TWI696703B - 用以診斷心肌梗塞的方法及套組 - Google Patents

用以診斷心肌梗塞的方法及套組 Download PDF

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Abstract

本揭示內容是關於用以診斷一個體是否罹患心肌梗塞的方法及套組。該方法及套組可藉由偵測血液循環中let-7a及let-7f的表現量來準確且有效地確認心肌梗塞病患，其中該let-7a及let-7f會高量表現於健康個體體內，而於心肌梗塞病患體內則會具有較低的表現量。利用本發明方法及套組，可及時對心肌梗塞病患投予適當的治療。

Description

用以診斷心肌梗塞的方法及套組
本揭示內容是關於疾病的診斷。更具體來說，本揭示內容是關於用以診斷心肌梗塞的方法及套組。
心肌梗塞(Myocardial infarction(MI)或heart attack)是造成人類發病及死亡的主要原因之一。當心肌缺血(減少供給心臟的血液)超過一臨界值且影響用以維持正常運作功能及體內平衡的心肌細胞修復機制時，即會產生心肌梗塞。長期處於該臨界值的缺血狀態，會造成心肌細胞不可回復之受損或死亡。
心肌梗塞的徵狀包含胸痛、疼痛輻射性地由胸部擴散到下頜或牙齒、肩膀、手臂及/或背部、呼吸困難或急促、伴隨或不伴隨噁心及嘔吐的上腹不適、發汗、暈厥及認知功能障礙。在超過75歲的病患中，約有5%的個體具有些微或完全無相關症狀的病史。心肌梗塞會導致心臟衰竭、心律不整或心跳停止。
目前已有數種用以診斷心肌梗塞的指標， 例如肌鈣蛋白I(troponin I)、肌鈣蛋白T(troponin T)、肌酸激酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin)、乙型利鈉尿胜肽(B-type natriuretic peptide,BNP)及C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)。然而，該些指標並無法成功地辨識每位病患。因此，本發明所屬領域亟需一種改良方法，用以快速診斷出罹患心肌梗塞之患者，其可準確且靈敏地確認一罹患或疑似患有心肌梗塞的個體，進而及時對有需要的個體投予適當的治療。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本發明的第一態樣是關於一種由一個體之血液檢體診斷該個體是否罹患心肌梗塞的方法。該方法包含：(a)決定該血液檢體中一標的miRNA的含量，其中該標的miRNA是let-7a或let-7f；以及(b)將該標的miRNA的含量與一取自健康個體之對照檢體的標的miRNA含量進行比對，其中若該血液檢體之標的miRNA的含量低於該對照檢體之標的miRNA的含量，表示該個體罹患心肌梗塞。
依據本揭示內容某些實施方式，let-7a miRNA包含一與序列編號：1具有至少85%序列相似度的核酸序列。依據本揭示內容其他實施方式，let-7f miRNA包含一與序列編號：2具有至少85%序列相似度的核酸序列。
依據本揭示內容的實施方式，以本發明方法進行評估的血液檢體可以是全血液檢體、血清檢體或血漿檢體。
在一實施方式中，心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞(ST elevation myocardial infarction,STEMI)。在另一實施方式中，心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞(non-ST elevation myocardial infarction,NSTEMI)。
依據本揭示內容某些實施方式，是利用一檢測方法來決定該標的miRNA的含量，其中該檢測方法是選自由北方墨點法(northern blotting)、微陣列(microarray)、螢光法(fluorescent assay)、電化學法(electrochemical assay)、生物性冷光法(bioluminescent assay)、生物性冷光蛋白重組(bioluminescent protein reassembly)、與生物性冷光共振能量轉移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)相關之檢測、反轉錄聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、螢光相關光譜(fluorescence correlation spectroscopy)及表面 增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy)所組成的群組。在一實施方式中，是利用一多核苷酸(其係作為一引子(primer))進行RT-PCR，來決定標的miRNA的含量，其中該多核苷酸包含一與序列編號：3或4具有至少85%序列相似度的核酸序列。在另一實施方式中，是利用一多核苷酸(其係作為一探針(probe))進行微陣列來決定標的miRNA的含量，其中該多核苷酸包含一與序列編號：3或4具有至少85%序列相似度的核酸序列。
依據本揭示內容實施方式，利用本發明方法評估的個體是一哺乳動物；較佳是一人類。
本發明的第二態樣是關於一種藉由偵測一標的miRNA來確認一個體是否罹患心肌梗塞的套組，其中該標的miRNA是源自該個體之血液檢體。該套組包含一多核苷酸及一雜合緩衝液。依據本揭示內容的實施方式，多核苷酸包含一與序列編號：3或4具有至少85%序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少一核苷酸是鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸。在一較佳實施方式中，多核苷酸包含一與序列編號：3或4具有至少85%序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少7個核苷酸是LNA核苷酸。
在本揭示內容一實施方式中，所述套組更包含一源自罹患心肌梗塞之個體的正對照檢體。在本揭示內容另一實施方式中，該套組更包含一源自健康個體的負對照檢體。
依據本揭示內容某些實施方式，雜合緩衝液是選自由Tris-HCl/NaCl/MgCl2(TNM)緩衝液、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate-buffered saline,PBS)緩衝液、Tris-HCl緩衝液、生理食鹽水檸檬酸鈉(saline sodium citrate,SSC)緩衝液、Hepes/EDTA/新亞銅(Hepes/EDTA/neocuproine,HEN)緩衝液及Tris/EDTA/NaCl(TEN)緩衝液所組成的群組。
本揭示內容的第三態樣是關於一種藉由偵測一標的miRNA來確認一個體是否罹患心肌梗塞的裝置，其中該標的miRNA是源自該個體之血液檢體。該裝置包含一用以偵測該標的miRNA的奈米孔洞或生物感測器，其中該標的miRNA是let-7a或let-7f；以及一用以計算在該血液檢體中標的miRNA含量的處理單元。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為闡述let-7家族中特定miRNA表現量的柱 狀圖，其中第1A圖是依據豬隻心臟的小RNA定序(small RNA-sequencing)結果所繪示，第1B圖則是依據人類心臟的小RNA定序結果所繪示；TPM：每百萬轉錄本(transcript per million)。在該些定序結果中，let-7a及let-7f皆為let-7家族中表現量最高的miRNA；第2圖是關於心肌細胞(cardiomyocyte,CM)及非心肌細胞(non-cardiomyocyte，非-CM)中let-7a的表現量；第2A圖：在經分離(sorted)之大鼠CM及非CM中let-7a的表現量；第2B圖：原位染色結果指出let-7a會廣泛表現於小鼠的心臟；第3圖是用以闡述豬隻在產生心肌梗塞後，let-7a及let-7f表現量會下降的點狀圖；第3A圖：利用莖環qRCR(stem-loop qRCR)來檢測不同時間之let-7a及let-7f的表現量；第3B圖：以TaqMan qPCR分別檢測let-7a(左圖)及let-7f(右圖)的表現量。I/R比值指出相較於遠端區域，梗塞部位之let-7a或let-7f的表現量；利用該些檢測方法可發現在產生心肌梗塞24小時內let-7a及let-7f的表現量皆會下降；第4圖是用以闡述豬隻在進行心肌梗塞手術後，特定時間點之let-7a及let-7b表現量的柱狀圖；第4A圖：在進行心肌梗塞手術前、一天後或一週後，豬隻血漿中let-7a的表現量；第4B圖：在進行心肌梗塞手術前、一天後或一週後，豬隻血漿中let-7f的表現量；非成對t檢測法(Unpaired t-test，n=18，*表示p<0.05)； 第4C圖：在接受心肌梗塞手術後，各豬隻血漿中let-7a表現量的改變趨勢；第4D圖：在接受心肌梗塞手術後，各豬隻血漿中let-7f表現量的改變趨勢；成對t檢測法(Paired t-test，n=18，*表示p<0.05)。
第5圖是用以闡述在罹患急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)病患之血漿中，let-7a及let-7f表現量會下降的點狀圖；第5A圖：在9位健康個體及25位急性心肌梗塞病患體內，let-7a的表現量；第5B圖：在9位健康個體及25位急性心肌梗塞病患體內，let-7f的表現量；該些實驗是由100微升的血漿中萃取microRNA，cel-mir-39則是作為一外加對照組(spike-in control)。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍 與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「心肌梗塞」(myocardial infarction)及「急性心肌梗塞」(acute myocardial infarction)在本揭示內容是為可互換的詞彙。該些詞彙可用以闡述因長時間缺血造成心肌細胞不可回復之壞死現象。本發明所 屬領域具有通常知識者當可了解，診斷通常無法對所有受測者產生100%的準確性。然而，對具有統計顯著性的個體族群而言，診斷具備有效性。本發明所屬技術領域具有通常知識者可利用已知統計方法來決定一族群是否具有統計顯著性；例如決定信賴區間(confidence interval)、決定p值、Student's t測試、曼-惠特尼測試(Mann-Whitney test)等。較佳的信賴區間至少是90%、至少是95%、至少是97%、至少是98%或至少是99%。p值較佳是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。較佳地，依據本發明評估的概率，診斷方法對特定族群之個體的準確率至少為60%、至少為70%、至少為80%或至少為90%。
如本發明所屬領域具有通常知識者所熟知，「miRNA」或「microRNA」一詞是關於一種會表現於真核細胞及多細胞有機體(或後生動物，metazoan organism)體液中的短核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子。當可了解，本發明亦包含pri-miRNA及本發明miRNA的pre-miRNA。較佳地，一miRNA前趨物是由25到數千個核苷酸所組成；更佳是由40到130個核苷酸所組成；再更佳是由50到120個核苷酸所組成；最佳是由60到110個核苷酸所組成。較佳地，一miRNA是由5到100個核苷酸所組成；更佳是由10到50個核苷酸所組成；再更佳是由12到40個核苷酸所組成；最佳是由18到26個核苷酸所組成。較佳地，本發明miRNA是源自人類的miRNA，意即是由人類基 因體編碼而得。較佳是，miRNA一詞是指最終會進入RNA誘導型緘默複合體(RNA-induced silencing complex,RISC)的「指引」(guide)股，以及與其互補的「乘載」(passenger)股。此外，較佳是將本揭示內容對於一特定miRNA的相關敍述解讀為包含該特定miRNA的變異體。所述變異體可以是異種同源物(ortholog)、同種同源物(paralog)或其他同源物(homolog)。再者，變異體包含多核苷酸，其係包含與該特定miRNA序列具有至少85%序列相似度的核酸序列。較佳是以完整的核酸序列區域來計算相似度百分比的比值。
在本揭示內容中，「多核苷酸」(polynucleotide)或「核酸序列」(nucleic acid sequence)是指RNA、去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)或其組合之單股或雙股聚合物，解讀方向是由5'到3'端。在本揭示內容中，多核苷酸可包含一或多經修飾的核苷酸殘基(例如鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸)，且可作為引子或探針。一「引子」(primer)或「探針」(probe)是指一包含一核酸序列的多核苷酸(合成或天然形成)，其中該核酸序列是與一標的分子的核酸序列互補，且可與該標的分子雜合形成一雙股結構。一般來說，「引子」(primer)是指一單股多核苷酸，其係與一欲進行複製的核酸序列互補，且作為一引子增長產物的合成起始點；而「探針」(probe)則是指一單股多核苷酸，其可與一互補的單股標 的序列進行雜合，以形成一雙股分子(雜合體)。
在本揭示內容中，「雜合」(hybridize 或hybridization)一詞是指任何涉及核酸之一股藉由鹼基配對結合至一互補股的反應。一般來說，雜合及雜合強度(即核酸之間的結合強度)會受到以下因素影響：核酸之間的互補程度、反應條件、形成雜合體的Tm值及核酸內的G：C比例。
在本揭示內容中，「含量」(amount)包含所指miRNA的絕對含量、相對含量、濃度及任何與其相關之數值或參數。該些數值或參數包含強度訊號值，其係藉由測量所指miRNA之物理或化學特性而得，例如由專一鍵結配位子得到的強度訊號。當可理解，亦可由標準數學運算來取得與上述含量或參數相關的數值。
在本揭示內容中，「鎖核酸」(locked nucleic acid或LNA)是指包含一或多個2'-O、4'-C亞甲基鍵結的雙環核酸類似物，其可有效鎖住C3'-內結構中的呋喃糖環(furanose)。該亞甲基鍵結限制了呋喃核糖環的可撓性，因而促使結構形成一剛性雙環構造。基於其結構，相較於天然DNA對應體，LNA對互補核酸具有更高的親和力及專一性，且可增加探針/標的核酸雙股結構之溫度及化學穩定性。即使在嚴荷的條件下(例如低鹽濃度及加入離散劑(chaotropic agent))，LNA仍可與互補核酸雜合。依據使用需求，在一寡核苷酸中，LNA核苷酸可與DNA或RNA鹼基混合；更具體來說，LNA核苷酸可分散在一寡核苷酸序列中，或是連續性或 單獨性地位於特定位置。
「序列相似度」(sequence identity)一詞在此是指二條或多條序列或次序列在進行比較或比對時的最大對應值，其中該些序列或次序列係相同或具有一特定比例之相同的胺基酸殘基或核苷酸。為取得相似度百分比，該些序列是以最佳化的比對方式進行比對(例如，可在第一胺基酸序列中插入或刪去間隙，使其與第二胺基酸序列比對時可達最大序列相同性)。再比對位於對應位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中相對應的位置具有相同的胺基酸殘基或核苷酸時，則該位置的二個分子係為相同。二條序列的相似度百分比是序列間相同位置的數量函數(即，相同百分比=相同位置的數量/位置的總數量(例如，兩兩排列的位置數量)×100)。在某些實施方式中，二條序列具有相同的長度。用來比對序列的方法是相關領域人士所熟知的，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。
基於本所屬領域亟需一種可準確且有效確認一個體是否罹患心肌梗塞的方法，據以即時對有需要之個體投予適當的治療，本揭示內容旨在提供一種由一個體之血液檢體來診斷心肌梗塞的方法及套組。
因此，本揭示內容的第一態樣是關於一種由一個體之血液檢體來診斷該個體是否罹患心肌梗塞的方法。該方法包含：(a)決定該血液檢體中一標的miRNA的含量，其中該標的miRNA是let-7a或let-7f；以及 (b)將該標的miRNA的含量與一取自健康個體之對照檢體的標的miRNA含量進行比對，其中若該血液檢體之標的miRNA的含量低於該對照檢體之標的miRNA的含量，表示該個體罹患心肌梗塞。
在本發明方法中，是先由一罹患或疑似罹患心肌梗塞的病患取得其血液檢體。依據本揭示內容的實施方式，血液檢體可以是全血液檢體、血清檢體或血漿檢體。在一特定實施例中，血液檢體是血漿檢體。
在步驟(a)中，是利用一適當的檢測方法來定量分析血液檢體中之標的miRNA。依據本揭示內容之實施例，可利用任何習知技藝人士熟知的方法由血液檢體(例如血漿檢體)萃取總RNA，例如利用細胞裂解緩衝液使細胞釋放核酸；亦或是，可藉由商業化套組來達到相同目的。非例示性之細胞裂解緩衝液包含NP-40裂解緩衝液、放射性免疫沈澱法(radioImmunoprecipitation assay,RIPA)裂解緩衝液、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解緩衝液及銨-氯-鉀(ammonium-chloride-potassium,ACK)裂解緩衝液。例示性之適用於本發明方法的套組包含，但不限於，mirVana PARIS套組(Ambion)、miRCURY RNA分離套組(Exiqon)、miRNeasy血清/血漿套組(Qiagen)，總RNA純化套組(Norgen Biotek Corporation)及NucleoSpin miRNAs套組(Macherey-Nagel)。依據本揭示內容一實施方式，是利用mirVana PARIS套組由血漿檢體萃取總RNA。 萃出的RNA可用以測量或定量分析特定的miRNA標的。
依據本揭示內容之實施方式，例示性之可用以決定標的miRNA含量的檢測方法包含，但不限於，北方墨點法、微陣列、螢光法、電化學法、生物性冷光法、生物性冷光蛋白重組、與生物性冷光共振能量轉移相關之檢測、反轉錄聚合酶鏈鎖反應、螢光相關光譜及表面增強拉曼光譜。依據定量分析方法的不同，可將標的miRNA的含量表示為一絕對值或一相對值。在本揭示內容一實施方式中，是以RT-PCR定量分析標的miRNA。在本揭示內容另一實施方式中，則是利用微陣列或生物晶片來定量分析標的miRNA。
依據本揭示內容某些實施方式，標的miRNA是let-7a，其係包含一與序列編號：1具有至少85%序列相似度的核酸序列；舉例來說，let-7a可包含一核酸序列，其係85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似於序列編號：1。較佳地，let-7a包含的核酸序列與序列編號：1具有至少90%的序列相似度。更佳地，let-7a包含的核酸序列與序列編號：1具有至少95%的序列相似度。在本揭示內容一特定實施方式中，let-7a具有序列編號：1的核酸序列。
在本揭示內容一實施方式中，是利用一多核苷酸(作為探針)來決定let-7a的含量，其中該多核苷酸包含一與序列編號：3具有至少85%序列相似度的核 酸。依據某些實施方式，序列編號：3的核酸序列係與序列編號：1的核酸序列互補。因此，包含序列編號：3之核酸序列的多核苷酸對包含序列編號：1之核酸序列的let-7a具有結合親和力及專一性。
依據本揭示內容其他實施方式，本發明多核苷酸可包含一或多個LNA核苷酸。較佳地，本發明多核苷酸包含至少7個LNA核苷酸。在一實施例中，本發明多核苷酸包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20個鹼基(base)位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸包含8個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22個鹼基位置。
依據本揭示內容其他實施方式，標的miRNA是let-7f，其係包含一與序列編號：2具有至少85%序列相似度的核酸序列；意即，let-7f與序列編號：2具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似度。較佳地，let-7f包含的核酸序列與序列編號：2具有至少90%的序列相似度。更佳地，let-7f包含的核酸序列與序列編號：2具有至少95%的序列相似度。在本揭示內容一特定實施方式中，let-7f包含的核酸序列與序列編號：2具有100%的序列相似 度。
在該些實施方式中，是利用一多核苷酸來決定let-7f的含量，其中該多核苷酸包含一與序列編號：4具有至少85%序列相似度的核酸，序列編號：4的核酸序列是與序列編號：2的核酸序列互補。因此，包含序列編號：4之核酸序列的多核苷酸可專一性地結合至包含序列編號：2之核酸序列的let-7f。較佳地，本發明多核苷酸的核酸序列包含至少7個LNA核苷酸。在一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含8個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22個鹼基位置。
基於LNA核苷酸的特性，標的miRNA(例如let-7a或let-7f)可與包含LNA核苷酸的多核苷酸在嚴苛的條件下進行雜合，例如低鹽濃度及/或高溫。依據本揭示內容一實施方式，標的miRNA與包含LNA核苷酸的多核苷酸是在50-60℃的溫度中進行雜合。
依據本揭示內容某些實施例，在與標的miRNA(例如let-7a或let-7f)結合前，可先將本發明多核苷酸固定在一固體基質上，例如磁珠、玻璃或矽層。
多核苷酸及標的miRNA之互補鹼基對可形成一「雙股」(double strand)結構。可利用習知技藝人士熟知的方法來偵測該RNA-DNA雜合體。例示性之用以偵測RNA-DNA雜合體的方法包含，但不限於，聚醯胺法(polyamide method，利用一與螢光染劑或特定受質接合的小型化學化合物來專一結合至RNA-DNA雜合體的小凹槽(minor groove))、三聯體法(triplex method，利用一與螢光染劑或放射性分子接合之可形成三螺旋的寡核苷酸，結合至dsDNA大凹槽(major groove)中的聚嘌呤/聚嘧啶結構)及蛋白法(protein method，利用一與螢光染劑或特定受質接合之具有序列專一性的DNA結合蛋白)。
依據一實施例，是先將多核苷酸固定在一固體基質上，其中該多核苷酸包含一與let-7a(即序列編號：1)之核酸序列互補的序列(即序列編號：3)，或包含一與let-7f(即序列編號：2)之核酸序列互補的序列(即序列編號：4)。接著，將該多核苷酸與源自心肌梗塞病患周邊血的血漿檢體於50-60℃溫度中進行雜合，以形成一RNA-DNA雜合體。可加入一會結合至RNA-DNA雜合結構的染劑或螢光來偵測RNA-DNA雜合體。之後藉由經結合之染劑或螢光所發散的訊號來定量分析let-7a或let-7b的表現量。
之後，如步驟(b)所述，比對血液檢體中標的miRNA(即let-7a或let-7f)的含量及源自健康個體之對照檢體中標的miRNA(即let-7a或let-7f) 的含量。依據本揭示內容的實施方式，若血液檢體之標的miRNA含量低於對照檢體之標的miRNA含量，表示該個體罹患心肌梗塞。
或者，可利用一合成RNA(作為外加/內部對照)來定量分析標的miRNA的含量。可藉由健康個體來建立miRNA含量的正常分布表。一旦決定個體之miRNA含量後，即可將該結果與正常分布表進行比對分析。
依據一實施方式，利用本發明方法評估的心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞。依據另一實施方式，利用本發明方法評估的心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞。
依據本揭示內容某些實施方式，以本發明方法評估的個體是一哺乳動物，包含人類、黑猩猩、猴子、狗、豬、大鼠及小鼠。在一特定實施例，利用本發明方法評估的個體是人類。
當可想見，標的miRNA可以是let-7a及let-7f的組合。在該種情況下，是將血液檢體中let-7a及let-7f的總含量與源自健康個體之對照檢體中let-7a及let-7f的總含量進行比對。當血液檢體中let-7a及let-7f的總含量低於對照檢體中let-7a及let-7f的總含量時，即可診斷該個體為罹患心肌梗塞的病患。
本揭示內容的第二態樣是關於一種藉由偵測一標的miRNA來確認一個體是否罹患心肌梗塞的套 組，其中該標的miRNA是源自該個體之血液檢體。該套組包含一多核苷酸及一雜合緩衝液。
依據本揭示內容某些實施方式，該多核苷酸包含一與序列編號：3具有至少85%序列相似度的核酸序列。為增加靈敏度及專一性，可將本發明多核苷酸之核酸序列中至少一個核苷酸修飾為LNA核苷酸；舉例來說，本發明多核苷酸的核酸序列可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個LNA核苷酸。較佳地，本發明多核苷酸的核酸序列包含至少7個LNA核苷酸。在一實施例中，本發明多核苷酸包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸包含8個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：3之核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22個鹼基位置。
依據本揭示內容其他實施方式，該多核苷酸包含一與序列編號：4具有至少85%序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少一個核苷酸是LNA核苷酸；舉例來說，本發明多核苷酸的核酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個LNA核苷酸。較佳地，本發明多核苷酸的核酸序列包含至少7個LNA核 苷酸。在一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含7個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21個鹼基位置。在另一實施例中，本發明多核苷酸的核酸序列包含8個LNA核苷酸，其係分別位於序列編號：4之核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22個鹼基位置。
在一實施方式中，多核苷酸具有一髮夾環狀(hairpin-loop)結構。在另一實施方式中，多核苷酸具有一莖環狀(stem-loop)結構。在再另一實施方式中，多核苷酸具有一雙環狀(double-loop)結構。
依據本揭示內容某些實施方式，套組更包含一正對照檢體，其係源自一罹患心肌梗塞之個體或源自一合成RNA。依據本揭示內容其他實施方式，套組更包含一負對照檢體，其係源自一健康個體或源自一合成RNA。
依據本揭示內容之實施方式，雜合緩衝液是選自由TNM、PBS、Tris-HCl、SSC、HEN及TEN所組成的群組。
本揭示內容的第三態樣是關於一種藉由偵測一標的miRNA來確認一個體是否罹患心肌梗塞的裝置，其中該標的miRNA是源自該個體之血液檢體。該裝置包含一用以偵測該標的miRNA的奈米孔洞或生物 感測器，其中該標的miRNA是let-7a或let-7f；以及一用以計算在該血液檢體中標的miRNA含量的處理單元。
依據本揭示內容某些實施方式，let-7amiRNA包含一與序列編號：1具有至少85%序列相似度的核酸序列。依據本揭示內容其他實施方式，let-7fmiRNA包含一與序列編號：2具有至少85%序列相似度的核酸序列。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
心肌梗塞的豬隻模式
插管前，以舒泰(Zoletil，每公斤12.5毫克；Virbac，法國)、若朋(Rompun，每公斤0.2毫升；Bayer Healthcare，德國)及阿托品(atropine，每公斤0.05毫克；TBC，台灣)對約22公斤的蘭嶼迷你豬(Lanyu minipig)進行手術麻醉。將豬隻連接至一間歇性正壓呼吸器，並投予包含氧、空氣及異氟烷(1.5到2%；Baxter Healthcare,Guayama,PR)在內的混合氣體。為持續投予生理食鹽水或麻醉劑，在手術期間 將靜脈留置導管放置於耳靜脈中。手術後，投予抗生素(Ampolin,YSP)及止痛劑(Keto,YSP)以預防感染及減緩疼痛。對左中前降枝動脈(midleft anterior descending artery)進行心肌梗塞手術，以產生永久性閉塞。
萃取miRNA
藉由離心，由周邊血分離血漿檢體。之後，依據使用操作說明，利用mirVana PARIS套組(Ambion)由血漿檢體萃取總RNA。將合成的microRNA(取名為cel-mir-39)加入檢體中，作為標準化技術性差異的內部對照。
莖環定量聚合酶連鎖反應(Stem-loop quantitative polymerase chain reaction,qPCR)
以反轉錄套組(Applied Biosystems)及序列編號：5之合成寡核苷酸對50奈克之總RNA進行反轉錄反應，其中序列編號：5之合成寡核苷酸可形成莖環結構及microRNA的負股，據以作為RT引子。利用序列編號：6或7的正向引子及序列編號：8的通用反向引子，以OmicsGreen qPCR Master Mix(Omics Bio)於ABI 7500即時PCR系統(Applied Biosystems)進行定量PCR反應。
Taqman定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction)
使用Taqman microRNA反轉錄套組(Applied Biosystems)及Taqman Universal PCR master mix(Applied Biosystems)。各microRNA之莖環RT引子隨附於TaqMan microRNA探針。利用TaqMan microRNA反轉錄套組(Assay ID 000377：偵測let-7a；Assay ID 000382：偵測let-7f)進行莖環RT。依據Taqman microRNA檢測(Applied Biosystems)隨附之使用操作方法進行定量PCR。
實施例1 健康個體之let-7a及let-7f表現量
本實施例將依據「材料及方法」所述流程，分別檢測let-7家族之miRNA(包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g及let-7imiRNAs)於豬隻、人類及囓齒動物體內的表現量。
首先利用小RNA定序法來分析豬隻心臟中let-7 miRNA的表現。如第1A圖所示，在let-7基因家族中，let-7a及let-7f具有最高的表現量。源自人類心臟之let-7 miRNA的表現量則與豬隻觀察結果相似(第1B圖)。
基於在豬隻及人類偵測之let-7 miRNA的表現量，進一步利用四甲基玫瑰紅甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)染色來檢測囓齒動物之let-7a的表現，並以流式細胞儀及原位染色進行分析。分析結果分別闡述於第2A及2B圖中。TMRM染色結果指出，於大鼠心肌細胞(cardiomyocyte,CM)及大鼠心肌纖維母細胞(cardiac fibroblast，非-CM)中皆可偵測到let-7a 的表現(第2A圖)。原位染色結果進一步確認let-7a會廣泛表現於小鼠的心臟組織(第2B圖)。
實施例2 罹患心肌梗塞之個體的let-7a或let-7f表現量
實施例1的結果指出，let-7a及let-7f皆會高量表現於健康動物的心臟組織。本實施例將分別利用豬隻心肌梗塞模式(實施例2.1)及人類個體(實施例2.2)來了解心肌梗塞對let-7a及let-7f表現的影響。
2.1 心肌梗塞之豬隻模式
實施例2.1是依據「材料及方法」所述流程建立豬隻心肌梗塞模式後，檢測梗塞部位及遠端區域之let-7a及let-7f的表現量。結果分別闡述於第3A及3B圖中。
第3A圖為在心肌梗塞手術後，let-7a及let-7f於不同時間點的表現量。莖環qPCR的結果指出，相較於對照組(偽處理組)，在產生心肌梗塞24小時內，心肌梗塞豬隻(即MI組)體內let-7a及let-7f的總表現量會逐漸下降；且於24小時時，心肌梗塞豬隻之let-7a及let-7f的總表現量與偽處理組之總表現量間具有顯著的差異。I/R比值為經標準化之缺血區域(ischemic region,I)及遠端區域(remote region,R)之表現量的比值。
進一步以TaqMan qPCR來確認let-7a及let-7f個別的表現量，其中相較於偽處理組，MI組之let-7a(第3B之左圖)及let-7f(第3B之右圖)的 表現量皆會顯著地下降。第4A-4D圖的結果則指出，在產生心肌梗塞後，豬隻血漿中let-7a(第4A及4C圖)及let-7f(第4B及4D圖)表現量下降的情況會至少持續一週。
2.2 罹患心肌梗塞之人類個體
實施例2.2將分別分析由9位健康個體及25位心肌梗塞病患(皆已取得其知情同意書)取得之血漿檢體，以了解let-7a let-7f的表現量。結果分別闡述於第5A及5B圖。
如第5圖所述，相較於健康個體(即對照組)，心肌梗塞病患(即AMI組)之let-7a(第5A圖)及let-7f(第5B圖)的表現量皆會顯著地下降。
總結上述，第3-5圖的結果指出，let-7a及let-7f會持續性地表現在健康個體(例如豬隻、大鼠、小鼠及人類)的組織及/或血液(例如心臟組織及血漿)中，其中可檢測到表現量相對較高的let-7a及let-7f；然而，一旦個體罹患心肌梗塞，其心臟組織及/或血液中let-7a及let-7f的表現量即會受到抑制或減少。
整體來看，本揭示內容提供一種用以確認心肌梗塞病患的方法及套組。相較於其他偵測方法(多數是分析萃取自心臟組織之miRNA)，本發明方法及套組可直接定量分析源自周邊血之miRNA(即let-7a及/或let-7f)的表現量。依據檢測結果，醫療人員可準確且有效地診斷一個體是否罹患心肌梗塞，並據此對心肌梗塞病患投予適當且即時的治療。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
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<160> 8
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<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7a
<400> 1
Figure 105131411-A0305-02-0028-1
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7f
<400> 2
Figure 105131411-A0305-02-0029-2
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-let-7a
<400> 3
Figure 105131411-A0305-02-0029-3
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-let-7f
<400> 4
Figure 105131411-A0305-02-0030-4
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-引子
<400> 5
Figure 105131411-A0305-02-0030-5
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子-1
<400> 6
Figure 105131411-A0305-02-0031-6
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子-2
<400> 7
Figure 105131411-A0305-02-0031-7
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用反向引子
<400> 8
Figure 105131411-A0305-02-0032-8

Claims (5)

  1. 一種由一個體之血液檢體診斷該個體是否罹患心肌梗塞的方法，包含：(a)決定該血液檢體中一標的miRNA的含量，其中該標的miRNA是let-7a或let-7f；以及(b)將該標的miRNA的含量與一取自健康個體之對照檢體的標的miRNA含量進行比對，其中若該血液檢體之標的miRNA的含量低於該對照檢體之標的miRNA的含量，表示該個體罹患心肌梗塞；其中該let-7a miRNA具有一序列編號：1的核酸序列；該let-7f miRNA具有一序列編號：2的核酸序列；其中該標的miRNA的含量是利用一多核苷酸進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應或微陣列來決定，其中該多核苷酸具有一序列編號：3或4的核酸序列，其中在該序列編號：3或4的核酸序列中包含至少7個鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸；其中該些鎖核酸係分別位於該序列編號：3或4的核酸序列第2、5、8、11、14、17及20個鹼基位置、或位於該序列編號：3或4的核酸序列第3、6、9、12、15、18及21個鹼基位置、或位於該序列編號：3或4的核酸序列第1、4、7、10、13、16、19及22個鹼基位置。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該血液檢體是一全血液檢體、一血清檢體或一血漿檢體。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞(ST elevation myocardial infarction,STEMI)。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞(non-ST elevation myocardial infarction,NSTEMI)。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該個體是一人類。
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