CN106319089B - lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用，该lncRNA为LOC101929707。本发明发现LOC101929707基因与缺血性脑卒中的发生发展相关，基于此，LOC101929707可作为可能的检测靶标应用于缺血性脑卒中的早期诊断。

Description

lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用，具体地该lncRNA为LOC101929707。

背景技术

脑卒中，又称为中风或脑血管意外，是一组突然起病，由于脑局部血液循环障碍导致的、以局灶性神经功能缺损为共同特征的急性脑血管疾病。其因高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率成为世界范围内三大死亡疾病之一，在我国已跃升为城市居民死因首位、农村居民死因第二位，也是成年人首位致残疾病。近20年来，随着自然人口增加和老龄化的冲击，我国的脑卒中发病率、死亡率总体呈上升趋势，据统计，我国每年新发脑卒中超过200万，每年死于脑卒中者超过100万，而且存活者中50～70％病人遗留瘫痪、失语等严重残疾，给个人和社会造成巨大的负担，成为严重危害人类健康及社会发展的主要公共卫生问题之一。

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)占所有脑卒中的70-80％。IS发病率高，病情危重，由于病因及发病机制尚未完全明确，且临床上理想的治疗手段有限，使得其死亡率和致残率亦较高。尽管超过半数的脑卒中有高血压、心房纤颤、糖尿病及高脂血症等危险因素，但尚不能完全解释很多患者在危险因素控制良好的情况下仍然会发病。越来越多的研究显示遗传因素在IS中的重要性，IS是遗传因素与环境因素共同作用的结果。

基因组学研究表明，大约只有1％的基因可转录成有蛋白编码功能的RNA，而大部分则转录成无蛋白编码功能的RNA，即非编码RNA。其中，长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度大于200个核苷酸，但无或很少具有蛋白编码功能的RNA，曾被认为是基因转录的副产物或“暗物质”，不具有生物学功能。随着1ncRNA功能学的进展，越来越多的研究表明1ncRNA在人类疾病中发挥重要作用。目前，研究表明1ncRNA具有复杂的生物学功能，如与细胞代谢、细胞凋亡、细胞周期、细胞黏附运动等有关，并可通过多种途径如调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构、作为miRNA的前体、mRNA降解、磷酸化作用、蛋白修饰等发挥功能，正如同内源性miRNA研究已取得重要成果一样，1ncRNA在疾病诊断和治疗领域代表了另一类重要的分子来源，其研究前景巨大。

多项研究已证实某些1ncRNA在人类缺血性脑卒中中发挥着重要作用，主要体现在参与调控血管新生调控的多种基因和信号分子关系密切，但是由于lncRNA数量庞大，目前针对lncRNA在人类疾病中的研究仍处在起步阶段。lncRNA影响脑卒中的发生和/或发展的机制尚有待进一步揭示，众多针对脑卒中治疗的潜在靶点也有待于研究者们不断发现。因为lncRNA在缺血性脑卒中的发生机制中的角色尚未阐明，因此探寻LncRNA缺血性脑卒中的分子基础具有重要意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一提供一种缺血性脑卒中诊断用标志物，用于解决现有技术中的问题。

本发明的目的之二，提供一种缺血性脑卒中的早期诊断产品，该产品用于脑卒中的诊断具有较高的灵敏度和特异性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种缺血性脑卒中诊断用lncRNA标志物，其特征在于，所述lncRNA为LOC101929707。

进一步，所述LOC101929707的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述的lncRNA在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LOC101929707基因的表达水平以诊断缺血性脑卒中。其中，所述用RT-PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增LOC101929707基因的引物；所述用实时定量PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增LOC101929707基因的引物；所述用原位杂交诊断缺血性脑卒中的产品包括：与LOC101929707基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断缺血性脑卒中的产品包括与LOC101929707基因的核酸序列杂交的探针。

本发明提供了一种产品，所述产品能够测定样品中上述lncRNA的含量，其中，LOC101929707基因在缺血性脑卒中患者中表达下调。发明中所述的“样品”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样品为血液。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或制剂。

进一步，所述芯片包括：固相载体，以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于上述lncRNA的部分或全部序列。其中，固相载体包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。

进一步，所述试剂盒包括针对上述lncRNA的特异性引物和探针。

进一步，所述述试剂盒还可包括dNTP、随机引物、还原剂、RNase抑制剂、反转录酶、MgCl₂和PCR缓冲液等中的一种或多种的组合，此外，所述试剂盒还可以含有标准品和/或对照品；在本发明的一个优选例中，选用了GAPDH作为内参。

进一步，上述试剂盒优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。

进一步，所述lncRNA的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种上述产品在制备诊断缺血性脑卒中的工具中的应用。

本发明中的试剂盒或芯片可用于检测包括LOC101929707在内的多个基因(例如，与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平，将缺血性脑卒中的多个标志物同时进行检测，可大大提高缺血性脑卒中诊断的准确率。

本发明中的检测包括但不限于测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定，核酸扩增技术包括但不限于聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。

本发明中，术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。

在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

如本发明所使用的，术语“LOC101929707”指基因或从该基因转录的mRNA，由于它是非蛋白编码基因，故不存在蛋白质产物。在人类中，位于20号染色体的短臂上。该基因具有8个注释的转录物(或剪接变体)。在本发明的具体实施方案中，LOC101929707指长转录物。

LOC101929707基因水平的降低通常是与对照相比的降低。技术人员能够挑选最相关的对照。这通常也取决于所研究疾病的性质、可获得的样品等等。合适的对照包括但不限于，来自不具脑卒中的受试者的类似样品、对照组(或对照细胞)的平均水平、或一组有关采样组织中LOC101929707基因产物平均水平的临床数据。从上述可清楚地看出，对照可以来自相同的受试者、或来自一个或多个不同的受试者或源自临床数据。可选地，对照在例如性别、年龄等上相匹配。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LOC101929707在缺血性脑卒中患者中差异表达，通过检测LOC101929707的表达水平可以判断早期缺血性脑卒中患者。

本发明提供了一种缺血性脑卒中的分子标记物，为缺血性脑卒中的机理研究以及临床应用提供理论基础。

附图说明

图1显示利用芯片筛选缺血性脑卒中患者的差异表达基因；

图2显示利用QPCR检测LOC101929707在缺血性脑卒中患者中的表达情况。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物

1、样品收集

收集10对正常人血液和缺血性脑卒中患者的血液，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

1)临床血清样本收集后12000rpm高速离心10min，重复2次，所得血清样本-80℃保存；

2)冻存血清样本4℃解冻；

3)吸取250μ1的血清样本至1.5m1EP管，加750μ1Trizol LS Reagent，吹打混匀，静置5min；

4)加氯仿(CHCl₃：trizol 250μ1:750μ1)，颠倒混匀，静置15min；

5)4℃，12000rpm，离心15min；

6)小心吸取上层液体至一新EP管；

7)加适量异丙醇(异丙醇：trizo1 500μ1：750μ1)，颠倒混匀，静置10min；

8)4℃，12000rpm离心10min；

9)弃上层离心液，加75％乙醇(RNA酶灭活)；

10)4℃，8000rpm离心5min；

11)保留沉淀，弃上层离心液，室温静置5-10min；

12)适量DEPC水溶解沉淀，取适量RNA溶液测浓度及观察RNA抽提情况；

13)标记名称、浓度及口期，-80℃保存。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

结果如图1所示，同正常人血液相比，LOC101929707基因在缺血性脑卒中患者中的表达量显著降低。

实施例2 QPCR测序验证LOC101929707基因的差异表达

1、对LOC101929707基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和缺血性脑卒中患者的血样样本各100例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

(1)逆转录反应

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(2)引物设计

LOC101929707基因的引物序列为：

正向引物：5’-AATGGTTCTGGATGGATTA-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-TGGTTCGTTCTCAAGTAG-3’(SEQ ID NO.3)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT--3’(SEQ ID NO.5)

(3)QPCR扩增检验

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×40个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图2所示，与正常人相比，LOC101929707基因在缺血性脑卒中患者中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学医学院第一附属医院

<120> lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3230

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

tctcagccat ggttgcatac cttccaagct ccaccgcctc ttcttcctcg tgggcagatc 60

cctgattttg tgtaggacag cacttgaaat gtatttgtgt gctcaacatt ggtttcctct 120

ctggaacctg ggatcacttc aggggtggac acgtggccca accatgactg atgagacatg 180

cggggaaatc tgcagaggca acttctagga aaggttgggc tcttgcagcc accctgtgac 240

tatgaggtga gaagcttgtc cagtgtgata gctgatccac tgaagatgac aaggaaaaca 300

gcagaaagga accaggctac ttgatcatag tgagagctga taaggcagcc aatctgaatt 360

tctttctacg taaaacaatt aacattagtg tttcattgca ttttctattg cttgcagcca 420

aaaatactct aaccactgtc cttgggcaaa ttactgacct ctttaagcct tgattttctc 480

atctctgaga gatgaacaca agagtttgta tttcattgaa tgagataagg taatgataag 540

aataagaaat atttatgctg cacttactat gtgctcaact ctgttcaaaa cagtttactc 600

atttaacata cgtatcatgc ttagcctagg atcctgaacc ttttatgttc tcaaacttac 660

ccttataatc attgctattg caggaactag gctattaatt cagaccttct gttcctagac 720

attttaccaa cagtgaaagt aaactttcac tcctcccacc accccacaag gaaaattaca 780

ggagcatttg aaaacatttt tgaaactcaa atgctctcac aattgaatga cacaggaatc 840

aatacttaga aaactctgcc ttttcagtgt tcagagtata atgcatattt ttaaaaatag 900

actcaataca agttcttgca aatctatttg gaagcgaaaa gagctcatta taacaatggt 960

tctggatgga ttacaaactt ctcagtttag aaatgggttt ttgttttgtt agtacaccat1020

gctctctact attatttact gcatagtttg agtcactcac tagtcaattt ctcaacgctt1080

tgtcaaggac tatgaagggc tgaagattta ctctacttga gaacgaacca ggtaacctcc1140

cacaatttca cagatgctag cagaagacag ggcactcctc ggttagacac ctagggcttc1200

attacttagg gcccagcagt cagtgtgggc accagttccc cttacccctc ttcccattcc1260

cacagctcat ggtatgtggg tgggtccacg tggacactgc acagaattga ggaaccttgc1320

atttaagaag acttaatctt acaaggggct gatagcaaac tttcccaaac cttgtcccag1380

agaaagatat tgtctttatc atcctgatct gaatactaat cttccctctg tagaaggaga1440

cagtatctct gtttcctaag gctcttgctg gacaaacatc tttgaaagga cagttcagag1500

gagatgctgt cagagtctta gctcacaaga tgtgcagaaa tggaaaggcc atggagaatt1560

gtctcccaac actgggaaac cactcagtct cactcacctc taccatgctt tttcagtgta1620

ccctattttt tttctcagca aagctgcttg ctatatttgc atttggctct gagctgaccc1680

caacctcaag tgttacctct tggtcatcca ccactttctg aataaattat attcagtggt1740

ccaagttcag atgacgaggg aagggaatct gatggatcca gcttgggtcc agtatccagg1800

cctggttcaa ttagtgtcat caggggtcag tgccatttaa cacactttgc ccaccctctg1860

tggatgggca ggagtgggta gagtcctgta gggtaaggac agggagacag ccttggtaaa1920

agttcattta acaaggatgg attgcataac tggtttcatc attgttagta gcagtagtct1980

ctctataaat cttataaatc acttatattg aaaaaagtca tcaagcatga ctcaaataac2040

ttcagcagaa aacagtcacc ctaataaagt catttaatta tatatgtcta tatattctga2100

atattcagcg aagtggatta tgccaccggc tgagtgtatc cagagtgatg cttgacagct2160

ccttttattg ctaatggctc acagagttta tgccctttag gaagtgccag aatcattagt2220

actgtcactg aaatgtgctg ttaatgtaaa ttctactcag aaaaatggaa cagcaattgc2280

aaaaccagca gctggagaat gggcagccca gtgaggaaag atcaatggga gaaaggcttg2340

taactttctc ccattttcta gaaatttgtg actttctaga aaacgaagcc agtctcaaca2400

gtgcctccaa ggacctgaag cttctccaag tgctgttttg aatgggaagg caggagtcgg2460

aactggccat ccaggactgt ctacatggcc tctctctctt ctcatcttcc tctaagaaat2520

ttctccagtt tttcaatctt gacctctcag aaaaaagaga ttctgatctt gtgaactgat2580

gctgcatgtt gaatgagttt tcatcctgca tgatacttca tggatttatt tgcattttaa2640

ttattctttt atacaaaaga gccatagaaa agaaaagtct gacccaagtt ttgtcaagat2700

aaagcagagt atgggaagtg ggcaactgtg agaacttggt tagagccagt ctgtatagtt2760

tagtatttaa tggggaagtt tggggtgtgg gaaatgggac ctatttcctt tgctcttgag2820

gttaggttga gccatctggc tccctgccct gcagttccca taactgaaga gttatacatc2880

ccataacccc tgcccactag tgaacccctt cctcagctct gggactgatt gtcttcaagc2940

tgagcacaca ctgagcactg ggcctgcctt cttcctaaca caggtttttg taagctccag3000

acattggata aagcattttg agggataggt gaaaacgaaa tcctgccctt tactcttgag3060

aactcactct gctgtgggag gagagacagg cagcattctg accacaatgc cagaagacaa3120

tacggaatta ctcagtacat gaagcaccag gaagatgaca acagaagaga gaggacccag3180

acattggaat cagcagagtt ggggtttcgc catgttgacc aggctggttt 3230

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatggttctg gatggatta 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggttcgttc tcaagtag 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

Claims (8)

1.LOC101929707的检测试剂在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LOC101929707序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LOC101929707基因的表达水平以诊断缺血性脑卒中。

4.测定样本中LOC101929707含量的产品在制备诊断缺血性脑卒中的工具中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述芯片包括：固相载体，以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于LOC101929707的部分或全部序列。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括LOC101929707的特异性引物和探针。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述LOC101929707的引物序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。