CN114478435B - 一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用，本发明属于有机分子荧光探针技术领域，将2’‑羟基查尔酮HCA和1,3‑二溴丙烷加入有机溶剂中反应，经硅胶柱色谱分离获得中间体Br‑HCA，将中间体Br‑HCA和吗啉加入有机溶剂中反应，经硅胶柱色谱分离获得溶酶体荧光探针Lyso‑HCA。该荧光探针制备方法简单、快速、成本低，制得的荧光探针背景干扰低、检测灵敏度高，应用于细胞荧光成像的激发能力强，该探针荧光对酸碱性环境稳定性好，对溶酶体荧光成像的特异性好。该探针为细胞溶酶体荧光成像研究提供了具有广阔应用前景的工具。

Description

一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于有机分子荧光探针技术领域，涉及一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
溶酶体是一种存在于真核细胞中的重要细胞器，含有多种酸性水解酶，是细胞分解各种外源和内源大分子物质的主要场所，还参与细胞自噬、分化和凋亡等过程，另外还与多种遗传疾病和肿瘤的发生密切相关。因此，监测活细胞中溶酶体的变化具有重大意义。荧光成像法是研究细胞中溶酶体形貌、分布及动态变化过程的有力工具，它具有特异性好、实时、可视化等众多优点。一些商品化的有机分子类荧光探针已广泛应用细胞内溶酶体的靶向荧光成像，但目前很多商品化溶酶体荧光探针的结构复杂，制备过程繁琐，成本高。因此，仍需要进一步开发结构简单、低成本、高性能的溶酶体荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的问题，提供一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针及其制备方法与应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针，所述探针结构式如下所示：
一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)将2’-羟基查尔酮HCA和1,3-二溴丙烷加入有机溶剂中混合均匀，在碱性条件下加热回流搅拌，过滤除去固体残渣，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得中间体Br-HCA；
步骤2)将中间体Br-HCA和吗啉加入有机溶剂中混合均匀，在碱性条件下加热回流，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得溶酶体荧光探针Lyso-HCA。
进一步的，步骤1)中，反应原料HCA与1,3-二溴丙烷的摩尔比为1:2～10。
进一步的，步骤1)中，所述有机溶剂使用N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙腈，反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和有机溶剂的摩尔比为1:2～10:60～1000。
进一步的，步骤2)中，所述有机溶剂使用N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙腈，中间体Br-HCA、吗啉和有机溶剂的摩尔比为1:2～10:60～1000。
进一步的，步骤1)中，所述碱性条件使用无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或氢化钠，且反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和碱的摩尔比为1:2～10:1～10。
进一步的，步骤2)中，所述碱性条件使用无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或氢化钠，且反应原料Br-HCA、吗啉和碱的摩尔比为1:1～5:1～10。
进一步的，步骤1)和步骤2)中，反应温度为60-120℃，反应时间为4～24h。
基于查尔酮的溶酶体荧光探针在细胞溶酶体靶向荧光成像中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于查尔酮分子的溶酶体荧光探针，该荧光探针包括具有荧光性能的查尔酮分子和溶酶体定位功能的吗啉基团，查尔酮分子具有分子内共轭的推-拉电子效应，结构简单，具有较大的斯托克斯位移，荧光性能优异；而弱碱性的吗啉基团可以和弱酸性的溶酶体内环境相互作用，从而实现该荧光探针在细胞溶酶体内的特异性定位与荧光检测。
该荧光探针制备方法简单、快速、成本低；斯托克斯位移约70-110nm，相比常见商品化溶酶体荧光染料的10-20nm显著增大，具有背景干扰低、检测灵敏度高等优点；荧光最大激发波长420nm与共聚焦荧光显微镜常用的405nm激光器匹配程度高，应用于细胞荧光成像的激发能力强；在较宽的pH范围内荧光强度比较稳定，表明该探针荧光对酸碱性环境稳定性好，不会受到细胞溶酶体酸性变化的影响；该探针与商品化溶酶体荧光探针复染成像的共定位系数可达0.947，说明其对溶酶体荧光成像的特异性好。该探针为细胞溶酶体荧光成像研究提供了具有广阔应用前景的工具。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的实施例1所合成中间体Br-HCA的核磁共振氢谱图。
图2为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA的核磁共振氢谱图。
图3为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA的核磁共振碳谱图。
图4为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA的高分辨质谱图。
图5为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA在不同溶剂中的荧光光谱图。
图6为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA荧光强度与溶液pH的关系曲线图。
图7为本发明的实施例1所合成溶酶体荧光探针Lyso-HCA与市售溶酶体染料Lyso-tracker Red细胞共定位荧光成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)将HCA和1,3-二溴丙烷加入有机溶剂中混合均匀，反应原料HCA与1,3-二溴丙烷的摩尔比为1:2～10，反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和有机溶剂的摩尔比为1:2～10:60～1000，在碱性条件下，加热到60-120℃，回流搅拌反应4～24h，反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和碱的摩尔比为1:2～10:1～10，过滤除去固体残渣，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得中间体Br-HCA，反应式如下：
步骤2)将中间体Br-HCA和吗啉加入有机溶剂中混合均匀，中间体Br-HCA、吗啉和有机溶剂的摩尔比为1:2～10:60～1000，在碱性条件下加热到60-120℃回流，反应原料Br-HCA、吗啉和碱的摩尔比为1:1～5:1～10，反应4～24h，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得溶酶体荧光探针Lyso-HCA，反应式如下：
实施例1：
一种基于查尔酮分子的溶酶体荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)中间体Br-HCA的制备
2’-羟基查尔酮(HCA，0.668g，2.5mmol)与1,3-二溴丙烷(1.010g，5mmol)溶于15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入无水碳酸钾(0.518g，3.75mmol)。升温至80℃下回流反应8h。停止反应，然后用乙酸乙酯萃取，萃取后合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏，粗产品经硅胶柱层析分离得到化合物Br-HCA，产率51％。
步骤(2)溶酶体荧光探针Lyso-HCA的制备
将化合物Br-HCA(39mg,0.1mmol)与吗啉(43mg,0.5mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，后加入5mL乙腈，向溶液中加入无水碳酸钾(20mg,0.15mmol)粉末，温度升至100℃回流反应12h。停止反应并冷却，减压旋蒸除去溶剂乙腈，将粗产物进行柱色谱分离，洗脱剂CH2Cl2:CH3OH＝40:1。得到橙黄色固体产物Lyso-HCA，产率56％。
实施例2：
一种基于查尔酮分子的溶酶体荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)中间体Br-HCA的制备
2’-羟基查尔酮HCA(0.267g，1mmol)与1,3-二溴丙烷(1.010g，5mmol)溶于8mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸铯(0.652g，2mmol)。升温至80℃下回流反应12h。停止反应，然后用乙酸乙酯萃取，萃取后合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏，粗产品经硅胶柱层析分离得到化合物Br-HCA，产率58％。
步骤(2)溶酶体荧光探针Lyso-HCA的制备
将化合物Br-HCA(78mg,0.2mmol)与吗啉(70mg,0.8mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，后加入5mL乙腈，向溶液中加入碳酸铯(130mg,0.4mmol)粉末，升温至80℃回流反应24h。停止反应并冷却，减压旋蒸除去溶剂乙腈，将粗产物进行柱色谱分离，洗脱剂CH2Cl2:CH3OH＝40:1。得到橙黄色固体产物Lyso-HCA，产率60％。
1.对实施例1制备的溶酶体荧光探针进行结构表征：
中间体Br-HCA的核磁共振氢谱如如图1所示，氢的数量和峰的耦合裂分情况与分子结构相符，表明所合成中间体Br-HCA的结构正确。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.64–7.41(m，5H)，7.19–6.99(m，3H)，6.69(d，J＝8.9Hz，2H)，4.21(t，J＝5.7Hz，2H)，3.56(t，J＝6.2Hz，2H)，3.06(s，6H)，2.34-2.25(m，2H)。
溶酶体荧光探针Lyso-HCA的核磁共振氢谱如图2所示，氢的数量和峰的耦合裂分情况与分子结构相符，表明所合成探针分子的结构正确。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.61-7.41(m，5H)，7.17(d，J＝15.7Hz，1H)，7.07-6.97(m，2H)，6.68(d，J＝8.7Hz，2H)，4.11(t，J＝6.0Hz，2H)，3.66-3.59(m，4H)，3.04(s，6H)，2.50-2.44(m，2H)，2.30(s，4H)，1.97(dd，J＝13.8，6.5Hz，2H)。
溶酶体荧光探针Lyso-HCA的核磁共振碳谱如图3所示，碳峰的数量与分子结构相符，表明所合成探针分子的结构正确。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：193.55，157.10，151.86，144.50，132.11，130.27，130.16，122.75，122.54，120.74，112.38，111.83，66.92，66.66，55.62，53.56，40.18，26.44。
溶酶体荧光探针Lyso-HCA的高分辨质谱如图4所示，HRMS(ESI)m/z：C24H30N2O3[M+H]+测量值395.2320，与预测值395.2335基本一致，表明所合成探针分子的结构正确。
2.溶酶体荧光探针Lyso-HCA在不同溶剂中的荧光光谱测试：
取实施例1制备的溶酶体荧光探针Lyso-HCA测试其在不同溶剂中的荧光光谱，具体操作步骤如下：所用溶剂包括甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、乙腈、二甲基亚砜、水。以荧光光谱仪进行测试，测试浓度为10μmol/L。结果如图5所示，在420nm波长的激发下，探针的最大荧光发射波长约480-540nm，波长随溶剂极性的增大发生显著红移，体现了该探针典型的分子内电荷转移特征，其中在二甲基亚砜中荧光最强，在540nm处有较强的荧光发射，斯托克斯位移可达110nm。
3.溶酶体荧光探针Lyso-HCA在不同pH溶液中的荧光光谱测试：
取实施例1制备的溶酶体荧光探针Lyso-HCA在不同pH溶液中测定荧光光谱，得到探针的荧光强度与pH关系如图6所示。具体操作步骤如下：不同pH的溶液通过向PBS缓冲溶液中分别加入NaOH和HCl来配制得到，具体pH值由pH计测定。测试时将不同pH的溶液和二甲基亚砜混合(v:v＝1:1)作为测试溶剂。用二甲基亚砜配制5mmol/L的探针母液，探针母液加入测试溶剂得浓度为10μmol/L的测试溶液。图6所示为探针在不同pH条件下530nm处的荧光强度与pH关系图。结果显示在pH范围从3到12时，探针的荧光强度没有较大差异，表明该探针荧光对酸碱性环境稳定性好，不会受到细胞溶酶体酸性变化的影响。
4.溶酶体荧光探针Lyso-HCA在细胞溶酶体荧光成像中的应用：
将实施例1制备的溶酶体荧光探针Lyso-HCA应用于细胞溶酶体荧光成像，具体操作步骤如下：探针母液使用二甲基亚砜配制，浓度为5mmol/L。实验所用HeLa细胞在DMEM培养基(1％青链霉素混合液双抗，10％胎牛血清)在37℃、饱和湿度、含5％的CO2的二氧化碳培养箱中培养，提前24h传代至细胞培养皿内贴壁培养准备进行荧光成像实验。取2μL探针母液加入到2mL培养基中，充分震荡均匀得到探针浓度为5μmol/L的细胞染色液，吸去细胞培养皿中的培养基，加入细胞染色液孵育30min，再加入市售溶酶体染料Lyso-Tracker Red(浓度0.1μmol/L)孵育10min，后用PBS洗三次，将细胞培养皿置于激光共聚焦荧光显微镜下进行观察和荧光成像，Lyso-HCA的激发波长为405nm，检测波长450-550nm，市售溶酶体染料Lyso-Tracker Red的激发波长为561nm，检测波长575-675nm。结果如图7所示，图中(a)为Lyso-HCA的荧光成像、(b)为Lyso-Tracker Red的荧光成像、(c)为细胞眀场成像、(d)为荧光成像中划线区域的荧光强度分布曲线。由图可以看出荧光探针Lyso-HCA与市售溶酶体荧光染料Lyso-Tracker Red在细胞内的重合性好，并得到其Pearson’s共定位系数为0.947，说明荧光探针Lyso-HCA成功定位于细胞内溶酶体，实现了溶酶体的特异性荧光成像。
综上所述，该荧光探针制备方法简单、快速、成本低，制得的荧光探针具有较大的斯托克斯位移，背景干扰低、检测灵敏度高，应用于细胞荧光成像的激发能力强，该探针荧光对酸碱性环境稳定性好，对溶酶体荧光成像的特异性好。该探针为细胞溶酶体荧光成像研究提供了具有广阔应用前景的工具。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针，其特征在于，所述探针结构式如下所示：
。
2.一种基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）将2’-羟基查尔酮（HCA）和1,3-二溴丙烷加入有机溶剂中混合均匀，在碱性条件下加热回流搅拌，过滤除去固体残渣，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得中间体Br-HCA；
步骤2）将中间体Br-HCA和吗啉加入有机溶剂中混合均匀，在碱性条件下加热回流，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱色谱分离获得溶酶体荧光探针Lyso-HCA。
3.根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中，反应原料HCA与1,3-二溴丙烷的摩尔比为1:（2~10）。
4.根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述有机溶剂使用N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙腈，反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和有机溶剂的摩尔比为1:（2~10）:（60~1000）。
5.根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述有机溶剂使用N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙腈，中间体Br-HCA、吗啉和有机溶剂的摩尔比为1:（2~10）:（60~1000）。
6.根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述碱性条件使用无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或氢化钠，且反应原料HCA、1,3-二溴丙烷和碱的摩尔比为1:（2~10）:（1~10）。
7.根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述碱性条件使用无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或氢化钠，且反应原料Br-HCA、吗啉和碱的摩尔比为1:（1~5）:（1~10）。
8. 根据权利要求2所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）中，反应温度为60-120℃，反应时间为4~24 h。
9.权利要求1所述的基于查尔酮的溶酶体荧光探针在细胞溶酶体靶向荧光成像中的应用，所述应用为非疾病诊断目的的应用。
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