CN101812528A - 开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，具体公开了一种开关式核酸适体探针及其应用，该核酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成互补序列的核酸片段，核酸适体片段和核酸片段通过一7～15nm长的连接片段连接形成一发夹型结构；核酸片段竞争性杂交核酸适体片段的能力弱于目标肿瘤细胞。本发明探针的应用可以是对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测、对血清中肿瘤活细胞的有效检测及活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测中的至少一种。本发明的探针具有较高稳定性、特异性和灵敏性，其应用操作简单、快速、灵敏、特异、成本低。

Description

开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种核酸适体探针及其在肿瘤检测中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的常见疾病。对肿瘤细胞进行准确的免疫分型有利于实现肿瘤的早期诊断和治疗，从而提高肿瘤治愈率。抗原-抗体反应是免疫学诊断的基础，过去几十年间抗体技术的迅速发展对肿瘤诊断及治疗相关研究做出了巨大贡献，然而近年来核酸适体的出现却使得抗体技术受到前所未有的挑战。
核酸适体(又称Aptamer)是利用核苷酸之间严格的识别能力和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸，并通过指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)技术筛选而获得。核酸适体不仅具有类似抗体对靶标高特异性和高亲和力的特点，更在许多方面优于抗体，如：分子量小、无免疫原性、靶标种类丰富(包括酶、生长因子、抗原、基因调节因子、细胞黏附分子、完整的肿瘤细胞等)、合成方法简单且重复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等等。这些特性使得核酸适体作为肿瘤诊断探针得到了广泛的关注和认可，而基于核酸适体的肿瘤识别与检测方法正逐渐成为一种新的、普遍适用的技术，为肿瘤细胞分型、诊断和治疗相关领域的发展带来了新的契机。
“Aptamers Evolved from Live Cells as Effective Molecular Probes for Cancer Study.”《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》2006，103(32)：11838-11843；Dihua Shangguan，Ying Li，Zhiwen Tang，et al.发展了一种以全细胞为靶标的cell-SELEX技术，针对白血病细胞筛选出一组特异性核酸适体，并利用荧光染料标记的核酸适体成功实现了对正常人骨髓抽吸混合细胞中目标白血病细胞的有效识别与检测。随后，该研究小组又采用cell-SELEX技术筛选出分别针对淋巴瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的一系列核酸适体，并将其广泛应用于多种肿瘤细胞或组织的分型与检测中。然而，目前基于核酸适体建立的肿瘤检测方法，还主要是采用单一的信号标记手段如荧光或放射性标记，仅仅将核酸适体作为靶向分子，利用其与目标和非目标细胞之间的亲和力差异来实现对肿瘤细胞的识别。由于核酸适体与非目标细胞之间必然存在一定的非特异性吸附，这类方法无法满足对复杂混合体系中肿瘤细胞的便捷、快速、高特异和高灵敏的分析要求，限制了临床检测中肿瘤早期诊断的实现和相关治疗的开展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有较高稳定性、特异性、灵敏性的开关式核酸适体探针，还提供一种操作简单、快速、灵敏、特异、成本低的开关式核酸适体探针在肿瘤活细胞及活体检测中的应用方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种开关式核酸适体探针，该核酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，所述探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段(设为片段1)和与该核酸适体片段形成6～12对碱基互补序列(连续的)的核酸片段(设为片段2)，所述核酸适体片段和核酸片段通过一7～15nm长的连接片段(设为片段3)连接形成一发夹型结构；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标肿瘤细胞杂交核酸适体片段的能力。该技术方案中，所述片段1具有对目标肿瘤细胞的特异性识别能力；所述片段2由于与片段1形成6-12对碱基互补序列，因此片段2的主要作用是与片段1的部分序列杂交以形成稳定的发夹构型，同时其杂交能力不会影响目标肿瘤细胞对片段1的竞争性结合；所述片段3的主要作用是将片段1和片段2连接成一条探针本体。所述片段2应当是与片段1靠近端部荧光发生(或熄灭)单元处的序列互补，以使得探针两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元能尽可能靠近。
上述的开关式核酸适体探针中，所述荧光发生单元优选为荧光染料分子或荧光纳米颗粒；所述荧光熄灭单元优选为荧光熄灭基团或者为具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料。
上述的开关式核酸适体探针中，所述荧光染料分子优选为荧光素、罗丹明或Cy5；所述荧光纳米颗粒优选为包裹荧光染料的二氧化硅纳米颗粒或荧光量子点。所述荧光熄灭基团优选为DABCYL、BHQ1或BHQ2；所述具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料优选为金纳米颗粒或碳纳米管。本领域人员可以自行确定和选择荧光发生单元和荧光熄灭单元的实施组合方式，例如荧光素与DABCYL、荧光素与BHQ1、四甲基罗丹明与BHQ2、四甲基罗丹明与金纳米颗粒、Cy5与金纳米颗粒、Cy5与碳纳米管、包裹荧光染料的二氧化硅纳米颗粒与BHQ2、荧光量子点与BHQ2等等。
上述的开关式核酸适体探针中，所述核酸适体片段优选是指通过指数富集的配体系统进化技术(简称SELEX技术)筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适体。更优选的，所述核酸适体片段是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(简称CCRF-CEM肿瘤细胞)具有特异性识别能力的核酸适体序列1或者对人B淋巴细胞瘤细胞(简称Ramos细胞)具有特异性识别能力的核酸适体序列2或者对小鼠肝细胞瘤细胞(简称MEAR细胞)具有特异性识别能力的核酸适体序列3；其中，
所述核酸适体序列1的核苷酸序列为：
5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3′；
所述核酸适体序列2的核苷酸序列为：
5’-AAC ACC GTG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3′；
所述核酸适体序列3的核苷酸序列为：
5’-AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3′。
上述的开关式核酸适体探针中，所述连接片段优选为一段不会与所述核酸适体片段和核酸片段杂交的片段，或者为一段具有亲水性和生物相容性的聚合物链(如聚乙二醇等)。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的开关式核酸适体探针在肿瘤活细胞及活体检测中的应用，所述应用包括以下三种检测中的至少一种：
(1)对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测；
(2)对血清中肿瘤活细胞的有效检测；
(3)活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测。
上述的应用中，所述对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测的具体检测步骤优选为：在待测缓冲液中加入所述开关式核酸适体探针5～50nM，于常温下避光培育15min后，立即采用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群(例如可以10000个计为一群)的荧光强度进行统计分析，当荧光强度高于10的特定细胞数占细胞群中细胞总数的20％以上时，即认为待测缓冲液中有目标肿瘤活细胞被所述开关式核酸适体探针检出。
上述的应用中，所述对血清中肿瘤活细胞的有效检测的具体检测步骤优选为：在待测血清中加入所述开关式核酸适体探针5～50nM，于冰上避光培育30min后，立即采用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群(例如可以10000个计为一群)的荧光强度进行统计分析，当荧光强度高于10的特定细胞数占细胞群中细胞总数的20％以上时，即认为待测血清中有目标肿瘤活细胞被所述开关式核酸适体探针检出。
上述的应用中，所述活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测的具体检测步骤优选为：向待测活动物体内静脉注射0.3～0.5nmol的开关式核酸适体探针和10倍以上于开关式核酸适体探针浓度的随机序列寡核苷酸，然后立即采用活体荧光影像系统实时记录动物体内各个部位的荧光强度变化，当观察到某一组织部位的荧光信号明显高于其他组织部位时(当然应当排除该荧光信号增强并非由开关式核酸适体探针因被动靶向而聚集于肝脏、心脏、肾脏、膀胱等代谢相关组织所导致的前提下，这对于本领域人员来说是公知的)，即认为该动物体内有目标肿瘤细胞被所述开关式核酸适体探针检出，且肿瘤部位位于荧光信号明显增强处。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明巧妙地利用了核酸适体对肿瘤细胞的特异性高亲和力和发夹型核酸探针的高灵敏信号转换机制特性，建立了基于开关式核酸适体探针的肿瘤活细胞及活体检测技术(Aptamer-based Switchable Probe，简称ASP)。本发明利用该发夹型核酸探针作为ASP中的信号转换元件，将核酸适体对目标肿瘤细胞的识别能力高灵敏、高特异性地转换为荧光信号的发生，避免了现有基于单一荧光或放射性标记核酸适体的检测方法中，为克服非特异性吸附信号而进行的繁琐的洗涤过程，缩短了检测时间，拓展了可适用的检测体系。同时，基于发夹型核酸探针信号转换机制，ASP与目标肿瘤细胞结合前后因构象发生变化而引起荧光信号“从无到有”，极大地提高了检测方法的灵敏性和特异性，这是传统分析方法所无法比拟的。核酸适体在本发明的技术方案中不仅起到了筛选、识别肿瘤细胞的作用，而且起到了控制ASP信号从“关闭”到“打开”的重要作用。由于核酸适体在与肿瘤细胞结合时，对肿瘤细胞具有较高的选择性，再加上发夹型核酸探针的设计使得构象或信号转换需要核酸适体与肿瘤细胞之间存在更强的亲和力，因此ASP对目标肿瘤细胞的检测具有高度的选择性和特异性，从而实现了在复杂混合体系(如血清)、甚至活动物体内无需分离的实时分析检测。
本发明为核酸适体在肿瘤活细胞检测和活体成像研究中的应用提供了全新的手段和思路。该开关式核酸适体探针对肿瘤活细胞和活体肿瘤组织的检测分析操作简单、快速、灵敏、特异、成本低，具有重要的科学价值和广阔的市场前景，有巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1中开关式核酸适体探针与肿瘤细胞结合前后的结构示意图(其中实线表示核酸适体片段、虚线表示连接片段、点线表示核酸片段)。
图2为本发明实施例1中开关式核酸适体探针对肿瘤细胞的检测原理图。
图3为现有技术中基于单一荧光标记的核酸适体探针对肿瘤细胞的检测原理图。
图4为本发明实施例2中不同探针在不同生理缓冲液中的荧光光谱表征图；其中，各曲线从下往上依次为：
曲线a为空白生理缓冲液的背景荧光光谱；
曲线b为开关式核酸适体探针在空白生理缓冲液中的荧光光谱；
曲线c为开关式对照核酸探针在空白生理缓冲液中的荧光光谱；
曲线d为开关式对照核酸探针在含有与开关式核酸适体探针互补核酸片段的生理缓冲液中培育后的荧光光谱；
曲线e为单一荧光标记的核酸适体探针在空白生理缓冲液中的荧光光谱；
曲线f为单一荧光标记的对照核酸探针在空白生理缓冲液中的荧光光谱；
曲线g为开关式核酸适体探针在含有与开关式核酸适体探针互补核酸片段的生理缓冲液中杂交后的荧光光谱。
图5为本发明实施例3中开关式核酸适体探针和开关式对照核酸探针对不同肿瘤细胞缓冲液的检测结果对比图。
图6为本发明实施例4中不同种类的探针对缓冲液中CCRF-CEM肿瘤细胞的检测灵敏性比较结果图，其中：
曲线h为CCRF-CEM细胞在缓冲液中与单一荧光标记的对照核酸探针培育后的荧光强度统计分析结果；
曲线i为CCRF-CEM细胞在缓冲液中与开关式对照核酸探针培育后的荧光强度统计分析结果；
曲线j为CCRF-CEM细胞在缓冲液中与单一荧光标记的核酸适体探针培育后的荧光强度统计分析结果；
曲线k为CCRF-CEM细胞在缓冲液中与开关式核酸适体探针培育后的荧光强度统计分析结果。
图7为本发明实施例5中开关式核酸适体探针在血清中的荧光稳定性考察图。
图8为本发明实施例6中开关式核酸适体探针和开关式对照核酸探针对血清中不同肿瘤细胞的特异性检测结果图。
图9为本发明实施例7中不同种类的探针在荷瘤裸鼠体内的肿瘤活体检测结果对比图，其中圆圈所指示的位置即为CCRF-CEM肿瘤所在的位置。
图10为本发明实施例8中开关式核酸适体探针在植有不同肿瘤的裸鼠体内的活体肿瘤特异性检测结果对比图，其中：
第(1)行为开关式核酸适体探针在未种瘤正常裸鼠体内的荧光成像结果；
第(2)行为开关式核酸适体探针在Ramos荷瘤裸鼠体内的荧光成像结果；
第(3)行为开关式核酸适体探针在CCRF-CEM荷瘤裸鼠体内的荧光成像结果。
图例说明：
1、探针本体；11、核酸适体片段；12、连接片段；13、核酸片段；2、荧光发生单元；3、荧光熄灭单元。
具体实施方式
以下结合优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限定本发明。
实施例1：
(针对CCRF-CEM肿瘤细胞设计的开关式核酸适体探针的检测原理示意图)
一种如图1所示的本发明的开关式核酸适体探针，该核酸适体探针包括探针本体1和分别连接于该探针本体1两端的荧光发生单元2和荧光熄灭单元3，探针本体1包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段11和与该核酸适体片段11部分序列互补的核酸片段13，核酸适体片段11和核酸片段13通过一连接片段12连接形成一发夹型结构。核酸片段13竞争性杂交核酸适体片段11的能力弱于目标肿瘤细胞。本实施例中的荧光发生单元2为荧光染料分子Cy5近红外荧光基团，其连接于核酸片段13的端部；本实施例中的荧光熄灭单元3为BHQ2荧光熄灭基团，其连接于核酸适体片段11的端部。本实施例的开关式核酸适体探针设计完成后直接交Takara生物工程公司合成。
本实施例中的核酸适体片段11是一段对CCRF-CEM肿瘤细胞具有特异性识别能力的DNA，其核苷酸序列为：
5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3′；
本实施例中的连接片段12是一段由多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸聚合而成的DNA，其核苷酸序列为：
5’-TTT TTT TTT TTT TTT TT-3′；
本实施例中的核酸片段13是一段与核酸适体片段11部分序列互补的DNA，其核苷酸序列为：
5’-CTA ACC GT-3′；
上述三个片段依次连接好后组成的开关式核酸适体探针的全序列为：
[5’-(Cy5)-CTA ACC GT TTT TTT TTT TTT TTT TT ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGGGAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-(BHQ2)-3′]。
本实施例的开关式核酸适体探针的检测原理如图2所示，当待检测体系中不存在CCRF-CEM肿瘤细胞时，开关式核酸适体探针主要为发夹型构象，一端的Cy5近红外荧光基团的荧光信号被另一端的BHQ2荧光熄灭基团吸收，使得荧光信号处于“关闭”状态；而当开关式核酸适体探针与CCRF-CEM肿瘤细胞特异性结合时，核酸适体构型发生变化导致其发夹型构象被破坏从而产生明显的荧光恢复，荧光信号处于“打开”状态；由于核酸适体片段11只有与CCRF-CEM肿瘤细胞结合时才会发生构型变化，没有与CCRF-CEM肿瘤细胞结合的荧光信号始终处于“关闭”状态，因此检测背景较低，这样就实现了对CCRF-CEM肿瘤细胞高特异、高灵敏和免分离的实时分析诊断。相比于图3所示的基于单一荧光标记的核酸适体探针对CCRF-CEM肿瘤细胞进行检测的检测原理相比，不论待检测体系中是否存在目标肿瘤细胞，基于单一荧光标记的核酸适体探针的荧光信号均可被检测到，对目标肿瘤细胞进行分析还需要进行繁琐的洗涤过程，从而难以实现对目标肿瘤细胞实时、高效、便捷地检测。
实施例2：
开关式核酸适体探针在缓冲液中的荧光光谱表征
在四个200μL缓冲液(Dulbecco’s PBS，4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2，1mg/mL BSA)样本中分别加入100nM的上述实施例1的开关式核酸适体探针、开关式对照核酸探针、单一荧光标记的核酸适体探针和单一荧光标记的对照核酸探针，四种探针的核苷酸序列分别如下：
开关式核酸适体探针：[5’-(Cy5)-CTA ACC GT TTT TTT TTT TTT TTT TT ATC TAA CTGCTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-(BHQ2)-3′]；
开关式对照核酸探针：[5’-(Cy5)-ACG GTT AG TTT TTT TTT TTT TTT TT ATA CGG TGACTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTC TAA CCG TA-(BHQ2)-3′]；
单一荧光标记的核酸适体探针：[5’-(Cy5)-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AATACT GTA CGG TTA GA-3′]；
单一荧光标记的对照核酸探针：[5’-(Cy5)-ATA CGG TGA CTG CGC CGC CGG GAA AATACT GTC TAA CCG TA-3′]。
将添加有上述探针后的缓冲液于6℃左右的冰箱中放置过夜后，在6℃温育，待荧光强度稳定后用荧光分光光度计(Hitachi日本F-2500型)记录荧光光谱(参见图4中的曲线a、b、c、e和f)，激发波长为620nm，发射波长为640～740nm。
另取两个200μL的上述生理缓冲液作为两个补充样本，向两样本中分别加入300nM与上述核酸适体片段11完全互补的核酸片段(5’-TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC CGG CGGCGC AGC AGT TAG AT-3′)，再向两个补充样本中分别加入100nM的上述开关式核酸适体探针及开关式对照核酸探针，混匀后于6℃左右冰箱中放置过夜，随后在6℃下温育，待荧光强度稳定后用荧光分光光度计(Hitachi日本，F-2500型)记录荧光光谱(参见图4中的曲线d和g)，激发波长620nm，发射波长640～740nm。
由图4可见，在没有目标物存在的空白生理缓冲液中，开关式核酸适体探针的荧光信号较单一荧光标记的核酸适体探针及单一荧光标记的对照核酸探针均大幅下降，具有较低的检测背景；而当本发明的开关式核酸适体探针与核酸适体的互补序列杂交之后，该开关式核酸适体探针的荧光得到极大恢复，且信号强度高于单一荧光标记的核酸适体探针。
实施例3：
开关式核酸适体探针对缓冲液中肿瘤细胞的高特异性检测
在200μL分散有2×105个CCRF-CEM肿瘤细胞的两个缓冲液样本中，分别加入25nM实施例2中准备的开关式核酸适体探针、开关式对照核酸探针，混合均匀后于常温下避光孵育15min，随即用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)检测细胞的荧光信号。另外，分别对含有Ramos细胞、人多发性骨髓瘤细胞(简称U266细胞)、非洲绒猴B淋巴细胞(简称B95-8细胞)等阴性对照细胞的缓冲液进行检测，操作如前所述，对含有前述四种不同肿瘤细胞缓冲液的检测结果如图5所示。由图5可见，开关式核酸适体探针和开关式对照核酸探针对Ramos细胞、U266细胞、B958细胞等阴性对照细胞均不能产生较强的荧光信号，但本发明的开关式核酸适体探针在与CCRF-CEM肿瘤细胞结合后能发生较强的荧光恢复，而开关式对照核酸探针仍不能产生较强的荧光信号，这显示出本实施例的开关式核酸适体探针对不同肿瘤细胞检测的高度特异性。
实施例4：
开关式核酸适体探针与传统方法对缓冲液中肿瘤细胞的检测灵敏性比较
在200μL分散有2×105个CCRF-CEM肿瘤细胞的缓冲液中，分别加入25nM实施例2中准备的开关式核酸适体探针、开关式对照核酸探针、单一荧光标记的核酸适体探针或单一荧光标记的对照核酸探针，混合均匀后于常温下避光孵育15min，随即用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)检测细胞的荧光信号。检测结果如图6所示，由图6可见，开关式对照核酸探针和单一荧光标记的对照核酸探针的荧光强度较弱，这说明其对CCRF-CEM肿瘤细胞不具有特异性识别能力；而较基于单一荧光基团标记的普通核酸适体探针而言，在相同CCRF-CEM肿瘤细胞浓度的条件下，本发明的开关式核酸适体探针能够产生更大的信背比，因此可用于较低浓度的目标肿瘤细胞的检测。
实施例5：
开关式核酸适体探针在血清中的荧光稳定性考察
在200μL小鼠血清中同时加入175nM开关式核酸适体探针和2.25μM未做任何标记的随机核酸片段(5’-CTA ACC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TAT CTA ACT GCT GCG CCG CCGGGA AAA TAC TGT AC-3′)，于37℃下温育，同时用荧光分光光度计(Hitachi日本，F-2500型)监测荧光强度，激发波长640nm，发射波长660nm，直到荧光强度稳定后结束监测。监测结果如图7所示，由图7可见，随着培育时间的延长，开关式核酸适体探针的荧光逐渐上升，这可能是血清中的核酸酶对探针的降解所致，也可能是由于某些非特异性蛋白与探针的结合使其构型发生变化，从而使荧光得到一定程度的恢复。由图7可知，37℃下，本实施例开关式核酸适体探针在小鼠血清中的半衰期大约为23分钟，这一稳定性足以满足体内外肿瘤细胞检测的需要。
实施例6：
开关式核酸适体探针对血清中肿瘤细胞的特异性检测
在200μL分散有2×105个CCRF-CEM肿瘤细胞的小鼠血清中，分别单独加入25nM实施例2中准备的开关式核酸适体探针及开关式对照核酸探针，混合均匀后于冰上避光孵育30min，随即用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)检测细胞的荧光信号。另对含Ramos细胞的小鼠血清采用如前所述的操作，最后的检测结果如图8所示。由图8可见，即使是在血清这一复杂混合体系中，本实施例的开关式核酸适体探针仍然可以实现对目标CCRF-CEM肿瘤细胞的高特异性检测。
实施例7：
开关式核酸适体探针在活体肿瘤检测中的应用
将200μL约含1×107个生长旺盛的CCRF-CEM细胞悬液皮下注射入3～4周龄BALB/c雄性裸鼠的右前肢背部，生长3～4周后即可明显成瘤。随后选取具有合适大小肿瘤的荷瘤裸鼠，以尾静脉注射约140μL含4.5nmole未做任何标记的随机核酸片段和0.35nmole实施例2中的开关式核酸适体探针的生理盐水(另采用实施例2中的开关式对照核酸探针的生理盐水作对照)，同时采用MaestroTM活体荧光成像系统(CRI，美国)实时监测肿瘤部位的荧光强度。与此相比较的传统成像方法则是使用0.5nmole实施例2中的单一荧光标记的核酸适体探针以尾静脉注入荷瘤裸鼠体内，其余操作同前所述。
本实施例的检测结果如图9所示，由图9可见，作为阴性对照的开关式对照核酸探针在注入CCRF-CEM荷瘤裸鼠体内后，并没有在肿瘤部位观察到明显的荧光信号；而开关式核酸适体探针在注入CCRF-CEM荷瘤裸鼠体内10分钟左右即可在肿瘤部位观察到明显的荧光信号，且随着时间延长，该肿瘤部位与其他非靶组织的荧光信号对比度逐渐增大；到30分钟左右，肿瘤部位仍然保持了较高的荧光信号对比度，有效实现了对目标肿瘤细胞的活体靶向成像和检测。与之相比较的单一荧光标记的核酸适体探针在注入CCRF-CEM荷瘤裸鼠体内后，荧光信号快速遍布小鼠全身，且随着时间延长荧光信号逐渐降低；虽然肿瘤部位与其他非靶组织的对比度在慢慢增加，且当时间延长至2小时后也较为明显，但由于背景太高导致其对比度明显不如本实施例的开关式核酸适体探针，且检测时间太长，成像机理相对复杂，不利于肿瘤早期诊断的实现。
实施例8：
开关式核酸适体探针的肿瘤活体检测特异性考察
将200μL约含1×107个生长旺盛的CCRF-CEM细胞悬液皮下注射入3～4周龄BALB/c雄性裸鼠的右前肢背部，生长3～4周后即可明显成瘤，另注射Ramos细胞悬液到另一只雄性裸鼠中作为对照。随后用前述两只具有合适大小肿瘤(但肿瘤细胞不同)的荷瘤裸鼠，分别以尾静脉注射约140μL含4.5nmole未做任何标记的随机核酸片段和0.35nmole实施例2中的开关式核酸适体探针的生理盐水，同时采用MaestroTM活体荧光成像系统(CRI，美国)实时监测肿瘤部位的荧光强度，监测结果如图10所示。由图10可见，本实施例的开关式核酸适体探针对肿瘤的活体检测具备高度特异性，仅能在CCRF-CEM肿瘤部位发生强荧光信号。
<110>湖南大学
<120>开关式核酸适体探针及其在肿瘤活细胞及活体检测中的应用
<160>4
<210>1
<211>66bp
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
ctaaccgttt tttttttttt tttttatcta actgctgcgc cgccgggaaa atactgtacg  60
gttaga                                                             66
<210>2
<211>66bp
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
acggttagtt tttttttttt tttttatacg gtgactgcgc cgccgggaaa atactgtcta  60
accgta                                                             66
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<211>41bp
<212>dna
<213>人工序列
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atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a                      41
<210>4
<211>41bp
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
atacggtgac tgcgccgccg ggaaaatact gtctaaccgt a       41

Claims (8)

1.一种开关式核酸适体探针，其特征在于：该核酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，所述探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成6～12对碱基互补序列的核酸片段，所述核酸适体片段和核酸片段通过一7～15nm长的连接片段连接形成一发夹型结构；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标肿瘤细胞杂交核酸适体片段的能力。
2.根据权利要求1所述的开关式核酸适体探针，其特征在于：所述荧光发生单元为荧光染料分子或荧光纳米颗粒；所述荧光熄灭单元为荧光熄灭基团或者为具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料。
3.根据权利要求2所述的开关式核酸适体探针，其特征在于：所述荧光染料分子为荧光素、四甲基罗丹明或Cy5；所述荧光纳米颗粒为包裹荧光染料的二氧化硅纳米颗粒或荧光量子点；所述荧光熄灭基团为DABCYL、BHQ1或BHQ2；所述具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料为金纳米颗粒或碳纳米管。
4.根据权利要求1或2或3所述的开关式核酸适体探针，其特征在于：所述核酸适体片段是指通过指数富集的配体系统进化技术筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适体。
5.根据权利要求4所述的开关式核酸适体探针，其特征在于：所述核酸适体片段是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞具有特异性识别能力的核酸适体序列1或者对人B淋巴细胞瘤细胞具有特异性识别能力的核酸适体序列2或者对小鼠肝细胞瘤细胞具有特异性识别能力的核酸适体序列3；
所述核酸适体序列1的核苷酸序列为：
5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3′；
所述核酸适体序列2的核苷酸序列为：
5’-AAC ACC GTG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3′；
所述核酸适体序列3的核苷酸序列为：
5’-AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3′。
6.根据权利要求1或2或3所述的开关式核酸适体探针，其特征在于：所述连接片段为一段不会与所述核酸适体片段和核酸片段杂交的片段，或者为一段具有亲水性和生物相容性的聚合物链。
7.一种如权利要求1～6中任一项所述的开关式核酸适体探针在肿瘤活细胞及活体检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下三种检测中的至少一种：
(1)对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测；
(2)对血清中肿瘤活细胞的有效检测；
(3)活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测的具体检测步骤为：在待测缓冲液中加入所述开关式核酸适体探针5～50nM，于常温下避光培育15min后，立即采用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群的荧光强度进行统计分析，当荧光强度高于10的特定细胞数占细胞群中细胞总数的20％以上时，即认为待测缓冲液中有目标肿瘤活细胞被所述开关式核酸适体探针检出；
所述对血清中肿瘤活细胞的有效检测的具体检测步骤为：在待测血清中加入所述开关式核酸适体探针5～50nM，于冰上避光培育30min后，立即采用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群的荧光强度进行统计分析，当荧光强度高于10的特定细胞数占细胞群中细胞总数的20％以上时，即认为待测血清中有目标肿瘤活细胞被所述开关式核酸适体探针检出；
所述活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测的具体检测步骤为：向待测活动物体内静脉注射0.3～0.5nmol的开关式核酸适体探针和10倍以上于开关式核酸适体探针浓度的随机序列寡核苷酸，然后立即采用活体荧光影像系统实时记录动物体内各个部位的荧光强度变化，当观察到某一组织部位的荧光信号明显高于其他组织部位时，即认为该动物体内有目标肿瘤细胞被所述开关式核酸适体探针检出，且肿瘤部位位于荧光信号明显增强处。
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