CN108348540A - 用以诊断心肌梗塞的方法及套组 - Google Patents

用以诊断心肌梗塞的方法及套组 Download PDF

Info

Publication number
CN108348540A
CN108348540A CN201680058229.8A CN201680058229A CN108348540A CN 108348540 A CN108348540 A CN 108348540A CN 201680058229 A CN201680058229 A CN 201680058229A CN 108348540 A CN108348540 A CN 108348540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
myocardial infarction
target mirna
seq
mirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680058229.8A
Other languages
English (en)
Inventor
谢清河
陈贞云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academia Sinica
Original Assignee
Academia Sinica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academia Sinica filed Critical Academia Sinica
Publication of CN108348540A publication Critical patent/CN108348540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本揭示内容是关于用以诊断一个体是否罹患心肌梗塞的方法及套组。该方法及套组可借由检测血液循环中let‑7a及let‑7f的表现量来准确且有效地确认心肌梗塞病患，其中该let‑7a及let‑7f会高量表现于健康个体体内，而于心肌梗塞病患体内则会具有较低的表现量。利用本发明方法及套组，可及时对心肌梗塞病患投予适当的治疗。

Description

用以诊断心肌梗塞的方法及套组
发明背景
技术领域
本揭示内容是关于疾病的诊断。更具体来说，本揭示内容是关于用以诊断心肌梗塞的方法及套组。
现有技术
心肌梗塞(Myocardial infarction(MI)或heart attack)是造成人类发病及死亡的主要原因之一。当心肌缺血(减少供给心脏的血液)超过一临界值且影响用以维持正常运作功能及体内平衡的心肌细胞修复机制时，即会产生心肌梗塞。长期处于该临界值的缺血状态，会造成心肌细胞不可回复的受损或死亡。
心肌梗塞的征状包含胸痛、疼痛辐射性地由胸部扩散到下颌或牙齿、肩膀、手臂及/或背部、呼吸困难或急促、伴随或不伴随恶心及呕吐的上腹不适、发汗、晕厥及认知功能障碍。在超过75岁的病患中，约有5％的个体具有些微或完全无相关症状的病史。心肌梗塞会导致心脏衰竭、心律不整或心跳停止。
目前已有数种用以诊断心肌梗塞的指标，例如肌钙蛋白I(troponin I)、肌钙蛋白T(troponin T)、肌酸激酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、肌红蛋白(myoglobin)、乙型利钠尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)及C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)。然而，该多个指标并无法成功地辨识每位病患。因此，本发明所属领域亟需一种改良方法，用以快速诊断出罹患心肌梗塞的患者，其可准确且灵敏地确认一罹患或疑似患有心肌梗塞的个体，进而及时对有需要的个体投予适当的治疗。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本发明的第一方式是关于一种由一个体的血液样品诊断该个体是否罹患心肌梗塞的方法。该方法包含：
(a)决定该血液样品中一标的miRNA的含量，其中该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及
(b)将该标的miRNA的含量与一取自健康个体的对照样品的标的miRNA含量进行比对，其中若该血液样品的标的miRNA的含量低于该对照样品的标的miRNA的含量，表示该个体罹患心肌梗塞。
依据本揭示内容某些实施方式，let-7a miRNA包含一与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相似度的核酸序列。依据本揭示内容其他实施方式，let-7f miRNA包含一与SEQID NO:2具有至少85％序列相似度的核酸序列。
依据本揭示内容的实施方式，以本发明方法进行评估的血液样品可以是全血液样品、血清样品或血浆样品。
在一实施方式中，心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞(ST elevation myocardialinfarction,STEMI)。在另一实施方式中，心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞(non-STelevation myocardial infarction,NSTEMI)。
依据本揭示内容某些实施方式，是利用一检测方法来决定该标的miRNA的含量，其中该检测方法是选自由北方墨点法(northern blotting)、微数组(microarray)、荧光法(fluorescent assay)、电化学法(electrochemical assay)、生物性冷光法(bioluminescent assay)、生物性冷光蛋白重组(bioluminescent protein reassembly)、与生物性冷光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)相关的检测、反转录聚合酶链锁反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy)及表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy)所组成的群组。在一实施方式中，是利用一多核苷酸(其是作为一引子(primer))进行RT-PCR，来决定标的miRNA的含量，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列。在另一实施方式中，是利用一多核苷酸(其是作为一探针(probe))进行微数组来决定标的miRNA的含量，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列。
依据本揭示内容实施方式，利用本发明方法评估的个体是一哺乳动物；较佳是一人类。
本发明的第二方式是关于一种借由检测一标的miRNA来确认一个体是否罹患心肌梗塞的套组，其中该标的miRNA是源自该个体的血液样品。该套组包含一多核苷酸及一杂合缓冲液。依据本揭示内容的实施方式，多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少一核苷酸是锁核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸。在一较佳实施方式中，多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少7个核苷酸是LNA核苷酸。
在本揭示内容一实施方式中，所述套组更包含一源自罹患心肌梗塞的个体的正对照样品。在本揭示内容另一实施方式中，该套组更包含一源自健康个体的负对照样品。
依据本揭示内容某些实施方式，杂合缓冲液是选自由Tris-HCl/NaCl/MgCl2(TNM)缓冲液、磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate-buffered saline,PBS)缓冲液、Tris-HCl缓冲液、生理食盐水柠檬酸钠(saline sodium citrate,SSC)缓冲液、Hepes/EDTA/新亚铜(Hepes/EDTA/neocuproine,HEN)缓冲液及Tris/EDTA/NaCl(TEN)缓冲液所组成的群组。
本揭示内容的第三方式是关于一种借由检测一标的miRNA来确认一个体是否罹患心肌梗塞的装置，其中该标的miRNA是源自该个体的血液样品。该装置包含一用以检测该标的miRNA的纳米孔洞或生物传感器，其特征在于，该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及一用以计算在该血液样品中标的miRNA含量的处理单元。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
图式简单说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1为阐述let-7家族中特定miRNA表现量的柱状图，其中图1A是依据猪只心脏的小RNA定序(small RNA-sequencing)结果所显示，图1B则是依据人类心脏的小RNA定序结果所显示；TPM：每百万转录本(transcript per million)。在该多个定序结果中，let-7a及let-7f皆为let-7家族中表现量最高的miRNA；
图2是关于心肌细胞(cardiomyocyte,CM)及非心肌细胞(non-cardiomyocyte,非-CM)中let-7a的表现量；图2A：在经分离(sorted)的大鼠CM及非CM中let-7a的表现量；图2B：原位染色结果指出let-7a会广泛表现于小鼠的心脏；
图3是用以阐述猪只在产生心肌梗塞后，let-7a及let-7f表现量会下降的点状图；图3A：利用茎环qRCR(stem-loop qRCR)来检测不同时间的let-7a及let-7f的表现量；图3B：以TaqMan qPCR分别检测let-7a(左图)及let-7f(右图)的表现量。I/R比值指出相较于远程区域，梗塞部位的let-7a或let-7f的表现量；利用该多个检测方法可发现在产生心肌梗塞24小时内let-7a及let-7f的表现量皆会下降；
图4是用以阐述猪只在进行心肌梗塞手术后，特定时间点的let-7a及let-7b表现量的柱状图；图4A：在进行心肌梗塞手术前、一天后或一周后，猪只血浆中let-7a的表现量；图4B：在进行心肌梗塞手术前、一天后或一周后，猪只血浆中let-7f的表现量；非成对t检测法(Unpaired t-test，n＝18，*表示p<0.05)；图4C：在接受心肌梗塞手术后，各猪只血浆中let-7a表现量的改变趋势；图4D：在接受心肌梗塞手术后，各猪只血浆中let-7f表现量的改变趋势；成对t检测法(Paired t-test，n＝18，*表示p<0.05)。
图5是用以阐述在罹患急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)病患的血浆中，let-7a及let-7f表现量会下降的点状图；图5A：在9位健康个体及25位急性心肌梗塞病患体内，let-7a的表现量；图5B：在9位健康个体及25位急性心肌梗塞病患体内，let-7f的表现量；该多个实验是由100微升的血浆中萃取microRNA，cel-mir-39则是作为一外加对照组(spike-in control)。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。
实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作该多个具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将该多个数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
“心肌梗塞”(myocardial infarction)及“急性心肌梗塞”(acute myocardialinfarction)在本揭示内容是为可互换的词汇。该多个词汇可用以阐述因长时间缺血造成心肌细胞不可回复的坏死现象。本发明所属领域具有通常知识者当可了解，诊断通常无法对所有受测者产生100％的准确性。然而，对具有统计显著性的个体族群而言，诊断具备有效性。本发明所属技术领域具有通常知识者可利用已知统计方法来决定一族群是否具有统计显著性；例如决定信赖区间(confidence interval)、决定p值、Student's t测试、曼-惠特尼测试(Mann-Whitney test)等。较佳的信赖区间至少是90％、至少是95％、至少是97％、至少是98％或至少是99％。p值较佳是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。较佳地，依据本发明评估的概率，诊断方法对特定族群的个体的准确率至少为60％、至少为70％、至少为80％或至少为90％。
如本发明所属领域具有通常知识者所熟知，“miRNA”或“microRNA”一词是关于一种会表现于真核细胞及多细胞有机体(或后生动物，metazoan organism)体液中的短核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子。当可了解，本发明亦包含pri-miRNA及本发明miRNA的pre-miRNA。较佳地，一miRNA前趋物是由25到数千个核苷酸所组成；更佳是由40到130个核苷酸所组成；再更佳是由50到120个核苷酸所组成；最佳是由60到110个核苷酸所组成。较佳地，一miRNA是由5到100个核苷酸所组成；更佳是由10到50个核苷酸所组成；再更佳是由12到40个核苷酸所组成；最佳是由18到26个核苷酸所组成。较佳地，本发明miRNA是源自人类的miRNA，意即是由人类基因体编码而得。较佳是，miRNA一词是指最终会进入RNA诱导型缄默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的“指引”(guide)股，以及与其互补的“乘载”(passenger)股。此外，较佳是将本揭示内容对于一特定miRNA的相关叙述解读为包含该特定miRNA的变异体。所述变异体可以是异种同源物(ortholog)、同种同源物(paralog)或其他同源物(homolog)。再者，变异体包含多核苷酸，其是包含与该特定miRNA序列具有至少85％序列相似度的核酸序列。较佳是以完整的核酸序列区域来计算相似度百分比的比值。
在本揭示内容中，“多核苷酸”(polynucleotide)或“核酸序列”(nucleic acidsequence)是指RNA、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)或其组合的单股或双股聚合物，解读方向是由5'到3'端。在本揭示内容中，多核苷酸可包含一或多经修饰的核苷酸残基(例如锁核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸)，且可作为引子或探针。一“引子”(primer)或“探针”(probe)是指一包含一核酸序列的多核苷酸(合成或天然形成)，其中该核酸序列是与一标的分子的核酸序列互补，且可与该标的分子杂合形成一双股结构。一般来说，“引子”(primer)是指一单股多核苷酸，其是与一欲进行复制的核酸序列互补，且作为一引子增长产物的合成起始点；而“探针”(probe)则是指一单股多核苷酸，其可与一互补的单股标的序列进行杂合，以形成一双股分子(杂合体)。
在本揭示内容中，“杂合”(hybridize或hybridization)一词是指任何涉及核酸的一股借由碱基配对结合至一互补股的反应。一般来说，杂合及杂合强度(即核酸之间的结合强度)会受到以下因素影响：核酸之间的互补程度、反应条件、形成杂合体的Tm值及核酸内的G:C比例。
在本揭示内容中，“含量”(amount)包含所指miRNA的绝对含量、相对含量、浓度及任何与其相关的数值或参数。该多个数值或参数包含强度讯号值，其是借由测量所指miRNA的物理或化学特性而得，例如由专一键合配位子得到的强度讯号。当可理解，亦可由标准数学运算来取得与上述含量或参数相关的数值。
在本揭示内容中，“锁核酸”(locked nucleic acid或LNA)是指包含一或多个2′-O、4′-C亚甲基键合的双环核酸类似物，其可有效锁住C3′-内结构中的呋喃糖环(furanose)。该亚甲基键合限制了呋喃核糖环的可挠性，因而促使结构形成一刚性双环构造。基于其结构，相较于天然DNA对应体，LNA对互补核酸具有更高的亲和力及专一性，且可增加探针/标的核酸双股结构的温度及化学稳定性。即使在严荷的条件下(例如低盐浓度及加入离散剂(chaotropic agent))，LNA仍可与互补核酸杂合。依据使用需求，在一寡核苷酸中，LNA核苷酸可与DNA或RNA碱基混合；更具体来说，LNA核苷酸可分散在一寡核苷酸序列中，或是连续性或单独性地位于特定位置。
“序列相似度”(sequence identity)一词在此是指二条或多条序列或次序列在进行比较或比对时的最大对应值，其中该多个序列或次序列是相同或具有一特定比例的相同的氨基酸残基或核苷酸。为取得相似度百分比，该多个序列是以优化的比对方式进行比对(例如，可在第一氨基酸序列中插入或删去间隙，使其与第二氨基酸序列比对时可达最大序列相同性)。再比对位于对应位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中相对应的位置具有相同的氨基酸残基或核苷酸时，则该位置的二个分子是为相同。二条序列的相似度百分比是序列间相同位置的数量函数(即，相同百分比＝相同位置的数量/位置的总数量(例如，两两排列的位置数量)×100)。在某些实施方式中，二条序列具有相同的长度。用来比对序列的方法是相关领域人士所熟知的，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。
基于本所属领域亟需一种可准确且有效确认一个体是否罹患心肌梗塞的方法，据以实时对有需要的个体投予适当的治疗，本揭示内容旨在提供一种由一个体的血液样品来诊断心肌梗塞的方法及套组。
因此，本揭示内容的第一方式是关于一种由一个体的血液样品来诊断该个体是否罹患心肌梗塞的方法。该方法包含：
(a)决定该血液样品中一标的miRNA的含量，其中该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及
(b)将该标的miRNA的含量与一取自健康个体的对照样品的标的miRNA含量进行比对，其中若该血液样品的标的miRNA的含量低于该对照样品的标的miRNA的含量，表示该个体罹患心肌梗塞。
在本发明方法中，是先由一罹患或疑似罹患心肌梗塞的病患取得其血液样品。依据本揭示内容的实施方式，血液样品可以是全血液样品、血清样品或血浆样品。在一特定实施例中，血液样品是血浆样品。
在步骤(a)中，是利用一适当的检测方法来定量分析血液样品中的标的miRNA。依据本揭示内容的实施例，可利用任何已知技艺人士熟知的方法由血液样品(例如血浆样品)萃取总RNA，例如利用细胞裂解缓冲液使细胞释放核酸；亦或是，可借由商业化套组来达到相同目的。非例示性的细胞裂解缓冲液包含NP-40裂解缓冲液、放射性免疫沈淀法(radioImmunoprecipitation assay,RIPA)裂解缓冲液、十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)裂解缓冲液及铵-氯-钾(ammonium-chloride-potassium,ACK)裂解缓冲液。例示性的适用于本发明方法的套组包含，但不限于，mirVana PARIS套组(Ambion)、miRCURYRNA分离套组(Exiqon)、miRNeasy血清/血浆套组(Qiagen)，总RNA纯化套组(Norgen BiotekCorporation)及NucleoSpin miRNAs套组(Macherey-Nagel)。依据本揭示内容一实施方式，是利用mirVana PARIS套组由血浆样品萃取总RNA。萃出的RNA可用以测量或定量分析特定的miRNA标的。
依据本揭示内容的实施方式，例示性的可用以决定标的miRNA含量的检测方法包含，但不限于，北方墨点法、微数组、荧光法、电化学法、生物性冷光法、生物性冷光蛋白重组、与生物性冷光共振能量转移相关的检测、反转录聚合酶链锁反应、荧光相关光谱及表面增强拉曼光谱。依据定量分析方法的不同，可将标的miRNA的含量表示为一绝对值或一相对值。在本揭示内容一实施方式中，是以RT-PCR定量分析标的miRNA。在本揭示内容另一实施方式中，则是利用微数组或生物芯片来定量分析标的miRNA。
依据本揭示内容某些实施方式，标的miRNA是let-7a，其是包含一与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相似度的核酸序列；举例来说，let-7a可包含一核酸序列，其是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似于SEQ ID NO:1。较佳地，let-7a包含的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列相似度。更佳地，let-7a包含的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列相似度。在本揭示内容一特定实施方式中，let-7a具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
在本揭示内容一实施方式中，是利用一多核苷酸(作为探针)来决定let-7a的含量，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相似度的核酸。依据某些实施方式，SEQ ID NO:3的核酸序列是与SEQ ID NO:1的核酸序列互补。因此，包含SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸对包含SEQ ID NO:1的核酸序列的let-7a具有结合亲和力及专一性。
依据本揭示内容其他实施方式，本发明多核苷酸可包含一或多个LNA核苷酸。较佳地，本发明多核苷酸包含至少7个LNA核苷酸。在一实施例中，本发明多核苷酸包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20个碱基(base)位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸包含8个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22个碱基位置。
依据本揭示内容其他实施方式，标的miRNA是let-7f，其是包含一与SEQ ID NO:2具有至少85％序列相似度的核酸序列；意即，let-7f与SEQ ID NO:2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似度。较佳地，let-7f包含的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列相似度。更佳地，let-7f包含的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少95％的序列相似度。在本揭示内容一特定实施方式中，let-7f包含的核酸序列与SEQ ID NO:2具有100％的序列相似度。
在该多个实施方式中，是利用一多核苷酸来决定let-7f的含量，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:4具有至少85％序列相似度的核酸，SEQ ID NO:4的核酸序列是与SEQID NO:2的核酸序列互补。因此，包含SEQ ID NO:4的核酸序列的多核苷酸可专一性地结合至包含SEQ ID NO:2的核酸序列的let-7f。较佳地，本发明多核苷酸的核酸序列包含至少7个LNA核苷酸。在一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含8个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22个碱基位置。
基于LNA核苷酸的特性，标的miRNA(例如let-7a或let-7f)可与包含LNA核苷酸的多核苷酸在严苛的条件下进行杂合，例如低盐浓度及/或高温。依据本揭示内容一实施方式，标的miRNA与包含LNA核苷酸的多核苷酸是在50-60℃的温度中进行杂合。
依据本揭示内容某些实施例，在与标的miRNA(例如let-7a或let-7f)结合前，可先将本发明多核苷酸固定在一固体基质上，例如磁珠、玻璃或硅层。
多核苷酸及标的miRNA的互补碱基对可形成一“双股”(double strand)结构。可利用已知技艺人士熟知的方法来检测该RNA-DNA杂合体。例示性的用以检测RNA-DNA杂合体的方法包含，但不限于，聚酰胺法(polyamide method，利用一与荧光染剂或特定受体接合的小型化学化合物来专一结合至RNA-DNA杂合体的小凹槽(minor groove))、三联体法(triplex method，利用一与荧光染剂或放射性分子接合的可形成三螺旋的寡核苷酸，结合至dsDNA大凹槽(major groove)中的聚嘌呤/聚嘧啶结构)及蛋白法(protein method，利用一与荧光染剂或特定受体接合的具有序列专一性的DNA结合蛋白)。
依据一实施例，是先将多核苷酸固定在一固体基质上，其中该多核苷酸包含一与let-7a(即SEQ ID NO:1)的核酸序列互补的序列(即SEQ ID NO:3)，或包含一与let-7f(即SEQ ID NO:2)的核酸序列互补的序列(即SEQ ID NO:4)。接着，将该多核苷酸与源自心肌梗塞病患周边血的血浆样品于50-60℃温度中进行杂合，以形成一RNA-DNA杂合体。可加入一会结合至RNA-DNA杂合结构的染剂或荧光来检测RNA-DNA杂合体。之后借由经结合的染剂或荧光所发散的讯号来定量分析let-7a或let-7b的表现量。
之后，如步骤(b)所述，比对血液样品中标的miRNA(即let-7a或let-7f)的含量及源自健康个体的对照样品中标的miRNA(即let-7a或let-7f)的含量。依据本揭示内容的实施方式，若血液样品的标的miRNA含量低于对照样品的标的miRNA含量，表示该个体罹患心肌梗塞。
或者，可利用一合成RNA(作为外加/内部对照)来定量分析标的miRNA的含量。可借由健康个体来建立miRNA含量的正常分布表。一旦决定个体的miRNA含量后，即可将该结果与正常分布表进行比对分析。
依据一实施方式，利用本发明方法评估的心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞。依据另一实施方式，利用本发明方法评估的心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞。
依据本揭示内容某些实施方式，以本发明方法评估的个体是一哺乳动物，包含人类、黑猩猩、猴子、狗、猪、大鼠及小鼠。在一特定实施例，利用本发明方法评估的个体是人类。
当可想见，标的miRNA可以是let-7a及let-7f的组合。在该种情况下，是将血液样品中let-7a及let-7f的总含量与源自健康个体的对照样品中let-7a及let-7f的总含量进行比对。当血液样品中let-7a及let-7f的总含量低于对照样品中let-7a及let-7f的总含量时，即可诊断该个体为罹患心肌梗塞的病患。
本揭示内容的第二方式是关于一种借由检测一标的miRNA来确认一个体是否罹患心肌梗塞的套组，其中该标的miRNA是源自该个体的血液样品。该套组包含一多核苷酸及一杂合缓冲液。
依据本揭示内容某些实施方式，该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相似度的核酸序列。为增加灵敏度及专一性，可将本发明多核苷酸的核酸序列中至少一个核苷酸修饰为LNA核苷酸；举例来说，本发明多核苷酸的核酸序列可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个LNA核苷酸。较佳地，本发明多核苷酸的核酸序列包含至少7个LNA核苷酸。在一实施例中，本发明多核苷酸包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸包含8个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:3的核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22个碱基位置。
依据本揭示内容其他实施方式，该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:4具有至少85％序列相似度的核酸序列，其中在核酸序列中至少一个核苷酸是LNA核苷酸；举例来说，本发明多核苷酸的核酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个LNA核苷酸。较佳地，本发明多核苷酸的核酸序列包含至少7个LNA核苷酸。在一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第2、5、8、11、14、17及20个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含7个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第3、6、9、12、15、18及21个碱基位置。在另一实施例中，本发明多核苷酸的核酸序列包含8个LNA核苷酸，其是分别位于SEQ ID NO:4的核酸序列的第1、4、7、10、13、16、19及22个碱基位置。
在一实施方式中，多核苷酸具有一发夹环状(hairpin-loop)结构。在另一实施方式中，多核苷酸具有一茎环状(stem-loop)结构。在再另一实施方式中，多核苷酸具有一双环状(double-loop)结构。
依据本揭示内容某些实施方式，套组更包含一正对照样品，其是源自一罹患心肌梗塞的个体或源自一合成RNA。依据本揭示内容其他实施方式，套组更包含一负对照样品，其是源自一健康个体或源自一合成RNA。
依据本揭示内容的实施方式，杂合缓冲液是选自由TNM、PBS、Tris-HCl、SSC、HEN及TEN所组成的群组。
本揭示内容的第三方式是关于一种借由检测一标的miRNA来确认一个体是否罹患心肌梗塞的装置，其中该标的miRNA是源自该个体的血液样品。该装置包含一用以检测该标的miRNA的纳米孔洞或生物传感器，其中该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及一用以计算在该血液样品中标的miRNA含量的处理单元。
依据本揭示内容某些实施方式，let-7a miRNA包含一与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相似度的核酸序列。依据本揭示内容其他实施方式，let-7f miRNA包含一与SEQID NO:2具有至少85％序列相似度的核酸序列。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将该多个实验例视为对本发明范围的限制。据信已知技艺者在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
实施例
材料及方法
心肌梗塞的猪只模式
插管前，以舒泰(Zoletil，每公斤12.5毫克；Virbac，法国)、若朋(Rompun，每公斤0.2毫升；Bayer Healthcare，德国)及阿托品(atropine，每公斤0.05毫克；TBC，台湾)对约22公斤的兰屿迷你猪(Lanyu minipig)进行手术麻醉。将猪只连接至一间歇性正压呼吸器，并投予包含氧、空气及异氟烷(1.5到2％；Baxter Healthcare,Guayama,PR)在内的混合气体。为持续投予生理食盐水或麻醉剂，在手术期间将静脉留置导管放置于耳静脉中。手术后，投予抗生素(Ampolin,YSP)及止痛剂(Keto,YSP)以预防感染及减缓疼痛。对左中前降枝动脉(midleft anterior descending artery)进行心肌梗塞手术，以产生永久性闭塞。
萃取miRNA
借由离心，由周边血分离血浆样品。之后，依据使用操作说明，利用mirVana PARIS套组(Ambion)由血浆样品萃取总RNA。将合成的microRNA(取名为cel-mir-39)加入样品中，作为标准化技术性差异的内部对照。
茎环定量聚合酶连锁反应(Stem-loop quantitative polymerase chainreaction,qPCR)
以反转录套组(Applied Biosystems)及SEQ ID NO:5的合成寡核苷酸对50奈克的总RNA进行反转录反应，其特征在于，SEQ ID NO:5的合成寡核苷酸可形成茎环结构及microRNA的负股，据以作为RT引子。利用SEQ ID NO:6或7的正向引子及SEQ ID NO:8的通用反向引子，以OmicsGreen qPCR Master Mix(Omics Bio)于ABI 7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行定量PCR反应。
Taqman定量聚合酶连锁反应(quantitative polymerase chain reaction)
使用Taqman microRNA反转录套组(Applied Biosystems)及Taqman UniversalPCR master mix(Applied Biosystems)。各microRNA的茎环RT引子随附于TaqManmicroRNA探针。利用TaqMan microRNA反转录套组(Assay ID000377：检测let-7a；Assay ID000382：检测let-7f)进行茎环RT。依据Taqman microRNA检测(Applied Biosystems)随附的使用操作方法进行定量PCR。
实施例1健康个体的let-7a及let-7f表现量
本实施例将依据“材料及方法”所述流程，分别检测let-7家族的miRNA(包含let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g及let-7i miRNAs)于猪只、人类及囓齿动物体内的表现量。
首先利用小RNA定序法来分析猪只心脏中let-7miRNA的表现。如图1A所示，在let-7基因家族中，let-7a及let-7f具有最高的表现量。源自人类心脏的let-7miRNA的表现量则与猪只观察结果相似(图1B)。
基于在猪只及人类检测的let-7miRNA的表现量，进一步利用四甲基玫瑰红甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)染色来检测囓齿动物的let-7a的表现，并以流式细胞仪及原位染色进行分析。分析结果分别阐述于第2A及2B图中。TMRM染色结果指出，于大鼠心肌细胞(cardiomyocyte,CM)及大鼠心肌纤维母细胞(cardiac fibroblast,非-CM)中皆可检测到let-7a的表现(图2A)。原位染色结果进一步确认let-7a会广泛表现于小鼠的心脏组织(图2B)。
实施例2罹患心肌梗塞的个体的let-7a或let-7f表现量
实施例1的结果指出，let-7a及let-7f皆会高量表现于健康动物的心脏组织。本实施例将分别利用猪只心肌梗塞模式(实施例2.1)及人类个体(实施例2.2)来了解心肌梗塞对let-7a及let-7f表现的影响。
2.1心肌梗塞的猪只模式
实施例2.1是依据“材料及方法”所述流程建立猪只心肌梗塞模式后，检测梗塞部位及远程区域的let-7a及let-7f的表现量。结果分别阐述于第3A及3B图中。
图3A为在心肌梗塞手术后，let-7a及let-7f于不同时间点的表现量。茎环qPCR的结果指出，相较于对照组(伪处理组)，在产生心肌梗塞24小时内，心肌梗塞猪只(即MI组)体内l et-7a及let-7f的总表现量会逐渐下降；且于24小时时，心肌梗塞猪只的let-7a及let-7f的总表现量与伪处理组的总表现量间具有显著的差异。I/R比值为经标准化的缺血区域(ischemic region,I)及远程区域(remote region,R)的表现量的比值。
进一步以TaqMan qPCR来确认let-7a及let-7f个别的表现量，其中相较于伪处理组，MI组的let-7a(第3B的左图)及let-7f(第3B的右图)的表现量皆会显著地下降。第4A-4D图的结果则指出，在产生心肌梗塞后，猪只血浆中let-7a(第4A及4C图)及let-7f(第4B及4D图)表现量下降的情况会至少持续一周。
2.2罹患心肌梗塞的人类个体
实施例2.2将分别分析由9位健康个体及25位心肌梗塞病患(皆已取得其知情同意书)取得的血浆样品，以了解let-7a let-7f的表现量。结果分别阐述于第5A及5B图。
如图5所述，相较于健康个体(即对照组)，心肌梗塞病患(即AMI组)的let-7a(图5A)及let-7f(图5B)的表现量皆会显著地下降。
总结上述，第3-5图的结果指出，let-7a及let-7f会持续性地表现在健康个体(例如猪只、大鼠、小鼠及人类)的组织及/或血液(例如心脏组织及血浆)中，其中可检测到表现量相对较高的let-7a及let-7f；然而，一旦个体罹患心肌梗塞，其心脏组织及/或血液中let-7a及let-7f的表现量即会受到抑制或减少。
整体来看，本揭示内容提供一种用以确认心肌梗塞病患的方法及套组。相较于其他检测方法(多数是分析萃取自心脏组织的miRNA)，本发明方法及套组可直接定量分析源自周边血的miRNA(即let-7a及/或let-7f)的表现量。依据检测结果，医疗人员可准确且有效地诊断一个体是否罹患心肌梗塞，并据此对心肌梗塞病患投予适当且实时的治疗。
虽然上文实施方式中揭示/公开了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中央研究院
<120> 用以诊断心肌梗塞的方法及套组
<130> P2894-PCT
<150> US62/234,672
<151> 2015-09-30
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7a
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7f
<400> 2
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-let-7a
<400> 3
aactatacaa cctactacct ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-let-7f
<400> 4
aactatacaa tctactacct ca 22
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-引物
<400> 5
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaact atac 44
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物-1
<400> 6
acactccagc tgggtgaggt agtagattgt 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物-2
<400> 7
acactccagc tgggtgaggt agtaggttgt 30
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用反向引物
<400> 8
ctggtgtcgt ggagtcggca attc 24

Claims (18)

1.一种由一个体的血液样品诊断该个体是否罹患心肌梗塞的方法，包含：
(a)决定该血液样品中一标的miRNA的含量，其中该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及
(b)将该标的miRNA的含量与一取自健康个体的对照样品的标的miRNA含量进行比对，其中若该血液样品的标的miRNA的含量低于该对照样品的标的miRNA的含量，表示该个体罹患心肌梗塞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该let-7a miRNA包含一与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相似度的核酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该let-7f miRNA包含一与SEQ ID NO:2具有至少85％序列相似度的核酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该血液样品是一全血液样品、一血清样品或一血浆样品。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该心肌梗塞是ST上升型心肌梗塞(STelevation myocardial infarction,STEMI)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该心肌梗塞是非ST上升型心肌梗塞(non-STelevation myocardial infarction,NSTEMI)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该标的miRNA的含量是由一检测方法来决定，其是选自由北方墨点法、微数组、荧光法、电化学法、生物性冷光法、生物性冷光蛋白重组、与生物性冷光共振能量转移相关的检测、反转录聚合酶链锁反应、荧光相关光谱及表面增强拉曼光谱所组成的群组。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该标的miRNA的含量是利用一多核苷酸进行反转录聚合酶链锁反应来决定，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该标的miRNA的含量是利用一多核苷酸进行微数组来决定，其中该多核苷酸包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该个体是一人类。
11.一种借由检测一标的miRNA来决定一个体是否罹患心肌梗塞的套组，其特征在于，该标的miRNA是源自该个体的血液样品，该套组包含：
一多核苷酸，其是包含一与SEQ ID NO:3或4具有至少85％序列相似度的核酸序列，其中在该核酸序列中至少一核苷酸是一锁核酸(locked nucleic acid,LNA)核苷酸；以及
一杂合缓冲液。
12.如权利要求11所述的套组，其特征在于，在SEQ ID NO:3或4的核酸序列中，至少7个核苷酸是锁核酸核苷酸。
13.如权利要求11所述的套组，更包含一正对照样品，其是源自一罹患心肌梗塞的个体或源自一合成RNA。
14.如权利要求11所述的套组，更包含一负对照样品，其是源自一健康个体或源自一合成RNA。
15.如权利要求11所述的套组，其特征在于，该杂合缓冲液是选自由Tris-HCl/NaCl/MgCl2缓冲液、磷酸盐缓冲生理食盐水缓冲液、Tris-HCl缓冲液、生理食盐水柠檬酸钠缓冲液、Hepes/EDTA/新亚铜缓冲液及Tris/EDTA/NaCl缓冲液所组成的群组。
16.一种借由检测一标的miRNA来决定一个体是否罹患心肌梗塞的装置，其特征在于，该标的miRNA是源自该个体的血液样品，该装置包含：
一用以检测该标的miRNA的纳米孔洞或生物传感器，其中该标的miRNA是let-7a或let-7f；以及
一用以计算在该血液检体中标的miRNA含量的处理单元。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该let-7a miRNA包含一与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相似度的核酸序列。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该let-7f miRNA包含一与SEQ ID NO:2具有至少85％序列相似度的核酸序列。
CN201680058229.8A 2015-09-30 2016-09-30 用以诊断心肌梗塞的方法及套组 Pending CN108348540A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562234672P 2015-09-30 2015-09-30
US62/234,672 2015-09-30
PCT/US2016/054971 WO2017059344A1 (en) 2015-09-30 2016-09-30 Method and kit for making diagnosis of myocardial infarction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108348540A true CN108348540A (zh) 2018-07-31

Family

ID=58424341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680058229.8A Pending CN108348540A (zh) 2015-09-30 2016-09-30 用以诊断心肌梗塞的方法及套组

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20180298442A1 (zh)
CN (1) CN108348540A (zh)
TW (1) TWI696703B (zh)
WO (1) WO2017059344A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009055979A1 (fr) * 2007-11-02 2009-05-07 Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd Micro-arn dans le sérum/plasma sanguin et leurs utilisations
CN101802227A (zh) * 2007-07-18 2010-08-11 科罗拉多大学董事会 非衰竭与衰竭的人心脏中微小rna的差异表达

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2385123B1 (en) * 2001-09-28 2018-04-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
WO2011110644A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 National University Of Ireland, Galway Detection and quantification of micrornas in the circulation and the use of circulating micrornas as biomarkers for cancer
US20150064704A1 (en) * 2012-04-04 2015-03-05 Comprehensive Biomarker Center Gmbh Complex sets of mirnas as non-invasive biomarkers for early diagnosis of acute myocardial infarction
CN102980920A (zh) * 2012-11-14 2013-03-20 华东师范大学 同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其检测方法和应用
WO2014113598A2 (en) * 2013-01-16 2014-07-24 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices to extract, concentrate and isolate molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802227A (zh) * 2007-07-18 2010-08-11 科罗拉多大学董事会 非衰竭与衰竭的人心脏中微小rna的差异表达
WO2009055979A1 (fr) * 2007-11-02 2009-05-07 Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd Micro-arn dans le sérum/plasma sanguin et leurs utilisations

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG ZHENG等: "Plasma miRNAs as Diagnostic and Prognostic Biomarkers for Ovarian Cancer", 《PLOS ONE》 *
HYE CHEOL JEONG等: "Aberrant expression of let-7a miRNA in the blood of non-small cell lung cancer patients", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180298442A1 (en) 2018-10-18
TW201713777A (zh) 2017-04-16
WO2017059344A1 (en) 2017-04-06
TWI696703B (zh) 2020-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10774386B2 (en) Serum or plasma microRNA as biomarkers for non-small cell lung cancer
US9637793B2 (en) Pancreatic cancer markers, and detecting methods, kits, biochips thereof
US9868988B2 (en) Method to assess human allograft status from microrna expression levels
CN101988060A (zh) 结直肠癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片
CN106319089B (zh) lncRNA在缺血性脑卒中诊断中的应用
WO2016186987A1 (en) Biomarker micrornas and method for determining tumor burden
WO2014114802A1 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
KR102375106B1 (ko) 핵산 검출 시스템
CN106701962B (zh) 用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒
WO2013179672A1 (ja) 子宮内膜症の判定方法
US20210079478A1 (en) Method for assisting in detection of breast cancer
CN110358810A (zh) 一种检测miRNA的生物探针及检测方法和用途
CN108348540A (zh) 用以诊断心肌梗塞的方法及套组
CN110257514A (zh) 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用
ES2856232B2 (es) Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos
CN110988346A (zh) 一种辅助诊断肺癌的标记物以及检测方法
CN108728530A (zh) 一种鉴定缺血性卒中病因亚型的microRNA标志物组合及其用途
CN102757965A (zh) 血清microRNA分子标志物及其应用
CN107653319B (zh) 胶质瘤诊断标志物circ8:61680968|61684188及应用
KR20210088053A (ko) 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 방법 및 진단 키트
KR20240097996A (ko) 간질성방광염 진단 또는 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도
CN115896250A (zh) 用于检测目标rna或单链dna的组合物及其应用
Culley et al. Circulating Micro RNA s as Biomarkers in Cardiovascular and Pulmonary Vascular Disease: Promises and Challenges
CN117070620A (zh) 一种体外鉴别中枢性性早熟女童的标志物及方法
KR101665165B1 (ko) 신규한 rna 앱타머 및 그의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180731

RJ01 Rejection of invention patent application after publication