KR101552014B1 - 폐암 진단을 위한 nir의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor)의 폐암 진단을 위한 신규 용도에 관한 것으로, 자세하게는 NIR 유전자의 수준 또는 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 폐암 진단용 조성물; 이를 포함하는 폐암 진단용 키트; 마이크로 어레이; 이를 이용한 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법; 및 NIR 유전자의 발현 억제제 또는 NIR 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor)의 단백질 발현은 폐조직 유래 비암성 세포주와 비교하여 폐암 세포주에서 매우 높게 나타나며, 특히 NIR의 과발현시키는 경우 세포증식 속도 증가할 뿐만 아니라, 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 통한 NIR의 발현을 저해한 경우 p-53 의존적 세포사멸(apoptosis)이 증대되는 것으로 나타났다. 따라서 NIR은 폐암을 특이적으로 진단할 수 있는 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 NIR 억제제의 경우 폐암 예방 또는 치료를 위한 의약품 소재로서 유용하세 사용될 수 있다.

Description

폐암 진단을 위한 NIR의 신규한 용도{Novel use of NIR for diagnosing lung cancer}

본 발명은 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor, 이하 간략하게 ‘NIR'이라고 함)의 폐암 진단을 위한 신규 용도에 관한 것으로, 자세하게는 NIR 유전자의 수준 또는 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 폐암 진단용 조성물; 이를 포함하는 폐암 진단용 키트; 마이크로 어레이; 이를 이용한 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법; 및 NIR 유전자의 발현 억제제 또는 NIR 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 폐암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 폐암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 폐암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.

이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 폐암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.

특히 폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 이 중 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다. 폐암의 높은 사망률은 일부 절제 불가능한 종양을 가진 환자의 높은 비율과 관련되어 있으며, 또한 절제 가능한 병기의 비소세포폐암 환자 중에서도 외과적으로 절제한 환자의 상당수가 암의 재발로 사망하고 있다. 현재 폐암의 경우 병리학적 병기로 진단하고 있지만, 같은 병기에서도 재발과 생존의 상당한 차이를 보이고 있기 때문에, 폐암의 진단과 치료의 방법이 발달했음에도 불구하고 여전히 생존율이 좋지 않다. 이러한 결과는 조기 진단방법과 알맞은 선별검사의 부족으로 인한 낮은 치료율에 기인하며, 따라서 폐암 사망률을 낮추기 위하여 효과적인 조기 진단 및 맞춤진단방법의 개발이 필요한 실정이다.

암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해, 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해이다. 이러한 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가된다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하여 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.

따라서 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기에 발견될 수 있는 것이어야 한다. 이러한 암의 발병여부 및 진행 단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 암의 진단제 및 외과적 절제술이나 항암제의 단점을 보완한 치료제의 개발을 위한 바이오 마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 난치병인 암을 정복하는 필수 불가결한 수단이라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 암을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 단백질 발현이 비암성 세포주와 비교하여 폐암 세포주에서 매우 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 특히 NIR의 과발현에 따른 세포증식 속도가 증대된다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2006-0087977호

따라서 본 발명의 목적은 높은 민감도와 특이도를 가진 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 높은 민감도와 특이도를 가진 폐암 진단용 마커를 이용한 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 폐암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 수준 또는 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 단백질은 서열번호 2의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 유전자의 수준을 측정하는 물질은 NIR 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질은 NIR 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩을 이용하여 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 발현 억제제 또는 NIR 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR 단백질은 서열번호 2의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NIR은 폐암 세포에서 과발현 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 NIR에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor)의 단백질 발현은 폐조직 유래 비암성 세포주와 비교하여 폐암 세포주에서 매우 높게 나타나며, 특히 NIR의 과발현시키는 경우 세포증식 속도가 증가할 뿐만 아니라, 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 통한 NIR을 발현을 저해한 경우 p-53 의존적 암세포주의 세포사멸(apoptosis)이 증대되는 것으로 나타났다. 따라서 NIR은 폐암을 특이적으로 진단할 수 있는 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 NIR 억제제의 경우 폐암 예방 또는 치료를 위한 의약품 소재로서 유용하세 사용될 수 있다.

도 1은 NIR 발현 벡터맵을 도식화하여 나타낸 것이다(도 1a: HA-NIR/pcDNA-3.1, 도 1b: NIR-FLAG/pcDNA-3.1, 도 1c: pEGFP-NIR).
도 2A는 Flag-NIR 형질주입된(+) 또는 비-형질주입된(-) 세포 용해물에서 NIR 단백질 검출한 위해 Flag 항체를 이용 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다(왼쪽). 또한, 동일 블랏을 스티립핑한 후 인간 NIR에 대한 다중클론 항체(HuAb)를 이용 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다(오른쪽). 도 2A에서 I는 세포 용해물 중 불용성 분획물(insoluble fraction)을 의미하며, S는 용해성 분획물(soluble fraction)을 의미한다.
도 2B는 마우스의 다양한 조직(뇌, 콩팥, 폐, 흉선, 심장 및 간 조직)에서 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb)를 이용 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다(B, brain; H, heart; K, kidney; L, liver; U, lung; Y, lymph node; O, ovary; S, spleen; T, thymus).
도 3은 NIR 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여, 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb) 및 인간 NIR에 대한 다중클론 항체(HuAb)를 이용 면역세포화학 염색을 통해 분석한 사진으로서, 도 3의 (A)는 FITC가 접합된 항-래빗 항체를 세포에 단독 처리한 것을 나타낸 것이며, (B)는 내생적(endogenous) NIR을 측정하기 위해 HuAb 및 FITC-접합된 항-래빗 항체를 사용하여 검출한 결과를 나타낸 것이며(e~h), (C)는 (B)와 동일한 세포 시료를 대상으로 NIH 3T3 세포의 핵소체 내에서 MoAb가 특이적으로 표지된 NIR을 검출한 결과를 나타낸 것이며, (D)는 NIR 유전자를 GFP 유전자와 융합하여 세포내에서 과발현한 후 GFP-NIR 융합단백질이 핵소체에 존재함을 나타낸 것이다. (D)의 l은 Mitotracker로 미토콘드리아를 염색하여 세포질 부분을 나타낸 결과를 나타낸 것이다 a, e, i 는 세포를 광학현미경을 이용하여 찍은 사진이고, b, f, m은 세포핵을 특이적으로 염색하는 Hoechst 33342 시약을 이용하여 세포 내에서의 세포핵의 위치를 나타낸 도면이다. d, h, k, o는 각각 a~c, e~g, i~j, l~n의 도면을 통합하여 나타낸 도면이다. a와 e에서 별표는 핵소체를 표시한다.
도 4는 NIR 단백질의 핵소체 위치화(localization)와 DNA 및/또는 RNA-결합 단백질과의 연관성을 살펴보기 위하여, NIH3T3 세포에 각각 DNase 또는 RNase 처리한 후 NIR의 단백질을 NIR 항체(MoAb) 및 FITC-컨쥬게이트된 항-래빗 항체를 이용 면역세포화학 염색을 통해 분석한 사진이다.
도 5A는 세포주기를 통한 NIR의 발현 조절을 알아보기 위하여 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb)를 이용 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다. 도 5B는 폐암 세포주(A427, A549), NCI-H23)와 폐조직 유래 비암성 세포주 (WI-38, MRC5, Hel299)에서 NIR 단백질의 발현양상을 인간 NIR에 대한 다중클론 항체(HuAb)를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다. 도 5B에서 IF는 세포 용해물 중 불용성 분획물(insoluble fraction)을 의미하며, SF는 용해성 분획물(soluble fraction)을 의미한다.
도 6A는 NIR 단백질이 과발현되는 경우 세포증식에 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, Hela 세포에 HA- 또는 GFP-태그된 NIR를 도입하여 NIR을 과발현시킨 후 시간 경과에 따른 세포증식 정도를 측정한 결과이다.
도 6B는 Hela 세포에 HA- 또는 GFP-태그된 NIR를 도입하여 NIR을 과발현시킨 후 형광을 모니터링한 사진이다.

본 발명은 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 NIR 단백질을 포함하는 신규한 폐암 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다.

기존에 폐암 진단을 위해 사용되고 있는 대부분의 마커의 경우, 폐암을 정확하게 진단하는 효과가 비교적 낮고 폐암 이외의 다른 질병들과도 뚜렷한 구분을 보이지 않아 폐암에 대한 예민도 및 특이도가 낮은 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 새로운 폐암 진단용 마커를 발굴하기 위해 폐암 조직 및 비-폐암 조직에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사한 결과, NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 단백질 발현이 폐조직 유래 비암성 세포주(WI-38, MRC5, Hel 299)와 비교하여 폐암 세포주(A427, A549, NCI-H23)에서 매우 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 특히 NIR의 과발현에 따른 세포증식 속도가 증대된다는 사실을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명은 NIR 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 NIR 단백질로 이루어지는 폐암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

본 발명에서, 상기 ‘진단’이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 폐암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 폐암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 폐암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 ‘진단용 마커(diagnosis marker)’란 폐암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 폐암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명에서 제공하는 폐암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 폐암의 세포에서 발현양이 증대하는 NIR 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 NIR 유전자는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드(NCBI Reference Sequence: XM_005244739.1)로 이루어질 수 있으며, 상기 NIR 단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드(NCBI Reference Sequence: XM_005244739.1)로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 NIR 유전자의 수준 또는 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 NIR 유전자의 수준은, 바람직하게 NIR 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 NIR 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 NIR 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 NIR 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 NIR 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-,알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 NIR 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 NIR 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다중클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 폐암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 NIR 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다중클론 항체의 경우에는 NIR 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 NIR 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 폐암 진단용 키트에 포함되는 폐암 진단용 조성물은 NIR 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 폐암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 폐암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 NIR 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, NIR 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 NIR 유전자의 발현수준 또는 NIR 단백질 수준을 측정하여 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 NIR 유전자의 발현수준 또는 NIR 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 폐암 조직 또는 폐암 세포주를 정상 조직 또는 정상 세포주와 비교하여 각각의 세포 또는 조직에서 발현되는 NIR의 발현수준을 웨스턴 블럿을 통해 비교하였다. 그 결과, 폐암이 발생한 샘플에서의 NIR 단백질 발현정도가 정상 샘플에 비해 증대함을 확인함으로써, 상기 본 발명에 따른 폐암 진단 방법은 생물학적 시료에서의 NIR 발현 수준이 대조군에 비해 증대되는 것으로 나타날 경우, 이를 폐암이 발병된 것으로 진단할 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 폐암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 NIR 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

또한, 상기 NIR 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 NIR 단백질 수준 측정은 항체를 이용할 수도 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 NIR 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 NIR mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 폐암 환자 또는 폐암 의심환자에서의 NIR mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 폐암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자 또는 NIR 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성이 억제되는 경우에 상기 시료는 폐암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 폐암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 NIR 유전자 또는 단백질을 포함하는 폐암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.

상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드 또는 천연 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성이 감소 또는 억제되는 것이 측정되면 상기 시료는 폐암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 NIR 유전자의 발현양, NIR 단백질의 양 또는 NIR 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

나아가, 본 발명에서 NIR 유전자 또는 단백질의 발현이 정상조직 또는 정상세포에 비해 폐암조직 또는 폐암세포에서 증대된다는 사실을 통해 본 발명자들은 NIR 억제제가 종양 억제자로 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 NIR 유전자의 발현 억제제 또는 NIR 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 NIR 유전자는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로 이루어질 수 있으며, 상기 NIR 단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용될 수 있는 NIR 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

본 명세서에서 "앱타머(aptamer)"라는 용어는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오타이드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오타이드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오타이드 이하이며, 보다 바람직하게는 약 60 뉴클레오타이드 이하이고, 가장 바람직하게는 약 45 뉴클레오타이드 이하일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 또한, 예컨대 약 18, 20 또는 25 뉴클레오타이드 이상일 수 있다. 총 뉴클레오타이드 개수가 적으면 화학합성, 화학수식 및 대량 생산이 보다 용이하고, 경제적이며, 생체 내 안정성은 높으면서 독성은 낮아 유리하다.

본 발명의 앱타머는 SELEX법 및 그 개량법[예컨대 Ellington et al., Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법이란, 10-14개 정도의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 풀로부터, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 선별해오는 방법이다. 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 40잔기 정도의 랜덤 서열을 프라이머 서열로 끼운 구조를 하고 있다. 이 올리고뉴클레오타이드 풀을 표적 물질과 회합시켜, 필터 등을 이용하여 표적 물질에 결합한 올리고뉴클레오타이드만 회수한다. 회수한 올리고뉴클레오타이드를 RT-PCR로 증폭하고, 이것을 다음 라운드의 주형으로서 이용한다. 이 작업을 10회 정도 반복함으로써 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 취득할 수 있다. SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머를 농축하고, 선별할 수 있다. 따라서 SELEX의 라운드수를 조절하고/하거나 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.

또한, 앱타머는 종래 SELEX 기법 이외에, 복합 타겟, 즉 살아있는 세포 및 조직에 대해 Cell-SELEX 기법을 이용하여 얻을 수 있는데(Guo et al., Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008), Cell-SELEX 기법은 표면 마커 타겟이 알려져 있지 않을 때조차도, 질환 세포에 대한 앱타머를 개발할 수 있게 하는 장점이 있다. 게다가, 분리된 상태에서는 그 본래의 특성을 나타내지 않을 수도 있어, 생리적 상태에 있는 타겟 단백질은 선별과정에서 더 기능적인 접근을 가능하게 하기 때문에, Cell-SELEX 기법은 종래의 SELEX 과정에 비하여 장점을 가지고 있다.

한편, 앱타머는, 인산기의 음전하를 이용한 이온결합, 리보오스를 이용한 소수성 결합 및 수소결합, 올리고 뉴클레오타이드 염기를 이용한 수소결합이나 스태킹(stacking)결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오타이드의 수만큼 존재하는 인산기의 음전하를 이용한 이온결합은 강하게 단백질의 표면에 존재하는 라이신이나 아르기닌의 양전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관련되어 있지 않은 올리고 뉴클레오타이드 염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 올리고 뉴클레오타이드 염기는 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 앱타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프구조 등 염기쌍을 만들지 않은 구조에서도 올리고 뉴클레오타이드 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 예컨대, 리보오스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기 (예:-O-CH3), -O-아실기 (예, -O-CHO), 아미노기(예, -NH2)로 치환되어 있는 뉴클레오타이드를 들 수 있다. 이와 같이 앱타머는 표적 분자와의 직접적인 결합에 관련되어 있는 관능기를 치환 또는 제거하지 않는 한 그 활성을 유지한다.

또한 본 발명의 NIR의 억제제로는 NIR 단백질 활성 억제제를 포함하며, 이러한 단백질 활성 억제제로서 바람직하게는 NIR에 특이적으로 결합하는 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 펩타이드, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 예시할 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 NIR 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이다. NIR 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al., European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 문헌[Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991]에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 NIR 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 폐암의 예방 또는 치료용 조성물은 폐암을 치료할 수 있는 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

NIR 발현 플라스미드 제조

The German cDNA Consortium을 통하여 DKFZ (German cancer research center)에서 분양받은 인간 NIR cDNA(서열번호 1, NCBI Reference Sequence: XM_005244739.1)를 pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, California)의 KpnI 및 NotI 사이트 사이에 서브클론하였는데, NIR의 N-말단에 HA 에피톱이 태깅된 벡터로서 도 1a의 HA-NIR/pcDNA-3.1를 제조하였고, NIR의 C-말단에 FLAG 에피톱이 태깅된 벡터로서 도 1b의 NIR-FLAG/pcDNA-3.1를 제조하였다. 또한, 형광분석을 위한 용도의 벡터로서 도 1a의 HA-NIR/pcDNA-3.1 및 도 1b의 NIR-FLAG/pcDNA-3.1의 플라스미드를 다시 KpnI 및 EcoRV로 절단한 후, 단편 조각을 pEGFP-C1 벡터(BDbioscience, California, USA) 내로 서브클론하여 NIR의 N-말단에 GFP 태그된 도 1c의 pEGFP-NIR 벡터를 제조하였다.

항- NIR 항체 생산

마우스 NIR cDNA의 단편(아미노산 500-750, 서열번호 4)을 SacI 및 XhoI으로 절단하고, pQE31 벡터(Qiagen, Hilden, Germany)에 삽입하여 히스-태그된 NIR을 발현시켰다. 상기 발현된 단백질을 정제한 후 토끼에 주입하여 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb)를 생산하였다. 한편, 인간 NIR에 대한 다중클론 항체를 생산하기 위하여 인간 NIR의 카르복실 말단의 17개 아미노산 펩타이드(AQGPEDELEDLQLSEDD)(Peptron, Deajeon, Korea)를 이용하여 토끼에서 인간 NIR에 대한 다중클론 항체(HuAb)를 생산하였다. 이렇게 생산된 두 종류의 항체를 정제하여 하기 실험에서 사용하였다.

세포배양 및 세포 형질주입

인체배아신장(Human Embryonic Kidney) 293T 세포, HeLa 세포 및 NIH3T3 세포는 10% 소태아혈청(FBS, Life technologies, Carlsbad, CA), 100 IU/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신이 공급된 Dulbecco modified Eagle’s medium(Hyclone, Logan, UT)을 이용, 37℃ 온도 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

NIR의 이소성(ectopic) 발현을 위해, 상기 배양된 세포들을 60nm 또는 100mm 디시에서 70% confluency까지 성장시키고 그 후 제조자의 프로토콜에 따라 JetPEI 형질주입 시약(Polyplus Transfection Inc, NY)을 이용하여 형질주입시켰다. 하기 실험에서 사용된 모든 비암성 세포주(WI-38, lung fibroblast; MRC5, lung fibroblast; Hel 299, lung embryo fibroblast) 및 암세포주(A427, lung carcinoma; A549, lung carcinoma; NCI-H23, non-small cell lung adenocarcinoma)들은 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. NIR 형질주입 후 세포 성장률을 측정하기 위하여, 세포수를 트립신처리 후 헤모사이토미터(hemocytometer)로 계산하였다. 초기 S기에서 HeLa 세포를 고정하기 위하여, 진핵세포의 핵의 DNA 복제 가역적 억제제인 아피디콜린(aphidicolin)을 이용하였다. 8×10⁵ HeLa 세포들을 60mm 디시에 분주한 다음, 최종농도 5nM에서 12시간 동안 아피디콜린(aphidicolin)을 첨가하였다. 이후, 상기 시약을 제거함으로써 초기 S기로 세포주기가 고정된 세포들은 다시 세포주기를 진행시킨 후 3시간 마다 수집하였다.

웨스턴 블랏 분석

형질주입된 세포들은 24시간 동안 배양된 후 차가운 인산 완충 식염수로 세척하였다. 세포 분획을 위하여, 전체 세포 추출물들을 세포질, 멤브레인 및 nuclear compartments로부터 단백질 추출을 할 수 있는 RIPA 버퍼(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS), 1 mM PMSF, 50 mM NaF, 4 μg/ml aprotinin, 0.7 μg/ml pepstatin and 0.5 μg/ml leupeptin)에서 준비되어졌다. 상기 시료는 4℃에서 15분 동안 로테이터로 회전시킨 다음 13,000rpm에서 20분간 원심분리하였으며, 이후 용해 단백질들이 포함된 상층액(soluble fraction, S)을 수득하였다. 상기 침전물을 동량의 SDS-PAGE 로딩 버퍼(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.1 M DTT, 0.005% bromophenol blue)에서 재현탁하고, 단백질 추출을 위해 변성 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 이를 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST 용액 (0.05% Tween-20 in PBS)으로 블로킹하고, 1차 항체로서 항-NIR 항체(1:1000 희석)로 2시간 동안 반응시켰다. PBST로 5회 세정하고 호스라디시 페록시다제 (hoseradish peroxidase: HRP)가 결합된 항-래빗 IgG(Jack son ImmunoResearch, West Grove, PA)와 반응시킨 후 단백질을 enhanced chemiluminescence(GE Healthcare Bio-Sciences)로 발색시켜 분석하였다.

면역세포화학 분석

NIR의 세포 위치화(localization)를 조사하기 위하여, 세포를 폴리-L 라이신-코팅된 커버슬립 상에 성장시켰다. 4% 포름알데하이드(PBS에 용해된 4% 포름알데하이드)로 세포를 고정시킨 다음, 얼음에서 20분 동안 블록킹 용액(PBS containing 1% BSA and 0.3% Triton X-100)으로 침투시켰다. 상기 세포를 항-NIR 항체와 함께 2시간동안 배양하면서 반응시켰으며, 이후 FITC- 또는 Cy3-컨쥬케이트된 항-래빗 2차 항체를 더 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. DNA는 Hoechst 33342 또는 DAPI 용액(Invitrogen, Carlsbad, California)으로 염색하였다. 이후 커버슬립을 마운트한 후 Nikon Eclipse 2000 microscope (Melville, NY)을 이용하여 관찰하였다. NIR의 위치화(localization)에서 DNase 및 RNase의 효과를 결정하기 위하여, 본 발명에서는 이전 보고된 프로토콜(Galcheva-Gargova et al., 1998)을 변형하여 실험하였다. 간략하게는, 커버슬립 상에 성장시킨 HeLa 세포들을 얼음 상에서 3분 동안 0.1% 트리톤 X-100으로 침투시켰으며, 이 후 0.1mg/ml RNase를 함유하는 PBS 또는 0.1 mg/ml DNase I와 5mM MgCl2를 함유하는 PBS를 이용하여 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 한편, PBS에서 인큐베이션시킨 세포들을 음성대조군으로 이용하였다.

2. 결과

NIR 발현 플라스미드의 세포 도입에 따른 NIR 과발현 확인

본 발명에서 제조한 NIR 발현 플라스미드가 세포 내에 도입이 잘 되었는지를 확인하기 위하여 Flag-NIR로 형질전환된 세포(+) 및 비-형질전환 세포의 용해물을 Flag 항체로 검출하였으며, 동일 블랏을 스트립핑한 후 NIR HuAb와 다시 반응시켜 endogenous NIR 및 exogenous NIR(FLAG-tagged NIR)를 검출하였다. 한편, 인간 NIR은 749 아미노산(생쥐의 경우 750개의 아미노산)으로 구성되므로, NIR 단백질은 약 85kDa으로 계산되었다.

그 결과 도 2A에서 나타낸 바와 같이, Flag-항체로 검출된 결과는 왼쪽에서 나타내었으며, NIR HuAb로 검출된 결과는 오른쪽에서 나타내었다. FLAG-태그된 NIR은 태그(15개 아미노산)로 인해 endogenous NIR 보다 사이즈가 다소 큰 것을 확인할 수 있었으며(95kDa), 또한 용해성 분획(S)이 불용성 분획(I)과 비교하여 이동이 좀 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.

다양한 조직에서의 NIR 발현 확인

마우스의 다양한 조직에서 NIR 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏 분석을 통해 조사하였다. 다양한 마우스 조직(뇌, 콩팥, 폐, 흉선, 심장 및 간 조직)의 용해물을 8% SDS-PAGE 젤(100μg per lane) 상에서 전기영동한 후 PVDF 멤브레인으로 이동시켰으며, 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb)를 이용하여 반응시켰다.

그 결과 도 2B에서 나타낸 바와 같이, 다양한 마우스 조직(뇌, 콩팥, 폐, 흉선, 심장 및 간 조직)에서 NIR 단백질 사이즈와 일치되는 강력한 밴드가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb)가 NIR 단백질을 특이적으로 인식하며, NIR 단백질이 다양한 조직에서 넓게 발현되는 것을 알 수 있었다(참고- B, brain; H, heart; K, kidney; L, liver; U, lung; Y, lymph node; O, ovary; S, spleen; T, thymus).

핵소체에서 NIR 축적 정도 분석

NIR은 세포 내에서 존재하는 위치에 대해 많은 논란이 있는 것으로 보고되고 있다. Hublitz등에 의한 2005년 보고 자료에 의하면 독소루비신으로 처리된 BHK 세포 내에서는 NIR이 핵질(nucleoplasm)에 위치하고 있다고 보고된 바 있고, 2011년 Wu 등의 보고에 의하면 Aurora B kinase가 과발현된 U2OS 세포에서도 NIR이 핵질(nucleoplasm)에 위치하고 있다고 보고된 바 있다. 한편, 이와는 상반적으로 2012년 Wu 등의 보고에 의하면 U2OS 및 HeLa 세포에서 NIR은 핵소체에 위치하고 있다고 보고된 바 있다. 또한, 2010년 Heyne 등의 보고에 의하면 TAp63γ가 도입된 H1299 세포에서는 NIR이 핵소체 및 핵질에 모두 위치하고 있다고 보고하였다.

이에 본 발명자들은 세포내에 존재하는 NIR의 세포내 위치를 확인하기 위해 마우스 NIR에 대한 다중클론 항체(MoAb) 및 인간 NIR에 대한 다중클론 항체(HuAb)를 이용한 면역세포화학 염색 방법을 수행하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 거의 모든 세포의 핵소체에서 형광이 검출된 것으로 나타남에 따라 NIR은 핵소체에 위치하고 있음을 알 수 있었으며, 상기 두 종류의 항체들은 인간 HeLa 세포(도 3B.g) 및 마우스 NIH3T3 세포에서 동일한 형광 패턴을 나타내었다(도 3C.j). 한편 2차 항체를 단독으로 처리한 세포에서는 형광이 검출되지 않았는데 이는 이들 형광이 항-NIR 항체로부터 발생되는 것임을 알 수 있었다(도 3A.c).

또한, 본 발명자들은 핵소체에 있는 NIR의 위치를 확인하기 위하여, HeLa 세포에서 GFP-NIR를 과발현시킨 결과, GFP 형광은 핵소체에서 주요하게 검출되었으며 핵질에서 미약하게 검출되었다(도 3D.n).

즉, 도 3의 결과를 정리하여 설명하면, 세포 내에서 일반적으로 NIR은 대부분 핵소체(인; nucleolus)에 위치하고 있으나 세포 내에서 NIR이 과발현되면 NIR이 핵질로 이동된다는 사실을 알 수 있었다.

NIR 의 핵소체 위치화(localization)에 대한 RNA 연관성 분석

본 실험에서는 NIR 단백질의 핵소체 위치화(localization)와 DNA 및/또는 RNA-결합 단백질과의 연관성을 살펴보기 위하여, NIH3T3 세포에 각각 DNase 또는 RNase 처리한 후 NIR의 단백질을 NIR 항체(MoAb) 및 FITC-컨쥬게이트된 항-래빗 항체를 이용하여 검출하였다. DNase/RNase 대신 PBS로 인큐베이션시킨 세포를 음성대조군으로 사용하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, NIH3T3 세포에 DNase를 처리한 실험군에서는 NIR 단백질의 위치가 영향을 받지 않은 반면, RNase를 처리한 실험군에서는 핵소체 내에서 더 이상 NIR 단백질이 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, NIR 단백질의 경우 핵소체 내에 위치화(localization) 되기 위해서는 RNA가 요구되어지는 것을 알 수 있었다.

세포주기를 통한 NIR 의 발현 조절

본 실험에서는 NIR 단백질의 발현 변화가 세포주기를 통해 조절될 수 있는지를 확인하였다.

그 결과 도 5A에서 나타낸 바와 같이, NIR 발현은 세포가 G2에서 M기로 들어가는 동안 감소되는 것을 확인할 수 있었다. NIR 발현이 세포 주기 진행에 의존적으로 보이기 때문에, NIR 단백질 발현을 몇몇 비종양 세포주(WI-38, MRC5, Hel 299) 및 몇몇 암세포주(A427, A549, NCI-H23)에서 조사하였다. 일반적으로 NIR 발현은 비종양세포주에 비해 종양세포주에서 높게 나타났다(도 5B 참조). NIR의 단백질 발현 수준은 세포주 각각의 불용성 분획물(IF)에서 유사한 반면, 용해성 분획물(SF)의 경우 비종양 세포주에 비해 종양세포주에서 NIR 단백질 발현이 두드러지게 높게 나타났다. 음성대조군으로는 β-tubulin을 사용하였다.

상기와 같은 결과를 통해, NIR의 발현은 세포주기를 통해 조절될 수 있을 것이라 판단되었다.

NIR 과발현에 따른 세포증식 강화

본 실험에서는 NIR 단백질이 과발현되는 경우 세포증식에 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, Hela 세포에 HA- 또는 GFP-태그된 NIR를 도입하여 NIR을 과발현시킨 후 시간 경과에 따른 세포증식 정도를 측정하였다. 한편, 세포성장에서 이소성 단백질 발현 효과를 배제하기 위하여, GFP는 음성대조군으로 사용되었다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, Hela 세포 수는 음성대조군인 GFP로 형질주입된 처리구와 비교하여 HA-NIR 또는 GFP-NIR로 형질주입된 실험군에서 형질주입 후 4일이 경과한 시점에 2배수로 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 6A). 도 6B에서 세포내에서의 NIR의 과발현을 GFP의 발현으로 확인하였다. 또한 세포의 모양과 수를 사진을 찍어 관찰하였다.

상기와 같은 결과를 통해 NIR 단백질이 세포증식을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

NIR: novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor

<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> Novel use of NIR for diagnosing lung cancer <130> PN1308-294 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2815 <212> DNA <213> Homo sapiens NIR polynucelotide squence <400> 1 gtgcgcagcc gcgcggcatt ctggggccgg aagtggggtg cacgcttcgg gttggtgtca 60 tggcagctgc ggggagccgc aagaggcgcc tggcggagct gacggtggac gagttcctag 120 cttcgggctt tgactccgag tccgaatccg agtccgaaaa ttctccacaa gcggagacac 180 gggaagcacg cgaggctgcc cggagtccgg ataagccggg cgggagcccc tcggccagcc 240 ggcgtaaagg ccgtgcctct gagcacaaag accagctctc tcggctgaag gacagagacc 300 ccgagttcta caagttcctg caggagaatg accagagcct gctaaacttc agcgactcgg 360 acagctctga ggaggaagag gggccgttcc actccctgcc agatgtgctg gaggaagcca 420 gtgaggagga ggatggagcg gaggaaggag aagatgggga cagagtcccc agagggctga 480 aggggaagaa gaattctgtt cctgtgaccg tcgccatggt tgagagatgg aagcaggcag 540 caaagcaacg cctcactcca aagctgttcc atgaagtggt acaggcgttc cgagcagctg 600 tggccaccac ccgaggggac caggaaagtg ctgaggccaa caaattccag 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65 70 75 80 Pro Glu Phe Tyr Lys Phe Leu Gln Glu Asn Asp Gln Ser Leu Leu Asn 85 90 95 Phe Ser Asp Ser Asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Gly Pro Phe His Ser 100 105 110 Leu Pro Asp Val Leu Glu Glu Ala Ser Glu Glu Glu Asp Gly Ala Glu 115 120 125 Glu Gly Glu Asp Gly Asp Arg Val Pro Arg Gly Leu Lys Gly Lys Lys 130 135 140 Asn Ser Val Pro Val Thr Val Ala Met Val Glu Arg Trp Lys Gln Ala 145 150 155 160 Ala Lys Gln Arg Leu Thr Pro Lys Leu Phe His Glu Val Val Gln Ala 165 170 175 Phe Arg Ala Ala Val Ala Thr Thr Arg Gly Asp Gln Glu Ser Ala Glu 180 185 190 Ala Asn Lys Phe Gln Val Thr Asp Ser Ala Ala Phe Asn Ala Leu Val 195 200 205 Thr Phe Cys Ile Arg Asp Leu Ile Gly Cys Leu Gln Lys Leu Leu Phe 210 215 220 Gly Lys Val Ala Lys Asp Ser Ser Arg Met Leu Gln Pro Ser Ser Ser 225 230 235 240 Pro Leu Trp Gly Lys Leu Arg Val Asp Ile Lys Ala Tyr Leu Gly Ser 245 250 255 Ala Ile Gln Leu Val Ser Cys Leu Ser Glu Thr Thr Val Leu Ala Ala 260 265 270 Val Leu Arg His Ile Ser Val Leu Val Pro Cys Phe Leu Thr Phe Pro 275 280 285 Lys Gln Cys Arg Met Leu Leu Lys Arg Met Val Ile Val Trp Ser Thr 290 295 300 Gly Glu Glu Ser Leu Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Leu Ser Arg Val 305 310 315 320 Cys Arg His Lys Lys Asp Thr Phe Leu Gly Pro Val Leu Lys Gln Met 325 330 335 Tyr Ile Thr Tyr Val Arg Asn Cys Lys Phe Thr Ser Pro Gly Ala Leu 340 345 350 Pro Phe Ile Ser Phe Met Gln Trp Thr Leu Thr Glu Leu Leu Ala Leu 355 360 365 Glu Pro Gly Val Ala Tyr Gln His Ala Phe Leu Tyr Ile Arg Gln Leu 370 375 380 Ala Ile His Leu Arg Asn Ala Met Thr Thr Arg Lys Lys Glu Thr Tyr 385 390 395 400 Gln Ser Val Tyr Asn Trp Gln Tyr Val His Cys Leu Phe Leu Trp Cys 405 410 415 Arg Val Leu Ser Thr Ala Gly Pro Ser Glu Ala Leu Gln Pro Leu Val 420 425 430 Tyr Pro Leu Ala Gln Val Ile Ile Gly Cys Ile Lys Leu Ile Pro Thr 435 440 445 Ala Arg Phe Tyr Pro Leu Arg Met His Cys Ile Arg Ala Leu Thr Leu 450 455 460 Leu Ser Gly Ser Ser Gly Ala Phe Ile Pro Val Leu Pro Phe Ile Leu 465 470 475 480 Glu Met Phe Gln Gln Val Asp Phe Asn Arg Lys Pro Gly Arg Met Ser 485 490 495 Ser Lys Pro Ile Asn Phe Ser Val Ile Leu Lys Leu Ser Asn Val Asn 500 505 510 Leu Gln Glu Lys Ala Tyr Arg Asp Gly Leu Val Glu Gln Leu Tyr Asp 515 520 525 Leu Thr Leu Glu Tyr Leu His Ser Gln Ala His Cys Ile Gly Phe Pro 530 535 540 Glu Leu Val Leu Pro Val Val Leu Gln Leu Lys Ser Phe Leu Arg Glu 545 550 555 560 Cys Lys Val Ala Asn Tyr Cys Arg Gln Val Gln Gln Leu Leu Gly Lys 565 570 575 Val Gln Glu Asn Ser Ala Tyr Ile Cys Ser Arg Arg Gln Arg Val Ser 580 585 590 Phe Gly Val Ser Glu Gln Gln Ala Val Glu Ala Trp Glu Lys Leu Thr 595 600 605 Arg Glu Glu Gly Thr Pro Leu Thr Leu Tyr Tyr Ser His Trp Arg Lys 610 615 620 Leu Arg Asp Arg Glu Ile Gln Leu Glu Ile Ser Gly Lys Glu Arg Leu 625 630 635 640 Glu Asp Leu Asn Phe Pro Glu Ile Lys Arg Arg Lys Met Ala Asp Arg 645 650 655 Lys Asp Glu Asp Arg Lys Gln Phe Lys Asp Leu Phe Asp Leu Asn Ser 660 665 670 Ser Glu Glu Asp Asp Thr Glu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Leu Arg 675 680 685 Pro Leu Ser Thr Arg His Gly Val Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu 690 695 700 Glu Gly Glu Glu Asp Ser Ser Asn Ser Glu Gly Glu Trp Ser Trp Asp 705 710 715 720 Gly Asp Pro Asp Ala Glu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Glu Leu Gln Gln 725 730 735 Leu Ala Gln Gly Pro Glu Asp Glu Leu Glu Asp Leu Gln Leu Ser Glu 740 745 750 Asp Asp <210> 3 <211> 250 <212> PRT <213> mouse NIR polypeptide fragment(amino acid 500-700) <400> 3 Ser Lys Pro Ile Asn Phe Ser Val Ile Leu Lys Leu Ser Ser Thr Asn 1 5 10 15 Leu Gln Glu Lys Ala Tyr Arg Asp Gly Leu Leu Glu Gln Leu Cys Asp 20 25 30 Leu Thr Leu Glu Tyr Leu His Ser Gln Ala His Ser Ile Ala Phe Pro 35 40 45 Glu Leu Val Leu Pro Thr Val Leu Gln Leu Lys Ser Phe Leu Arg Glu 50 55 60 Cys Lys Val Ala Asn Tyr Cys Arg Gln Val Arg Gln Leu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Val Gln Glu Asn Ala Gln His Ile Gln Ser Leu Arg Gln Ser Ala Thr 85 90 95 Phe Ser Val Ser Asp Gln Met Ala Val Asp Ala Trp Glu Lys Gln Val 100 105 110 Arg Glu Glu Gly Thr Pro Leu Thr Arg Tyr Tyr Gly His Trp Lys Lys 115 120 125 Leu Arg Asp Arg Glu Ile Gln Leu Glu Ile Ser Gly Lys Glu Arg Leu 130 135 140 Glu Asp Leu Asn Phe Pro Glu Ile Lys Arg Arg Lys Val Glu Asp Arg 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asp Arg Lys Glu Leu Lys Asp Leu Phe Glu Leu Asp Ser 165 170 175 Ser Glu Gly Glu Asp Ser Thr Asp Phe Phe Glu Arg Gly Val Pro Arg 180 185 190 Leu Pro Glu Ala His Gln Gly Leu Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asp 195 200 205 Lys Glu Glu Gly Asp Ser Asp Ser Glu Asp Gly Asp Thr Asp Thr Gly 210 215 220 Val Asp Leu Ser Glu Leu Trp Gln Leu Ala Gln Gly Pro Gln Asp Glu 225 230 235 240 Leu Glu Asp Leu Gln Leu Ser Glu Glu Asp 245 250 <210> 4 <211> 756 <212> DNA <213> mouse NIR polynucleotide fragment(amino acid 500-700) <400> 4 agctccaagc ccatcaactt ctctgtgatc ttgaagctgt ccagcaccaa cctgcaggag 60 aaggcgtacc gggacgggct gctggaacag ctgtgtgacc ttactctgga atacctgcac 120 agccaggccc acagcatcgc tttcccagag ttggtgttgc ctactgttct acagctgaaa 180 tcttttctcc gggagtgcaa agtggctaac tactgccggc aggtgcgcca gctgctggag 240 aaagtgcaag agaatgcacg acacatccaa agtcttcgac agagcgcgac cttcagcgtg 300 tctgaccgga cggcagtgga tgcgtgggag aagcaggttc gtgaagaggg gaccccactc 360 accagatact acggccactg gaagaagctg agggaccgtg agatccagct ggaaatcagt 420 ggcaaagagc ggctagaaga cctgaacttc ccagagatca aaaggcggaa ggtggaagac 480 aggaaggatg aagacaggaa agaattaaag gacctgtttg agttggacag ttctgagggc 540 gaggacagca ccgacttctt tgagagagga gtacctaggc tcccggaagc tcaccaagga 600 ctgaaagaag atcaggaaga agaagataaa gaagaaggtg acagcgattc agaggatgga 660 gacacagaca cgggagtgga tctgagcgaa ctgtggcagc tggctcaggg accacaagat 720 gagctggagg atcttcagct ctcagaagag gactga 756

Claims (15)

1. NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 수준 또는 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 폐암 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 NIR 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 NIR 단백질은 서열번호 2의 폴리펩티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 NIR 유전자의 수준을 측정하는 물질은 NIR 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 NIR 단백질의 수준을 측정하는 물질은 NIR 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 진단용 마이크로어레이.
8. (a) 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 NIR(novel inhibitor of histone acetyltransferase repressor) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
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