CN107601455B

CN107601455B - 长时间靶向成像活细胞内rna荧光碳点的制备方法及其产品和应用

Info

Publication number: CN107601455B
Application number: CN201710851818.8A
Authority: CN
Inventors: 黄承志; 程云英
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: CN107601455A

Abstract

本发明涉及一种长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法及其产品和应用，荧光碳点以间苯二胺、胺类化合物和水为原料水热合成具有长时间靶向成像活细胞内RNA的荧光碳点；合成方法简单，条件可控，制得的碳点具有强绿色荧光发射、超低生物毒性、还具有强抗光漂白及长时间成像细胞内RNA的性能，可作为RNA探针用于常规细胞内RNA分布定位或细胞内RNA动态变化，还可以用于指示细胞的状态以及筛选以RNA聚合酶I为靶点的抗癌药物。

Description

长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种抗光漂白性强、生物相容性高，具有长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，还涉及由该方法制得的产品和应用。

背景技术

RNA在细胞内具有极其复杂的功能，如运输(tRNA)、遗传信息翻译(mRNA)、分子机器支架(rRNA)、基因表达水平的调节(miRNA)以及催化功能(核酶)等。因此，长时间实时成像监控细胞内RNA的动态水平及其时空分布对理解RNA在细胞活动中的生理功能、RNA相关疾病发生的生理过程以及筛选以RNA聚合酶为靶向的抗癌药物均具有重要意义。

目前，越来越多的研究者致力于发展细胞内RNA的成像方法，其中被广泛应用的有荧光标记RNA显微注射技术、荧光原位杂交技术(FISH)、绿色荧光蛋白标记RNA结合蛋白技术等。但是这些技术繁琐耗时且只是针对单个或几个RNA分子，不能成像活细胞内整体RNA。虽然有机小分子荧光染料已被成功地应用于细胞内整体RNA成像，但是它们仍然面临着水溶性差、细胞毒性高以及光漂白性差等问题，不利于活细胞内RNA的长时间实时成像分析。

近年来，荧光碳点作为新型发光纳米材料中的杰出代表，具有粒径小(<10nm)、水溶性良好、抗光漂白性强以及生物毒性低等优势，已经被广泛地应用于各种领域，尤其是生物成像领域。将碳点应用于亚细胞结构(包括细胞器和生物大分子)靶向成像的研究在近几年已逐步受到重视，但它们中的绝大部分需要借助靶向分子才能获得靶向效果。此外，可用于靶向细胞内RNA的碳点尚未见报道。因此，制备一种生物相容性好、抗光漂白性强且可长时间靶向成像活细胞内RNA的碳点是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，制备方法简单，条件可控；本发明的目的之二在于提供由上述方法制得的荧光碳点，该碳点具有强绿色荧光发射、超低生物毒性，具有抗光漂白性强和生物相容性高；本发明的目的之三在于提供上述荧光碳点在制备靶向细胞内RNA成像剂中的应用；本发明的目的之四在于提供荧光碳点在制备筛选靶向RNA聚合酶的抗癌药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

1)反应：取间苯二胺、胺类化合物与水混合并溶解，然后于160～220℃反应至少16小时，冷却后得到棕黄色的液体；所述间苯二胺与胺类化合物的质量体积比为95～105︰0.1～0.5，单位mg︰mL，所述胺类化合物含有氨基和亚胺基；

2)中和：向步骤1)的反应液加入酸溶液调整反应液pH至6.8～7.8，得中和液；

3)纯化：将步骤2)得到的中和液固液分离，获得长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点。

优选的，所述反应是在四氟乙烯反应釜中，于180℃反应20小时。

本发明步骤1)中，所述间苯二胺与胺类化合物的质量体积比为100︰0.2，单位mg︰mL。

本发明步骤1)中，所述水加入量按胺类化合物与水的体积比为2：48～5：45。

本发明步骤2)中，所述酸溶液为盐酸溶液。

本发明步骤3)中，所述固液分离为用孔径0.22微米的滤头过滤后，用截留分子量为 500-1000Da的透析袋透析24～48小时。

本发明中，所述胺类化合物为三亚乙基四胺、乙二胺、精胺或间苯二胺，其中使用三亚乙基四胺效果最佳。

上述制备过程中，混合和反应步骤中所使用的器皿用超纯水洗净。

2、由所述制备方法制得的具有长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点。

3、所述荧光碳点在制备靶向细胞内RNA成像剂中的应用，用于常规的细胞内RNA的分布定位，也可以将其应用于研究长时间尺度上(例如某些重要的细胞生理活动过程中)单个细胞内RNA的动态变化，还可以将该碳点用于指示细胞的状态。

4、所述荧光碳点在制备筛选靶向RNA聚合酶的抗癌药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明利用水热合成的方法，简单易得地合成了具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的绿色荧光碳点，不需要后续的修饰步骤，并且无论在体内还是体外均具有较好的抗光漂白性和生物相容性，且生物毒性低。此荧光碳点在检测细胞状态、与 RNA相关的细胞生理过程以及靶向RNA聚合酶抗癌药物的筛选等方面将会得到广泛的应用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为碳点的高倍透射电镜图片(a：在较低放大倍数下大量碳点的宏观照片；b：较高放大倍数下，碳点面内晶格；c：较高放大倍数下，碳点面间晶格)。

图2为碳点表面官能团的表征(a：碳点总体的X射线光电子能谱；b：C1s的X-rayphotoelectron spectrometer图谱；c：N1s的X-ray photoelectron spectrometer图谱；d：傅立叶转换红外吸收光谱)；

图a、b和c均为使用ESCALAB250 X-ray photoelectron spectrometer测定得到的XPS图谱，以此来确定碳点中所含元素及其价态；C:表示碳元素，N:表示氮元素，O:表示氧元素， 1,2：主量子数；s,p：原子轨道；1/2,3/2：磁量子数和自旋量子数的和，其中自旋量子数取得是1/2和-1/2。

图3为碳点的荧光光谱与紫外可见吸收光谱。

图4为碳点荧光稳定性考察(a：不同盐浓度对碳点的荧光强度的影响；b：不同浓度的过氧化氢对碳点荧光强度的影响；c：不同时间紫外光照对碳点荧光强度的影响；d：不同pH 对碳点荧光强度的影响)。

图5为碳点的细胞毒性实验结果，表明该碳点具有较好的生物相容性。

图6为碳点靶向不同活细胞内RNA的图片(a：碳点的RNA靶向特异性；b：碳点靶向成像三种人细胞系内RNA，a、b均为使用奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统拍摄得到的图片)。

图7为碳点抗光漂白性能探究结果(上排照片为碳点在激光下连续激发120min过程中使用奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统拍摄得到的照片；下排照片为RNA特异染料SYTO RNA Select在激光下连续激发120min过程中使用奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统拍摄得到的照片。该结果表明碳点较有机小分子染料具有更强的抗光漂白性)。

图8为碳点长时间靶向细胞内RNA的荧光共聚焦照片(a为不同细胞凋亡诱导剂处理不同时间后碳点在HEp-2细胞内的荧光共聚焦照片；b为碳点成像HEp-2细胞在有丝分裂过程中RNA动态的照片；图c为在3天时间内，细胞的数量变化，a、b和c均为使用奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统拍摄得到的照片)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明所有试剂如下：间苯二胺(阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)、三亚乙基四胺 (阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)，盐酸(重庆川东化工(集团)有限公司，重庆)，实验中所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水(18.2M，Mili-Q)。

本发明所用仪器如下：MILIPORE(美国)超纯水机；QL-901型漩涡混匀器(海门市其林贝尔器材制造有限公司)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(一恒科学仪器有限公司，上海)；25mL四氟乙烯高压反应釜(恒化科技有限公司，济南)透析袋MD31(500-1000Da) (易佰聚经贸有限公司，上海)；0.22微米滤头(钛新化工有限公司，重庆)。

实施例1、一种抗光漂白性强、生物相容性高、具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的绿色荧光碳点的制备

一种抗光漂白性强、生物相容性高、具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的绿色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

1)将25mL四氟乙烯反应釜用超纯水洗净待用；

2)将100mg间苯二胺、0.2mL三亚乙基四胺以及4.8mL超纯水混匀后加入反应釜中；

3)将反应釜置于电热恒温鼓风干燥箱中，于180℃反应20小时后，冷却得到棕黄色的液体；

4)将反应产物用盐酸溶液中和至溶液pH＝7.0；

5)将中和后的溶液先用0.22微米滤头过滤后，随后用截留分子量为500-1000Da的透析袋透析20小时，透析完毕后冷冻干燥，得具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的绿色荧光碳点的碳点。

本发明中通过多次实验发现，将间苯二胺与三亚乙基四胺以质量体积比为95～105︰ 0.15～0.2混合，再加入4.8mL的超纯水，反应温度为180℃，反应20小时所得碳点的荧光强、 RNA靶向性好，反应时间过少或者温度过低都会使其荧光强度以及RNA靶向性减弱。

本发明制得的碳点，因其表面含有氨基或者亚胺基和吡啶环结构，携带较强的正电荷，而RNA因为大量磷酸根的存在携带较强的负电荷，因此可以通过静电结合的作用于RNA被动的结合。此外在180℃反应过程中碳点表面形成了大量的苯环和含氮杂环结构，这些结构可以通过π-π堆积作用与RNA独特的二级结构中大沟内碱基进行结合，这就使得该碳点可以特异性的结合细胞内的RNA。按上述原理使用含氨基和亚胺基的胺类化合物，如乙二胺、精胺或间苯二胺均可实现发明目的。

在本发明中，步骤1)中反应前需将反应产物搅拌均匀。此外，步骤1)中会产生氨气，所以需要在通风厨中操作，并且注意废气的处理以免对人体造成伤害。

此外，制备过程中三亚乙基四胺可以使用含有氨基和亚胺基的胺类化合物替换，反应过程中在160～220℃下反应至少16小时，水按含有氨基和亚胺基的胺类化合物与水的体积比为 2：48～5：45加入均可制得本发明性质相同的碳纳米材料。

实施例2、表征制备得到的制备得到的抗光漂白性强、生物相容性高、具有长时间靶向成像活细胞内RNA能力的绿色荧光碳点的形貌及其光学性质测定

FTIR-8400S傅立叶转换红外光谱仪(Hitachi,Japan)；高倍透射电镜(Tecnai G2F20 S-TWIN microscopy)；ESCALAB250 X-ray photoelectron spectrometer；紫外可见分光光度计 (Shimadzu,Japan)；F-2500荧光分光光度计(Hitachi,Japan)；Absolute PLQuantum yield Spectrum C11347(HAMAMATSU,Japan)；多功能酶标仪(BioTek,USA)。

(1)形貌表征：取少许制备好的碳点溶于水，然后滴于投射电镜专用铜网上，干燥后用高倍投射电镜观察其形貌，结果图1所示。通过高倍投射电镜可以看出，本发明制备的碳点平均大小约2.75nm。

(2)使用ESCALAB250 X-ray photoelectron spectrometer测定得到的XPS图谱，以此来确定碳点中所含的元素及其相应价态。图2中a位于285eV左右的峰属于碳元素，400eV左右的峰属于氮元素，531eV左右的峰属于氧元素。图2中b键能为288.0eV的峰属于羰基碳，键能为284.6eV的峰属于C-C/C＝C中的碳；键能为286.2eV的峰属于与C-N/C＝N中的碳。图2中c键能为399.2eV的峰为吡啶型N的峰，401.0eV的峰为吡咯型N的峰，401.5eV的峰为N-H中N的峰。

图2中C：表示碳元素，N：表示氮元素，O：表示氧元素，1,2：主量子数；s,p：原子轨道；1/2,3/2：磁量子数和自旋量子数的和，其中自旋量子数取得是1/2和-1/2。

(3)取少量碳点，KBr压片，测定样品的红外吸收光谱(图2，d)，图中，3439cm^-1、2917cm^-1、2842cm^-1、、1643cm^-1、1562cm^-1和1077cm^-1分别表示碳点中氨基、烷基(1)、烷基(2)、C＝N、石墨烯碳以及-C-O-C-的红外特征吸收峰。

(4)吸收光谱：利用3600UV-Vis-NIR紫外可见分光光度计和F-2500荧光光谱仪分别测得碳点的吸收光谱以及激发与发射光谱图，结果如图3所示。结果显示，碳点的荧光最大发射峰位于510nm处，最大激发波长位于360nm处；碳点在360nm处有良好的紫外吸收，在285nm左右有良好的紫外吸收肩峰。

(5)取少量碳点溶于水后，用数码相机分别测定其自然光与365nm紫外光下的图片，结果如图3所示。结果显示，碳点在365nm紫外光下发出荧光。

实施例3、制备得到碳点的光稳定性、细胞毒性及长时间细胞内RNA靶向成像能力考察

仪器：F-2500荧光分光光度计(Hitachi,Japan)；奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统 (Olympus，Japan)；多功能酶标仪(BioTek,USA)。

将实施例1制得的碳点进行检测，结果如下：

(1)光稳定性考察：使用F-2500荧光分光光度计测定碳点在含有不同浓度的氯化钠溶液、过氧化氢溶液、不同pH梯度的BR缓冲液中以及不同紫外处理时间后的荧光强度，结果如图 4所示。结果显示，本发明制得的碳点具有较强的光稳定性和抗光漂白性。

(2)细胞培养：所选细胞为人呼吸道上皮细胞(HEp2)在96孔板中，细胞在含有10％牛血清(Hyclone)的RPMI1640(Hyclone)培养基中于5％CO₂培养箱中37℃培养24小时后弃去培养基，再将不同质量浓度的碳点分别加入96孔板孵育24小时，而后分别加入10 μLCCK-8溶液，再用PBS缓冲液洗涤两次并加入90μL PBS缓冲作为维持液，继续孵育1h。用多功能酶标仪在450nm波长下测定吸收度，计算细胞存活率，结果如图5所示。结果显示，碳点浓度在0.5mg/mL及其以下对细胞几乎没有毒性，细胞存活率均高于95％，说明该碳点具有较高的生物相容性，将其用于细胞成像具有可行性的。

(3)碳点的RNA特异性及其普适性：将HEp-2细胞分别接种于含有2％牛血清的RPMI1640细胞培养液的成像培养皿中，于37℃，5％CO₂条件下培养了24小时后弃去培养基。首先用预冷的甲醇固定细胞1min，再用1％放入Triton X-100溶液于室温下处理2min。而后分别用DNase(50μg/mL)，RNase(100μg/mL)和PBS溶液孵育1小时。用PBS清洗3 次后，分别加入碳点(50μg/mL)和商业化的RNA染料——SYTO RNA Select(5μM)孵育 2小时，再分别加入DNA特异染料Hoechist33342，继续孵育后15min，最后用PBS冲洗3 次。上述步骤完成后将细胞放于共聚焦显微镜下进行成像，结果如图6中a所示。其中绿色分别为碳点和SYTO RNASelect的荧光，蓝色为Hoechst33342的荧光。结果显示，DNA酶处理过后，碳点的绿色荧光并无明显减弱，而RNA酶处理过后，碳点的荧光几乎看不到了，这个结果与商用RNA染料SYTORNA Select的结果一致，而且前者比后者的效果要更好。这个结果证实了该碳点在细胞内确实是具有RNA靶向性且特异性较好。此外，该碳点可以应用于人的癌细胞系(包括HEp-2细胞和HeLa细胞)以及正常细胞系(如NHBE细胞)，将细胞放于共聚焦显微镜下进行成像，结果如图6中b所示。结果显示，该碳点对多种人细胞系并无差别，说明了该碳点对于细胞内RNA的靶向成像具有普适性。

(4)碳点的抗光漂白性能：将碳点与SYTO RNA Select分别染HEp-2细胞后，用共聚焦显微镜激光对细胞进行连续激发，并在不同时间监测碳点与SYTO RNA Select荧光强度的变化，结果如图7所示。结果显示SYTO RNA Select在持续激发30min后荧光基本消失，而碳点的荧光在持续激发120min后荧光强度仍然保持80％以上，说明该碳点具有良好的抗光漂白性能。

(5)碳点长时间靶向成像细胞内RNA性能：将碳点(50μg/mL)用含有2％牛血清的RPMI1640细胞培养液稀释后用于细胞培养，孵育HEp-2细胞，而后分别观察其在细胞凋亡诱导剂处理下不同时间后、有丝分裂期间以及细胞增殖期间细胞内RNA的动态变化并检测在此期间碳点对细胞内RNA长时间靶向成像的性能，结果如图8所示。结果显示，该碳点可以指示细胞的状态以及帮助筛选以RNA聚合酶I为靶点的抗癌药物(图8中a)，还可以间接的靶向核仁，进而监控在有丝分裂过程中核仁和RNA的动态变化(图8中b)；图8中c为在3 天时间内，细胞的数量从7个增长到17个，同时碳点一直保持良好的RNA靶向性能，说明碳点具有长时间靶向细胞内RNA的能力。

上述结果表明，本发明制得的碳点在细胞的重要并且漫长生理活动过程中，均可观察到碳点对细胞内RNA明显的靶向能力。即该碳点具有良好的、长时间靶向成像细胞内RNA的性能。

综上所述，材料所具有的性质和用途：该碳点具有强绿色荧光发射、超低生物毒性、强抗光漂白与长时间成像细胞内RNA的性能。该碳点所具备的这些独特性质使其既可以用于常规的细胞内RNA的分布定位，也可以将其应用于研究长时间尺度上(例如某些重要的细胞生理活动过程中)单个细胞内RNA的动态变化。除此之外，还可以将该碳点用于指示细胞的状态以及筛选以RNA聚合酶I为靶点的抗癌药物。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）反应：取间苯二胺、胺类化合物与水混合并溶解，然后于160~220℃反应至少16小时，冷却后得到棕黄色的液体；所述间苯二胺与胺类化合物的质量体积比为95~105:0.1~0.5，单位mg:mL，所述胺类化合物含有氨基和亚胺基，所述胺类化合物为三亚乙基四胺；

2）中和：向步骤1）的反应液加入酸溶液调整反应液pH至6.8~7.8，得中和液；

3）纯化：将步骤2）得到的中和液固液分离，获得长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点。

2.根据权利要求1所述长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述反应是在四氟乙烯反应釜中，于180℃反应20小时。

3.根据权利要求1所述长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述间苯二胺与胺类化合物的质量体积比为100:0.2，单位mg:mL。

4.根据权利要求1所述长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述水加入量按胺类化合物与水的体积比为2:48~5:45。

5.根据权利要求1所述长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述酸溶液为盐酸溶液。

6.根据权利要求1所述长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述固液分离为用孔径0.22微米的滤头过滤后，用截留分子量为500-1000Da的透析袋透析24~48小时。

7.由权利要求1~6任一项所述的制备方法制得的具有长时间靶向成像活细胞内RNA荧光碳点。

8.权利要求7所述荧光碳点在制备靶向细胞内RNA成像剂中的应用。

9.权利要求7所述荧光碳点在制备筛选靶向RNA聚合酶I的抗癌药物中的应用。