KR101665165B1

KR101665165B1 - 신규한 rna 앱타머 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101665165B1
Application number: KR1020130150232A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 이원일; 한승렬
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2016-10-12
Also published as: KR20150065090A

Abstract

본 발명은 신규한 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 효과적으로 결합하는 RNA 앱타머, 특히 저온자극도메인에 결합하는 RNA 앱타머, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 키트, 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 Lin28A 또는 Lin28B 단백질과 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 RNA 앱타머는 Lin28과 Lin28B 단백질 모두에 결합하며 특히 저온자극도메인에 효과적으로 결합하는 특징을 가지므로, 상기 단백질의 기능 연구에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 상기 단백질이 발현되는 암의 진단 또는 치료에도 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 RNA 앱타머 및 그의 용도{Novel RNA aptamers and the Uses thereof}

본 발명은 신규한 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 효과적으로 결합하는 RNA 앱타머, 특히 저온자극도메인에 결합하는 RNA 앱타머, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 키트, 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 Lin28A 또는 Lin28B 단백질과 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

앱타머(Aptamer)는 표적분자에 밀접하고 선택적으로 결합하는 저분자의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 이에 따라, 종양학적 관점에서는 진단과 치료 측면에서 새롭게 각광받는 수단이다. 일반적으로, 단백질로 이루어진 항체는 높은 친화력과 특수성, 표적의 광범위성에서는 우수한 면이 있으나, 생체 내 긴 혈류잔류로 이미징 능력에 있어서 효율이 감소되고, 표적 조직에 대한 고특이성의 장점은 있으나 오랜 잔류로 종종 혈액 독성의 단점을 가진다. 또한, 항체는 표적조직에 불완전한 침투성을 보인다. 따라서 새로운 표적물질과 임상 프로토콜이 요구된다. 예를 들면 더 작은 항체 절편이나 펩타이드 뿐만 아니라 항체 원시표적 전략이 포함된다(Boerman OC, et al. Cancer Res. 1999;59:4400-4405).

이에 따라, 새로운 수단으로 앱타머를 암조직 특이적 표적을 위하여 이용하려는 임상 시도가 현재 진행중에 있다. 올리고뉴클레오타이드 리간드인 앱타머는 항체와 같은 전형적인 단백질 표적 분자와 특이성과 친화력을 가진다. 앱타머는 분자량이 8-15 kDa인데, 이는 펩타이드(1-5kDa)(Wu AM, et al. Immunotechnology. 1996;2:21-36; Lister-James J, et al., Q. J. Nucl. Med., 1996;40:221-233)와 항체(150 kDa)와 비교하여 분자량 면에서 중간크기이고 단일사슬의 변이절편 항체 (scFve, 25 kDa)보다 더 작다. 다가 음이온인 앱타머는 scFv와 달리 구조와 활성을 나타내는 부위의 modification을 통하여 쉽게 합성분자를 만들 수 있다. 그래서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 폴리머와 생물결합, 진단 그리고 치료제에 연결하여 사용될 수 있다. 또한, 앱타머는 약동력학적으로 변형할 수 있는 장점이 있다 (Watson SR et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000;10:6375).

Lin28A와 Lin28B는 초기 분화단계에서 큰 영향을 끼치는 진화적으로 잘 보전되어 있는 유전자로, 처음에는 선충(Caenorhabditis elegans)에서 발견되었다(Moss, E. G. et al, Cell. (1997) 88: 637646). Lin28A 또는 Lin28B는 25kDa, 28kDa의 RNA 바인딩 단백질으로 한 개의 저온자극도메인(cold shock domain, CSD)과 두 개의 레트로바이러스성(retroviral) 아연 핑거 모티프(zinc finger motif, ZFM)로 구성되어 있다. CSD과 ZFM는 유사하지만 N-말단과 C-말단의 아미노산에서 차이를 보인다. 즉, 두 단백질의 도메인(domain) 부분은 서로 유사하지만 단백질의 N-말단과 C-말단 부분은 서로 유사성이 적다.

이는, 사람과 쥐의 배아줄기세포(Embryonic stem cell)에서 많이 발현되며, 분화가 진행되게 되면 발현량이 급격히 감소하게 된다(Darr, H. et al. Stem Cells. (2009) 27: 35262.) 인체에서도 난소나 정소와 같이 줄기세포가 존재하는 조직에서 발현이 되며, 진행된 간암세포에서도 많이 발현되는 것으로 알려져 있다(Assou, S. et al., BMC Genomics, (2009) doi:10.1186/1471-2164-10-10.; Yingqiu, G. et al., Gene. (2006) 384: 5161.). 그리고 Lin28이 IGF2, MYOD1등의 mRNA와 결합하여서 번역을 촉진한다고 알려져 있으며, let7 패밀리의 pri-miRNA에서 pre-miRNA로 공정되는 단계를 억제하거나(Srinivas, R. et al., Science. (2008) 320: 97 - 100), pre-miRNA에서 mature miRNA로 공정되는 단계를 억제함으로써 mature let7의 양을 감소시키게 된다(Inha, H. et al., (2008) 32: 276-84.). Lin28은 pre-let7의 루프에 있는 특이적 시퀀스(sequence)인 GGAG를 인지하여 결합하고(Martin, A. et al., RNA. (2008) 14: 1539 - 1549.), TUT4가 결합해서 pre-let7의 3' 끝 부위에 폴리우리딜레이션(polyuridylation) 시켜서 분해하게 된다(Inha, H. et al., Molecular Cell. (2008) 32: 276284.).

마이크로 RNA(miRNA)는 ~22개 정도의 뉴클레오티드로 이루어져 있는 small non-코딩 RNA로 전사 후 단계(post-transcription)에서 유전자의 발현을 조절하는 RNA이다. RNA 폴리머라아제Ⅱ에 의해서 전사 되어서 pri-miRNA를 만들게 되고, 핵 안에서 RNase Ⅲ drosha에 의해 잘려서 pre-miRNA가 되거나, 스플라이싱에 의해 나온 인트론이 pre-miRNA와 같은 mitron으로 공정된다. pre-miRNA는 exportin5에 의해서 세포질로 이동하게 되고, RNase Ⅲ dicer에 의해서 mature miRNA가 된다. mature miRNA는 RISC와 결합하여 기능을 수행하게 된다. miRNA는 타겟 mRNA의 3'UTR 부위에 바인딩하여 억제하게 되는데, 억제하는 방법에는 타겟 mRNA를 분해, 번역 개시 억제, mRNA의 디아데닐레이션(deadenylation), 번역 신장 억제, 생성되는 단백질 분해의 방법으로 유전자 발현을 조절하게 된다. miRNA의 일종인 let7은 처음에 C. elegans에서 발견이 되었으며, 발달과정에 중요한 역할을 하는 작은 RNA로 밝혀졌다(Ingo, B. et al., Trends in Molecular Medicine. (2008) 14: 400 - 409.). let7이 타겟하는 mRNA는 HMGA2, MYC, RAS와 같은 셀 사이클이나 분열과 관련된 유전자들이다. 이러한 유전자를 타겟하는 let7의 감소는 암의 발달과정에 관여될 수 있는데 실제로 폐암과 간암세포에서는 mature let7의 발현이 감소되어 있다(Yingqiu, G. et al., Gene. (2006) 384: 5161.; Takamizawa, J. (2004) Cancer Res. 64: 3753-3756.). 간암에서는 많이 진행된 경우 Lin28B의 발현량이 증가하는 경우를 볼 수 있다. 이 경우에는 pri-let7, pre-let7의 양은 변화가 없으나 mature let7의 양만 감소하는 것을 볼 수 있는데 Lin28B의 발현량 증가가 pre-let7의 공정을 억제해서 mature let7의 양이 감소하게 되는 것이다. 이러한 Lin28B의 증가가 mature let7의 감소로 이어지는 경우에 Lin28B의 기능을 억제시킨다면 pre-let7의 공정을 증가시켜 mature let7의 증가로 인해 let7이 타겟하는 암유전자(oncogene)의 조절을 증가시켜 암의 억제에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.

이에, 상기와 같은 배경하에 본 발명자들은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 개발하고자 노력해오던 중, Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 개발한 바 있다(대한민국 공개출원 제10-2012-0117563호). 그러나, 상기 RNA 앱타머는 RNase에 의해 쉽게 분해될 수 있는 normal RNA로 구성된 앱타머로 생체 내 투입하여 효과적인 항암제 등으로 활용하기에는 많은 제약이 존재하였다.

이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 Lin28A 또는 Lin28B을 조절할 수 있으며, RNAse에 저항성을 갖는 고감도 RNA 앱타머 개발하고자 노력한 결과, RNase에 대해 저항성을 가지며 기존 RNA 앱타머와 완전히 상이한 염기서열로 구성되고, 특히 Lin28A 또는 Lin28B의 저온자극도메인을 표적으로 하는 RNA 앱타머를 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 신규한 RNA 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하여 암이 의심되는 개체의 시료와 정상 대조군 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 측정하여 비교하여, 암 발병 여부에 대한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질과 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다. 이때, 상기 RNA 앱타머는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 34 내지 45의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택됨이 바람직하다.

특히, 본 발명의 RNA 앱타머는 RNase 저항성을 가질 수 있으며, Lin28A 또는 Lin28B 단백질의 저온자극도메인(Cold shock domain)에 결합하는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

RNA 앱타머는 기존의 항체에 비해 고르기가 용이하며, 화학적 합성이 가능하고, 바이러스나 포유류 발현 벡터를 이용해 인체에서 발현시킬 수 있으며, 인체에 투여했을 경우 면역반응이 약하거나 일으키지 않는다고 알려져 있다. 이러한 장점을 이용해서, 본 발명자들은 Lin28A 또는 Lin28B에 대한 특이적인 RNA 앱타머를 개발해 낼 수 있다면, Lin28 발현의 증가에 의해 감소되는 mature let7을 회복시킬 수 있을 것으로 기대될 뿐만 아니라, Lin28의 두 종류에 존재하는 도메인인 저온자극도메인(CSD, Cold Stimulatory Domain)와 아연 핑거 모티프(ZFM, Zinc-Finger Motif)를 각각 특이적으로 억제할 수 있다면 각 도메인의 기능을 연구하는데 좋은 도구가 될 수 있을 것이라는 점에 착안하여 본 발명을 수행하게 되었다.

본 발명에서 용어, "앱타머"란 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 특히, "RNA 앱타머"는 짧은 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 높은 친화도와 특이성으로 표적 단백질 또는 세포에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있다. 또한, 대부분의 RNA 앱타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다. 본 발명의 경우에는 Lin28A 또는 Lin28B와 결합하는 RNA 앱타머를 의미하는 것으로 간주된다.

상기 RNA 앱타머는 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법을 통해 선택할 수 있고, 또는 화학적으로 합성될 수 있다.

본 발명의 용어 "SELEX"는 시험관 내에서 약 10²⁴개의 다양한 종류를 가지는 RNA 라이브러리에서 표적 단백질에 대해 특이적이고 높은 친화력을 가지는 특정 RNA 염기서열을 분리해 내는 방법을 의미한다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명은 RNA 앱타머를 선별하기 위해 우선 필요한 과정으로 (a) RNA 라이브러리를 제조하였으며(2-플루오린 피리미딘 뉴클레오티드를 기질로 제조), 그 방법으로 양쪽 끝(5'과 3')에 클로닝과 염기서열 확인을 위한 제한효소 인식 자리를 배열하고, 가운데에는 40 bp의 무작위적인 염기서열이 배열된 DNA 주형(template), T7 RNA 중합효소 프로모터 부분을 포함하는 5' 프라이머와 3' 프라이머를 준비하였다. 다음으로 (b) RNA 라이브러리와 표적 물질(Lin28A 또는 Lin28B)과 반응시켜, 이로부터 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하였다.

선별된 RNA 앱타머는 다음과 같다:

Lin28A 그룹 1

클론 7

5'-TCGTGTGAGAGCCGTAAGTGAAAGGCCGCGACAAAGATCGGA-3' (서열번호 34)

Lin28A 그룹 2

클론 37

5'-CTTTCTCAATCGACATCAACTTCAGTTGAACAGCTGGTT-3' (서열번호 35)

클론 4

5'-CTTTCTCAATCGACATCAACTTCAGTTGAACAGCTGGT C -3' (서열번호 36)

클론 17

5'-CT C TCTCAATCGACATCAACTTCAGTTGAACAGCTGGTT-3' (서열번호 37)

클론 41

5'-CTTTCTCAATCGACATCAACTTCAGTTGAACAGCTGG C T-3' (서열번호 38)

(상기 밑줄 친 굵은 글자는 클론 37과 다른 부위를 의미함)

Lin28B 그룹 1

클론 9

5'-TCTTCTCATTCGACATCAACGTTCAGTTGAACAGCTGGTTC-3' (서열번호 39)

클론 12

5'- C CTTCTCA A TCGACATCAAC - TTCAGTTGAACAGCTGGTTC-3' (서열번호 40)

클론 29

5'- CT TTCTCA A TCGACATCAAC - TTCAGTTGAACAGCTGGTTC-3' (서열번호 41)

클론 32

5'- C CTTCTCA A TCGACATCAAC - TTCAGTTGAACAGCTGGT A C-3' (서열번호 42)

클론 19

5'-TCTTCT - A A TCGACATCAAC - TTCAGTTGAACAGCTGG C TC-3' (서열번호 43)

(상기 밑줄 친 굵은 글자는 클론 9와 다른 부위를 의미함)

Lin28B 그룹 2

클론 33

5'-GCCGTTTTGGCGCGGGAGGATAATATTGAACTGCCTTAAC-3' (서열번호 44)

Lin28B 그룹 3

클론 45

5'-CCGTTTAATCGGTTTGGCTGAGGATTTCTTACTTTTCGCTCAC-3' (서열번호 45)

본 발명에서는 Lin28이라는 표적 물질을 이용하여 그에 결합하여 길항체(antagonist)로 작용하는 치료적 목적의 앱타머 개발에 초기 목적을 두고 실험을 수행하였다. 기존에 알려진 바에 의하면 Lin28이라고 불리우는 이 RNA 결합 단백질(RNA Binding Protein, RBP)는 초기 암(primary cancer)에서 과발현 되어있는 양상이 발견되어 왔기 때문이다. 이러한 이유로 이에 대한 RNA 앱타머를 생체내에서, 특히 Lin28 발현율이 높은 암세포 내에서 발현시켜서 Lin28의 기능을 억제한다고 한다면 암 억제자 miRNA(tumor suppressor miRNA)로 알려진 let-7 miRNA의 발현을 증가시킴을 통해서 이 miRNA의 타겟인 mitotic signaling에 관여하는 RAS, 세포 주기에 관여하는 HMGA2 등의 암 증식에 관여되는 요소들을 조절하여 암 증식을 억제할 수 있을 것으로 예상하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Lin28에 결합능을 갖는 RNA를 개발한 결과 Lin28A의 경우에는 총 2개의 유사 서열을 가진 그룹과 Lin28B경우는 총 3개의 유사서열 가진 그룹을 얻을 수 있었다. 이 그룹들의 대표 서열을 가지고 있는 각각의 클론을 이용하여 qRT-PCR과 EMSA를 통해 단일 클론으로 결합하는 정도를 확인해 보았을 때 유일하게 Lin28A 그룹 1에 속하는 클론 7만이 두 실험 결과에서 높은 친화력으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해서 클론 7이 과연 앱타머라고 말할 수 있는 특이적인 결합을 하는 것인가를 확인하기 위해서 클론 7과 library RNA와 Pre-let7a-1에 α-³²p label한 RNA와 하지 않은 RNA 두 종류의 RNA를 제작하였고, 이를 통해서 competition assay를 수행하여 클론 7이 자신과 동일한 RNA를 통해서 competition한다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 클론 7이 특이적인 결합을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 클론 7 앱타머의 2차 구조를 유지하되 Lin28에 결합할 수 있는 최소 크기의 RNA로 최소화(Minimization)를 진행하였고, 무작위 서열 부분의 구조를 유지하는 최소 45 mer의 크기의 RNA를 만들었다.

이 최소화를 거친 앱타머를 이용하여 Full-length aptamer와 Lin28 패밀리에 결합하는 패턴과 정도에 변화가 있는지를 확인하기 위해 EMSA를 수행하였고 이를 통해서 최소화를 거친 앱타머와 최소화 앱타머(minimized aptamer)의 표적에 결합하는 패턴과 정도가 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었다. 또한 이 실험을 수행하면서 Lin28B에 대한 결합력도 같이 확인하였다. 결과적으로 Lin28A에 특이적인 이 앱타머가 같은 패밀리에 속해 있는 Lin28B에도 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 Lin28A와 Lin28B의 상동적인 서열이나 구조에 의해서 이 앱타머가 결합을 하는 것이라는 것을 예상할 수 있었다. 하지만 이 앱타머의 minimized form의 경우에는 Lin28B에서 Full-length에 비해 약한 결합력을 확인할 수 있었다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 앱타머가 Lin28의 어느 도메인이나 모티프를 표적으로 하는 것인가에 대한 실험을 수행하였다. Lin28은 RNA 결합 단백질(RNA Binding Protein)로서 RNA가 결합할 수 있는 하나의 도메인(Cold shock domain)과 한 쌍의 모티프(Zinc finger motif)를 가지고 있기 때문에, 우선 Lin28 패밀리의 truncated form의 단백질을 정제하기 위한 실험이 선행하였다. Truncated form의 단백질은 우선 저온자극도메인(cold shock domain, CSD)만을 가지는 form과 한쌍의 아연 핑거 모티프(Zinc finger motif, ZFM)만을 가지는 form 그리고 CSD부터 ZFM까지만을 포함하는 form을 제작하고 정제하여, 해당 단백질을 이용해서 전과 동일한 실험 방법인 EMSA를 통해서 결합패턴을 확인하였다. 이를 통해 최소화 앱타머와 Full-length aptamer가 저온자극도메인만을 가지는 mutant form의 단백질에 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이 결과가 저온자극도메인이 가지는 구조에 의한 결합인지 단순 서열인식으로 인한 결합인지 확인할 수 없었기 때문에 앱타머를 2'-F에서 2'-OH 형태의 RNA로 새롭게 만들어서 RNA의 2차 구조에 변화를 주었고 이를 이용해 같은 실험을 다시 진행해 보았다. 그 결과로 이 변화를 준 RNA의 경우에도 같은 패턴의 결합을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 발굴한 앱타머의 특정 서열에 의해서 Lin28 패밀리의 저온자극도메인에 결합한다는 것을 명확히 확인하였다.

본 발명의 저온자극도메인에 결합하는 앱타머를 이용하면, Lin28 패밀리 단백질의 도메인별 기능, 특히 저온자극도메인의 기능을 연구하는 측면에서 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 저온자극도메인에 특이적으로 결합하는 앱타머는 본 발명자들이 처음으로 발명해내었다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 기존 Lin28에 결합하는 앱타머들의 결합패턴을 확인하였다. Lin28에 결합하는 것으로 확인된 6개 클론을 각 도메인과 모티프 construct에 결합시켜서 EMSA로 확인하여 보았을 때 Lin28A에만 결합하고 어느 도메인이나 모티프에도 결합하지 않는 클론 2개와 Lin28A/28B 두 단백질에 결합을 하지만 어느 도메인이나 모티프에 결합하지 않는 클론 4개와 본 발명에서 발굴한 Lin28A/28B 두 단백질에 결합하고 또한 그 단백질에 포함되어 있는 저온자극도메인에 결합하는 클론 1개를 확인하였다. 이를 통해서 3가지 패턴을 가지는 앱타머군을 확인할 수 있었고, 이 앱타머는 후에 다른 메카니즘 연구(mechanism study)나 여러 실험에서 유용한 도구가 될 수 있을 것이라고 생각이 된다.

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 앱타머로 인한 Let-7 miRNA processing을 증가시키기 위해서 앱타머를 세포 내에서 cytoplasm에서 발현할 수 있도록, 7SL 벡터 시스템에 앱타머를 클로닝하여 construct를 제작하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 앱타머의 본연 목적인 목적 단백질과 결합하는 특정 서열을 활용한 목적 단백질과 다른 알려지지 않는 분자와의 상호관계를 밝히는 실험을 수행하였다. 우선 앞에서 언급하였던 앱타머 군 7개의 무작위 서열 부분을 blast search와 miRbase web site를 이용하여 유사한 서열을 포함하는 예측되는 표적들을 찾아보았고, 이를 통해서 candidate를 찾아내었다(도 16). 이렇게 찾아낸 후보군으로 miR-340이 검색되었으며, miR-340의 경우는 Lin28의 본연의 기능이 let-7 miRNA processing에 관여하기 때문에 Lin28에 의해 processing이 억제되는 새로운 miRNA가 될 수 있을 것으로 사료된다. Lin28에 의하여 조절되는 miRNA 후보군은 많이 발표되었으나, 그 중에서 miR-340은 언급된 적이 없었고, let-7 이외에 어떤 miRNA가 Lin28에 의해 영향을 받는다는 것도 알려진 바 없다. 이에, miR-340과 Lin28이 결합하는지를 EMSA를 통해서 확인해 본 결과, in vitro에서는 결합하는 것을 확인하였다(도 17). 이에 따라, 본 발명의 RNA 앱타머가 Lin28의 억제를 통하여 let-7 이외에 miR-340 또한 조절할 것으로 보이며, miR-340은 침입(invasion)과 이동(migration)에 역할을 한다는 것이 알려져 있어, 암 질환의 진행 및 암 전이와 관련되어 효과를 가질 것임을 예측할 수 있다(도 18).

즉, 정리하면 본 발명에서는 Lin28 과발현된 조직이나 세포에서 let-7 processing을 활성을 증가시킬수 있는 Lin28의 antagonist로서의 RNase-resistant aptamer를 발굴하는 것을 초기 목적으로 해 실험하여 앱타머를 선별해 내었고, 이 앱타머가 Lin28의 저온자극도메인 특이적 결합을 한다는 것을 밝혔다. 또한, 선별해낸 앱타머의 서열을 이용해서 새로운 Lin28의 표적을 선별하는 실험을 수행하였고, 그 candidate로 miR-340을 예측할 수 있었다.

본 발명의 RNA 앱타머는 2'-플루오린 개질 RNA(2'-fluorine-modified RNA)를 포함하여 각종 핵산 분해 효소에 저항성을 가지는 것일 수 있으며, 특히 각종 nuclease 및 RNase A에 대하여 저항성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 RNA 앱타머는 2'-히드록실 재질 RNA(2'-OH RNA)를 포함하여 세포 내로 RNA 앱타머를 발현할 수 있는 DNA 벡터로 도입 가능함으로써, 앱타머 효능을 꾀할 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 암 진행시 증가되는 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "Lin28A 또는 Lin28B 단백질"은 이미 진행된 암에 존재하며, 정상 세포를 암세포 상태로 전환하는 단백질을 말한다. 배아 줄기세포에 풍부하게 존재하는 Lin28 단백질은 암의 진행을 진단하는 새로운 표적에 해당한다. Lin28 단백질은 let-7로 알려진 종양을 억제하는 마이크로 RNA(microRNA)를 조절하므로, 이에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 암을 진단하는 조성물 및 암을 예방하거나 치료하는 약학 조성물의 개발에 이용될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명자들은 Lin28A 또는 Lin28B와 앱타머의 결합력을 테스트하기 위해 앱타머와 pre-let7a 결합력을 측정하였고, 높은 결합력을 확인하였으며, 또한 컴피티션 어세이(competition assay)를 통해 Lin28A 또는 Lin28B와 앱타머가 특이적인 결합임을 확인하였으며, 또한 동위원소로 표시된 Lin28A와 앱타머의 결합이 control보다 월등하게 결합함을 확인함으로써, 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하여 Lin28A 또는 Lin28B의 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 발병 여부 또는 암의 진행 정도를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단용 조성물은 암을 가진 개체와 정상 개체에서 발현에 차이가 있는 단백질 마커인 Lin28을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 키트는 개체가 암인지 아닌지를 구별하여 진료 행위자가 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하게 하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 암 진행시 증가되는 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명의 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 이용하여 암의 발병 또는 진행을 진단할 수 있는 마커 단백질인 Lin28 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다. 본 발명의 진단용 키트에는 본 발명의 Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 암 진단용 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 추가로 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리할 수 있는 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 Lin28A 또는 Lin28B와 결합할 수 있는 상술한 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물을 제공한다.

암이 심각하게 진행된 경우, 체내에서 Lin28A 또는 Lin28B의 발현량이 증가하고, pri-let7, pre-let7의 양은 변화가 없으나 성숙한 let7의 양만 감소함을 알 수 있는데, Lin28A 또는 Lin28B의 발현량이 증가되면, pre-let7의 가공과정의 진행을 억제하여 성숙한 let7의 양이 감소하게 되는 것으로 알려져 있다. 이때, Lin28A 또는 Lin28B의 발현을 억제하거나 또는 이미 발현된 Lin28A 또는 Lin28B의 기능을 불활성화 시키면, 이에 의하여 성숙한 let7의 양이 증가하고, 결과적으로는 암 치료 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 10 내지 95 중량%로 본 발명의 RNA 앱타머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피하내 경로를 통해 통상적인 방식이 가능하다. 이때, 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하다.

본 발명 암 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 치료제의 RNA 앱타머의 유효량은 세포내 농도가 1 nM 내지 1000 nM, 바람직하게는 100 nM 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 암을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 방법 또는 화합물과 병용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물과 병용될 수 있는 방법 또는 화합물은 종래 암 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 화합물로서는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 조성물과의 병용은 항암제의 종류 및 양에 따라 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 수행될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 질환은 암 질환일 수 있다. 상기 암 질환은 이에 제한되지는 않으나, 흑색종, 백혈병, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 피부암, 림프종, 재생불량성 빈혈 등을 포함한다. 상기에서 림프종은 호지킨씨 림프종 및 비호지킨씨 림프종을 모두 포함하며, 전구B세포종양(Precursor B-cell neoplasm)과 같은 B세포신생물(B-CELL NEOPLASMS), 전구T세포종양(Precursor T-cell neoplasm)과 같은 T세포와 NK세포 신생물(T-CELL AND NK-CELL NEOPLASMS) 및 전형적호지킨병(Classical Hodgkin lymphoma)와 같은 호지킨림프종(Hodgkin lymphoma, Hodgkin disease)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 Lin28A 또는 Lin28B와 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 Lin28A 또는 Lin28B와 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법은 상기 선별한 RNA 앱타머에 포함된 공통된 염기서열을 도출하는 단계; 상기 도출된 공통의 염기서열을 DNA/RNA 데이터베이스에 조회하여 상기 공통된 서열을 포함하는 새로운 유전자 단편을 검색하는 단계; 및, 검색된 유전자 단편의 Lin28A 또는 Lin28B와의 상호작용 활성을 측정하여 Lin28A 또는 Lin28B와 상호작용하는 유전자 단편을 선발하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 암이 의심되는 개체의 시료로부터 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하여 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, Lin28A 또는 Lin28B 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 Lin28A 또는 Lin28B의 양을 측정하는 암이 의심되는 개체의 시료는 생체 내 및 생체 외, 분리된 시료 등을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 검출하는 방법은 본 발명의 암진단용 키트를 이용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하는 한 상기에 제한되지 않고 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 수행될 수 있다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 Lin28의 발현 수준을 암 의심 개체에서의 발현 수준과 비교함으로써, 암 의심 개체의 실제 암 발병 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다. 즉, 상기 양자에서 Lin28의 발현 수준 수준을 비교한 후, 암 의심 개체에서 Lin28의 발현 수준이 정상 대조군의 것보다 높을 경우 암이 발병된 것으로 예측할 수 있는 것이다.

즉, 본 발명은 암이 의심되는 개체의 시료로부터 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하여 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 발병 여부에 대한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 Lin28A 또는 Lin28B와 결합할 수 있는 상술한 RNA 앱타머를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 개체는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 앱타머로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다. 본 발명의 앱타머를 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 RNA 앱타머를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 RNA 앱타머는 Lin28A와 Lin28B 단백질 모두에 결합하며 특히 저온자극도메인에 효과적으로 결합하는 특징을 가지므로, 상기 단백질의 기능 연구에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 상기 단백질이 발현되는 암의 진단 또는 치료에도 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 Lin28 단백질이 let7 miRNA의 생성과정 중 미치는 영향에 관한 모식도이다.
도 2는 재조합 단백질을 추출하기 위한 Lin28A 또는 Lin28B 발현벡터로 pQE-80L 벡터에 클로닝 모식도이다.
도 3은 Lin28A 또는 Lin28B 단백질을 효율적으로 추출하기 위해 인덕션 테스트를 수행한 결과를 나타내는 도이다((a) Lin28A 단백질 (b) Lin28B 단백질).
도 4는 let7 miRNA 패밀리의 생물학적 기능을 정리한 모식도이다.
도 5는 Lin28에 특이적인 RNA 앱타머를 수득하는 과정에 대한 모식도이다.
도 6은 Lin28에 특이적인 RNA 앱타머를 수득하는 과정으로 도 6의 A는 무작위 40 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 라이브러리 template를 나타낸 모식도이고, 도 6의 B는 인간 피부에서 발견되는 nucleases 및 RNase A에 완벽한 저항성을 갖는 2'-fluorine-modified RNA 전사체를 표현하고 있으며, 도 6의 C는 RNA 앱타머의 in vitro selection 전략을 나타낸 모식도이다.
도 7은 Lin28(이른바 Lin28A)에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 7의 A는 Lin28A에 특이적인 앱타머를 그룹별로 나누어 그룹별 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도이며, 도 7의 B는 각 그룹의 주 RNA의 2차 구조를 나타낸 도면으로, 빨간 선으로 표현된 부분은 무작위 40 뉴클레오티드 부분이다.
도 8은 Lin28B에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 8의 A는 Lin28B에 특이적인 앱타머를 그룹별로 나누어 그룹별 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도이며, 도 8의 B는 각 그룹의 주 RNA의 2차 구조를 나타낸 도면으로, 빨간 선으로 표현된 부분은 무작위 40 뉴클레오티드 부분이다.
도 9는 선별된 RNA 앱타머의 Lin28에 대한 특이성을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 9의 A는 RNA 앱타머의 Lin28에 대한 결합력을 측정한 정량성 RT-PCR를 나타낸 도이며, 도 9의 B는 재조합 Lin28의 증가되는 농도(20 nM, 40 nM)와 Sel'3 프로브(서열번호 13)를 이용한 EMSA의 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 in vitro 컴피티션 어세이(competition assay)를 통하여 Lin28 특이적 앱타머(클론 7)의 결합능을 확인한 도이다. 구체적으로, 도 10의 A는 ³²P-isotope 표지 RNA(클론 7), 비표지 경쟁 RNA (pre- let7a-1, 클론 7)를 통해 경쟁적 컴피티션 어세시 결과를 보여준 도이며, 도 10의 B는 ³²P-isotope 표지 RNA(클론 7), 비표지 경쟁 RNA (library, 클론 7)를 통해 경쟁적 컴피티션 어세이 결과를 보여준 도이다.
도 11은 클론 7의 Lin28에 대한 앱타머를 최소화하는 것을 표현한 도로, 클론 7 앱타머의 in vitro 또는 in vivo 예상 2차 구조를 나타낸 모식도이다.
도 12는 클론 7에 대하여 최소화한 앱타머가 목적 단백질 패밀리에 결합하는지를 확인한 도이다.
도 13은 앱타머가 결합하는 Lin28의 부위를 확인하기 위하여 2'OH/2'F 앱타머를 이용하여 확인한 도이다. 구체적으로, 도 13의 A는 부위를 확인하기 위해 제조한 Lin28의 mutant form을 도식화한 도이고(NLS는 nuclear localization signal이다), 도 13의 B는 결합한 도메인/모티프 또는 전장 단백질을 확인한 도이다.
도 14는 클론 7 앱타머가 Lin28의 저온자극도메인에 특이적으로 결합하는지를 확인한 도이다. 도 14의 A는 클론 7-특이적 프라이머를 프로브를 이용한 EMSA 결과를 나타낸 도이고, 도 14의 B는 동일한 서열을 가지는 2'OH 앱타머를 이용한 EMSA 결과를 나타낸 도이다.
도 15a는 전체 선택된 앱타머의 앱타머 결합 도메인 스크리닝 결과를 나타낸 도이다. 전체 선택된 앱타머 중 Lin28A 2'OH 앱타머(그룹 1, 2, 3; A1, A2, A3)에 대한 도메인 스크리닝 결과이다.
도 15b는 전체 선택된 앱타머의 앱타머 결합 도메인 스크리닝 결과를 나타낸 도이다. 전체 선택된 앱타머 중 Lin28B 2'OH 앱타머(그룹 2, 3, 4; B2, B3, B4), 및 Lin28A 2'F 앱타머(그룹 1; A4)에 대한 도메인 스크리닝 결과이다. 앱타머 A1(Lin28 2'OH 그룹 1) 및 B1(Lin28B 2'OH 그룹 2)은 동일한 무작위 서열의 40 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다.
도 16은 Lin28 앱타머 서열에 의한 Lin28의 새로운 타겟 예측 결과를 나타낸 도로, miR-340을 나타낸 도이다.
도 17은 Lin28의 타겟으로 예측된 miR들의 Lin28 결합여부를 EMSA로 확인한 도면으로, 구체적으로는 알려지지 않은 새로운 타겟인 miR-340과 miR-3655과 알려진 타겟인 let-7, 타겟이 아닌 것으로 알려진 miR-122(대조군)으로 수행한 EMSA 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 Lin28과 miR-340의 관계에 대한 가설을 나타낸 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: PCR

Lin28A 또는 Lin28B 유전자가 각각 포함되어 있는 pET28a-Lin28, pET28a-Lin28B 플라스미드(plasmid) DNA를 서울대학교의 김빛내리 교수님께 제공을 받았다. 플라스미드 DNA에서 Lin28A 또는 Lin28B 유전자를 얻어내기 위해 다음과 같은 조건으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. Lin28A의 경우 주형 플라스미드 DNA 10 ng, 5' 프라이머 100 nM (5'-CGCGGATCCATGGGCTCCGTGTCC-3', 서열번호 46), 3' 프라이머 100 nM (5'-CCCAAGCTTTCAATTCTGTGCCTCCGG-3', 서열번호 47), 5X HF buffer 20 ㎕, 200 μM dNTP, Phusion Taq 폴리머라아제(Finnzyme) 0.4 unit을 혼합하고 총량 100 ㎕ 부피로 수행하였다. Lin28B의 경우 주형 플라스미드 DNA 10 ng, 5' 프라이머 100 nM (5'-CGCGGATCCATGGCCGAAGGCGGGGC-3', 서열번호 48), 3' 프라이머 100 nM (5'-CGCGGATCCTCCCAGGTCAGCTACTGC-3', 서열번호 49), 5X HF buffer 20 μl, 200 μM dNTP, Phusion Taq 폴리머라아제 0.4 unit을 혼합하고 총량 100μl 부피로 수행하였다. PCR 조건으로는 95 ℃ 30초, 58 ℃ 30초 72 ℃ 1분의 조건으로 35 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72 ℃ 7분으로 수행하여 Lin28 유전자를 얻었다.

한편, 본 발명에서 사용한 프라이머와 DNA 주형 서열은 하기 표 1에 정리하였다.

서열번호	이름	서열(5' -> 3')	용도
1	5'-Lin28A CSD(BamHⅠ)	5'-CGCGGATCCCACGGTGCGGGCATC-3'	단백질 construct
2	3'-Lin28A CSD(SalⅠ)	5'-GTCGACTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGGTCCGGTGACACGG-3'
3	5'-Lin28B CSD(BamHⅠ)	5'-CGCGGATCCCGCGGAACTGGCCAC-3'
4	3'-Lin28B CSD(SalⅠ)	5'-GTCGACTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGGTCCTGTTACCCG-3'
5	5'-Lin28A ZFM(BamHⅠ)	5'-CGCGGATCCGACAGGTGCTACAAC-3'
6	3'-Lin28A ZFM(SalⅠ)	5'-GTCGACTCACAGCGGACATGAGGC-3'
7	5'-Lin28B ZFM(BamHⅠ)	5'-CGCGGATCCGATAGATGCTACAAC-3'
8	3'-Lin28B ZFM(SalⅠ)	5'-GTCGACTCAATGTGGGCAGTTTGCC-3'
9	Sel-5'(T7 promoter)	5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3'	selection
10	Sel-3'	5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'
11	N40 template	5'-GCGGAAGCGTGCTGGGCC-N₄₀-CATAACCCAGAGGTCGAT-3'
12	Sel-5'(cloning)	5'-GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3'	Pool cloning
13	Sel-3'(5'-biotin)	5'-biotin-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'	probe
14	Clone7 probe	5'-TGTCGCGGCCTTTCACTTACGGCTCTCAC-3'	probe
15	Clone7 60mer F	5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGGGTCGTGTGAGAGCC-3'	truncated aptamer synthesis
16	Clone7 45mer F	5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTGTGAGAGCC-3'
17	Clone7 Middle	5'-TTGTCGCGGCCTTTCACTTACGGCTCTCACA-3'
18	Clone7 60mer R	5'-CTGGGTTATGTCCGATCTTTGTCGCGGC-3'
19	Clone7 45mer R	5'-GTGTCCGATCTTTGTCGCGGC-3'
20	Hsa-Pre-miR-340 F	5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGTACCTGGTGTGATTA-3'	new- target selection
21	Hsa-Pre-miR-340 M1	5'-CGACATATGACAATCAGTCTCATTGCTTTATAATCACACC-3'
22	Hsa-Pre-miR-340 M2	5'-CTATAAAGTAACTGAGACGGATCCCACAAACGACATATGA-3'
23	Hsa-Pre-miR-340 R	5'-TAAGATACCAGGTATGGCTATAAAGTA-3'
24	Hsa-Pre-miR-3655 F	5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTTGTCGCTGCGGTGTTGC-3'
25	Hsa-Pre-miR-3655 M	5'-TTTCGCTGTCACCAACAATCGAGTCTCCAACAGCAACACCGC-3'
26	Hsa-Pre-miR-3655 R	5'-ACTATCTCGCTCCGGCATTTTGTTATC GTTCTTTCGCTGTC-3'
27	Hsa-Pre-let-7a-1 F	5'-TAATACGACTCACTATAGGGTCGGATGAGGTAG-3'
28	Hsa-Pre-let-7a-1 R	5'-CCTAGGAAAGACAGTAGATTGTATAGTT-3'
29	Hsa-Pre-miR-122 F	5'-TAATACGACTCACTATAGGGCCTTAGCAGAGCTG-3'
30	Hsa-Pre-miR-122 R	5'-GCCTAGCAGTAGCTATTTAG-3'
31	Hsa-Pre-let-7a-1 template	5'-GTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGGGTCACACCCACCACTGGGAGATAACTATACAATCT-3'
32	7SL-N40 aptamer F	5'-ACGCGTCGACGGGAGAGCGGAAGCGTGC-3'	transfection
33	7SL-N40 aptamer R	5'-GCTCTAGAGGGGGGATCCATCGACCT-3'	transfection

실시예 2: 클로닝 및 시퀀싱

실시예 1의 과정을 통해 얻어진 DNA의 단백질을 발현시키기 위해서 다음 과정을 거쳐 단백질 발현 벡터인 pQE-80L 벡터에 클로닝하였다. Lin28의 경우 벡터와 Lin28 DNA를 BamHⅠ (Roche)으로 자른 후 페놀 추출(phenol extraction)과 에탄올 침전(ethanol precipitation)과정을 거친 후 HindⅢ (Roche)로 다시 잘라주었다. Lin28B의 경우 벡터와 Lin28 DNA를 BamHⅠ으로 자른 후 벡터 DNA를 알카라인 포스파테이스(alkaline phospatase(NEB))를 처리하였다. 이 과정을 통해 얻어진 DNA를 T4 DNA 라이게이즈(ligase(Roche)) 5 unit을 이용하여 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 반응물을 BL21(DE3)PlysS 대장균에 42 ℃에서 90초 동안 충격을 주는 방법을 통해 형질전환시킨 후 앰피실린(ampicillin)이 50 ㎍/ml 농도로 만든 아가 플레이트에 스프레딩하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 콜로니(colony)를 접종하여 미니-프리퍼레이션(mini-preparation) 방법을 통하여 플라스미드 DNA를 얻고, Lin28A의 경우 BamHⅠ과 HindⅢ를 이용하여 Lin28A 유전자가 들어가 있는 클론을 얻었고, Lin28B의 경우 BamHⅠ을 이용하여 유전자가 들어가 있는 클론을 얻었다(도 2). 얻어진 클론들을 시퀀싱 (ABI PRISM 310 genetic analyzer)을 통해 정확한 염기 서열인지를 확인하였다.

도 2는 재조합 단백질을 추출하기 위한 Lin28A 또는 Lin28B 컨스트럭의 모식도로서, 상기 도 2와 같이 pQE-80L 벡터에 Lin28A 또는 Lin28B 유전자가 들어있는 발현벡터를 얻을 수 있었다.

실시예 3: 인덕션 테스트

실시예 2에서 pQE-80L에 클로닝한 발현벡터를 포함하는 BL21(DE3)PlysS 형질전환 대장균을 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 포함되어 있는 5 ㎖ LB 배지 (1 % tryptone, 1 % sodium chloride, 0.5 % yeast extract)에 접종하여 16시간 동안 배양하였다. 30 ㎖의 LB 배지에 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 첨가한 후 16시간 배양한 5 ㎖ 배지를 300 ㎕ 다시 접종하였다. OD 600 값이 0.6이 되면 멸균된 1.5 ㎖ 마이크로-튜브에 각각 1 ㎖씩 분주한 후 IPTG (Isopropylthio-β-D-Galactoside) 농도(0, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM)와 시간(30분, 1, 2, 4시간), 온도 조건(37 ℃)을 달리하여 배양을 통해 인덕션 테스트를 수행하였다. 각 조건의 인덕션이 끝나면 각각의 튜브를 13000 rpm에서 1분 동안 원심 분리 후 상층 액을 제거하고 H₂O 100 ㎕를 넣고 침전물을 풀어 이 중 20 ㎕를 덜어내어 5X 단백질 샘플 버퍼 (250 mM Tris-Cl, pH 6.8, 10 % SDS, 1 % Brommophenol blue, 50 % Glycerol, 5 % β-mercaptoethanol) 5 ㎕를 섞은 후 끓는 물에 5분 동안 끓인다. 아이스에서 5분 정도 식힌 후 15% SDS-PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) 겔에 2시간 30분 동안 내린다. 겔을 분리한 후 단백질 스테이닝 버퍼 용액 (45 % Methanol, 10 % Glacial acetic acid, 45 % H₂O, 0.025 % Coomassie Brillian Blue R-250)으로 3시간 동안 스테이닝(staining) 한 뒤 단백질 디스테이닝 버퍼 용액(desaining buffer solution, 50 % Methanol, 10 % Glacial acetic acid, 40 % H₂O)으로 디스테이닝하여 밴드를 확인하였다(도 3).

도 3은 상기의 방법으로 단백질의 발현량이 가장 좋은 조건을 선별하기 위한 결과로, 상기 도 3a에서 보듯이 Lin28A 단백질은 IPTG농도 0 mM에서 0.8 mM까지, 1시간에서 4시간까지 37℃에서 수행하였고, 상기 도 3b에서 보듯이 Lin28B 단백질은 IPTG 농도 0mM에서 0.8 mM까지, 30분에서 4시간까지 37 ℃에서 수행하여, Lin28A의 경우 37℃ 2시간 IPTG 0.1 mM의 농도를, Lin28B의 경우 37℃ 4시간 IPTG 0.1 mM의 농도를 최적의 조건을 선별하였다.

실시예 4: Lin28A 및 Lin28B 단백질 정제

4-1. Lin28A 및 Lin28B 단백질 수득

50 ㎍/㎖ 앰피실린이 포함되어 있는 LB 배지에 실시예 2에서 pQE-80L 벡터에 클로닝한 Lin28A 또는 Lin28B 발현벡터를 포함하는 형질전환 대장균을 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 포함되어 있는 LB 배지 1ℓ에 10 ㎖ 다시 접종하여 O.D 600값이 0.6이 되면 실시예 3의 조건으로 인덕션을 수행하였다. 인덕션한 E. coli는 4 ℃ 8000 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물은 -80 ℃에서 16시간 이상 보관하였다.

이 침전물을 15 ㎖ 용해 완충액(lysis buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM Imidazole)에 잘 풀어준 다음 100 ㎎/㎖ lysozyme을 넣어 30분 동안 ice에서 반응시키고, 10분마다 vortexing하였다. 그 후 15 mL 튜브에 각각 7.5 ㎖씩 나눠 담고 70% amplitude로 10초씩 10회 sonication하였다. 4℃ 11500 rpm으로 30분간 원심분리시킨 후 상층액을 50 ㎖ 튜브로 옮겼다.

한편, Ni-NTA-agarose bead(QIAGEN) 500 ㎕를 micro-tube에 넣어 13000 rpm으로 10초 동안 원심분리시켰다. 상층액은 버리고 용해 완충액 500㎕에 풀어주는 것을 3회 반복하였다. 세척이 끝난 비드는 sonication 후 원심 분리한 상기 상층액과 혼합하여 2시간 동안 10 rpm의 속도로 4℃에서 단백질과 비드를 결합시켰다. Polypropylene column(QIAGEN)에 혼합물을 흘려주면서 흘러나온 용액(flow through, FT)을 얻어 보관하고 세척 완충액(washing buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10 mM imidazole) 50 ㎖를 흘려주어 비특이적으로 결합되어 있는 단백질을 제거하였다. 세척 과정이 끝난 비드에 용출 완충액1(elution buffer1; 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 100 mM imidazole), 용출 완충액2(elution buffer2; 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM -mercaptoethanol, 200 mM imidazole)을 1 ㎖씩 차례대로 흘려주어 각각 3 바이얼씩 용출액을 마이크로- 튜브에 받아 보관하였다. 용출한 용액을 각각 16㎕씩 덜어 12% SDS-PAGE에 걸어 확인하였다.

4-2. Lin28A 및 Lin28B 단백질 투석

멤브레인 포어 크기(Membrane pore size)가 3.5 kDa인 투석 막(dialysis membrane, cellu sep)을 10 cm 정도로 잘랐다. 증류수 50 mL에 막을 불려 투석에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

상기 활성화시킨 투석 막의 아래쪽에 closure (spectrom)로 막은 다음 tube 안쪽에 상기 실시예 4-1에서 수득한 Lin28A 단백질 또는 Lin28B의 단백질을 넣는다. 단백질을 모두 넣으면 용액이 빠져나가지 않게 closure로 막은 다음 1000배 부피의 투석 완충액(dialysis buffer; 20 mM Potassium phosphate(PH8), 100 mM NaCl, 50% 글리세롤, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.02 % Sodium azide) 용액 안에 담갔다. 16시간 동안 4 ℃에서 회전시키면서 투석한 다음 다시 동량의 투석 완충액으로 바꿔주고 16시간 동안 회전시키며 투석시켰다. 투석을 마치면 closure를 조심스럽게 열고 단백질 용액을 모두 얻은 후 -80 ℃에 얼려 보관하였다.

실시예 5: 단백질 정량

1 ㎍/㎕인 BSA (Bovine Serum Albumin) 단백질 (CALBIOCHEM)을 농도 별로 (0, 1, 2, 4, 8 ㎍) 준비하고 측정하고자 하는 투석 완료된 실시예 4-2의 단백질을 준비하였다. 이 모든 단백질 용액에 bradford solution 200㎕를 섞은 후 1시간동안 상온에서 반응시킨다. 이렇게 반응시킨 용액은 595 nm로 파장이 변한 정도를 UV spectrophotometer (Smart Spec 3000 / BMS)로 측정하여 단백질 양을 정량하였다.

실시예 6: DNA 라이브러리의 제조

RNA 라이브러리 제조를 위해 40개의 무작위 염기서열이 포함되어 있는 76 mer의 단일 올리고뉴클레오티드(5'-GCGGAAGCGTGCTGGGCC-N₄₀-CATAACCCAGAGGTCGAT-3', 서열번호 11)를 주형으로 사용하여 5' 프라이머(서열번호 9)와 3' 프라이머(서열번호 10)로 PCR을 통해 이중나선 DNA 라이브러리를 제조하였다. 5'-프라이머는 T7 RNA 중합효소를 이용해 RNA를 만들어 내기 위한 T7 RNA 중합효소 프로모터 염기서열과 BamHⅠ 제한효소 염기서열이 포함되어 있고, 3'-프라이머에는 BamHⅠ 제한효소 염기서열이 포함되어 있다.

119bp의 DNA 라이브러리 주형은 100 nM DNA 올리고뉴클레오티드, 100 pmole 5' 프라이머(서열번호 9), 100 pmole 3' 프라이머(서열번호 10), 100μM dNTP, 10X Dynazyme 버퍼 10㎕, 3 unit DyNazyme Taq 폴리머라제 (Finnzyme)을 혼합하여 95 ℃ 5분을 먼저 진행한 후, 95 ℃ 30초, 58 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 10 cycle을 반복한 뒤, 마지막으로 72 ℃ 7분으로 DNA 라이브러리를 제조하였다.

실시예 7: RNA 라이브러리의 구축

7-1. RNA 라이브러리 제조

실시예 6의 과정에서 얻어진 DNA 라이브러리를 주형으로 하여 시험관내 전사과정을 통해 다양한 염기서열을 갖는 RNA 라이브러리를 제조하였다. 특히, RNase 저항성 RNA 라이브러리를 만들기 위해 Durascribe T7 transcription kit을 사용하였고, 전사는 DNA 라이브러리 1 ㎍, 10x 반응 완충액 2 ㎕, 5 mM ATP, GTP, 2'F CTP, 2'F UTP, 10 mM DTT, Enzyme mixture 2 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 16시간 이상 반응시켰다.

7-2. RNA 라이브러리 용출

상기 실시예 7-1을 통해 얻은 RNA를 페놀 추출과 에탄올 침전을 하여 10 ㎕의 DEPC-H₂O에 용해시켰다. 동량의 변성 RNA 로딩 다이(95 % deionized formamide, 5 mM EDTA, 0.025 % Bromophenol blue, 0.025 % Xylene cyanol, 5 mM EDTA)를 섞은 뒤 95 ℃에서 5분간 변성시키고 아이스에서 10분간 냉각시켰다. 변성된 RNA를 8M urea - 8 % polyacrylamide gel에서 180V로 전기 영동하여 분리한 다음 정확한 RNA 크기의 밴드를 잘라서 400 ㎕의 용출 완충액(elution buffer; 0.5 M Ammonium acetate, 1 mM EDTA, 0.2 % SDS)에 넣고 37 ℃에서 3시간 동안 용출하였다. 용출된 RNA는 페놀 추출과 에탄올 침전을 통해 정제한 후 UV spectrometer(Biomate3 / Thermo)로 정량하였다.

실시예 8: 컨퍼메이션 테스트( Confirmation test )

이로부터 Lin28A 또는 Lin28B에 결합하는 것으로 확인하여 수득한 RNA에 10 pmole 3' 프라이머(서열번호 10)를 넣고, 65 ℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 RNA와 3' 프라이머를 결합시켰다. 1 mM dNTP, 2X RTase 완충액, 200 unit M-MLV RTase(Promega)를 첨가하여 42 ℃에서 1시간 반응한 뒤 95 ℃에서 5분간 RTase를 불활성화시켰다. 역전사 시킨 단일 DNA 중 1/10만 PCR 주형으로 사용하였다. 실시간 양을 측정하기 위해 Real-time PCR (Rotor Gene RG-6000)을 다음과 같은 조건으로 사용하였다. cDNA, 10 pmole 5' 프라이머(서열번호 9), 10 pmole 3' 프라이머(서열번호 10), 10X PCR 완충액 10 ㎕, 100 μM dNTP, 5X RTase 완충액 10 ㎕, 10X Syber green, 3 unit DyNAzyme 폴리머라아제 (Finnzyme)을 혼합하여 처음 95 ℃ 30초, 58 ℃ 20초, 72 ℃ 30초 조건으로 40 사이클을 반복하여 Lin28A와 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 양이 비드에 비교하여 상대적인 결합도를 측정하였다.

실시예 9 : 클로닝 및 염기서열 결정

9-1. 클로닝

상기 과정을 통해 얻은 DNA를 제한효소 인지부위가 들어있는 5' 프라이머(서열번호 12)와 3' 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 실시예 6의 조건으로 25 사이클을 수행하였다. TA 벡터에 클로닝하기 위해 벡터와 insert를 BamHⅠ제한효소로 자른 후 잘려진 DNA들을 5 unit T4 DNA ligase를 이용하여 상온 4시간 반응시켰다. Ligate를 TOP10 E. coli에 열 충격 방법으로 42℃에서 1분 30초 동안 열 충격을 주어 형질전환 후 50 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린이 첨가되어 있는 아가 배지(agar plate)에 깔아서(spreading) 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 각 콜로니를 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 포함되어 있는 LB 배지에 각각 접종한 후에 미니-프렙(mini-prep)을 통해서 DNA를 얻었다.

9-2. 염기서열 확인

상기 실시예 9-1의 과정을 통해 얻어진 클론을 서열분석하여 각각의 앱타머 염기서열들을 'Multiple Sequence Alignment by Florence Corpet' 프로그램을 이용하여 그룹핑 하였고 이렇게 얻어진 그룹들은 'Mfold' 프로그램을 이용하여 RNA의 2차 구조를 예측하였다.

9-3. RNA 서열 분석 및 구조 분석 결과

상기 수득한 Lin28A와 Lin28B에 특이적으로 결합하는 RNA를 RT-PCR하여 실시예 8-1의 방법을 통해서 클로닝하고 실시예 8-2의 방법으로 RNA 서열을 분석하고 유사한 서열끼리 묶어 그룹을 만들었고, Lin28A의 경우는 크게 2개의 그룹을 얻었으며, Lin28B의 경우는 3개의 그룹을 얻었다. 각 그룹별로 무작위 서열 부분에 선택되어 나온 서열을 정리하였으며, Lin28A의 경우는 클론 7과 클론 37의 서열을 가지고 있는 RNA가 대다수인 것으로 확인되었고, Lin28B의 경우는 어느 한 쪽으로 많이 치우친 서열을 찾기는 어려웠지만, 3개의 클론(9, 33, 45)의 서열을 포함하는 RNA가 다수였다(도 7의 A, 도 8의 A). 그리고 각 그룹별로 대표적인 서열인 RNA를 10-2에 나열된 Mfold 프로그램을 이용하여 예측되는 RNA의 2차 구조를 만들었다(도 7의 B, 도 8의 B).

실시예 10: Electrophoretic Mobility Shift assay ( EMSA )

10-1. 그룹별 주요 RNA 앱타머에 대한 EMSA

상기 실시예 9의 그룹핑 과정에서 얻은 앱타머 클론 중에서 가장 다수의 클론에 대한 RNA 앱타머를 상기 실시예 7-1과 동일한 과정을 통해서 RNA로 만들었다. RNA 3 pmole, 단백질 60 pmole, tRNA 600 pmole, 10X 결합 완충액(binding buffer; 300 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1.5 M Sodium Chloride, 15 mM Magnesium Chloride, 20 mM DTT) 2㎕와 DEPC-H₂O를 이용해 20㎕로 만든 뒤 상온에서 20분간 결합시켰다. 6X 로딩 완충액(loading buffer; 30% 글리세롤, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol)를 첨가하여 4℃에서 100V로 5% native gel (5% acrylamide, 1X TBE, 10mM MgCl₂, 2% 글리세롤)에 0.5X TBE buffer에서 1시간 30분 동안 전기영동하였다.

전기영동이 끝난 젤을 0.45 ㎛ nylon transfer membrane(Whatman)으로 0.25X TBE buffer에서 4℃ 200 mA로 1시간 동안 transfer 하였다. membrane을 RNA가 있는 부위를 UV에 노출될 수 있도록 하여 240 mJ/㎠로 RNA를 가교 결합(cross linking)시켰다. blocking buffer(Brightstar BioDetect kit, Ambion) 5㎖과 hybridizer에서 37 ℃에서 한 시간 동안 교반시키고 biotin labeled 3' 프라이머 (Full-length aptamer : 서열번호 13, truncated aptamer : 서열번호 14)가 들어가 있는 blocking buffer 5 ml에서 16시간 이상 결합시키고 blocking buffer로 3회 세척해준 후 streptavidin-AP (Brightstar BioDetect kit, Ambion) 0.5㎕가 들어가 있는 blocking buffer 5㎖를 1시간 반응시켰다. 그 뒤에 blocking buffer 5㎖로 10분, washing buffer (Brightstar BioDetect kit, Ambion) 5 ㎖로 5분씩 3회로 비특이적으로 결합되어 있는 streptavidin-AP를 제거하였다. Assay buffer (Brightstar BioDetect kit, Ambion) 5 ㎖로 2분씩 2회 교반시켰다. membrane에서 assay buffer를 제거한 뒤 CDP-Star (Brightstar BioDetect kit, Ambion)를 500 ㎕ 골고루 뿌려 5분간 반응시켰다. membrane을 X-선 필름에 감광시켜서 밴드를 확인하였다.

10-2. 선별한 RNA 를 이용한 컨퍼메이션 테스트

실시예 9-3에서 선별한 각 그룹별 대표적 RNA를 이용하여 단일 클론으로서 Lin28에 결합하는 정도를 확인하기 위하여 실시예 9의 방법을 이용해 qRT-PCR과 실시예 10-1의 방법을 이용해 EMSA를 수행하여 결합 정도를 확인하였다. qRT-PCR을 통해서 클론 7과 클론 37이 라이브러리 RNA 대비 Lin28에 대한 결합정도가 매우 높은 것을 확인하였고, 이것이 Ni-NTA 아가로스 비드에 의한 background가 아님을 확인하였다(도 9의 A). 또한 EMSA를 통해서 클론 7이 Lin28 단백질과 결합하여 밴드가 shift됨을 확인 할 수 있었다. 하지만 클론 37의 경우 결합하는 것을 확인할 수 없었다(도 9의 B).

또한, Lin28B에 결합하는 클론의 경우 qRT-PCR과 EMSA를 통해 결합 정도를 확인해 보았을 때 결합하지 않음을 확인하였다.

10-3.α- ³² P UTP 를 이용한 앱타머 바디 표지( aptamer body labelling )

실시예 6의 조건으로 25 사이클 수행하여 얻은 PCR DNA 200ng을 이용하여 500μM ATP(Roche), CTP(Roche), GTP(Roche), 10μM UTP(Roche), 2.5μM α-32P UTP(PerkinElmer), 40 unit RNase inhibitor, 100 unit T7 RNA 폴리머라아제, 10X transcription buffer, 5 mM DTT를 이용해서 전체 20㎕로 맞춘 뒤 37 ℃에서 3시간 반응하였다. 이후 과정은 실시예 7의 과정과 동일하다.

10-4. Competition assay

하기 실시예 11-2에서 얻은 RNA를 액체 섬광계수기(Liquid Scintillation Counter / PerkinElmer)를 이용하여 정량한 뒤 라이브러리, 클론 7, 클론 37 RNA 각각 10 fmole을 Lin28 2 pmole, tRNA 40 pmole과 20분간 결합시켰다. 이 과정에서 동위원소로 표지되지 않은 라이브러리, 클론 7, 클론 37 RNA를 10 fmole, 100 fmole, 1 pmole, 10 pmole을 각각 넣어주었다. 이후 과정은 상기 실시예 10-1과 동일하였다.

즉, 상기에서 결합을 확인한 클론 7의 RNA를 이용하여 Lin28에 대한 결합이 특이적인 결합인 것인가를 확인하기 위하여 상기 실시예 10-2 방법을 통해 RNA를 α-³²P 표지하여 RNA를 만들었다. 상기 방법을 이용하여 competition assay를 수행하였다. 표지한 RNA와 표지하지 않은 RNA을 눈으로 확인할 수 있었고, 이를 통해서 특이적인 결합임을 알 수 있었다(도 10의 A). 또한, pre-let7a-1와의 competition을 통해서 정확한 kD의 계산을 하지 않았지만, pre-let7a-1보다는 낮은 kD로 결합을 할 수 있을 것이라는 것을 확인할 수 있었고 또는 서로 다른 도메인이나 모티프의 결합으로서 competition하지 않을 수 있다는 사실을 알 수 있었다(도 10의 B).

10-5. Domain binding assay

하기 실시예 12-3에서 제작한 truncated protein과 상기 실시예 4에서 제작한 Full length protein을 사용하였으며, RNA는 하기 실시예 12-1에서 minimization한 앱타머와 상기 실시예 10-1에서 사용한 앱타머 클론 7을 이용하였다. 실험 방법은 상기 실시예 10-1에서 상온에서 결합시킨 이후의 과정과 동일하다.

실시예 11 : 앱타머 최소화( Minimization )

11-1. 최소화( Minimization )

상기 실시예 10-1을 통해 Lin28에 결합하는 것을 확인한 클론 7에 대해서 상기 실시예 9-2에 언급한 Mfold 프로그램을 이용하여 RNA 2차 구조를 예상하고, 무작위 서열 부분의 구조가 변하지 않는 범위 내에서 60 mer, 45 mer로 RNA 크기를 최소화하였다.

11-2. 최소화 RNA 제작

11-1에서 최소화한 서열을 전사하기 위해 5' 프라이머(서열번호 15 및 16)에 T7 프로모터 포함 프라이머를 제작한 이후 그 프라이머와 서열이 5 내지 10 mer 가량 오버랩되는 프라이머(서열번호 17 내지 19)를 연속적으로 제작하여, PCR을 수행하여 원하는 최소화된 앱타머(minimized aptamer)만 전사되게 하였다. PCR 방법과 in vitro 전사 방법은 실시예 6 또는 실시예 7과 동일하게 수행하였다.

11-3. 앱타머 최소화와 결합력 측정

Lin28에 대한 결합력과 무작위 서열 부분의 2차 구조는 유지하되 92 mer보다는 작은 크기의 RNA 앱타머를 만들기 위해, 상기 실시예 9-2에서 언급한 Mfold 프로그램을 이용하여, 구조를 유지하는 최소 크기의 RNA를 구상하고(도 11), 이를 상기 실시예 11-1 및 11-2의 방법으로 제조하였다.

이렇게 만들어낸 45 mer, 60 mer의 truncated RNA와 Full-length RNA를 이용하여 Lin28A와 Lin28B에 대한 결합력을 EMSA로 확인하였다(도 12). EMSA를 통해 확인하여 보았을 때 Lin28A에 대한 각 앱타머의 결합을 확인하였고, 결합된 정도도 비슷한 수치로 확인되었다. 하지만, Lin28B의 경우는 Full-length RNA 대비 최소화를 진행한 RNA의 경우 그 결합력이 약해지는 것을 확인하였다.

실시예 12 : Truncated form 의 Lin28 단백질 제작

12-1. Polymerase chain reaction ( PCR )

실시예 4-1에 언급한 플라스미드 DNA construct를 이용하여 각 도메인과 모티프의 부분을 표적하는 프라이머를 제작하여 PCR을 하였다. 프라이머는 Lin28A-CSD(저온 자극 도메인, 서열번호 1 및 2), Lin28B-CSD(서열번호 3 및 4), Lin28A-ZFM(아연 핑거 모티프, 서열번호 5 및 6), Lin28B-ZFM(서열번호 7 및 8), Lin28A-CSD-ZFM(서열번호 1 및 6), Lin28B-CSD-ZFM(서열번호 3 및 8)을 사용하였다. 주형 플라스미드 DNA 10 ng, 각각의 25 pmole 5' 프라이머, 각각의 25 pmole 3' 프라이머, 5X HF buffer 20 ㎕, 100 μM dNTP, Phusion Taq 폴리머라아제(Finnzyme) 0.4 unit을 혼합하고 총량 100 ㎕ 부피로 수행하였다. PCR 조건으로는 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 30 cycle을 반복한 뒤, 마지막으로 72 ℃ 7분으로 수행하여 각각의 목적에 맞는 mutant gene을 얻었다.

12-2. 클로닝 및 서열분석

상기 12-1의 과정을 통해 얻어진 DNA의 단백질을 발현시키기 위해서 다음 과정을 거쳐 GST tagging 벡터인 pGEX-4T-3 벡터에 클로닝하였다. 벡터와 Lin28A/28B 각각의 도메인/모티프 PCR construct를 BamHⅠ(Enzynomics)으로 자른 후 페놀 추출과 에탄올 침전 과정을 거친 후 SalⅠ(Enzynomics)로 다시 잘라주었다. 이 과정을 통해 얻어진 DNA를 T4 DNA ligase(Enzynomics) 5 unit을 이용하여 25 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 반응물을 BL21(DE3) codon⁺ 대장균에 42 ℃에서 90초 동안 충격을 주는 방법을 통해 형질전환시킨 후 앰피실린이 50 ㎍/ml 농도로 만든 아가 플레이트에 깔아서 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 콜로니를 접종하여 mini-preparation 방법을 통하여 플라스미드 DNA를 얻고, BamHⅠ과 SalⅠ을 이용하여 Lin28 유전자가 들어가 있는 클론을 얻었다. 얻어진 클론들을 서열분석(bioneer 의뢰)을 통해 정확한 염기 서열인지를 확인하였다.

12-3. Truncated Lin28 단백질 정제

상기 실시예 12-2에서 제작한 Lin28A/28B truncated 단백질을 정제하기 위한 각각의 pGEX-4T-3-CSD, pGEX-4T-3-ZFM, pGEX-4T-3-CSD-ZFM construct를 50 ㎍/㎖ 앱피실린이 포함되어 있는 LB 배지에 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 포함되어 있는 LB 배지 1 ℓ에 10 ㎖ 다시 접종하여 O.D 600값이 0.4 내지 0.8이 되면 IPTG를 통해 인덕션을 수행하였다. 인덕션한 E. coli는 4 ℃ 8000×g에서 5분 동안 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물은 -80 ℃에서 16시간 이상 보관하였다. 이 침전물을 15 ㎖ 용해 완충액(lysis buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM beta-mercaptoethanol)에 잘 풀어준 다음 100 ㎎/㎖ lysozyme을 넣어 30분 동안 ice에서 반응시키고, 10분마다 vortexing하였다. 그 후 15 mL tube에 각각 7.5㎖씩 나눠담고 70% amplitude로 10초씩 10회 sonication하였다. 4 ℃ 11500 rpm으로 30분간 원심분리시킨 후 상층액을 50 ㎖ 튜브로 옮겼다. 글루타티온 레진(Glutathione resin, Genscript) 300 ㎕를 micro-tube에 넣어 13000 rpm으로 10초 동안 원심 분리시켰다. 상층액은 버리고 용해 완충액 500㎕에 풀어주는 것을 3회 반복하였다. 세척이 끝난 비드는 sonication 후 원심 분리한 상층액과 혼합하여 2시간 동안 10 rpm의 속도로 4 ℃에서 단백질과 비드를 결합시킨다. Polypropylene column(QIAGEN)에 혼합물을 흘려주면서 흘러나온 용액(flow through, FT)을 얻어 보관하고 세척 완충액(washing buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM beta-mercaptoethanol, 5 mM reduced glutathione) 50 ㎖를 흘려주어 비 특이적으로 결합되어 있는 단백질을 제거한다. 세척 과정이 끝난 비드에 용출 완충액1(elution buffer1; 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM beta-mercaptoethanol, 20 mM reduced glutathione), 용출 완충액2(elution buffer2; 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM reduced glutathione)을 1 ㎖씩 차례대로 흘려주어 각각 3 바이얼씩 용출액을 micro-tube에 받아 보관한다. 용출액을 각각 16㎕씩 덜어 12% SDS-PAGE에 걸어 확인한다.

실시예 13 : 앱타머 결합 부위 확인

앱타머의 결합 부위를 확인하기 위해 Lin28A와 Lin28B의 돌연변이 형태의 단백질 제작 construct를 구상하였고(도 13), 상기 실시예 12의 방법을 통해서 돌연변이 형태의 단백질 9종을 클로닝하고 단백질을 정제하였다. 이 construct를 이용해 Full-length aptamer와 최소화 앱타머(minimized aptamer; 45 mer)와의 결합 유무를 EMSA를 통해서 확인하였다.

EMSA를 통해 확인해본 결과 클론 7 앱타머의 저온 자극 도메인(Cold shock domain)에 대한 결합을 확인할 수 있었다(도 14의 A).

저온 자극 도메인(cold shock domain)은 기존 연구에 의하면 서열 특이적인 결합을 한다고 알려진 도메인이기에 앱타머의 구조에 변화를 줄 수 있게 클론 7 앱타머의 2'F을 2'-OH로 변화시켜 RNA를 만들었고, 이를 이용하여 같은 실험을 반복하여 보았다. 이를 통해서 여전히 저온 자극 도메인에 결합력을 가진 앱타머라는 것을 확인할 수 있었다(도 14의 B).

이를 통해서 앱타머의 Loop 부분의 어느 특정 서열을 인지하여 Lin28과 앱타머가 결합할 것이라는 것을 예측할 수 있었지만, 정확한 서열은 확인할 수 없었다. 그리하여 같은 저온 자극 도메인을 가진 단백질에 대한 검색을 통해서 UNR이라고 불리우는 저온자극도메인 5개를 가진 단백질과 결합하는 서열에 대한 논문을 근거로(Gerard Triqueneaux, Marion Velten, Pascale Franzon, Francois Dautry and Helene Jacquemin-Sablon. (1999) RNA binding specificity of Unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Research, 27, 1926-1934) 45 mer 앱타머의 5'을 기준으로 GAGA와 AAGUG라는 Purine-rich한 서열이 결합에 중요한 역할을 할 것이라고 예상이 된다. 하지만 정확한 결합 서열을 확인하기 위해서는 결합할 것이라고 생각되는 앱타머의 Loop과 stem부분의 mutantion study로서 결합 서열을 확인할 필요가 있다.

실시예 13 : 앱타머 결합 패턴

선행 실험으로서 진행된 Lin28A/28B에 결합하는 2'-OH 앱타머(도 15 및 도 16) 6종과 본 발명에 진행한 Lin28A에 결합하는 2'-F 앱타머로 얻은 앱타머 1종(Lin28A 2'F 그룹 1 : 클론 7, 서열번호 34)을 이용해서 각 도메인/모티프 construct에 결합을 시켜서 EMSA로서 확인해 보았고 각 앱타머들 간의 결합 패턴을 파악할 수 있었다. Lin28A에만 결합하는 그룹 2개와 Lin28A와 Lin28B 둘 다에 결합하는 그룹 3개와 CSD 특이적으로 Lin28A와 Lin28B 둘다 결합하는 그룹 1개를 확인하였고, 각 결합 패턴을 하기 표 2에 정리하였다.

Lin28A/Lin28B 앱타머 결합-도메인 맵핑

		Lin28A			Lin28B
		full	CSD	ZFM	full	CSD	ZFM
Lin28A 2'OH	그룹 1	+	-	-	+	-	-
	그룹 2	+	-	-	+	-	-
	그룹 3	+	-	-	+	-	-
Lin28B 2'OH	그룹 1	+	-	-	-	-	-
	그룹 2	+	-	-	+	-	-
	그룹 3	+	-	-	-	-	-
Lin28A 2'F	그룹 1 (클론 7)	+	+	-	+	+	-

실시예 14 : cytoplasm 에서 앱타머를 발현시키기 위한 construct 제작

14-1. Polymerase chain reaction

상기 실시예 10-1에 언급한 다수 클론 중에 클론 7과 이전 실험실에서 개발되어진 Lin28 2'-OH 앱타머 construct를 이용하여 7SL 발현 벡터에 클로닝하기 위한 프라이머(서열번호 32 및 33)로 PCR을 하였다. 주형 플라스미드 DNA 10 ng, 각각의 25 pmole 5' 프라이머, 각각의 25 pmole 3' 프라이머, 5X HF buffer 20 ㎕, 100μM dNTP, Phusion Taq 폴리머라아제(Finnzyme) 0.4 unit을 혼합하고 총량 100㎕ 부피로 수행하였다. PCR 조건으로는 95 ℃ 30초, 58 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 30 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72 ℃ 7분으로 수행하여 PCR하였다.

14-2. 클로닝 및 서열분석

클로닝을 위해 사용된 벡터가 7SL 발현 벡터인 것을 제외하고 실시예 13-2와 방법은 동일하게 수행하였다.

실시예 15 : 앱타머 서열을 이용한 Lin28 의 신규 타겟 검색

15-1. Blast search

본 실험실에서 개발되어 있던 Lin28 앱타머와 상기 실시예에 의해서 수득한 Lin28 앱타머의 무작위 서열을 이용하여 miRBase(http://www.mirbase.org)와 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 유사한 서열을 포함하는 candidate를 선정하여 정리하였다.

15-2. EMSA : Predicted new targets of Lin28A /28B

실시예 12-2와 같은 방식으로 Pre-miR-340, Pre-miR-3655, Pre-let-7a-1, Pre-miR-122를 over-lapping PCR을 통해 In vitro transcription을 위한 DNA 주형을 만들었다. 프라이머는 서열번호 20 내지 31을 조합하여 만들었다. 이렇게 만들어 낸 DNA 주형을 가지고, 실시예 10-3의 방법으로 방사선 동위원소 라벨을 하였고, RNA와 Lin28 단백질 비율이 1:4000이 되게 하여 실시예 11-1과 동일한 방법으로 EMSA를 수행하였다.

15-3. 앱타머 6 종 서열 이용 새로운 타겟

상기 실시예 13에서 언급한 앱타머 6종의 무작위 서열을 이용하여 기존에는 알려져 있지 않은 새로운 표적 단백질이나 mRNA 또는 miRNA를 스크리닝해 낼 수 있을 것으로 생각되어 상기 실시예 15-1의 방법을 통해 찾아보았다. 이를 통해서 Lin28B에 대하여 결합하는 그룹 3(2'OH)는 miR-340이라고 하는 마이크로 RNA와 유사한 구조와 유사한 서열을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 16). 이를 통해서 Lin28 단백질과 miR-340의 연관성에 대한 실험을 진행하였다. 우선 miR-340을 in vitro transcription하여 Lin28와의 결합을 EMSA를 통해서 확인하였다(도 17). Pre-let7a-1과 miR-122는 control로 사용하였다.

삭제

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Novel RNA aptamers and the Uses thereof <130> PA130974KR <160> 49 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-Lin28A_CSD_BamH1 primer <400> 1 cgcggatccc acggtgcggg catc 24 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-Lin28A_CSD_Sal1 primer <400> 2 gtcgactcag tgatggtgat ggtgatgagg tccggtgaca cgg 43 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-Lin28B_CSD_BamH1 primer <400> 3 cgcggatccc gcggaactgg ccac 24 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-Lin28B_CSD_Sal1 primer <400> 4 gtcgactcag tgatggtgat ggtgatgagg tcctgttacc cg 42 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-Lin28A_ZFM_BamH primer <400> 5 cgcggatccg acaggtgcta caac 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-Lin28A_ZFM_Sal1 primer <400> 6 gtcgactcac agcggacatg aggc 24 <210> 7 <211> 24 <212> 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15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone7 60mer F <400> 15 ggtaatacga ctcactatag ggctgggtcg tgtgagagcc 40 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone7 45mer F <400> 16 ggtaatacga ctcactatag ggtgtgagag cc 32 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone7 Middle <400> 17 ttgtcgcggc ctttcactta cggctctcac a 31 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone7 60mer R <400> 18 ctgggttatg tccgatcttt gtcgcggc 28 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone7 45mer R <400> 19 gtgtccgatc tttgtcgcgg c 21 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-340 F <400> 20 ggtaatacga ctcactatag ggttgtacct ggtgtgatta 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-340 M1 <400> 21 cgacatatga caatcagtct cattgcttta taatcacacc 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-340 M2 <400> 22 ctataaagta actgagacgg atcccacaaa cgacatatga 40 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-340 R <400> 23 taagatacca ggtatggcta taaagta 27 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-3655 F <400> 24 ggtaatacga ctcactatag ggcttgtcgc tgcggtgttg c 41 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-3655 M <400> 25 tttcgctgtc accaacaatc gagtctccaa cagcaacacc gc 42 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-3655 R <400> 26 actatctcgc tccggcattt tgttatcgtt ctttcgctgt c 41 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-let-7a-1 F <400> 27 taatacgact cactataggg tcggatgagg tag 33 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-let-7a-1 R <400> 28 cctaggaaag acagtagatt gtatagtt 28 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-122 F <400> 29 taatacgact cactataggg ccttagcaga gctg 34 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-miR-122 R <400> 30 gcctagcagt agctatttag 20 <210> 31 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsa-Pre-let-7a-1 template <400> 31 gtagtaggtt gtatagtttt agggtcacac ccaccactgg gagataacta tacaatct 58 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7SL-N40 aptamer F <400> 32 acgcgtcgac gggagagcgg aagcgtgc 28 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7SL-N40 aptamer R <400> 33 gctctagagg ggggatccat cgacct 26 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Lin28A group 1 clone 7 <400> 34 tcgtgtgaga gccgtaagtg aaaggccgcg acaaagatcg ga 42 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Lin28A group 2 clone 37 <400> 35 ctttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggtt 39 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Lin28A group 2 clone 4 <400> 36 ctttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggtc 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Lin28A group 2 clone 17 <400> 37 ctctctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggtt 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Lin28A group 2 clone 41 <400> 38 ctttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggct 39 <210> 39 <211> 41 <212> DNA <213> Lin28B group 1 clone 9 <400> 39 tcttctcatt cgacatcaac gttcagttga acagctggtt c 41 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Lin28B group 1 clone 12 <400> 40 ccttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggttc 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Lin28B group 1 clone 29 <400> 41 ctttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggttc 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Lin28B group 1 clone 32 <400> 42 ccttctcaat cgacatcaac ttcagttgaa cagctggtac 40 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Lin28B group 1 clone 19 <400> 43 tcttctaatc gacatcaact tcagttgaac agctggctc 39 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Lin28B group 2 clone 33 <400> 44 gccgttttgg cgcgggagga taatattgaa ctgccttaac 40 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Lin28B group 3 clone 45 <400> 45 ccgtttaatc ggtttggctg aggatttctt acttttcgct cac 43 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28A 5' primer <400> 46 cgcggatcca tgggctccgt gtcc 24 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28A 3'primer <400> 47 cccaagcttt caattctgtg cctccgg 27 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28B 5' primer <400> 48 cgcggatcca tggccgaagg cggggc 26 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28B 3' primer <400> 49 cgcggatcct cccaggtcag ctactgc 27

Claims

삭제
Lin28A 또는 Lin28B 단백질에 결합하는 RNA 앱타머로서,
상기 RNA 앱타머는 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, RNA 앱타머.
제2항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 Lin28A 또는 Lin28B 단백질의 저온자극도메인(Cold shock domain)에 결합하는 것을 특징으로 하는 것인, RNA 앱타머.
삭제
제2항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 2'-플루오린 피리미딘 개질 RNA(2'-fluorine-modified RNA)를 포함하여 핵산 분해 효소에 저항성을 가지는 것인, RNA 앱타머.
제2항, 제3항, 및 제5항 중 어느 한 항의 RNA 앱타머를 포함하는 암 진단용 키트.
제6항에 있어서,
완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기를 추가로 포함하는 것인, 암 진단용 키트.
삭제
삭제
(a) 제2항, 제3항, 및 제5항 중 어느 한 항의 RNA 앱타머를 이용하여 암이 의심되는 개체의 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정한 암이 의심되는 개체의 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 발병 여부에 대한 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 암이 의심되는 개체의 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 Lin28A 또는 Lin28B의 발현 수준보다 높을 경우, 암이 발병한 것으로 판단하는 것인, 정보제공방법.
(ⅰ) 제2항, 제3항, 및 제5항 중 어느 한 항의 RNA 앱타머에 포함된 공통된 염기서열을 도출하는 단계;
(ⅱ) 상기 도출된 공통의 염기서열을 DNA/RNA 데이터베이스에 조회하여 상기 공통된 서열을 포함하는 새로운 유전자 단편을 검색하는 단계; 및,
(ⅲ) 검색된 유전자 단편의 Lin28A 또는 Lin28B와의 상호작용 활성을 측정하여 Lin28A 또는 Lin28B와 상호작용하는 유전자 단편을 선발하는 단계를 포함하는, Lin28A 또는 Lin28B와 상호작용하는 유전자 단편을 스크리닝하는 방법.