CN111228305A - 一种碳点混合物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种碳点混合物，采用以下步骤制备，1)取对苯二胺、乙二胺，溶于溶剂中；2)加热至170℃，反应10‑14h，得到碳点混合物。本发明碳点混合物的制备方法简单、成本低，且无需分离，可直接用于检测并清除生物体内的活性氧，起到高效抗炎的作用。

Description

一种碳点混合物及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种碳点混合物及其应用。

背景技术

活性氧是氧代谢过程中的一种天然产物，参与多种生理活动。然而，当疾病或某些外源性药物和毒物侵入后，抗氧化系统可能会紊乱，自由基代谢平衡可能会失衡，导致机体产生过多的活性氧和过氧化损伤。氧化应激在炎症和癌症的发病机制中起着至关重要的作用。因此，控制生物体内活性氧的浓度是一个非常重要的问题，将其控制在适当的范围内也是减少一系列氧化异常的关键。

纳米酶是一种以纳米材料为基础的模拟酶，由于其优越于天然酶的性能，近年来引起了人们的广泛关注。纳米酶的种类繁多，包括贵金属纳米颗粒、碳纳米材料、过渡金属氧化物和硫化物等，在生物分析和疾病诊断领域具有实际应用价值。活性氧的酶活性研究已被广泛接受。

碳点是近年来发展起来的一种新型碳基纳米材料，具有良好的生物相容性、较低的成本和广泛的应用前景。目前已报道了大量关于碳点作为活性氧清除剂的相关内容。然而，现有的基于碳点的活性氧清除剂只能清除一种或几种活性氧。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种碳点混合物，其制备方法简单、成本低，且无需分离，可直接用于检测并清除生物体内的活性氧，起到高效抗炎的作用。

实现本发明目的之一的技术方案是：一种碳点混合物，采用以下步骤制备：

1)取对苯二胺、乙二胺，溶于溶剂中；

2)加热至170℃，反应10-14h，得到碳点混合物。

优选的，所述对苯二胺和乙二胺的摩尔比为125：1。

优选的，所述溶剂为水或者为乙醇。

优选的，1L溶剂中添加0.3-0.4mol对苯二胺。

本发明的目的之二是提供上述碳点混合物在制备治疗炎症药物中的应用，具体为由氧化应激引起的炎症。

采用上述技术方案具有以下有益效果：

1、本发明碳点混合物采用“一锅法”制备，制备方法简单，使用的原料成本低，且反应完毕直接得到目标产物，无需分离即可直接用于检测并清除生物体内的活性氧，起到高效抗炎的作用。

2、本发明碳点混合物具有多种抗氧化酶并清除活性氧的作用，如过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，使细胞免受因脂多糖诱导的氧化应激，起到保护细胞的作用。

3、本发明碳点混合物的制备方法控制反应温度在170℃，若温度过低，将导致反应速度过低，甚至无法反应，若反应温度过高，则将反应生成其他杂质，影响碳点混合物的抗炎效果。

下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。

附图说明

图1为实施例二碳点混合物模拟过氧化物酶结果图，其中，图1A为以TMB和ABTS作为底物，对碳点混合物的过氧化物酶(POD)活性试验结果，图1B为碳点混合物、TMB和ABTS的zeta电位图，图1C为碳点混合物POD活性的pH优化，图1D为碳点混合物POD活性的浓度优化；

图2为实施例三碳点混合物模拟过氧化氢酶、超氧化物歧化酶结果图，其中，图2A为在不同pH下，碳点混合物催化H₂O₂产生氧气的结果图，图2B为用ESR验证碳点混合物清除羟基自由基(·OH)的活性，随着碳点混合物浓度的增加，羟基自由基(·OH)的信号逐渐减弱，图2C为碳点混合物对超氧阴离子的抑制结果图；

图3为实施例四细胞毒性试验结果图；

图4为实施例五检测细胞内活性氧试验的结果图，其中，图4A为碳点混合物清除细胞内活性氧的细胞成像结果，图4B为碳点混合物清除细胞内活性氧的浓度依赖线性关系图；

图5、图6为实施例六细胞炎症试验的结果图，其中，图5A为碳点混合物清除细胞内多余的活性氧，降低细胞受脂多糖诱导的氧化应激，图5B为碳点混合物清除脂多糖刺激细胞产生的过量活性氧的浓度依赖关系，图6A为不同方式处理的RAW264.7细胞的荧光照片(a-d)，明场照片(e-h)及二者合图(i-1)，(a)常规培养的RAW264.7细胞，(b)lμg/mL脂多糖处理RAW264.7细胞24h，(c)5μg/mL碳点预处理后再用lμg/mL脂多糖刺激24h，(d)15μg/mL碳点预处理后再用lμg/mL脂多糖刺激24h，(e-h)及(i-1)分别对应图(a-d)，通过荧光强度来表示ROS强度，图6B为碳点和脂多糖作用后肝脏组织的TNF-α因子水平；

图7、图8为碳点混合物在小鼠体内的抗炎效果试验结果图，其中，图8A为碳点混合物抑制LPS诱导的肝部炎症的组织学分析结果(H&E染色)，图8B为碳点混合物抑制LPS诱导的肝部炎症的组织学分析结果(TUNEL染色)。

具体实施方式

本发明中，使用的对苯二胺、乙二胺均为分析纯，使用的乙醇为无水乙醇。

使用的仪器中，荧光光谱和紫外-可见吸收光谱分别用日立F-2500分光光度计(Tokyo,Japan)和岛津UV-3600分光光度计(Tokyo,Japan)记录。透射电子显微镜(TEM)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)分别来自Tecnai G2 F20 S-TWIN显微镜(FEI,USA)。拉曼光谱是使用LabRAM HR800激光共焦拉曼光谱仪(France)获得的。利用Shimadzu FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪分析官能团(Tokyo,Japan)，用FL-TCSPC分光光度计测量荧光寿命(Horiba Jobin Yvon Inc.,France)。荧光成像采用荧光共聚焦显微镜(Olympus IX2-DSU共聚焦扫描系统，CoolSNAP HQ2 CCD,美国)。

实施例一碳点混合物的制备

精密称定0.11g对苯二胺、精密量取535μL乙二胺溶液作为原料，量取3mL无水乙醇作为溶剂，加入25mL聚四氟乙烯内衬中，用水热反应釜，在170℃下反应12小时即得红棕色的碳点混合物。

得到的碳点混合物在365nm的紫外灯照射下呈现出亮黄色的荧光。采用荧光光谱对碳点混合物的光学性质进行表征，在420nm激发时，最大发射为560nm。紫外-可见吸收光谱表明，该碳点混合物在250nm和400nm处有两个特征吸收峰。

实施例二过氧化物酶活性模拟

在0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.6)中，以TMB和ABTS为底物，测定室温下过氧化物酶(POD)样活性。在一定的反应时间内，用多功能酶标仪记录颜色反应(TMB在650nm,ABTS在405nm)的吸光度，以表达类过氧化物酶活性。反应体系中一般含有1mg/mL的碳点混合物、30％的H₂O₂、5mg/mL的TMB/ABTS和缓冲液(pH 3.6)，碳点混合物、H₂O₂、TMB/ABTS、缓冲液(pH3.6)的体积比为1:3:1:20。模拟结果如图1所示。

从图1A可以看出，碳点混合物显示出类似过氧化物酶的活性，图1B为碳点混合物、TMB、ABTS的Zeta电位图，图1C表示碳点混合物表现的过氧化物酶活性与pH值之间的关系，图1D表示碳点混合物表现的过氧化物酶活性与浓度之间的关系。

实施例三过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性模拟

在室温下对碳点混合物进行类过氧化氢酶(CAT)活性测定。将0.3M H₂O₂溶液加入PBS缓冲液(pH 2.0、5.0、7.6或11.4)中，再加入0.6mg/mL的碳点混合物。测定不同反应时间生成的O₂溶解度(单位:mg/L)。通过记录O₂的溶解度来检测所用的碳点浓度对生成的O₂的影响，结果如图2A所示，显示出在碱性条件下，氧的溶解度逐渐增大。利用ESR验证碳点混合物清除羟基自由基(·OH)的活性。由Fe²⁺/H₂O₂体系生成羟基自由基(·OH)，与BMPO反应生成BMPO/·OH加合物，用ESR光谱进行检测。在FeSO₄/BMPO/H₂O₂/碳点混合物混合5分钟后，用ESR谱记录不同样品的羟基自由基(·OH)信号。如图2B所示，显示出随着碳点混合物浓度的增加，羟基自由基(·OH)的信号逐渐减弱。将黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶(XOD)混合在缓冲溶液中生成超氧化物，然后用BMPO以自旋加合物BMPO/·OOH的形式捕获超氧化物。如图2C所示，显示出随着碳点混合物浓度的增加，超氧阴离子(O₂ ^·-)的信号逐渐减弱。

实施例四细胞毒性试验

小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)在添加了10％PRMI-1640培养基中培养，置于37℃、5％CO₂的湿化培养箱中。采用CCK-8法评价碳点混合物的细胞毒性。RAW264.7细胞孵育不同浓度的碳点混合物(2、4、6、8、10、15和20μL/mL),培养24h。用无血清培养基洗两次，每孔加入100μL 10％的CCK-8。在37℃的培养基中孵育20分钟，直到溶液变黄。用多功能酶标仪在450nm处测量吸收值，并扣除碳点混合物的背景值。如图3所示，碳点混合物的浓度达到15μL/mL时，细胞存活率仍然能达到80％以上。

实施例五检测细胞内的活性氧试验

用DCFH-DA染料测定细胞内ROS水平。DCFH是一种可以通过细胞膜的非荧光分子，一旦进入细胞，内源性酯酶将其裂解成DCFH，不再被细胞排出。ROS可将非荧光性DCFH氧化为荧光性DCF，可检测细胞内ROS水平。

RAW264.7细胞用含有不同浓度的碳点混合物(2、4、6、8、10和20μg/mL)孵育24h，然后用10μM的DCFH-DA染在避光孵育20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，去除多余的染料。最后，将被标记的细胞储存在冰上并且避光，在DSU活细胞共聚焦显微镜下拍照，或使用多功能酶标仪在激发波长为488nm，发射波长为525nm的条件下进行测量。细胞内DCF的荧光强度用来表示细胞内ROS含量。如图4A所示，显示出碳点混合物可以消除RAW264.7细胞内ROS生成，如图4B所示，显示出随着碳点混合物浓度的增加，DCF的荧光强度逐渐减弱并且呈现一条良好的线性关系。

实施例六细胞炎症试验

将RAW264.7细胞接种于35×35mm培养板或96孔板，置于培养箱中。这些细胞分别与不同浓度的碳点混合物孵育24h，然后用脂多糖(LPS)孵育24h诱导细胞活性氧水平增加并产生炎症。ROS的产生水平在DSU活细胞共聚焦显微镜系统下进行研究，或使用多功能酶标仪在激发波长为488nm，发射波长为525nm的条件下进行测量。如图5A所示，碳点混合物可以有效地清除小鼠体内的活性氧并且保护细胞免受氧化应激，显示出预孵育随着碳点混合物浓度的增加，有效降低了细胞对外界的氧化应激，用酶联免疫试剂盒按照说明书对细胞上清液中的TNF-α水平进行检测(Beyotime,中国)，预孵育碳点混合物的细胞在脂多糖(LPS)诱导炎症以后起到了良好的抗炎作用，如图5B所示，显示出随着碳点混合物浓度的增加，DCF的荧光强度逐渐减弱并且呈现一条良好的线性关系，如图6A所示，碳点混合物可以有效抑制LPS诱导的过量ROS生成，如图6B所示，显示出碳点混合物对细胞上清液中的TNF-α因子水平有明显的抑制作用。

实施例七碳点混合物在小鼠体内的抗炎效果试验

将ICR小鼠(6-8周龄)随机分为4组(每组5只小鼠):正常组(组1)、脂多糖诱导炎症组(组2)，脂多糖/碳点混合物组(组3和组4)。除了日常喂养的普通饮食,第3组小鼠静脉注射5mg/公斤体重的碳点混合物，一周注射3次，第4组小鼠静脉注射20mg/公斤体重的碳点混合物，一周注射3次，给1和2组小鼠注射等剂量的生理盐水。一周以后，给第2，3和4小组的小鼠静脉注射500μg/公斤体重的脂多糖(脂多糖诱导的小鼠氧化应激和炎症反应模型)，12小时后处死小鼠。观察发现，与组1相比，脂多糖诱导炎症模型组(组2)的小鼠肝脏发生明显的病变，细胞肿胀发炎并且存在颜色异常的情况，预先注射碳点混合物的两组(组3、4)小鼠的肝脏没有明显的病变。取肝组织称重，分成两半，4％多聚甲醛固定一半肝组织，石蜡包埋，切成4mm厚切片，用常规苏木精-伊红染色，用显微镜观察组织形态，如图7所示，显示出取小鼠肝组织，用常规苏木精-伊红(H&E)染色，用显微镜观察组织形态，H&E染色图像中黄色箭头所示，脂多糖处理小鼠肝组织出现局灶性核固缩、炎性细胞浸润，说明脂多糖成功引起了小鼠急性肝炎。与脂多糖诱导炎症模型组的小鼠相比，经过CDs预处理的小鼠中几乎没有观察到肝脏的组织学改病变。采用末端脱氧核苷转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸二氢双氧生镍末端标记(TUNEL)法检测肝组织细胞凋亡。另一半肝组织用冷PBS匀浆检测ROS水平，如图8所示，从TUNEL染色图像显示出与脂多糖诱导炎症模型组的小鼠相比，CDs预处理组的阳性细胞(黄色轮廓)数量明显减少。取对照组和治疗组肝脏组织0.5g，快速取出放入生理盐水中，用匀浆机匀浆。用离心机离心取上清液稀释100倍，转移到96孔板(100μL/孔)并孵育5分钟。每孔加入100μL 20μM DCFH-DA孵育30分钟。然后用多功能酶标仪检测在激发波长为488nm，发射波长为525nm的条件下检测DCF的荧光强度。与脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝炎的模型组小鼠相比，预先注射碳点混合物的实验组小鼠肝脏匀浆的上清液中，ROS得到了有效清除。

Claims (6)

1.一种碳点混合物，其特征在于，采用以下步骤制备：

1)取对苯二胺、乙二胺，溶于溶剂中；

2)加热至170℃，反应10-14h，得到碳点混合物。

2.根据权利要求1所述的碳点混合物，其特征在于，所述对苯二胺和乙二胺的摩尔比为125：1。

3.根据权利要求1所述的碳点混合物，其特征在于，所述溶剂为水或者为乙醇。

4.根据权利要求1所述的碳点混合物，其特征在于，1L溶剂中添加0.3-0.4mol对苯二胺。

5.权利要求1-4任一所述碳点混合物在制备治疗炎症药物中的应用。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述炎症由氧化应激引起。

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