 이를 이용한 글루코스 검출방법 |
| KR20230119420A (ko) | 2022-02-07 | 2023-08-16 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | 기재의 표면에 포도당 감응 시약이 작용기에 의해 화학 결합되어 있는 고정화물, 그 제조방법 및 용도 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yoshihara et al. | Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes | |
| Fang et al. | A dual-function fluorescent probe for monitoring the degrees of hypoxia in living cells via the imaging of nitroreductase and adenosine triphosphate | |
| Li et al. | Organic fluorescent probes for detecting mitochondrial membrane potential | |
| Berezin et al. | Near-infrared fluorescence lifetime pH-sensitive probes | |
| Li et al. | A near-infrared frequency upconversion probe for nitroreductase detection and hypoxia tumor in vivo imaging | |
| Yang et al. | Phenothiazine–aminothiourea–Hg (II) ensemble-based fluorescence turn-on toward iodide in aqueous media and imaging application in live cells | |
| CN102344795A (zh) | 一种荧光探针及其在可逆检测次氯酸根上的应用 | |
| Zhang et al. | Near-infrared hybrid rhodol dyes with spiropyran switches for sensitive ratiometric sensing of ph changes in mitochondria and drosophila melanogaster first-instar larvae | |
| Shi et al. | A ratiometric fluorescent sensor for pH fluctuation and its application in living cells with low dark toxicity | |
| Wang et al. | Fluoride-specific fluorescence/MRI bimodal probe based on a gadolinium (III)–flavone complex: synthesis, mechanism and bioimaging application in vivo | |
| Dong et al. | Recent research progress of red-emitting/near-infrared fluorescent probes for biothiols | |
| CN110981842A (zh) | 一种区分正常细胞和癌细胞的特异性检测脂滴的荧光探针及应用 | |
| Weng et al. | Deep-red fluorogenic probe for rapid detection of nitric oxide in Parkinson’s disease models | |
| Zhao et al. | A salicylaldehyde benzoyl hydrazone based near-infrared probe for copper (ii) and its bioimaging applications | |
| KR101269096B1 (ko) | 글루코스의 검출을 위한 이광자 형광 표시자, 이의 제조방법 및 글루코스를 검출하는 방법 | |
| KR102015450B1 (ko) | 반응성 형광체 화합물 및 이를 포함하는 황화수소 검출용 나노복합체 | |
| KR101578384B1 (ko) | 생체 내 리소좀 및 미토콘드리아의 동시 영상화용 조성물 및 이를 이용한 리소좀 및 미토콘드리아의 영상화 방법 | |
| KR101493935B1 (ko) | 아밀로이드 베타 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 생체 내 아밀로이드 베타 플라크의 영상화 방법 | |
| US8632749B2 (en) | Two photon tracer, method for the preparation thereof and the use thereof in screening anticancer agents | |
| Yoshihara et al. | Iridium complex probes for monitoring of cellular oxygen levels and imaging of hypoxic tissues | |
| Zhai et al. | A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process | |
| Yang et al. | Solvent-dependent tautomeric equilibrium between fluorescent colorimetric probes with dual mitochondrial/liposome targetability | |
| Liang et al. | A NIR fluorescent probe for dual imaging of mitochondrial viscosity and FA in living cells and zebrafish | |
| EP4023646A1 (en) | Reagent for measuring oxygen concentration in cell and tissue | |
| Jia et al. | Near-infrared fluorescent probes for non-invasive, real-time, and dual-color in vivo NIR-II imaging |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160520 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170523 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180406 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190524 Year of fee payment: 7 |
|
| R401 | Registration of restoration |